3种竹子内生固氮菌特征及多样性

冯歌林; 高竞; 严淑娴; 王晶; 梁辰飞; 秦华; 陈俊辉; 徐秋芳

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.20190586

3种竹子内生固氮菌特征及多样性

DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20190586

冯歌林^{1, 2,},
高竞^{1, 2},
严淑娴^{1, 2},
王晶^{1, 2},
梁辰飞^{1, 2},
秦华^{1, 2},
陈俊辉^{1, 2},
徐秋芳^{1, 2, ,}

1.
浙江农林大学环境与资源学院，浙江杭州 311300
2.
浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江杭州 311300

基金项目: 浙江省自然科学基金重点资助项目(LZ16C160002)；国家自然科学基金资助项目(31570602)

详细信息

作者简介: 冯歌林(ORCID: 0000-0002-3069-0810)，从事农业资源与环境研究。E-mail: 492644070@qq.com

通信作者: 徐秋芳(ORCID: 0000-0002-0959-8577)，教授，博士，博士生导师，从事土壤与植物微生物研究。E-mail: xuqiufang@zafu.edu.cn

中图分类号: S718.8

Characteristics and diversity of endophytic diazotrophs in three bamboo species

FENG Gelin^{1, 2
,},
GAO Jing^{1, 2},
YAN Shuxian^{1, 2},
WANG Jing^{1, 2},
LIANG Chenfei^{1, 2},
QIN Hua^{1, 2},
CHEN Junhui^{1, 2},
XU Qiufang^{1, 2
, ,}

1.
College of Environment and Resources, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China
2.
State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China

摘要: 目的了解不同竹子内生固氮菌及其定殖土壤根区固氮菌的特征和生物多样性。方法以毛竹Phylloslachys edulis、狭叶青苦竹Pleioblastus chino、孝顺竹Bambusa multiplex叶部、根部及定植土壤为对象，设计nifH固氮基因引物，采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和随机克隆技术，通过聚类分析、Shannon多样性指数分析构建系统发育树。结果不同竹子根区土壤之间、同一竹种根部与叶部之间、不同竹种同一器官之间、根区土壤与植物之间的固氮菌群落结构差异明显，同一竹种叶部或根部的重复样品相似度均不高；根部内生固氮菌种类总体多于叶部，土壤固氮菌与根部内生固氮菌相似度高于叶部。不同竹种不同器官间固氮菌Shannon多样性指数差异显著，孝顺竹叶部(2.73)与土壤(2.70)大于根部(2.53)(P＜0.05)，狭叶青苦竹根部和毛竹根部大于叶部和土壤(P＜0.05)。植物样品随机克隆测序对比得到83株固氮菌，仅12株为可培养固氮菌株，分别属于慢生根瘤菌属Bradyrhizobium、Dechlorosoma、固氮螺菌属Azospirillum、肠杆菌属Enterobacter、Kosakonia、变形杆菌属Gammaproteobacteria、红长菌属Rubrivivax和Azohydromonas。系统发育树结果表明：3种竹子内生固氮菌明显不同于其他植物。结论土壤环境、竹子种类及组织器官均能影响竹子内生固氮菌的结构特征和多样性，定殖于根部的内生固氮菌多样性显著高于叶部。3种竹子内生固氮菌种类与已报道的禾本科Gramineae植物差异显著。图4表4参30
- 竹子 /
- 内生固氮菌 /
- PCR-DGGE /
- 聚类分析 /
- Shannon多样性指数 /
- 随机克隆 /
- 系统发育树
Abstract: Objective The objective is to investigate the characteristics and biodiversity of endophytic diazotrophs in three bamboo species and in planting soil of root zones. Method Samples of leaves, roots and planting soil from Phyllostachys edulis, Bambusa multiplex and Pleioblastus chino were taken as the objects. The primers of nifH nitrogen fixation gene were designed. PCR-DGGE and random cloning technology were used to construct phylogenetic tree by cluster analysis and Shannon diversity index analysis. Result There were significant differences in community structure of diazotrophs among soils, between roots and leaves of the same bamboo species, between the same organs of different bamboo species, and between the soils of root zones and plants. The similarity of the same bamboo leaf or root was not high. More endophytic diazotrophs were detected in roots than in corresponding leaves. The similarity between diazotrophs in soil and those in roots was higher than that between soil and leaves. Significant differences of diazotrophs among plant species and plant tissues were observed by Shannon diversity index. The Shannon diversity index in leaf (2.73) and soil (2.70) of B. multiplex was higher than that in root (2.53) (P＜0.05), and that in roots of P. chino and Ph. edilus was higher than that in leaf and soil (P＜0.05). 83 strains of diazotrophs were obtained by random cloning and sequencing of plant samples, and only 12 strains were culturable, belonging to Bradyrhizobium, Dechlorosoma, Azospirillum, Enterobacter, Kosakonia, Gammaproteobacteria, Rubrivivax and Azohydromonas. The sequences of phylogenetic tree indicated that the endophytic diazotrophs in the three bamboo species differed greatly from those in other plants. Conclusion The structural characteristics and diversity of diazotrophs in bamboo are affected by soil properties, species and plant tissues. The diversity of endophytic diazotrophs in roots is significantly higher than that in leaves, and the corresponding taxa are distinct from those of Gramineae reported previously. [Ch, 4 fig. 4 tab. 30 ref.]
- bamboo /
- endophytic diazotroph /
- PCR-DGGE /
- cluster analysis /
- Shannon diversity index /
- random cloning /
- phylogenetic tree

