Proliferation and differentiation of rhizomes from a filial generation of Cymbidium goeringii×Cymbidium hybridum

供试材料为2010年2月利用春兰‘黄水仙’C. goeringii ‘Huangshuixian’与大花蕙兰2个品种‘梦境’C. hybridum ‘Wanderland’和‘皇后’C． hybridum‘Princess Nobuko’进行杂交获杂交种子（分别标记为A1和A2组合），当年10月种子成熟后无菌播种，培养基为1/2MS（Murashige and Skoog）+ 30 g·L^-1蔗糖+ 5 g·L^-1琼脂 + 1 g·L^-1活性炭，诱导形成的原球茎经继代培养4～5次，从中选取稳定生长且较一致的根状茎。

A₁和A₂根状茎分别接在MS，1/2MS，Knudson C（KC），VW（Vacin and Went）和B5等5种培养基上（表 1），培养基中附加有60.0 g·L^-1香蕉泥、1.5 mg·L^-16-苄基腺嘌呤（6-BA）和0.5 mg·L-1萘乙酸（NAA）。根状茎切成约7 mm，经称量后接种于培养基中，每个处理20条，重复3次。30 d后统计增殖结果，60 d后观察生长特征，统计出苗数。

以1/2MS为基本培养基，生长素选则萘乙酸（NAA），2,4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），并与1.0 mg·L-16-BA 进行组合；细胞分裂素选择激动素（KT）和6-BA，并与0.2 mg·L^-1 NAA进行组合，设置对照组，质量浓度设置见表 2和表 3，将A1根状茎接在培养基上，20条·处理^-1，重复3次。30 d后统计增殖结果，60 d后观察生长特征，统计出苗数，计算分化率。

以1/2MS为基本培养基，附加有0.5 mg·L^-1NAA，分别添加椰汁、香蕉泥和土豆汁作为不同处理，质量浓度设置见表 4。其中香蕉、土豆均去皮后用榨汁机榨成匀浆备用。设置对照组，将A₁根状茎接在培养基上，20条·处理^-1，重复3次。40 d后统计增殖结果，60 d后统计出苗数，计算分化率。

将根状茎诱导出的大于1 cm的不定芽小心地分开，接到生根培养基中。

培养基中添加20.0 g·L^-1蔗糖，6.0 g·L^-1琼脂 ，1.0 g·L^-1活性炭，pH 5.6～5.8，培养室温度（25±2） ℃，光照14 h·d^-1，光照强度2 000 lx。

培养一段时间后统计新长出根状茎数，计算增殖倍数，增殖倍数=新长出根状茎数/接种根状茎数。60 d后统计根状茎的出苗数（苗以超过1.0 cm以上为标准），计算分化率，分化率 =出芽根状茎数/接种根状茎总数×100%。结果采用SPSS 19.0统计软件分析，用邓肯氏新复极差测验法（Duncan）进行差异显著性分析。

在不同的基本培养基上分别接种A₁和A₂根状茎，根状茎在10 d后开始萌动，15 d左右外植体基部切口处出现许多白色颗粒状愈合组织，之后这些组织进一步发育生长，25 d开始出现小芽。培养30 d后根状茎的增殖结果见表 1。由表 1可知，基本培养基种类对杂交兰根状茎增殖分化影响较明显。总体看来，1/2MS对于根状茎增殖分化效果较好，1/2MS与MS相比较可知，过多的无机盐也不利于杂交根状茎的增殖和分化，KC和B5效果则较差。但是，A₂根状茎在VW培养基上的增殖效果要好于1/2MS，且其在VW培养基上增殖分化效果要好于A1根状茎，这可能是由于杂交A₁组合遗传了亲本大花蕙兰更多的特性。综合来看，1/2MS较适合杂交根状茎的增殖和分化生长。

在其他条件一致时，生长素NAA和2,4-D对根状茎增殖和分化均有影响，结果见表 2。随着NAA质量浓度的升高，根状茎的增殖倍数也显著提高，并以1.0 mg·L^-1最佳，培养30 d后达到4.00。NAA为0.1～2.0 mg·L^-1时，对分化率进行方差分析。结果表明：各处理的出苗根状茎数和分化率差异显著，说明NAA及其不同质量浓度梯度对根状茎增殖分化的影响不同。观察到NAA为1.0和2.0 mg·L^-1时形成较多丛生芽（图 1）。在0.1～2.0 mg·L^-1范围内，2,4-D对于根状茎增殖分化的影响差异不显著，培养60 d后观察到分化的小苗较NAA处理的短而粗壮。综合考虑，NAA促进增殖分化的效果优于2,4-D。以1.0 mg·L^-16-BA +1.0 mg·L^-1 NAA增殖分化效果最佳。

