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植物内生固氮菌是指定殖在健康植物体内、与宿主植物进行联合固氮活动的一类原核微生物，是植物微生态系统的天然组分[1]。研究发现[2]：因为存在固氮菌，某些亚热带地区稻田可以连续百年不施氮肥而土壤氮水平不下降。固氮微生物一般分为3类：自生固氮菌、与植物共生固氮的微生物、与植物联合固氮的微生物。共生固氮微生物常见于豆科Leguminosae植物中[3]，其固氮机制、菌肥开发等研究已相当成熟。联合固氮微生物最早由DÖBEREINER [4]从热带禾木科Gramineae牧草雀裨Paspalum thunbergii根际中分离获得，这种被命名为雀裨固氮菌Azotobacter paspali的微生物被认为是存在于根际的自由生活的固氮菌。它们可以部分入侵植物表层组织，依靠根系分泌物生存繁殖，不与宿主形成特异分化结构，因而固氮能力不及共生固氮菌，但这类固氮菌与植物关系密切。BARRAQUIO等[5]通过建立有效的水稻Oryza sativa内生固氮菌分离方法，测得水稻内生固氮菌数量为105~108 CFU·g−1；袁梅等[6]从湖南桂阳农田水稻分离出19株内生固氮菌，其中13株可抑制水稻苗期对镉的吸收；谭志远等[7]从青香茅Cymbopogon caesius与五节芒Miscanthus floridulus中分离出66株内生固氮菌共10个类群；BALDANI等[8]发现玉米Zea mays茎内存在内生固氮菌肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae，后者具有促进植物生长的作用。作为同属禾本科的木本植物，竹子内生固氮菌的报道较少。竹子是喜氮植物，对氮素要求较高；调查发现许多自然竹林没有氮肥补充但生长良好，提示竹子可能存在某种固氮菌，且后者具有较强的固氮潜能。顾小平等[9]从浙江淡竹Phyllostachys glauca根际分离到3株活性较高的固氮菌，从毛竹Phyllostachys edulis根表面分离到36株固氮菌，分别为多黏芽孢杆菌Bacillus polymyxa和地衣芽孢杆菌Baclicus lincheniformis [10]；侯伟等[11]从簕竹Bambusa blumeana中分离到40株高效固氮酶活性菌株，分别属固氮螺菌属Azosprillum、大肠埃希氏菌属Escherichias、绿脓杆菌属Pseudomonas和水螺旋菌属Aquaspirillum；同时从簕竹[12]中分离到5株内生固氮菌，具有活性高、生长强势、可以通过自身代谢作用来适应环境酸碱性变化等特征。目前，国内关于竹子内生固氮菌的研究甚少。本研究以毛竹 (散生)、孝顺竹Bambusa multiplex (丛生)和狭叶青苦竹Pleioblastus chino (混生)为研究对象，利用分子生物技术研究不同生长型竹子根部及叶部的内生固氮菌、定殖土壤固氮菌的多样性和结构特征，探究不同竹种和不同器官间内生固氮菌多样性，探讨植株与定殖土壤内固氮菌多样性的关系，为竹子培育管理提供指导，也为开发有潜力的高效固氮菌，减少化学氮肥施用量、解决因化肥使用过度所造成的环境污染问题提供参考。
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狭叶青苦竹、孝顺竹栽植于浙江农林大学竹种园内，毛竹栽植于浙江农林大学后山。所有林相均为纯林，所有土壤均为红黄壤。采集竹叶、细根及不同竹种根部定植土壤。被选植株要求生长力旺盛，远离边缘地带，未受到病虫害感染。每种竹子选取3株间隔约15 m的不同植株作为重复。土壤样品采自所选竹子根周，深度为0~30 cm。所有样品放入4 ℃冰箱保存备用。
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经风干、磨细、过筛后，测定土样土壤化学性质。具体参考鲍士旦[13]的方法，测定土壤含水量、pH、有机质、有效氮、速效磷、速效钾等指标。由表1可知：3种竹子定植土壤的pH、有机质、有效氮、速效钾、速效磷等指标均未表现出显著性差异(P＞0.05)，说明土壤样品的化学性质差异不影响固氮菌种类。
表 1 3种土壤的基本化学性质
Table 1. Basic chemical properties of three soil
种类 pH 有机质/(g·kg−1) 有效氮/(mg·kg−1) 速效磷/(mg·kg−1) 速效钾/(mg·kg−1) 毛竹 4.32±0.24 a 33.01±7.04 a 58.20±16.46 a 5.40±0.85 a 79.00±8.80 a 孝顺竹 4.64±0.27 a 36.85±10.81 a 66.14±14.46 a 4.99±0.61 a 69.33±17.02 a 狭叶青苦竹 4.72±0.54 a 37.67±9.16 a 57.34±15.63 a 4.65±0.94 a 70.67±4.50 a 说明：同列相同字母表示差异不显著(P＞0.05) -
竹子叶与根的预处理参考谭致远等[7]方法。叶与根灭菌消毒后，剪碎放入无菌研钵。用液氮充分研磨破碎植物样品，参考高志民等[14]改良后的CTAB法提取植物内生微生物DNA，−40 ℃冰箱保存备用。
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土壤样品过20目筛，按Mobio土壤微生物DNA试剂盒(Powersoil kit，美国)提取土壤微生物DNA。
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固氮酶nifH基因采用聚合酶链式反应方法(PCR)扩增。第1轮正向引物FGPH19：5′-TACGGCAARGGTGGNATHG-3′，反向引物polR：5′-ATSGCATCATYTCRCCGGA-3′；第2轮正向引物AQER：5′-GACGATGTAGATYTCCTG-3′，反向引物polF-GC：5′-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3′。扩增程序参考DIALLO等[15]。
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使用DCodeTM Universal Mutation Detection System (Bio-Rad，美国)对PCR产物进行变性梯度凝胶电泳，用GelDocTM EQ凝胶成像系统 (Bio-Rad，美国)拍照保存。
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用polF(不含GC)与AQER引物扩增各竹种叶部、根部DNA，PCR产物用纯化试剂盒(Takara)纯化后与pEASY-T3 Vector(全金式生物技术公司，中国，北京)连接，转化到Trans1-T1感受态细胞中，涂在含有X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB琼脂平板上进行蓝白斑筛选，用菌落PCR方法检测阳性克隆子。阳性克隆菌液送上海生工生物技术公司进行测序，序列通过NCBI进行Blast比对分析，获取相近典型菌株序列[16]。
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利用Quantity one软件对DGGE电泳图进行指纹图谱分析，根据条带对比结果，通过未加权算术平均法进行聚类分析；计算Shannon多样性指数，使用SPSS软件进行单因素方差分析与两两比较(Ducan法)；使用Mega 5.0，采用邻接法进行系统发育树分析。
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对土壤微生物、植物内生微生物DNA分别进行2轮巢氏PCR，获得土壤和植物固氮菌的nifH基因。由图1A和图1B可见：400~500 bp出现了一系列较为明亮的条带，即为目标nifH基因。
图 1 土壤固氮菌(A)与植物固氮菌(B)nifH基因扩增
Figure 1. nifH gene’s PCR products of soil azotobacteria (A) and plant endophytic diazotrophs (B)