林分郁闭度是指林木树冠垂直投影面积占林地总面积的比例，是反映林分密度的重要指标，在森林资源调查中尤为重要。在传统的森林资源调查中，获取林分郁闭度的主要方法为抬头望法，该方法耗时耗力，获取的数据精度较低，且只适用于面积小、地势缓的林地，难以在地理环境复杂的大区域内应用。随着数字成像技术的发展，HERBERT^[1]提出利用鱼眼相机拍摄全天空相片进行郁闭度估测，扩大了拍摄的林冠范围；濮毅涵等^[2]基于普通可见光照片中的树叶、树干和天空进行分类，将估测结果与抬头望法结果进行模型比较，得到决定系数(R²)为0.77，但该方法适用于地形平坦的林区，在地形复杂的山地难以应用。为克服地形因子的限制，不少学者基于卫星遥感影像对乔木林林分郁闭度的提取进行了研究。高云飞等^[3]基于SPOT 5影像，对各波段的遥感影像像元亮度值进行组合，建立反演模型，最终得到最佳组合模型的R²为0.66；李擎等^[4]为提高模型精度，基于高分二号(GF-2)遥感影像，结合光谱信息、纹理特征和地形因子构建郁闭度估测模型，模型精度达89.82%。然而卫星遥感成本高、时效低、灵活性低^[5]，相比之下无人机可见光遥感在中小型遥感区域作业中能发挥更大的优势，满足动态森林资源监测的条件和需求，并提供更多可能性^[6-8]。苏迪等^[9]基于无人机可见光影像，利用主成分分析确定模型的主成分变量，建立郁闭度回归方程，估算精度为83.18%；汪霖^[10]结合无人机可见光影像得到的数字正射影像(DOM)和冠层高度模型(CHM)，使用阈值法对树冠区域进行提取并计算郁闭度，平均精度为92.93%。以上关于乔木林分郁闭度遥感估测的研究都取得了一定的成果，能够满足林业调查需求，然而，目前基于无人机可见光影像的毛竹林林分郁闭度估测研究为数不多。

毛竹作为中国南方重要的笋、竹两用竹种，是最重要的森林资源之一。第九次全国森林清查结果显示：毛竹林面积为467 hm²，占竹林总面积的73%^[11]。由于毛竹林的生长特点(扩鞭)^[12-13]和经营特点(择伐)，使得林分郁闭度在毛竹林经营中尤为重要，出笋率和采伐结果都将反映在郁闭度上，只有保持适宜毛竹生长的郁闭度，才能提高毛竹生产力。毛竹林多分布在山地丘陵地区，传统的实地调查工作量大、效率低、工作周期长、精确度低。随着无人机技术的发展，无人机林业遥感为实现低成本、高时效、高分辨率、高灵活性的动态森林资源监测提供了技术基础。基于无人机和图像识别技术的单木树冠提取已有一定进展。然而相比其他乔木林，毛竹林竹冠具有特殊性，分为钩梢与未钩梢2种形态，且竹冠鲜少呈单个状态，具有“重叠性”，目前还没有利用现有方法直接获取单株毛竹竹冠的研究。本研究对无人机可见光影像的毛竹林郁闭度估测方法进行了分析，以期为快速获取毛竹林的郁闭度提供参考。

1. 研究区概况与研究方法

1.1 研究区概况

研究区位于浙江省湖州市安吉县(30°23′~30°53′N，119°14′~119°53′E)，该区地处长江三角洲腹地，属于亚热带季风气候，植被类型为亚热带常绿阔叶林，年均气温为12.2~15.6 ℃，年均降水量为1 100~1 900 mm。研究区内光照充足，雨量充沛，竹资源丰富，竹林总面积达757 km²，占森林面积56.47%，其中毛竹占79.30%，被誉为“中国竹乡”。

1.2 数据获取

1.2.1 样地划分与地面数据获取

根据是否钩梢和郁闭度2个因素选设样地，共调查36个10 m×10 m的样地，其中已钩梢毛竹林样地24个，未钩梢毛竹林样地12个。利用研究区数字正射影像目视解译获得毛竹林的郁闭度，未钩梢样地为抛荒毛竹林，处于无人经营状态，郁闭度均大于0.9，故在本研究中不再细分郁闭度等级。样地基本情况见表1。

表 1 毛竹林样地基本情况

Table 1 Basic information of plot sites

类型	郁闭度	样地/ 个	平均胸径/cm	平均树高/m	坡度/ (°)	坡向
钩梢	0~0.7	13	8.91	9.9	11.6	北坡
钩梢	0.7~0.8	8	9.03	9.4	16.1	西北坡
钩梢	0.8~1.0	3	8.65	9.2	13.3	北坡
未钩梢		12	8.58	9.6	17.1	东南坡

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1.2.2 无人机系统及数据采集

数据采集所用无人机遥感系统为大疆Phantom 4 RTK,飞行系统包括3部分：飞行器、云台相机和遥控器。飞行器提供多方位视觉系统，可稳定飞行和精准悬停，进行航点飞行作业；机身装备机载D-RTK，可提供厘米级高精度准确定位，实现更精准的测绘作业。Phantom 4 RTK配备24 mm广角相机、高精度防抖云台及图像传感器、机械快门，确保成像效果。遥控器的主要功能包括作业设计、远距离信号传输和航拍高清画面实时监测等。

2020年11月18日14:00—15:00，天气晴朗、无风、无云，采用大疆Phantom 4 RTK搭载光学相机对选定研究区域进行拍摄。无人机飞行高度为160 m，飞行范围东西走向为222.82 m，南北走向为106.28 m，航向重叠率为90%，旁向重叠率为80%，飞行路线设计为“S”型路线。拍摄共得原始照片142张，空间分辨率为3.36 cm，照片共3波段：红波段(R)、绿波段(G)、蓝波段(B)。

1.2.3 影像预处理

使用大疆智图软件对无人机所获取照片进行图像处理，通过三维重建技术，生成带有空间参考信息的数字表面模型(DSM)和色调自然、无明显接痕的正射影像图。图像处理的主要流程包括：①数据预处理，对照片进行校验、筛选、对齐，剔除一些无法进行后续合成的照片；②空三加密，通过空三计算得到密集点云和纹理；③生成网格，得到带空间参考信息的数字表面模型和数字正射影像。

