Karyotypes in 13 Clematis cultivars

13个铁线莲品种均取自浙江农林大学铁线莲种质资源圃（表 1），所取试材均为自然生长状态下幼嫩根尖。

采用酶解法与去壁低渗火焰干燥法制片^[8]。将材料放入0.002 mol·L^-1 8-羟基喹啉溶液中预处理4 .0~ 4.5 h，预处理后以0.075 mol·L^-1氯化钾溶液进行前低渗处理，0.5 h后在V（甲酸）∶V（冰乙酸）=3∶1的根尖固定液下固定数小时。再以体积分数为2.5% 纤维素酶和2.5% 果胶酶混合液对根尖进行4.0 ~5.0 h 的酶解去壁，酶解完全后去除上清液和杂质，再固定0.5 h后用滴管将此黏稠溶液滴于预先在乙醇溶液中冷冻-20 ℃的载玻片上，用乙醇灯火焰微热烘干，即得到含有根尖细胞的玻片。

采用染色体Giemsa-C分带技术^[9]进行染色。将0.2 mol·L^-1氯化氢和2 × 柠檬酸钠（SSC）缓冲液分别放入60 ℃恒温水浴锅中加热，将制好的载玻片放入0.2 mol·L^-1氯化氢中处理160 s。之后将玻片放入水中洗去残留的氯化氢，再放入氢氧化钡溶液中处理420~430 s，后转入水龙头下将氢氧化钡溶液冲洗掉。最后将玻片放入2 × SSC水浴锅中加热，1.0 h后放入20.0 mL磷酸氢二钠+10.0 mL磷酸二氢钾+50~60滴Giemsa染液的混合溶液中染色数小时。

染色后用蒸馏水轻轻冲洗玻片，空气中干燥后即可进行染色体观测和拍照。先在40倍物镜下找到分裂较好的染色体，向载玻片滴2滴二甲苯，盖玻片滴2滴镜油，再转至100倍物镜下拍照。

统计细胞分裂相30个·品种^-1，其中85% 以上的分裂相中染色体一致的数目定为该品种的染色体数^[10]。分析时，各个品种取1个染色体形态好且分散好的分裂相，染色体相对长度的计算按照LEVAN等^[11]的方法。核型类型以染色体长度比和臂比值来衡量，方法参照STEBINNS^[12]的分类标准。着丝点位置的命名按照LEVAN等^[11]的方法。核不对称系数（As.K.，%）的计算按照ARANO^[13]的方法。染色体相对长度系数（I.R.L）的分类参照KUO等^[14]的方法。以Adobe Photoshop CS测量染色体的长短臂与随体的相对长度^[15]，再以Excel计算染色体的相对长度^[16]，臂比值，臂比均值（AAR），臂比值大于2的染色体比例（PCA），臂指数（N.F值），着丝点指数等，并制作核型模式图。

经观察发现：13个铁线莲品种均为二倍体，染色体数为2n=2x=16，染色体基数为8，且品种间的核型公式极为相似，核型类型均为2A。13个铁线莲品种的核型参数见表 2。由表 2可知：核型公式‘灵感’为2n=2x=16=10m+4st+2t（2SAT），‘仙女座’为2n=2x=16=10m+6st（4SAT），‘浪子’为2n=2x=16=10m+4st（2SAT）+2t，‘白王冠’为2n=2x=16=10m+4st+2t（2SAT），‘狂想曲’为2n=2x=16=10m+6st（2SAT），‘蓝光’为2n=2x=16=10m+4st+2t（2SAT），‘茱莉亚夫人’为2n=2x=16=10m+6st（2SAT），‘绿玉’为2n=2x=16=10m+4st+2t（2SAT），‘蓝焰’为2n=2x=16=10m+6st（2SAT），‘劳拉’为2n=2x=16=10m+6st（2SAT），‘普鲁吐斯’为2n=2x=16=10m+4st+2t（2SAT），‘乌托邦’为2n=2x=16=10m+6st（2SAT），‘马来西亚石榴石’为2n=2x=10m+2st+4t（4SAT）。

13个品种的臂指数均为26，臂比值大于2的染色体比例均为37.50%。由图 1~图 3可知，‘灵感’‘白王冠’‘狂想曲’‘绿玉’‘蓝焰’在第8对染色体上具有随体，‘仙女座’‘马来西亚石榴石’于第6对与第8对染色体上具有随体，‘浪子’‘茱莉亚夫人’‘普鲁吐斯’‘乌托邦’于第7对染色体上具有随体，‘蓝光’‘劳拉’在第6对染色体上具有随体。其他染色体组的核型参数比较见表 3。

Figure 1.  Metaphase cleavage phase of chromosomes of thirteen Clematis cultivars (×1 000)

Figure 2.  Karyotype of thirteen Clematis cultivars

Figure 3.  Chromosomes Karyotype mode of thirteen Clematis cultivars

核型分析是细胞分类学的一个重要指标，能够识别染色体的形态特征，对研究系统的演化、种间亲缘关系及分类有重要的意义^[17]。本研究报道了13个铁线莲栽培品种的染色体数目与核型，均为首次详细报道。13个品种均为二倍体（2n=2x=16），染色体基数为8，说明铁线莲品种的染色体在数目上是比较恒定的，这与彭绿春等^[7]的研究结果一致，这证明铁线莲属的染色体基数比较恒定的表现为x=8。本试验中13个铁线莲品种的核型类型均为“2A”，这与张镱锂等^{[2, 4]}的研究结果有所不同。

13个品种的臂指数值均为26，核型结构为：第1~5对均为具中部着丝点（m）染色体，第6对为均为具近端（st）着丝点染色体，第7至8对为具近端（st）着丝点染色体或端部（t）着丝点染色体，这说明铁线莲品种的核型基本模式极为一致，这与张镱锂等^[4]研究一致。但这13个品种所包含的m，st，t这4类染色体的数量却不尽相同，从核型模式图中可明显看出这种差异。核型分析结果表明，13个铁线莲品种都能观察到随体染色体，除‘仙女座’和‘马来西亚石榴石’具有2对随体外，其他品种均具有1对随体，且位置都在短臂上，这与前人的研究结果也一致^[2-4]。在被子植物中，核型进化的基本趋势是由对称向不对称方向发展的，系统演化上处于比较古老或原始的植物往往具有较对称的核型，不对称的核型通常出现在较进化或特化的植物中^[12]。本研究中13个铁线莲品种的核不对称系数均相对较低（61.78%~64.78%），变异很小，其按进化程度由高到低的顺序为‘绿玉’‘茱莉亚夫人’‘浪子’‘劳拉’‘乌托邦’‘普鲁吐斯’‘马来西亚石榴石’‘狂想曲’‘蓝光’‘蓝焰’‘仙女座’‘灵感’‘白王冠’。此结果与杨光穗等人的研究结果基本一致^[18]。

本研究13个铁线莲品种的核型特征极为相似，说明杂交不亲和可能是温度、湿度或人为等其他因素造成，有待于进一步探究。13个品种间的核型参数间存在的差异，可为铁线莲杂交育种提供细胞学资料。本研究中各染色体显带都不明显，因此，未将染色体Giemsa-C分带技术应用到铁线莲品种的核型分析中。