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DGGE图谱中，条带数量代表样品所含固氮菌种类、多样性的丰富程度，条带粗细代表该种菌的生物量的大小(图2A)。使用Quantity one软件识别DGGE图中条带信息，以毛竹土壤3号为基准进行相似度分析，共识别出17个条带，且不同土壤样品之间出现一定数量的共有条带。这表明不同竹子定植的土壤存在着一定数量相同种类的固氮菌。
图 2 土壤固氮菌nifH基因片段DGGE指纹图谱(A)与聚类分析树(B)
Figure 2. The nifH gene DGGE fingerprint(A) and clustering analysis tree (B) of soil azotobacteria
聚类分析中各样品之间的分支点数值代表植物内生固氮微生物之间亲缘关系的远近，数值越大越相似。由图2B可知：不同竹种之间、同一竹种重复样品间土壤固氮菌相似度不高。一般认为相似度达到0.60及以上时说明群体间相似性好[17]。本研究中孝顺竹3个土壤样品重复聚在一起，但整体相似度也仅为0.57，说明土壤中固氮菌群落的变异性较大。对于土壤微生物而言，复杂的物质组成和空间结构导致微生物的变异性增加。虽然3种土壤的理化性质没有显著差异(表1)，但土壤的固氮菌仍然存在较大差异。
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不同竹种、不同器官的内生固氮菌nifH基因DGGE指纹图谱如图3A所示。以毛竹土壤3号为参照，毛竹叶与根、狭叶青苦竹叶、孝顺竹叶与根等9个样品出现了明亮且粗大的条带，这些条带丰度较大，为优势固氮菌种。研究发现[18]：不同菌在组织内占有不同生态位，它们相互作用建立一种生态平衡，分离频率高的为植物体内数量大的优势种群，相反则为稀有种群。图3中，竹根的条带数明显多于竹叶，说明根部内生固氮菌种类多于叶部。刘丽辉等[19]发现普通野生稻Oryza rufipogon内生固氮菌在水稻根部分布最多，茎叶中偏少，呈自下而上逐级递减规律，与本研究一致。且竹根部内生固氮菌种类远多于土壤，说明竹子根部固氮菌不仅来源于土壤，还通过其他途径进入植株，如KLUEPFEL等[20]认为细菌是通过植物自然开口(水孔、气孔、皮孔和蜜腺等)和伤口(根磨损、动物摄食及收割多年植物等)进入植物体内的。
图 3 竹子叶与根内生固氮菌nifH基因DGGE指纹图谱(A)与聚类分析树(B)
Figure 3. DGGE fingerprint of nifH gene endophytic diazotroph(A) and clustering analysis tree (B) in bamboo’s leaves and roots
聚类分析结果(图3B)表明：不同植物样品整体相似度不高，但大部分叶与根的样品明显区分，竹子叶与根分别聚在不同组，表明竹子器官差异是影响内生固氮定殖的重要因素。毛竹土壤样品(MT3)和根部样品聚集，但相似值仅有0.48，进一步说明了植株内生固氮菌仅有部分通过土壤进入，且大多定殖在根部，少部分扩散到叶部。以相似度大于0.60为群体间相似性很好的标准判断[17]，同一品种同部位重复样品间的相似度均不高，除狭叶苦青竹1号与狭叶苦青竹2相似值达0.77外，其他样品3个重复都未能聚集，说明内生固氮菌种类与植物种类关系不大，遗传因子没有起到决定性作用。植物内生固氮菌的捕获具有一定的偶然性。
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以指纹图谱信息为依据计算各个样品的Shannon多样性指数可以评价群落多样性。如表2所示：狭叶青苦竹根部内生固氮菌多样性最为丰富，显著高于叶部与土壤(P＜0.05)。毛竹固氮菌多样性依次为根部(2.98)、土壤(2.75)、叶部(2.30)，毛竹根部和土壤间无显著差异，但两者显著大于毛竹叶部(P＜0.05)，说明土壤固氮菌与根部内生固氮菌多样性都比叶部要丰富。孝顺竹叶部、根部内生固氮菌、土壤固氮菌间多样性差异不显著(P＞0.05)。不同竹种不同部位固氮菌多样性不同，狭叶青苦竹和毛竹以叶部最低，孝顺竹叶部最高，这可能与竹子的生长繁殖方法有关；孝顺竹为丛生竹，竹子在某一个固定位置生长更新，根部和土壤中的固氮菌容易进入叶子；毛竹为散生竹，狭叶青苦竹虽然是混合型竹子，但以散生的居多，随着地下鞭的延伸更新，这些竹子不断改变着生地点，其本身的固氮菌可能也少，通过地下鞭和地上部分的通道到达叶子中的固氮菌便更少。
表 2 不同来源固氮菌Shannon多样性分析
Table 2. Shannon indexes of the three bamboos’ leaves, roots and soil
种类 叶部 根部 土壤 狭叶青苦竹 2.43±0.30 Bb 2.89±0.12 ABa 2.36±0.09 Bb 毛竹 2.30±0.28 Bb 2.98±0.19 Aa 2.75±0.17 Aa 孝顺竹 2.73±0.10 Aa 2.53±0.26 Ba 2.70±0.15 Aa 说明：大写字母表示同列间差异显著(P＜0.05)，小写字母 表示同行间差异显著(P＜0.05) 对不同竹种相同部位内生菌多样性分析发现：孝顺竹叶部内生菌多样性显著高于狭叶青苦竹和毛竹(P＜0.05)，根部则显著低于狭叶青苦竹和毛竹(P＜0.05)；毛竹和孝顺竹土壤固氮菌多样性显著高于狭叶青苦竹(P＜0.05)；说明对于毛竹与狭叶青苦竹而言，固氮菌群落更偏爱在根部定殖，对于孝顺竹而言，固氮菌群落更喜爱在叶内定殖。
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对不同竹种根部/叶部的内生固氮菌DNA作随机克隆并测序(表3)，在培养基上共得到484个蓝色斑点，经验阳后送测121个，序列经BLAST数据库对比，得到83株菌株，其中12株为可培养固氮菌，归属于8种菌属，其余71株为不可培养固氮菌(来源于毛竹叶8株，毛竹根14株，孝顺竹叶7株，孝顺竹根14株，狭叶青苦竹叶8株，狭叶青苦竹竹根20株)，尚未被命名，不可培养的比例高达86%；推测原因可能是不可培养固氮菌在竹子内生固氮菌中处于优势地位，也可能是竹子中某些可培养的内生固氮菌尚未在其他植物中被分离鉴定，这也进一步说明了该类固氮菌的特殊性。12株可培养的固氮菌大部分为根组织内生菌(表4)，除Immundisolibacter和红长命菌属Rubrivivax外，均已报道具有固氮基因[19，21-28]。8个菌属中，慢生根瘤菌属Bradyrhizobium出现频率最高，一般是从大豆Glycine max根部分离得到，如XU等[21]从大豆和野大豆Glycine soja根瘤中分离出了与大豆结瘤的超慢生辽宁大豆根瘤菌Bradyrhizobium liaoninggense。固氮螺菌属Azospirillum具有明显的固氮功能，在植物根、茎、叶中广泛存在[19]；此外，翟超男[22]，周建娇[23]分别从海滨雀稗Paspalum vaginatum和白菜Brassica pekinensis根发现具有固氮功能的肠杆菌Enterobacter sp.；李洁琼等[24]从玉米根际中分离出具有促生作用的Kosakonia radicincitans strain YD4同样具有固氮功能，而Kosakonia是从肠杆菌属Enterobacter中分离出来的新属。TAN等[25]通过南方杂交法与乙炔还原法发现Dechlorosoma suillum中具有nifH基因；唐凯等[26]在研究浑善达克沙地苔藓Bryophyta结皮下层土壤细菌时发现Azohydromonas具有固氮功能。红长命菌可以氨为氮源，是目前发现的唯一能分泌蛋白酶的光合细菌[27]，Immundisolibacter是变形杆菌的一种新细菌，具有降解多环芳香烃的功能[28]。本研究从毛竹根部和孝顺竹根部鉴定出的红长命菌和Immundisolibacter中存在固氮基因，推测此2种菌很可能是具有固氮能力的新种。
表 3 基于nifH序列的不可培养固氮菌分布情况(相似度98%以上)
Table 3. Distribution of unculturable bacteria based on nifH gene (The similarity is more than 98%)