1.3 研究方法

1.3.1 多尺度分割

在毛竹林高分辨率遥感影像中，由于影像信息太多、林间空隙太杂，经常会产生“同物异谱”和“同谱异物”现象，而在分类前执行分割能有效解决该问题^[14-16]。

多尺度分割是从任意一像元开始，自下而上进行合并的一种分割手段，其参数设置包括分割尺度、形状因子和紧致度因子。其中形状因子的取值为[0，1]，它包含了形状和光谱2个方面的意义，取值越大，表示在同质性标准中形状因子所占比例越高，光谱因子所占比例就越低，反之亦然。紧致度因子包含紧致度和光滑度，两者权重之和也为“1”。分割尺度作为各参数中最重要的一项，决定了分割所得的多边形对象内部的异质性，分割尺度越大，所生成的对象面积就越大，数目就越少，反之亦然^[17]。本研究采用eCognition软件中的Estimation of Scale Paramater 2(ESP2)插件来确定分割尺度，通过设置一系列的参数进行迭代，计算局部方差以及局部方差变化率(R_OC)^[18-19]，R_OC=[V_L−(V_L−1)]/(V_L−1)×100。其中：V_L表示尺度为L时分割结果中所有对象局部方差值的方差；V_L−1表示尺度为L−1时分割结果中所有对象局部方差值的方差。

本研究对不同类型的毛竹林进行不同参数组合实验，得到不同毛竹林的最优参数组合(表2)。

表 2 不同毛竹林的最优参数组合

Table 2 Optimal parameter combination of different Moso bamboo stands　　　　　

类型	郁闭度	分割尺度	形状因子	紧致度因子
	0~0.7	29	0.3	0.5
钩梢	0.7~0.8	31	0.3	0.5
	0.8~1.0	29	0.3	0.5
未钩梢		41	0.3	0.5

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1.3.2 分类

①基于像元的阈值分类(TP)。通过设定不同的特征阈值，将图像分为若干类。常用的特征值包括2类：直接来自于原始图像的灰度或彩色特征和由原始灰度或彩色值变换得到的特征值。基于无人机影像的毛竹林竹冠区域阈值分类的关键在于选取能有效区分竹冠与非竹冠的最优阈值。通过选取竹冠与非竹冠的样点，得到各样点的阈值，统计不同阈值所包含的像元数目，绘成具有明显峰值与谷值的曲线图^[20-21]。2个峰值对应位置分别为竹冠与非竹冠的典型特征值，谷值为竹冠与非竹冠交界处对应的特征值，也就是最优阈值(图1)。

图 1 双峰法最优阈值示意图

Figure 1 Schematic diagram of the double peak threshold method

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特征值的选取对提取精度至关重要，本研究使用ENVI软件对数字正射影像中的红、绿、蓝波段进行主成分分析，得到红光和绿光波段包含98%以上的信息量，故选取由红、绿波段变换得到的归一化绿红差异指数(I_NGRD)为特征值^[22-23]，在MATLAB中对竹冠区域进行提取，表达式为I_NGRD=(G−R)/(G+R)。其中R为红光波段，G为绿光波段。②基于像元的监督分类(SP)。根据已知训练区提供的样本，选取并求出特征参数作为决策规则，建立判别函数对各类图像进行分类的一种方法。本研究建立竹冠区与非竹冠区2种样本，并在ENVI软件中选择最大似然法作为分类算法进行竹冠区域提取，该方法根据训练样本的均值和方差，评价待分类像元和训练样本之间的相似性进而分类，可同时考虑2个以上的波段和类别。③基于多尺度分割的阈值分类(TM)。与传统基于像元的分类不同，基于多尺度分割的阈值分类是一种面向对象分类，其分类的基本单元为影像对象，基本内容分为影像分割与影像分类2个独立模块。结合了多尺度分割的分类方法，在精确分类的同时，很好地兼顾了地物的宏观尺度和微观特征，极大地消除了传统分类带来的“椒盐效应”。在分割的基础上，本研究使用I_NGRD对竹冠区域进行阈值提取。④基于多尺度分割的监督分类(SM)。该分类也是在多尺度分割的基础上，基于对象进行监督分类。本研究通过eCognition软件进行多尺度分割，并选择最邻近值分类法进行分类提取，该方法通过均匀地选择样本，建立训练集，统计样本的特征信息，通过计算未分类对象与样本之间的距离进行分类，并提取竹冠区域。

1.3.3 郁闭度计算

郁闭度是指树冠的总垂直投影面积(m²)与该样方的总面积(m²)之比，反映林分的密度和林分光能利用程度，是抚育间伐的重要指标，郁闭度=总冠幅/样方总面积。

1.3.4 精度评价

在无人机影像的基础上，根据竹冠部分的亮度、纹理和阴影等特征，在ArcGIS软件中对各个小样地进行目视解译，并以目视解译的结果作为真值对4种方法进行精度评价^[24]。分别用正确识别的竹冠总面积(A_C，m²)、真实的竹冠总面积(A_R，m²)、识别的竹冠面积(A_D，m²)、正确识别的非竹冠面积(A_N，m²)、样地面积(A_S，m²)、真实郁闭度(R_D)、分类结果得到的郁闭度(D_C)等7个指标进行精度和误差的计算。总体精度(O_A)=(A_C+A_N)/A_S×100%；用户精度(U_A)=A_C/A_D×100%；生产者精度(P_A)=A_C/A_R×100%；郁闭度误差(D_E)=|R_D−D_C|。

1.3.5 单因素方差分析

使用SPSS 25.0对各样地的总体精度、用户精度、生产者精度、郁闭度误差进行统计分析，采用单因素方差分析法(one-way ANOVA)进行显著性检验，采用LSD法进行多重比较分析(P=0.05)，文中数据为平均值±标准差。

2. 结果与分析

2.1 毛竹林竹冠区域提取

从图2可见：无论是在钩梢毛竹林还是未钩梢毛竹林中，基于像元的阈值分类法的结果存在较多错分和漏分的情况，且提取结果存在“碎片化”情况。基于像元的监督分类法的漏分情况较少，但存在较多的错分且提取结果呈“碎片化”；基于多尺度分割的阈值分类法提取的树冠存在较严重的错分和漏分情况；基于多尺度分割的监督分类法基本解决了树冠提取结果“碎片化”的问题，提高了所提取树冠的整体性，减少了错分和漏分的情况。从表3可以看出：基于多尺度分割的监督分类法的总体精度、生产者精度和用户精度都显著高于其他3种方法(P＜0.05)；基于多尺度分割的监督分类法郁闭度误差最小，为0.004，显著低于其他3种方法(P＜0.05)，表明使用基于多尺度分割的监督分类法提取毛竹林郁闭度的结果明显优于其他3种方法。