Figure 1.  Rhizomes proliferation and budding(A)， rhizomes differentiate into seedlings(B)， clustered shoots(C)

在其他条件一致时，比较细胞分裂素6-BA和KT对根状茎增殖分化的影响结果见表 3。6-BA对根状茎增殖分化具有极显著的促进作用，6-BA质量浓度为2.0 mg·L^-1时增殖倍数达3.90，根状茎为嫩绿色，生长快，质量浓度为0.5～4.0 mg·L^-1时，分化率随着质量浓度升高而降低。当KT质量浓度为0.5～1.0 mg·L^-1时，根状茎增殖较多，但多为嫩黄色，丛生芽状，生长较慢，质量浓度超过1.0 mg·L^-1易导致根状茎玻璃化。由方差分析可见：KT对根状茎分化结果差异性不显著。综合考虑，0.2 mg·L^-1 NAA +2.0 mg·L^-1 6-BA对根状茎的增殖分化效果最佳。比较表 2和表 3中的处理4，前者1.0 mg·L^-16-BA +1.0 mg·L^-1 NAA增殖分化效果更好。

在其他条件一致时，比较不同添加物处理对根状茎增殖和分化的影响，结果见表 4。培养40 d后，单独添加3种有机物对杂交兰根状茎增殖均有促进作用，效果由大到小为椰汁＞香蕉泥＞土豆汁，随添加物用量的增加，根状茎增殖倍数下降。100.0 g·L^-1香蕉泥和50.0 mL·L^-1椰汁混合添加增殖效果最佳，优于所有有机物单独添加的效果。在幼苗分化方面，土豆汁处理中，分化率显著高于椰汁和香蕉泥处理，并在处理间存在显著性差异。椰汁和香蕉泥处理间在分化率方面无显著性差异。综合考虑，100.0 g·L^-1香蕉泥+50.0 mL·L^-1椰汁对根状茎的增殖分化效果最佳。

将分化出大于1 cm的不定芽接入生根培养基1/2MS+0.2 mg·L^-1赤霉素（GA3）+1.0 mg·L^-1NAA+25.0 g·L^-1蔗糖+2.0 g·L^-1活性炭中，培养至15 d时，无菌苗开始生根，生根率达95%以上，长出肉质根，待形成完整且较健壮植株时（约3个月）即可移栽。

不同基本培养基对兰花杂交根状茎增殖分化效果不同，以1/2MS效果较适宜，这与王利民等^[10]、孙芳等^[11]报道的结果一致。生长素NAA增殖分化效果优于2,4-D，但是2,4-D有利于分化出较壮的小苗。这与朱根发等^[1]报道的NAA对原球茎的增殖影响不大不同。6-BA对根状茎增殖分化具有极显著的促进作用，这与相关研究^{[1, 12-13]}结果相同，说明杂交兰在原球茎（根状茎）分化方面具有相似的特征。1.0 mg·L^-1 6-BA +1.0 mg·L^-1 NAA对根状茎增殖和分化最适。KT对根状茎分化结果差异性不显著，与相关报道低质量浓度KT对原球茎增殖有明显促进作用^[14-16]不同，可能是试验设计的质量浓度过高或者是由于所试品种和外植体的生长阶段不同。100 g·L^-1香蕉泥+50 mL·L^-1椰汁对根状茎的增殖分化效果优于分别单独使用香蕉泥、椰汁和土豆汁。组织培养中常用的有机添加物如椰乳、番茄汁、苹果汁和马铃薯等一些含有氨基酸、植物生长调节物质和酶等有机物且成分较为复杂的天然复合物，它们对细胞和组织的增殖和分化有明显的促进作用。王丰妍等^[9]研究发现培养基中添加15 mL·L^-1香蕉汁最有利于杂交兰原球茎的增殖。由于有机添加物的不同品种、不同产地和有效成分含量存在较大差异。