样品来源 相似菌种基因 毛竹叶 HP-46 nitrogenase (nifH) gene、HP-76 nitrogenase (nifH) gene、nifH gene for nitrogenase iron protein、nitrogen-
fixingbacteriumcloneb1 -HA3-1nitrogenase iron protein (nifH) gene、isolate DGGE gel band 5 nitrogenase iron protein (nifH)
gene、J19I(16) nitrogenase (nifH) gene、HP-12 nitrogenase (nifH) gene、TNO_elv_99f12 dinitrogenase reductase (nifH) gene毛竹根 nifH gene for nitrogenase iron protein、HP-27 nitrogenase (nifH) gene、HP-84 nitrogenase
(nifH) gene、HP-84 nitrogenase (nifH) gene、CI(12) nitrogenase (nifH) gene、HP-14 nitrogenase (nifH) gene、TII(5) nitrogenase
(nifH) gene、HP-48 nitrogenase (nifH) gene、HP-75 nitrogenase (nifH) gene、J19I(12) nitrogenase (nifH) gene、TNO_elv_81h1
dinitrogenase reductase (nifH) gene、TNO_elv_81h1 dinitrogenase reductase (nifH) gene、HP-46 nitrogenase (nifH) gene、HP-75
nitrogenase (nifH) gene孝顺竹叶 HP-215 nitrogenase (nifH) gene、HP-5 nitrogenase (nifH) gene、HP-218 nitrogenase (nifH) gene、CY1-01 nitrogenase iron
protein (nifH) gene、HP-56 nitrogenase (nifH) gene、HP-226 nitrogenase (nifH) gene、HP-157 nitrogenase (nifH) gene孝顺竹根 isolate DGGE gel band 18 nitrogenase iron protein (nifH) gene、isolate DGGE gel band 12 nitrogenase iron protein (nifH) gene、
HP-226 nitrogenase (nifH) gene、partial nifH gene for dinitrogenase reductase、HP-90 nitrogenase (nifH) gene、partial nifH
gene for dinitrogenase reductase、HP-237 nitrogenase (nifH) gene、HP-246 nitrogenase (nifH) gene、HP-246 nitrogenase
(nifH) gene、HP-51 nitrogenase (nifH) gene、C13L7NH26 dinitrogenase reductase (nifH) gene、isolate DGGE gel band 20
nitrogenase iron protein (nifH) gene、b1-HA3-1 nitrogenase iron protein (nifH) gene、431 nitrogenase iron protein (nifH) gene狭叶青苦竹叶 TC30 NifH (nifH) gene、C12L6CK9 dinitrogenase reductase (nifH) gene、C13L6NH2 dinitrogenase reductase (nifH) gene、
C12L7NH35 dinitrogenase reductase (nifH) gene、nifH gene for nitrogenase iron protein(partial cds)、C13L10NH15
dinitrogenase reductase (nifH) gene、C13L8CK17 dinitrogenase reductase (nifH) gene、HP-75 nitrogenase (nifH) gene狭叶青苦竹根 isolate DGGE gel band 14 nitrogenase iron protein (nifH) gene、Rb3_NifH_48 nitrogenase gene、C12L8CK4 dinitrogenase
reductase (nifH) gene、WK-A5 nitrogenase iron protein (nifH) gene、486 nitrogenase iron protein (nifH) gene、C13L8NL22
dinitrogenase reductase (nifH) gene、C13L6CK40 dinitrogenase reductase (nifH) gene、99 nitrogenase iron protein (nifH)
gene、HP-201 nitrogenase (nifH) gene、HP-2 nitrogenase (nifH) gene、243 nitrogenase iron protein (nifH) gene、
C12L10NL20 dinitrogenase reductase (nifH) gene、C13L10NL22 dinitrogenase reductase (nifH) gene、isolate DGGE gel band
11 nitrogenase iron protein (nifH) gene、C12L7CK25 dinitrogenase reductase (nifH) gene、HP-159 nitrogenase (nifH) gene、
HP-215 nitrogenase (nifH) gene、HP-90 nitrogenase (nifH) gene、C12L7NH35 dinitrogenase reductase (nifH) gene、
b1-HA3-1 nitrogenase iron protein (nifH) gene表 4 基于nifH序列的可培养固氮菌分布情况
Table 4. Distribution of culturable bacteria of nifH gene
类群 样品来源 NCBI中最相近菌种(登录号) 序列相似性/% 慢生根瘤菌属 Bradyrhizobium MG38 Bradyrhizobium sp.(KC356360.1) 98 QG11 Bradyrhizobium sp.(AB079616.1) 99 QG255 Bradyrhizobium sp.(LT859959.1) 99 XG32 Bradyrhizobium sp.(CU234118.1) 99 Dechlorosoma MG31 Dechlorosoma suillum(CP003153.1) 98 固氮螺菌属 Azospirillum XG434 Azospirillum canadense strain(GU256446.1) 99 肠杆菌属 Enterobacter XY47 Enterobacter sp.(KC989924.1) 99 Kosakonia MG6 Kosakonia sacchari strain(KR075981.1) 99 XG52 Kosakonia sacchari strain(KR075959.1) 99 变形杆菌属 Gammaproteobacteria XG255 Immundisolibacter cernigliae strain (CP014671.1) 99 红长菌属 Rubrivivax MG16 Rubrivivax gelatinosus strain(KF800058.1) 98 Azohydromonas XG66 Azohydromonas australica(AB188121.1) 100 孙建光等[29]从小麦Triticum aestivum、水稻、白菜、玉米、芹菜Apium sp.