图 2 不同方法提取竹冠效果对比示意图

Figure 2 Comparison of the bamboo crown extraction results with different methods

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表 3 不同方法的毛竹林竹冠提取精度及郁闭度误差对比

Table 3 Bamboo crown extraction accuracy and canopy density error of different methods

方法	总体精度/%	生产者精度/%	用户精度/%	郁闭度误差
TP	91.81±3.08 c	93.34±3.37 c	96.24±2.03 b	0.038±0.026 c
SP	92.96±3.66 bc	95.47±3.29 b	95.64±2.64 b	0.030±0.026 ab
TM	93.47±2.53 b	96.10±2.24 b	95.57±2.57 b	0.024±0.018 b
SM	98.86±0.53 a	99.15±0.40 a	99.36±0.53 a	0.004±0.003 a
说明：同列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)

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2.2 钩梢与未钩梢对毛竹林竹冠区域和郁闭度提取精度的影响

如表4所示：在基于多尺度分割的监督分类法中，是否钩梢对总体精度均没有显著影响，说明基于多尺度分割的监督分类法对钩梢和未钩梢毛竹林均适用；在其他3种方法中，钩梢毛竹林总体精度显著高于未钩梢毛竹林，说明这3种方法更适用于钩梢毛竹林。无论是钩梢林分，还是未钩梢林分，基于多尺度分割的监督分类法的总体精度均显著高于其他3种方法(P＜0.05)。

表 4 4种方法下钩梢和未钩梢毛竹林竹冠区域的提取精度

Table 4 Extraction accuracy of the four methods with truncation and non-truncation

类型	方法	总体精度/%	生产者精度/%	用户精度/%
钩梢	TP	92.82±2.57 Ab	93.85±3.11 Ac	95.96±2.32 Ab
	SP	93.95±2.74 Ab	96.67±1.39 Ab	95.00±2.98 Ab
	TM	94.05±2.25 Ab	96.15±2.04 Ab	95.49±2.90 Ab
	SM	98.9±0.59 Aa	99.14±0.45 Aa	99.27±0.61 Aa

未钩梢	TP	89.80±3.12 Bb	92.33±3.77 Ac	96.81±1.15 Ab
	SP	90.97±4.52 Bb	93.07±4.57 Bc	96.92±0.98 Bb
	TM	92.30±2.77 Bb	96.01±2.70 Ab	95.73±1.81 Ac
	SM	98.78±0.37 Aa	99.16±0.29 Aa	99.55±0.22 Aa
说明：同列不同小写字母表示相同林分类型在不同方法之　　　　　间差异显著(P＜0.05)；同列不同大写字母表示相同　　　　　方法在不同林分类型之间差异显著(P＜0.05)

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从表5可见：基于多尺度分割的监督分类法所得到的郁闭度误差最小，在钩梢林分中仅为0.003，在未钩梢林分中仅为0.004，显著低于其他3种方法(P＜0.05)。在基于多尺度分割的监督分类法和基于多尺度分割的阈值分类法中，是否钩梢对郁闭度误差没有显著影响；在基于像元的监督分类法和基于像元的阈值分类法中，钩梢毛竹林的郁闭度误差显著低于未钩梢毛竹林(P＜0.05)。

表 5 4种方法下钩梢和未钩梢毛竹林的郁闭度误差

Table 5 Canopy density error of the four methods with truncation and non-truncation

类型	方法	郁闭度误差	类型	方法	郁闭度误差
钩梢	TP	0.029±0.021 Ab	未钩梢	TP	0.052±0.029 Bc
	SP	0.023±0.015 Ab		SP	0.042±0.039 Bbc
	TM	0.022±0.016 Ab		TM	0.026±0.023 Ab
	SM	0.003±0.003 Aa		SM	0.004±0.003 Aa
说明：同列不同小写字母表示相同林分类型在不同方法之　　　　　间差异显著(P＜0.05)；同列不同大写字母表示相同　　　　　方法在不同林分类型之间差异显著(P＜0.05)

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2.3 郁闭度对毛竹林竹冠区域提取精度的影响

从表6可见：4种方法对不同郁闭度毛竹林的总体精度均没有显著影响，说明这4种方法在不同郁闭度的毛竹林中均适用。

表 6 不同方法下郁闭度对毛竹林竹冠提取精度的影响

Table 6 Effect of canopy density on the extraction accuracy under different methods

郁闭度	方法	总体精度/%	生产者精度/%	用户精度/%
0~0.7	TP	93.70±2.44 Ab	95.04±2.50 Ab	95.26±2.69 Ab
	SP	94.98±2.11 Ab	97.02±1.37 Ab	95.33±2.90 Ab
	TM	93.89±2.66 Ab	96.15±2.52 Ab	94.70±3.32 Ab
	SM	98.82±0.69 Aa	99.11±0.53 Aa	99.09±0.68 Aa

0.7~0.8	TP	92.21±2.65 Ab	92.43±3.83 Ac	97.03±1.68 Ab
	SP	93.62±4.31 Ab	96.97±1.43 Ab	95.22±4.78 Ab
	TM	92.71±1.40 Ab	96.11±1.43 Ab	95.19±1.90 Ab
	SM	98.88±0.48 Aa	99.08±0.32 Aa	99.42±0.48 Aa

0.8~1.0	TP	90.68±1.46 Ac	92.46±1.39 Ac	96.14±0.74 Ab
	SP	93.62±4.31 Ab	96.97±1.43 Ab	95.22±4.78 Ab
	TM	92.71±1.40 Ab	96.11±1.43 Ab	95.19±1.90 Ab
	SM	99.28±0.33 Aa	99.48±0.22 Aa	99.66±0.33 Aa
说明：同列不同小写字母表示相同郁闭度在不同方法之　　　　　间差异显著(P＜0.05)；同列不同大写字母表示相同　　　　　方法在不同郁闭度之间差异显著(P＜0.05)