等5种农作物中分离到25个属的内生固氮菌。本研究选取伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp. strain STM678、假单胞菌Pseudomonas corrugata、芽孢杆菌Bacillus aryabhattai strain B8W22和克雷伯氏菌Klebsiella variicola等4个优势种作为参照，与3种竹子中筛选出的克隆序列构建系统发育树。由图4可见，除1株来源于狭叶青苦竹的菌株(不可培养)与伯克霍尔德氏菌聚在一起外，其他菌株均远离参照菌株。具体来看，慢生根瘤菌属位于发育树中部位置，红长命菌属、Kosakonia、肠杆菌属、脱氯菌属Dechlorosoma、固氮螺菌属亲缘关系接近，Immundisolibacter cernigliae位于发育树的偏顶端位置，亲缘关系远离以上5个属。牛艳芳[30]对内蒙古植被主要建群植物的根际固氮菌进行分离时发现：6个地区的固氮菌类群存在显著差异，有些固氮菌分布具有区域性。推测这种大区域环境差异造成的固氮菌类群差异，可能也是竹子内生固氮菌与其他作物内生固氮菌存在较大区别的原因。
图 4 邻接法构建的内生固氮菌序列系统发育树
Figure 4. System phylogenetic tree of endophytic diazotrophs by using neighbor-joining method
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不同竹种定植的土壤中存在着一定数量的同种固氮菌，但整体区系的相似度不高。同一竹种不同器官(根与叶)之间、不同竹种相同器官之间、土壤与植物之间的固氮菌群落结构差异显著；同种竹叶部或根部的重复样品相似度均不高。3种竹子根部内生固氮菌种类总体显著多于叶部，土壤固氮菌群落结构与根部内生固氮菌相似度高于叶部；不同竹种、不同器官之间固氮菌群落Shannon多样性指数差异显著，孝顺竹叶部与土壤大于根部，狭叶青苦竹和毛竹根部大于叶部和土壤。植物样品随机克隆测序BLAST对比得到83株固氮菌，其中12株为可培养固氮菌株，分别属于慢生根瘤菌属、Dechlorosoma、固氮螺菌属、肠杆菌属、Kosakonia、变形杆菌属、红长菌属、Azohydromonas等8个属，与已报道对竹子内生固氮菌研究相比，仅与侯伟等[12]从簕竹中分离得到了相同的固氮螺菌，但未发现其他相同种属。系统发育树结果表明3种竹子内生固氮菌显著不同于其他植物中分离得到的内生固氮菌。
Characteristics and diversity of endophytic diazotrophs in three bamboo species
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摘要:
目的 了解不同竹子内生固氮菌及其定殖土壤根区固氮菌的特征和生物多样性。 方法 以毛竹Phylloslachys edulis、狭叶青苦竹Pleioblastus chino、孝顺竹Bambusa multiplex叶部、根部及定植土壤为对象，设计nifH固氮基因引物，采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和随机克隆技术，通过聚类分析、Shannon多样性指数分析构建系统发育树。 结果 不同竹子根区土壤之间、同一竹种根部与叶部之间、不同竹种同一器官之间、根区土壤与植物之间的固氮菌群落结构差异明显，同一竹种叶部或根部的重复样品相似度均不高；根部内生固氮菌种类总体多于叶部，土壤固氮菌与根部内生固氮菌相似度高于叶部。不同竹种不同器官间固氮菌Shannon多样性指数差异显著，孝顺竹叶部(2.73)与土壤(2.70)大于根部(2.53)(P＜0.05)，狭叶青苦竹根部和毛竹根部大于叶部和土壤(P＜0.05)。植物样品随机克隆测序对比得到83株固氮菌，仅12株为可培养固氮菌株，分别属于慢生根瘤菌属Bradyrhizobium、Dechlorosoma、固氮螺菌属Azospirillum、肠杆菌属Enterobacter、Kosakonia、变形杆菌属Gammaproteobacteria、红长菌属Rubrivivax和Azohydromonas。系统发育树结果表明：3种竹子内生固氮菌明显不同于其他植物。 结论 土壤环境、竹子种类及组织器官均能影响竹子内生固氮菌的结构特征和多样性，定殖于根部的内生固氮菌多样性显著高于叶部。3种竹子内生固氮菌种类与已报道的禾本科Gramineae植物差异显著。图4表4参30 Abstract:Objective The objective is to investigate the characteristics and biodiversity of endophytic diazotrophs in three bamboo species and in planting soil of root zones. Method Samples of leaves, roots and planting soil from Phyllostachys edulis, Bambusa multiplex and Pleioblastus chino were taken as the objects. The primers of nifH nitrogen fixation gene were designed. PCR-DGGE and random cloning technology were used to construct phylogenetic tree by cluster analysis and Shannon diversity index analysis. Result There were significant differences in community structure of diazotrophs among soils, between roots and leaves of the same bamboo species, between the same organs of different bamboo species, and between the soils of root zones and plants. The similarity of the same bamboo leaf or root was not high. More endophytic diazotrophs were detected in roots than in corresponding leaves. The similarity between diazotrophs in soil and those in roots was higher than that between soil and leaves. Significant differences of diazotrophs among plant species and plant tissues were observed by Shannon diversity index. The Shannon diversity index in leaf (2.73) and soil (2.70) of B. multiplex was higher than that in root (2.53) (P＜0.05), and that in roots of P. chino and Ph. edilus was higher than that in leaf and soil (P＜0.05). 83 strains of diazotrophs were obtained by random cloning and sequencing of plant samples, and only 12 strains were culturable, belonging to Bradyrhizobium, Dechlorosoma, Azospirillum, Enterobacter, Kosakonia, Gammaproteobacteria, Rubrivivax and Azohydromonas. The sequences of phylogenetic tree indicated that the endophytic diazotrophs in the three bamboo species differed greatly from those in other plants. Conclusion The structural characteristics and diversity of diazotrophs in bamboo are affected by soil properties, species and plant tissues. The diversity of endophytic diazotrophs in roots is significantly higher than that in leaves, and the corresponding taxa are distinct from those of Gramineae reported previously. [Ch, 4 fig. 4 tab. 30 ref.] -
Key words:
- bamboo /
- endophytic diazotroph /
- PCR-DGGE /
- cluster analysis /
- Shannon diversity index /
- random cloning /
- phylogenetic tree
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植物病害是导致现代农林业减产的主要原因，及时准确的植物病害识别技术是实施有效防治的关键。在实际生产中，植物病害识别主要依靠人工肉眼观察及经验判断，需要人们在实地进行持续监测[1-2]。这种人工评估方法耗时费力且具有一定的主观性，阻碍了现代农林业的快速发展，因此，快速准确的植物病害自动识别成为了精准农业、高通量植物表型和智能温室等领域的研究热点[3-4]。基于图像处理的植物病害识别方法得到了广泛的研究和应用。早期的识别过程需要从图片中分割病斑，人工提取病斑特征，再利用机器学习算法对特征进行分类。HIARY等[5]提取病斑的纹理特征，采用k-means聚类算法和人工神经网络(artificial neural network，ANN)对5种植物病害进行识别，准确率达94%。TIAN等[6]提出用基于支持向量机(support vector machine，SVM)的多分类器识别小麦Triticum aestivum叶部病害。秦丰等[7]对4种苜蓿Medicago叶部病害进行识别研究，分析比较了多种分割方法、特征选择和分类方法。虽然以上方法在特定场景取得了较好效果，但仍无法实现病害的现场实时诊断。这些方法极大程度上基于阈值的病斑分割算法，对亮度、物体形态和遮挡程度都非常敏感[8−9]，都只适合背景单一且对比度高的扫描式图像。此外，特征提取和选择复杂耗时，仅局限于有限几种病害，难以处理复杂背景的大数据。近年来，深度学习在计算机视觉领域取得重大突破。深度卷积网络神经网络(convolutional neural network，CNN)可在大数据中自动端到端提取特征，避免了人工图像分割和特征工程[10]。MOHANTY等[11]针对PlantVillage数据集[11] 54 306张植物病害图像，使用AlexNet[12]和GoogLeNet[13]识别38种植物病害。孙俊等[14]在同样的数据集上，将AlexNet进行改进，提出一种批归一化与全局池化相结合的识别模型。龙满生等[15]采用参数精调的迁移学习方式训练AlexNet，用于油茶Camellia oleifera病害图像识别。张建华等[16]基于改进的VGG16模型，通过迁移学习实现自然条件下棉花Anemone vitifolia病害图像分类。DECHANT等[17]提出了集成多个CNN的方法，实现玉米Zea mays大斑病图像的高精度识别。PICON等[18]利用深度残差网络ResNet对3种早期小麦病害进行识别，改善了复杂背景下的病害识别率。通常深度学习模型部署在云平台，需要将拍摄图像上传至云平台进行识别。但这种方法严重依赖高速的4G/5G无线网络和强大的云平台，不仅无法覆盖广大偏远农田林地，长时间大范围的上传与识别还导致能耗、流量及云服务成本大幅上涨，限制了物联网的建设规模。然而，目前的监控设备借助低成本低功耗加速芯片，即可支持边缘计算，仅在发现病害时通过低功耗广覆盖的NB-IoT网络[19]上报，可显著降低网络及云服务成本，促进大规模的农林业物联网普及。但现有的CNN模型计算量和参数量过大，不适用于边缘部署。轻量级模型MobileNet[20]在速度和精度两者间达到了一个较好的均衡，但其目标平台是手机等高端嵌入式平台，参数量及运算量仍超过PaddlePi等廉价边缘设备的承受能力。近年来，学术界也提出了多种模型压缩方法。模型通道剪枝[21]剪裁掉模型一部分冗余或低权重的卷积核，减少模型的参数量。量化[22]将模型由32 bit浮点数转化为定点整数，减少模型参数占用的空间。然而上述压缩方法仅应用于ResNet等重量级模型，尚未对MobileNet等轻量级模型压缩进行优化，而且这些压缩方法彼此相互独立，未能联合使用实现模型的深度压缩。为解决上述问题，本研究提出了面向边缘计算的植物病害识别模型构建方法，主要贡献为：①首次针对轻量级模型MobileNet实现深度压缩。②通过联合通道剪枝、量化等多种模型压缩方法，得到了深度压缩的轻量级边缘端模型，可在廉价边缘节点运行。③将模拟学习方法[23]与量化相结合，实现模型压缩的同时，提升识别效果，最后得到的边缘端模型可达到与原模型相近的识别准确率。
1. 材料与方法
1.1 材料
本研究使用PlantVillage植物病害数据集。PlantVillage既包含单一背景下的植物叶片扫描式图像，也收录自然背景下的植物叶片图像，包括叶片重叠、阴影和土壤干扰等情形。截至目前已收集了87 280张图像，包括25种植物和29种病害组成的58类植物-病害组合(图1)。
图 1 PlantVillage数据集植物病害示例图Figure 1 Example of plant disease images from the PlantVillage dataset数据集按图1所示的编号将各种叶片归类并制作标签。随机抽取数据集中60%图像作为训练集，剩余的40%作为测试集。单一背景图像与自然背景图像使用相同的分割比例。由于PlantVillage数据集包含从不同角度对同一叶片拍摄的多张图像，因此相同叶片的图像仅存在于训练集或测试集中。
1.2 方法
选择轻量级卷积神经网络MobileNet[20]作为本研究的基准模型。MobileNet模型将传统的卷积分解为一个深度卷积(depthwise convolution，DC)和一个卷积核为1×1的逐点卷积(pointwise convolution，PC)，计算速度比传统卷积快8~9倍，主要面向智能手机等高端嵌入式系统。为深度压缩MobileNet，本研究提出了如图2所示的面向边缘计算的植物病害识别模型二阶段构建方法。
图 2 面向边缘计算的植物病害识别模型构建方法：通道剪枝和量化模拟学习Figure 2 Plant disease recognition model for edge computing building pipeline: channel pruning and quantized mimic learning第1阶段使用通道剪枝压缩迁移学习训练的MobileNet模型。与从头训练方法相比，迁移学习可以有效提升模型的识别准确率。迁移学习是用ImageNet数据集上预训练好的参数初始化模型，然后在PlantVillage数据集上通过标准多分类损失函数优化模型参数。最后使用基于L1范数的通道剪枝[21]精简低权值的卷积核，同时将该卷积核所有的输入输出连接从网络中删除，降低了模型计算量和存储空间。