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3. 讨论

本研究4种方法提取的毛竹林竹冠区域精度均在90%以上，而汪霖等^[25]通过提取单个树冠面积，得到提取树冠区域的总体精度为93.09%，高于本研究基于像元的阈值分类法和基于像元的监督分类法，但低于基于多尺度分割的阈值分类法和基于多尺度分割的监督分类法，证明在分类前执行分割能有效提高提取精度。4种方法在竹冠区域提取精度上，基于像元的提取精度小于基于多尺度的提取精度。可能是相比于乔木林，毛竹林由于其扩鞭生长的特殊性，竹冠部分难以单个呈现，具有很强的整体性，使用传统基于像元的提取方法难以达到对整体性的要求。基于多尺度分割的监督分类法表现最好的原因是在保证对象内部同质性最大的基础上进行的分类，且结合了光谱、纹理等信息进行分类，分类依据更全面；而相较于基于多尺度分割的监督分类法，基于多尺度分割的阈值分类法由于分类规则只基于光谱信息，较为单一，故精度较低。

在基于像元的阈值分类法、基于像元的监督分类法和基于多尺度分割的阈值分类法中，是否钩梢对竹冠区域提取的影响存在较大影响。其一是由于未钩梢毛竹林郁闭度过高，林隙较小且颜色与竹冠接近，导致光学影像的饱和度增高，对特征量的敏感度随之下降，造成误差^[26-27]；其二是由于未钩梢毛竹林一般处于无人经营状态，存在毛竹倒伏现象和新老竹之间的光谱差异，造成误差。但是，基于多尺度分割的监督分类法则不受毛竹林是否钩梢的影响，其原因是多尺度分割得到内部同质性最大、外部同质性最小的斑块，很好保留了分类必需的有效信息，且避免了高分辨率影像中过于丰富的光谱与纹理信息所带来的干扰，减少错分与漏分的情况，基于此进行的监督分类能在保证竹冠整体性的前提下，通过训练样本分别提取钩梢与未钩梢毛竹林的特征参数，从而提取毛竹林竹冠区域。

在4种方法中郁闭度对竹冠区域的提取均不存在显著影响，说明4种方法对不同郁闭度的毛竹林竹冠提取都有较好的适用性。原因是不同郁闭度的毛竹林遥感影像的光谱与纹理特征差别不大，这4种方法都足以从影像中提取稳定的特征量对竹冠区域进行提取。

就郁闭度估测结果而言，4种方法提取的郁闭度误差都小于0.04，其中基于多尺度分割的监督分类法的误差最低，郁闭度误差仅为0.004，说明基于无人机的可见光影像可以用于毛竹林的郁闭度提取，具有很高的应用价值。苏迪等^[9]基于冠层高度模型数据进行主成分确定自变量建立郁闭度模型，通过检验得到模型精度为83.18%，低于本研究的估测精度，说明基于影像提取的郁闭度优于建模所得的郁闭度。严羽^[28]使用标记控制分水岭算法对树冠区域与非树冠区域进行分割，基于分割得到的树冠区域面积与实测面积对比，得到郁闭度估测误差为2.33%，高于本研究基于像元的阈值分类法、基于像元的监督分类法和基于多尺度分割的阈值分类法，但低于基于多尺度分割的监督分类法。

4. 结论

在提取毛竹林竹冠区域和郁闭度的中，本研究基于像元的阈值分类、基于像元的监督分类、基于多尺度分割的阈值分类、基于多尺度分割的监督分类等4种方法都达到了较高精度，其中基于多尺度分割的监督分类法的提取结果精度最高，竹冠区域总体精度为98.86%，郁闭度误差为0.004，显著优于其他3种方法，而且是否钩梢对于基于多尺度分割的监督分类法提取竹冠区域没有影响。在4种方法中，郁闭度对竹冠区域的提取均不存在显著影响。总体上，低廉轻便的无人机搭载可见光相机节省了大量的调查时间与精力，提高了调查效率与精度，可以用于大面积毛竹林竹冠区域和郁闭度的提取。

图 1 土壤固氮菌(A)与植物固氮菌(B)nifH基因扩增

Figure 1 nifH gene’s PCR products of soil azotobacteria (A) and plant endophytic diazotrophs (B)

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图 2 土壤固氮菌nifH基因片段DGGE指纹图谱(A)与聚类分析树(B)

Figure 2 The nifH gene DGGE fingerprint(A) and clustering analysis tree (B) of soil azotobacteria

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图 3 竹子叶与根内生固氮菌nifH基因DGGE指纹图谱(A)与聚类分析树(B)

Figure 3 DGGE fingerprint of nifH gene endophytic diazotroph(A) and clustering analysis tree (B) in bamboo’s leaves and roots

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图 4 邻接法构建的内生固氮菌序列系统发育树

Figure 4 System phylogenetic tree of endophytic diazotrophs by using neighbor-joining method

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表 1 3种土壤的基本化学性质

Table 1. Basic chemical properties of three soil

种类	pH	有机质/(g·kg⁻¹)	有效氮/(mg·kg⁻¹)	速效磷/(mg·kg⁻¹)	速效钾/(mg·kg⁻¹)
毛竹	4.32±0.24 a	33.01±7.04 a	58.20±16.46 a	5.40±0.85 a	79.00±8.80 a
孝顺竹	4.64±0.27 a	36.85±10.81 a	66.14±14.46 a	4.99±0.61 a	69.33±17.02 a
狭叶青苦竹	4.72±0.54 a	37.67±9.16 a	57.34±15.63 a	4.65±0.94 a	70.67±4.50 a
说明：同列相同字母表示差异不显著(P＞0.05)

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表 2 不同来源固氮菌Shannon多样性分析

Table 2. Shannon indexes of the three bamboos’ leaves, roots and soil

种类	叶部	根部	土壤
狭叶青苦竹	2.43±0.30 Bb	2.89±0.12 ABa	2.36±0.09 Bb
毛竹	2.30±0.28 Bb	2.98±0.19 Aa	2.75±0.17 Aa
孝顺竹	2.73±0.10 Aa	2.53±0.26 Ba	2.70±0.15 Aa
说明：大写字母表示同列间差异显著(P＜0.05)，小写字母　　　　　表示同行间差异显著(P＜0.05)