第2阶段对剪枝后的模型通过量化方法进一步压缩，得到轻量级的边缘端模型。量化是将模型的权值和激活值由32 bit降低至8 bit，分为训练时量化和训练后量化。虽然训练时量化方法更适用于轻量级模型，但直接使用该方法压缩剪枝后的MobileNet模型仍会导致识别精度显著下降，因此第2阶段将模拟学习与训练时量化相结合，利用迁移学习的MobileNet监督剪枝后模型的量化训练过程，实现量化模拟学习，在模型压缩的同时提升识别准确率。
1.2.1 通道剪枝
模型通道剪枝采用均匀剪枝方法对MobileNet模型的分离卷积层进行通道剪枝，即每层都减掉同样比例的卷积核。依据需要减少模型的浮点运算数量(floating point operations, FLOPs)来确定每层的剪枝比例。计算各层中每个卷积核权值的绝对值和(即L1范数)，L1范数越大，代表该卷积核对模型的贡献越大，反之越小。每层按L1范数由高到低的顺序排序卷积核，优先剪枝L1范数低的卷积核。为实现模型的深度压缩，需进行较高比例的通道剪枝，分别对模型减掉70%、80%和90%的FLOPs。
1.2.2 量化模拟学习
通常训练时，量化的损失函数是标准的多分类损失函数。量化模拟学习是用模拟学习损失函数作为训练时量化的损失函数。模拟学习方法使剪枝量化后模型的输出特征尽量接近迁移学习训练的MobileNet输出特征。利用2个输出特征之间的L2范数作为模拟损失函数，即：
$$ {L_{L_2}}\left( {{W_{\rm{s}}},{W_{\rm{t}}}} \right) =|| F\left( {x;{W_{\rm{t}}}} \right) - F\left( {x;{W_{\rm{s}}}} \right)||_2^2{\text{。}} $$ (1) 式(1)中：Wt和Ws分别是迁移学习训练的MobileNet和剪枝量化后模型的权值矩阵，F (x; Wt)和F(x; Ws)分别表示这2个模型的输出特征值。
剪枝量化后模型的输出特征再经Softmax归一化得到预测类别概率，与分类标签比较后得到交叉熵，作为标准多分类损失函数Lclass(Ws)。模拟学习的完整损失函数就是分类损失函数与模拟损失函数的权重和：
$$ L\left( W \right) = {L_{\rm{class}}}\left( {{W_{\rm{s}}}} \right) + \alpha {L_{{L}_{{\rm}2}}}\left( {{W_{\rm{s}}},{W_{\rm{t}}}} \right){\text{。}} $$ (2) 式(2)中：α为平衡损失权重的超参数。相较于普通多分类问题的损失函数，模拟学习方法可提供额外的监督信息。
将训练时量化方法与模拟学习相结合，实现量化模拟学习具体的训练步骤为：①在训练的前向传播中，将模型的权值wf和激活值af进行量化得到定点值wq和aq，对于浮点数x具体的量化过程为：
$$ {x_{{\rm{int}}}} = {\rm{round}}\left( {\frac{x}{\varDelta }} \right);\; {x_{\rm{Q}}} = {\rm{clamp}}\left[ { - \left( {\frac{N}{2} - 1} \right),\frac{N}{2} - 1,{x_{{\rm{int}}}}} \right]{\text{。}} $$ (3) xQ即为得到的量化值。其中：clamp函数对于输入的变量a，b，c输出为：
$$\begin{aligned} {\rm{clamp}}(a,b,c) & = a\;\;\;\;x {\text{≤}} a \\ & = x\;\;\;a {\text{＜}} x {\text{≤}} b \\ & = b\;\;\;x {\text{＞}} b\text{。} \end{aligned}$$ (4) 也就是将浮点数除以缩放因子Δ，再最近邻取整，最后把范围限制到1个区间内。N与量化后整数类型占用的比特数有关。本研究采用有符号8 bit整数类型，N=256。对于权值，每层权值的最大绝对值作为缩放因子。对于激活值，计算各训练批次激活的最大绝对值的滑动平均值作为缩放因子。②计算剪枝量化后模型对迁移学习训练的MobileNet进行模拟学习的损失函数，即计算公式(2)，得到损失值L(wq)。③后向传播过程，利用步骤②得到的损失函数值对量化之后的权值求梯度，公式为
$ \dfrac{{{\rm{\partial}} L\left( {{w_q}} \right)}}{{{\rm{\partial}} {w_q}}}$ 。④用步骤③计算梯度去更新量化前的浮点值，也就是将模型的权值反量化回有误差的浮点类型。公式为$ {w_{\rm{f}}} = {w_{\rm{f}}} - v\dfrac{{{\rm{\partial}} L\left( {{w_q}} \right)}}{{{\rm{\partial}} {w_q}}}$ ，其中：ν为学习率。因此，模型的后向传播过程仍然是浮点数计算。⑤重复步骤①至步骤④，直至完成训练。最后再对模型按照步骤①量化，得到最终的边缘端模型。2. 结果与分析
模型实现和训练采用的软件环境为Ubuntu1 6.04操作系统和PaddlePaddle深度学习框架，硬件环境为GPU工作站，使用NVIDIA Titan X显卡(12 GB显存)和AMD Ryzen 7 1700X处理器(32 GB内存)。采用模型的平均识别准确率(accuracy)作为衡量模型精度的标准。同时为了更好地评价模型的鲁棒性，将每类病害样本分别进行测试，计算每个类别的查准率(precision)、查全率(recall)以及查全率与查准率的加权平均分数，并在所有类别上求平均。
2.1 MobileNet迁移学习训练试验
训练CNN模型需要对输入图片进行预处理。首先，利用数据增广技术对原图像进行变换，将训练图像变换为256×256大小，然后再随机剪枝成224×224，再进行随机水平翻转和随机垂直翻转。该过程极大扩充了训练数据集的多样性，可提升CNN模型的准确率，降低网络过拟合的风险。之后，计算训练集的红(R)、绿(G)、蓝(B)3个颜色通道的均值和方差，所有图像都减去该均值，除以方差，得到归一化后的数据作为CNN的输入，可加速训练过程收敛。对于测试集中的每一张图片，需要变换至224×224大小，减去训练集各通道均值，除以其方差进行归一化后就可以输入CNN模型进行识别。
利用迁移学习训练MobileNet，使用ImageNet数据集预训练的参数初始化模型，采用批量训练的方法将训练集分为多个批次(batch)，使用随机梯度下降算法来实现模型优化，批次大小为32，遍历1次训练集中的所有图片作为1个周期(epoch)，共迭代50个周期，初始学习率为0.005，动量值为0.9，之后每迭代20个周期就将学习率减小为原来的0.1倍。训练好的模型参数量为3.3 M，识别准确率为96.23%，查准率、查全率和加权平均分数分别为96.62%、95.46%和95.75%。
2.2 边缘端植物病害识别模型训练试验
研究不同压缩率下本研究方法的有效性，使用不同的剪枝率，分别对模型减掉不同比例的FLOPs。结果表明：当剪枝率低于60%时，即使使用无模拟训练方法重新训练模型，得到的识别准确率与原MobileNet模型差别很小，说明原模型在该数据集上具有较高的冗余性，只有当剪枝率高于70%时，才能体现不同压缩方法表现的差距。因此，设置剪枝率为70%、80%和90%，对应的模型参数量大小为0.91、0.58和0.23 M，模型的参数量压缩了3.6、5.7、14.3倍，量化又将精度由32 bit降低至8 bit，压缩率为4倍，得到的边缘端模型的整体压缩率分别为14.4、22.8和57.2倍。为快速恢复剪枝后模型精度，首先利用模拟学习损失函数进行30个周期的32 bit浮点模型训练，使用随机梯度下降算法优化模型，批次大小为32，初始学习率为0.005。之后，每迭代15个周期就将学习率减小为原来的0.1倍。公式(2)的α值设置为1。之后再进行20个周期的量化模拟学习，学习率为0.005，公式(2)的α值为0.1，其余超参数值不变。训练结果如表1所示。
表 1 边缘端模型植物病害识别结果Table 1 Plant disease recognition results of models on the edge剪枝率/% 参数量/M 剪枝压缩率/倍 量化压缩率/倍 整体压缩率/倍 准确率/% 查准率/% 查全率/% 加权平均分数/% 70 0.91 3.6 4 14.4 95.99 96.18 94.41 94.92 80 0.58 5.7 4 22.8 95.55 95.51 93.52 93.99 90 0.23 14.3 4 57.2 94.58 94.87 92.41 93.15 表1表明：整体压缩率分别为14.4、22.8和57.2倍的边缘端模型，识别准确率分别为95.99%、95.55%和94.58%，与迁移学习训练的MobileNet模型相比仅下降了0.24%、0.68%和1.65%。同时查准率、查全率和加权平均分数值也表明边缘端模型具有较高的鲁棒性。
不同压缩率的边缘端模型在测试集的混淆矩阵如图3所示。图3列出了58个类中的每类被正确分类的比例(对角线上的值)和被误识别为其他类的比例(非对角线上的值)。每类的编号与图1一致。可以看出：边缘端模型对不同植物的不同病害均具有较强的识别能力，但不同病害识别结果之间存在着较大的差异。58类病害中，这3个边缘端模型的识别准确率均超过90%的有43类，均超过80%的有51类，均超过70%的有55类。其中有11号哈密瓜健康叶、24号葫芦霜霉病、25号葡萄健康叶、39号树莓健康叶、46号草莓健康叶这5类的识别准确率在3个模型均达到了100%。识别效果最差，在3个模型上识别准确率几乎均低于70%的病害是12号木薯褐斑病(3个模型识别率分别为48.15%、58.33%、48.15%)，35号马铃薯健康叶(3个模型识别率分别为48.33%、33.33%、48.33%)，21号黄瓜健康叶(3个模型识别率分别为67.92%、66.04%、77.36%)。这些病害大多都被误识别为外形相似的其他病害，例如12号木薯褐斑病被误识别为13号木薯绿螨病，35号马铃薯健康叶被误识别为病斑较小的36号马铃薯晚疫病，21号黄瓜健康叶被误识别为11号哈密瓜健康叶。
2.3 边缘端植物病害识别模型对比试验
为进一步测试边缘端模型性能，分别在剪枝率70%、80%和90%的条件下，利用无模拟学习方法，即标准的多分类损失函数分别训练通道剪枝后模型和通道剪枝并量化模型，训练的超参数与本研究的训练超参数一致，与本研究模型进行对比实验。从表2可见：在不同的剪枝率的情况下，本研究模型与其他模型压缩方法相比均具有更高的模型压缩率和识别准确率，而且压缩率越高，识别准确率相比其他方法提升越明显，能更好识别植物病害类别并部署于边缘设备。
表 2 不同压缩方法边缘端模型植物病害识别结果Table 2 Plant disease recognition results of models on the edge compressed by different methods剪枝率/% 参数量/M 边缘端模型 精度/bit 压缩率/倍 准确率/% 70 0.91 剪枝+无模拟学习 32 3.6 95.48 剪枝+量化+无模拟学习 8 14.4 95.45 本研究模型 8 14.4 95.99 80 0.58 剪枝+无模拟学习 32 5.7 94.95 剪枝+量化+无模拟学习 8 22.8 94.92 本研究模型 8 22.8 95.55 90 0.23 剪枝+无模拟学习 32 14.3 93.40 剪枝+量化+无模拟学习 8 57.2 93.53 本研究模型 8 57.2 94.58 3. 结论
本研究针对边缘环境下计算资源的限制，在迁移学习训练的MobileNet模型基础上，联合使用2种压缩算法降低模型参数量和运算量，并结合模拟学习恢复识别精度，得到深度压缩的边缘端模型。在PlantVillage的实验结果表明：利用本研究方法对MobileNet进行不同程度的深度压缩，均能够大大减少网络计算量并保留原始识别能力。其中减少70%~90% FLOPs的模型，参数量压缩了3.6~14.3倍，再经过量化模拟学习后整体压缩率为14.4~57.2倍，准确率达到了95.99%~94.58%，较迁移学习训练的MobileNet模型仅降低0.24%~1.65%，同时还具有较高的鲁棒性，对不同植物的不同病害均具有较强的识别能力。实验结果证明了该压缩方法的可行性和有效性。
随着PlantVillage数据集的不断扩展，深度学习模型能更多更准地识别植物病害。本研究提出的模型构建方法可平衡识别的速度和精度，满足植物病害识别边缘部署的需求。
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图 1 土壤固氮菌(A)与植物固氮菌(B)nifH基因扩增
Figure 1 nifH gene’s PCR products of soil azotobacteria (A) and plant endophytic diazotrophs (B)
图 2 土壤固氮菌nifH基因片段DGGE指纹图谱(A)与聚类分析树(B)
Figure 2 The nifH gene DGGE fingerprint(A) and clustering analysis tree (B) of soil azotobacteria
图 3 竹子叶与根内生固氮菌nifH基因DGGE指纹图谱(A)与聚类分析树(B)
Figure 3 DGGE fingerprint of nifH gene endophytic diazotroph(A) and clustering analysis tree (B) in bamboo’s leaves and roots
图 4 邻接法构建的内生固氮菌序列系统发育树
Figure 4 System phylogenetic tree of endophytic diazotrophs by using neighbor-joining method
表 1 3种土壤的基本化学性质
Table 1. Basic chemical properties of three soil
种类 pH 有机质/(g·kg−1) 有效氮/(mg·kg−1) 速效磷/(mg·kg−1) 速效钾/(mg·kg−1) 毛竹 4.32±0.24 a 33.01±7.04 a 58.20±16.46 a 5.40±0.85 a 79.00±8.80 a 孝顺竹 4.64±0.27 a 36.85±10.81 a 66.14±14.46 a 4.99±0.61 a 69.33±17.02 a 狭叶青苦竹 4.72±0.54 a 37.67±9.16 a 57.34±15.63 a 4.65±0.94 a 70.67±4.50 a 说明：同列相同字母表示差异不显著(P＞0.05) 
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表 2 不同来源固氮菌Shannon多样性分析
Table 2. Shannon indexes of the three bamboos’ leaves, roots and soil
种类 叶部 根部 土壤 狭叶青苦竹 2.43±0.30 Bb 2.89±0.12 ABa 2.36±0.09 Bb 毛竹 2.30±0.28 Bb 2.98±0.19 Aa 2.75±0.17 Aa 孝顺竹 2.73±0.10 Aa 2.53±0.26 Ba 2.70±0.15 Aa 说明：大写字母表示同列间差异显著(P＜0.05)，小写字母 表示同行间差异显著(P＜0.05)
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表 3 基于nifH序列的不可培养固氮菌分布情况(相似度98%以上)
Table 3. Distribution of unculturable bacteria based on nifH gene (The similarity is more than 98%)
样品来源 相似菌种基因 毛竹叶 HP-46 nitrogenase (nifH) gene、HP-76 nitrogenase (nifH) gene、nifH gene for nitrogenase iron protein、nitrogen-