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表 3 基于nifH序列的不可培养固氮菌分布情况(相似度98%以上)

Table 3. Distribution of unculturable bacteria based on nifH gene (The similarity is more than 98%)

样品来源	相似菌种基因
毛竹叶	HP-46 nitrogenase (nifH) gene、HP-76 nitrogenase (nifH) gene、nifH gene for nitrogenase iron protein、nitrogen- 　fixingbacteriumcloneb1 -HA3-1nitrogenase iron protein (nifH) gene、isolate DGGE gel band 5 nitrogenase iron protein (nifH) 　gene、J19I(16) nitrogenase (nifH) gene、HP-12 nitrogenase (nifH) gene、TNO_elv_99f12 dinitrogenase reductase (nifH) gene

毛竹根	nifH gene for nitrogenase iron protein、HP-27 nitrogenase (nifH) gene、HP-84 nitrogenase 　(nifH) gene、HP-84 nitrogenase (nifH) gene、CI(12) nitrogenase (nifH) gene、HP-14 nitrogenase (nifH) gene、TII(5) nitrogenase 　(nifH) gene、HP-48 nitrogenase (nifH) gene、HP-75 nitrogenase (nifH) gene、J19I(12) nitrogenase (nifH) gene、TNO_elv_81h1 　dinitrogenase reductase (nifH) gene、TNO_elv_81h1 dinitrogenase reductase (nifH) gene、HP-46 nitrogenase (nifH) gene、HP-75 　nitrogenase (nifH) gene

孝顺竹叶	HP-215 nitrogenase (nifH) gene、HP-5 nitrogenase (nifH) gene、HP-218 nitrogenase (nifH) gene、CY1-01 nitrogenase iron 　protein (nifH) gene、HP-56 nitrogenase (nifH) gene、HP-226 nitrogenase (nifH) gene、HP-157 nitrogenase (nifH) gene

孝顺竹根	isolate DGGE gel band 18 nitrogenase iron protein (nifH) gene、isolate DGGE gel band 12 nitrogenase iron protein (nifH) gene、　HP-226 nitrogenase (nifH) gene、partial nifH gene for dinitrogenase reductase、HP-90 nitrogenase (nifH) gene、partial nifH 　gene for dinitrogenase reductase、HP-237 nitrogenase (nifH) gene、HP-246 nitrogenase (nifH) gene、HP-246 nitrogenase 　(nifH) gene、HP-51 nitrogenase (nifH) gene、C13L7NH26 dinitrogenase reductase (nifH) gene、isolate DGGE gel band 20 　nitrogenase iron protein (nifH) gene、b1-HA3-1 nitrogenase iron protein (nifH) gene、431 nitrogenase iron protein (nifH) gene

狭叶青苦竹叶	TC30 NifH (nifH) gene、C12L6CK9 dinitrogenase reductase (nifH) gene、C13L6NH2 dinitrogenase reductase (nifH) gene、　C12L7NH35 dinitrogenase reductase (nifH) gene、nifH gene for nitrogenase iron protein(partial cds)、C13L10NH15 　 dinitrogenase reductase (nifH) gene、C13L8CK17 dinitrogenase reductase (nifH) gene、HP-75 nitrogenase (nifH) gene

狭叶青苦竹根	isolate DGGE gel band 14 nitrogenase iron protein (nifH) gene、Rb3_NifH_48 nitrogenase gene、C12L8CK4 dinitrogenase 　reductase (nifH) gene、WK-A5 nitrogenase iron protein (nifH) gene、486 nitrogenase iron protein (nifH) gene、C13L8NL22 　dinitrogenase reductase (nifH) gene、C13L6CK40 dinitrogenase reductase (nifH) gene、99 nitrogenase iron protein (nifH) 　gene、HP-201 nitrogenase (nifH) gene、HP-2 nitrogenase (nifH) gene、243 nitrogenase iron protein (nifH) gene、　C12L10NL20 dinitrogenase reductase (nifH) gene、C13L10NL22 dinitrogenase reductase (nifH) gene、isolate DGGE gel band 　11 nitrogenase iron protein (nifH) gene、C12L7CK25 dinitrogenase reductase (nifH) gene、HP-159 nitrogenase (nifH) gene、　HP-215 nitrogenase (nifH) gene、HP-90 nitrogenase (nifH) gene、C12L7NH35 dinitrogenase reductase (nifH) gene、　b1-HA3-1 nitrogenase iron protein (nifH) gene

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表 4 基于nifH序列的可培养固氮菌分布情况

Table 4. Distribution of culturable bacteria of nifH gene

类群	样品来源	NCBI中最相近菌种(登录号)	序列相似性/%
慢生根瘤菌属 Bradyrhizobium	MG38	Bradyrhizobium sp.(KC356360.1)	98
	QG11	Bradyrhizobium sp.(AB079616.1)	99
	QG255	Bradyrhizobium sp.(LT859959.1)	99
	XG32	Bradyrhizobium sp.(CU234118.1)	99

Dechlorosoma	MG31	Dechlorosoma suillum(CP003153.1)	98

固氮螺菌属 Azospirillum	XG434	Azospirillum canadense strain(GU256446.1)	99

肠杆菌属 Enterobacter	XY47	Enterobacter sp.(KC989924.1)	99

Kosakonia	MG6	Kosakonia sacchari strain(KR075981.1)	99
Kosakonia	XG52	Kosakonia sacchari strain(KR075959.1)	99

变形杆菌属 Gammaproteobacteria	XG255	Immundisolibacter cernigliae strain (CP014671.1)	99

红长菌属 Rubrivivax	MG16	Rubrivivax gelatinosus strain(KF800058.1)	98

Azohydromonas	XG66	Azohydromonas australica(AB188121.1)	100

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图(4) / 表(4)

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1. 研究区概况与研究方法
1.1 研究区概况
1.2 数据获取
1.3 研究方法
2. 结果与分析
2.1 毛竹林竹冠区域提取
2.2 钩梢与未钩梢对毛竹林竹冠区域和郁闭度提取精度的影响
2.3 郁闭度对毛竹林竹冠区域提取精度的影响
3. 讨论
4. 结论

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植物内生固氮菌是指定殖在健康植物体内、与宿主植物进行联合固氮活动的一类原核微生物，是植物微生态系统的天然组分^[1]。研究发现^[2]：因为存在固氮菌，某些亚热带地区稻田可以连续百年不施氮肥而土壤氮水平不下降。固氮微生物一般分为3类：自生固氮菌、与植物共生固氮的微生物、与植物联合固氮的微生物。共生固氮微生物常见于豆科Leguminosae植物中^[3]，其固氮机制、菌肥开发等研究已相当成熟。联合固氮微生物最早由DÖBEREINER ^[4]从热带禾木科Gramineae牧草雀裨Paspalum thunbergii根际中分离获得，这种被命名为雀裨固氮菌Azotobacter paspali的微生物被认为是存在于根际的自由生活的固氮菌。它们可以部分入侵植物表层组织，依靠根系分泌物生存繁殖，不与宿主形成特异分化结构，因而固氮能力不及共生固氮菌，但这类固氮菌与植物关系密切。BARRAQUIO等^[5]通过建立有效的水稻Oryza sativa内生固氮菌分离方法，测得水稻内生固氮菌数量为10⁵~10⁸ CFU·g⁻¹；袁梅等^[6]从湖南桂阳农田水稻分离出19株内生固氮菌，其中13株可抑制水稻苗期对镉的吸收；谭志远等^[7]从青香茅Cymbopogon caesius与五节芒Miscanthus floridulus中分离出66株内生固氮菌共10个类群；BALDANI等^[8]发现玉米Zea mays茎内存在内生固氮菌肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae，后者具有促进植物生长的作用。作为同属禾本科的木本植物，竹子内生固氮菌的报道较少。竹子是喜氮植物，对氮素要求较高；调查发现许多自然竹林没有氮肥补充但生长良好，提示竹子可能存在某种固氮菌，且后者具有较强的固氮潜能。顾小平等^[9]从浙江淡竹Phyllostachys glauca根际分离到3株活性较高的固氮菌，从毛竹Phyllostachys edulis根表面分离到36株固氮菌，分别为多黏芽孢杆菌Bacillus polymyxa和地衣芽孢杆菌Baclicus lincheniformis ^[10]；侯伟等^[11]从簕竹Bambusa blumeana中分离到40株高效固氮酶活性菌株，分别属固氮螺菌属Azosprillum、大肠埃希氏菌属Escherichias、绿脓杆菌属Pseudomonas和水螺旋菌属Aquaspirillum；同时从簕竹^[12]中分离到5株内生固氮菌，具有活性高、生长强势、可以通过自身代谢作用来适应环境酸碱性变化等特征。目前，国内关于竹子内生固氮菌的研究甚少。本研究以毛竹 (散生)、孝顺竹Bambusa multiplex (丛生)和狭叶青苦竹Pleioblastus chino (混生)为研究对象，利用分子生物技术研究不同生长型竹子根部及叶部的内生固氮菌、定殖土壤固氮菌的多样性和结构特征，探究不同竹种和不同器官间内生固氮菌多样性，探讨植株与定殖土壤内固氮菌多样性的关系，为竹子培育管理提供指导，也为开发有潜力的高效固氮菌，减少化学氮肥施用量、解决因化肥使用过度所造成的环境污染问题提供参考。

1. 材料与方法

1.1. 样品采集

狭叶青苦竹、孝顺竹栽植于浙江农林大学竹种园内，毛竹栽植于浙江农林大学后山。所有林相均为纯林，所有土壤均为红黄壤。采集竹叶、细根及不同竹种根部定植土壤。被选植株要求生长力旺盛，远离边缘地带，未受到病虫害感染。每种竹子选取3株间隔约15 m的不同植株作为重复。土壤样品采自所选竹子根周，深度为0~30 cm。所有样品放入4 ℃冰箱保存备用。

1.2. 土壤基本化学性质测定

经风干、磨细、过筛后，测定土样土壤化学性质。具体参考鲍士旦^[13]的方法，测定土壤含水量、pH、有机质、有效氮、速效磷、速效钾等指标。由表1可知：3种竹子定植土壤的pH、有机质、有效氮、速效钾、速效磷等指标均未表现出显著性差异(P＞0.05)，说明土壤样品的化学性质差异不影响固氮菌种类。

表 1 3种土壤的基本化学性质

Table 1. Basic chemical properties of three soil

种类	pH	有机质/(g·kg⁻¹)	有效氮/(mg·kg⁻¹)	速效磷/(mg·kg⁻¹)	速效钾/(mg·kg⁻¹)
毛竹	4.32±0.24 a	33.01±7.04 a	58.20±16.46 a	5.40±0.85 a	79.00±8.80 a
孝顺竹	4.64±0.27 a	36.85±10.81 a	66.14±14.46 a	4.99±0.61 a	69.33±17.02 a
狭叶青苦竹	4.72±0.54 a	37.67±9.16 a	57.34±15.63 a	4.65±0.94 a	70.67±4.50 a
说明：同列相同字母表示差异不显著(P＞0.05)

1.3. 竹子内生微生物DNA提取

竹子叶与根的预处理参考谭致远等^[7]方法。叶与根灭菌消毒后，剪碎放入无菌研钵。用液氮充分研磨破碎植物样品，参考高志民等^[14]改良后的CTAB法提取植物内生微生物DNA，−40 ℃冰箱保存备用。

1.4. 土壤微生物DNA提取

土壤样品过20目筛，按Mobio土壤微生物DNA试剂盒(Powersoil kit，美国)提取土壤微生物DNA。

1.5. 固氮酶nifH基因扩增

固氮酶nifH基因采用聚合酶链式反应方法(PCR)扩增。第1轮正向引物FGPH19：5′-TACGGCAARGGTGGNATHG-3′，反向引物polR：5′-ATSGCATCATYTCRCCGGA-3′；第2轮正向引物AQER：5′-GACGATGTAGATYTCCTG-3′，反向引物polF-GC：5′-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3′。扩增程序参考DIALLO等^[15]。