fixingbacteriumcloneb1 -HA3-1nitrogenase iron protein (nifH) gene、isolate DGGE gel band 5 nitrogenase iron protein (nifH)
gene、J19I(16) nitrogenase (nifH) gene、HP-12 nitrogenase (nifH) gene、TNO_elv_99f12 dinitrogenase reductase (nifH) gene毛竹根 nifH gene for nitrogenase iron protein、HP-27 nitrogenase (nifH) gene、HP-84 nitrogenase
(nifH) gene、HP-84 nitrogenase (nifH) gene、CI(12) nitrogenase (nifH) gene、HP-14 nitrogenase (nifH) gene、TII(5) nitrogenase
(nifH) gene、HP-48 nitrogenase (nifH) gene、HP-75 nitrogenase (nifH) gene、J19I(12) nitrogenase (nifH) gene、TNO_elv_81h1
dinitrogenase reductase (nifH) gene、TNO_elv_81h1 dinitrogenase reductase (nifH) gene、HP-46 nitrogenase (nifH) gene、HP-75
nitrogenase (nifH) gene孝顺竹叶 HP-215 nitrogenase (nifH) gene、HP-5 nitrogenase (nifH) gene、HP-218 nitrogenase (nifH) gene、CY1-01 nitrogenase iron
protein (nifH) gene、HP-56 nitrogenase (nifH) gene、HP-226 nitrogenase (nifH) gene、HP-157 nitrogenase (nifH) gene孝顺竹根 isolate DGGE gel band 18 nitrogenase iron protein (nifH) gene、isolate DGGE gel band 12 nitrogenase iron protein (nifH) gene、
HP-226 nitrogenase (nifH) gene、partial nifH gene for dinitrogenase reductase、HP-90 nitrogenase (nifH) gene、partial nifH
gene for dinitrogenase reductase、HP-237 nitrogenase (nifH) gene、HP-246 nitrogenase (nifH) gene、HP-246 nitrogenase
(nifH) gene、HP-51 nitrogenase (nifH) gene、C13L7NH26 dinitrogenase reductase (nifH) gene、isolate DGGE gel band 20
nitrogenase iron protein (nifH) gene、b1-HA3-1 nitrogenase iron protein (nifH) gene、431 nitrogenase iron protein (nifH) gene狭叶青苦竹叶 TC30 NifH (nifH) gene、C12L6CK9 dinitrogenase reductase (nifH) gene、C13L6NH2 dinitrogenase reductase (nifH) gene、
C12L7NH35 dinitrogenase reductase (nifH) gene、nifH gene for nitrogenase iron protein(partial cds)、C13L10NH15
dinitrogenase reductase (nifH) gene、C13L8CK17 dinitrogenase reductase (nifH) gene、HP-75 nitrogenase (nifH) gene狭叶青苦竹根 isolate DGGE gel band 14 nitrogenase iron protein (nifH) gene、Rb3_NifH_48 nitrogenase gene、C12L8CK4 dinitrogenase
reductase (nifH) gene、WK-A5 nitrogenase iron protein (nifH) gene、486 nitrogenase iron protein (nifH) gene、C13L8NL22
dinitrogenase reductase (nifH) gene、C13L6CK40 dinitrogenase reductase (nifH) gene、99 nitrogenase iron protein (nifH)
gene、HP-201 nitrogenase (nifH) gene、HP-2 nitrogenase (nifH) gene、243 nitrogenase iron protein (nifH) gene、
C12L10NL20 dinitrogenase reductase (nifH) gene、C13L10NL22 dinitrogenase reductase (nifH) gene、isolate DGGE gel band
11 nitrogenase iron protein (nifH) gene、C12L7CK25 dinitrogenase reductase (nifH) gene、HP-159 nitrogenase (nifH) gene、
HP-215 nitrogenase (nifH) gene、HP-90 nitrogenase (nifH) gene、C12L7NH35 dinitrogenase reductase (nifH) gene、
b1-HA3-1 nitrogenase iron protein (nifH) gene
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表 4 基于nifH序列的可培养固氮菌分布情况
Table 4. Distribution of culturable bacteria of nifH gene
类群 样品来源 NCBI中最相近菌种(登录号) 序列相似性/% 慢生根瘤菌属 Bradyrhizobium MG38 Bradyrhizobium sp.(KC356360.1) 98 QG11 Bradyrhizobium sp.(AB079616.1) 99 QG255 Bradyrhizobium sp.(LT859959.1) 99 XG32 Bradyrhizobium sp.(CU234118.1) 99 Dechlorosoma MG31 Dechlorosoma suillum(CP003153.1) 98 固氮螺菌属 Azospirillum XG434 Azospirillum canadense strain(GU256446.1) 99 肠杆菌属 Enterobacter XY47 Enterobacter sp.(KC989924.1) 99 Kosakonia MG6 Kosakonia sacchari strain(KR075981.1) 99 XG52 Kosakonia sacchari strain(KR075959.1) 99 变形杆菌属 Gammaproteobacteria XG255 Immundisolibacter cernigliae strain (CP014671.1) 99 红长菌属 Rubrivivax MG16 Rubrivivax gelatinosus strain(KF800058.1) 98 Azohydromonas XG66 Azohydromonas australica(AB188121.1) 100
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