1.6. 固氮酶nifH基因的变性梯度凝胶电泳(DGGE)

使用DCode^TM Universal Mutation Detection System (Bio-Rad，美国)对PCR产物进行变性梯度凝胶电泳，用GelDoc^TM EQ凝胶成像系统 (Bio-Rad，美国)拍照保存。

1.7. 固氮酶nifH基因的随机克隆

用polF(不含GC)与AQER引物扩增各竹种叶部、根部DNA，PCR产物用纯化试剂盒(Takara)纯化后与pEASY-T3 Vector(全金式生物技术公司，中国，北京)连接，转化到Trans1-T1感受态细胞中，涂在含有X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB琼脂平板上进行蓝白斑筛选，用菌落PCR方法检测阳性克隆子。阳性克隆菌液送上海生工生物技术公司进行测序，序列通过NCBI进行Blast比对分析，获取相近典型菌株序列^[16]。

1.8. 数据分析

利用Quantity one软件对DGGE电泳图进行指纹图谱分析，根据条带对比结果，通过未加权算术平均法进行聚类分析；计算Shannon多样性指数，使用SPSS软件进行单因素方差分析与两两比较(Ducan法)；使用Mega 5.0，采用邻接法进行系统发育树分析。

3. 结论

不同竹种定植的土壤中存在着一定数量的同种固氮菌，但整体区系的相似度不高。同一竹种不同器官(根与叶)之间、不同竹种相同器官之间、土壤与植物之间的固氮菌群落结构差异显著；同种竹叶部或根部的重复样品相似度均不高。3种竹子根部内生固氮菌种类总体显著多于叶部，土壤固氮菌群落结构与根部内生固氮菌相似度高于叶部；不同竹种、不同器官之间固氮菌群落Shannon多样性指数差异显著，孝顺竹叶部与土壤大于根部，狭叶青苦竹和毛竹根部大于叶部和土壤。植物样品随机克隆测序BLAST对比得到83株固氮菌，其中12株为可培养固氮菌株，分别属于慢生根瘤菌属、Dechlorosoma、固氮螺菌属、肠杆菌属、Kosakonia、变形杆菌属、红长菌属、Azohydromonas等8个属，与已报道对竹子内生固氮菌研究相比，仅与侯伟等^[12]从簕竹中分离得到了相同的固氮螺菌，但未发现其他相同种属。系统发育树结果表明3种竹子内生固氮菌显著不同于其他植物中分离得到的内生固氮菌。

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3种竹子内生固氮菌特征及多样性

DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20190586

作者简介: 冯歌林(ORCID: 0000-0002-3069-0810)，从事农业资源与环境研究。E-mail: 492644070@qq.com

通信作者: 徐秋芳(ORCID: 0000-0002-0959-8577)，教授，博士，博士生导师，从事土壤与植物微生物研究。E-mail: xuqiufang@zafu.edu.cn

Characteristics and diversity of endophytic diazotrophs in three bamboo species

1. 研究区概况与研究方法

1.1 研究区概况

1.2 数据获取

1.2.1 样地划分与地面数据获取

1.2.2 无人机系统及数据采集

1.2.3 影像预处理

1.3 研究方法

1.3.1 多尺度分割

1.3.2 分类

1.3.3 郁闭度计算

1.3.4 精度评价

1.3.5 单因素方差分析

2. 结果与分析

2.1 毛竹林竹冠区域提取

2.2 钩梢与未钩梢对毛竹林竹冠区域和郁闭度提取精度的影响

2.3 郁闭度对毛竹林竹冠区域提取精度的影响

3. 讨论

4. 结论

期刊类型引用(2)

其他类型引用(3)

计量

出版历程

3种竹子内生固氮菌特征及多样性

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20190586

1. 浙江农林大学 环境与资源学院，浙江 杭州 311300 2. 浙江农林大学 省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江 杭州 311300

作者简介: 冯歌林(ORCID: 0000-0002-3069-0810)，从事农业资源与环境研究。E-mail: 492644070@qq.com

通信作者: 徐秋芳(ORCID: 0000-0002-0959-8577)，教授，博士，博士生导师，从事土壤与植物微生物研究。E-mail: xuqiufang@zafu.edu.cn

English Abstract

Characteristics and diversity of endophytic diazotrophs in three bamboo species

1. College of Environment and Resources, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China 2. State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China

全文HTML

1.1. 样品采集

1.2. 土壤基本化学性质测定

1.3. 竹子内生微生物DNA提取

1.4. 土壤微生物DNA提取

1.5. 固氮酶nifH基因扩增

1.6. 固氮酶nifH基因的变性梯度凝胶电泳(DGGE)

1.7. 固氮酶nifH基因的随机克隆

1.8. 数据分析

2.1. 不同来源固氮菌PCR产物

2.2. 土壤固氮菌DGGE分析

2.3. 竹子根部与叶部内生固氮菌DGGE分析

2.4. 不同来源固氮菌Shannon多样性指数分析

2.5. 竹子根部与叶部内生固氮菌的随机克隆

目录

全文HTML

1.1. 样品采集

1.2. 土壤基本化学性质测定

1.3. 竹子内生微生物DNA提取

1.4. 土壤微生物DNA提取

1.5. 固氮酶nifH基因扩增

1.6. 固氮酶nifH基因的变性梯度凝胶电泳(DGGE)

1.7. 固氮酶nifH基因的随机克隆

1.8. 数据分析

2.1. 不同来源固氮菌PCR产物

2.2. 土壤固氮菌DGGE分析

2.3. 竹子根部与叶部内生固氮菌DGGE分析

2.4. 不同来源固氮菌Shannon多样性指数分析

2.5. 竹子根部与叶部内生固氮菌的随机克隆

1. 浙江农林大学环境与资源学院，浙江杭州 311300

2. 浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江杭州 311300

作者简介:
冯歌林(ORCID: 0000-0002-3069-0810)，从事农业资源与环境研究。E-mail: 492644070@qq.com

1. College of Environment and Resources, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China

2. State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China