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石蒜属Lycoris植物为多年生球根花卉，花型奇特且类型繁多，花色丰富，冬春花败观其叶，夏秋叶枯赏其花，观赏价值高[1]。此外，石蒜属植物含有的生物碱、石蒜碱颇具医药研究开发潜力[2−3]。石蒜新品种‘梦幻少女’Lycoris chinensis × radiata ‘Astro Girl’是中国石蒜L. chinensis和石蒜L. radiata的种间杂交种，其花色以乳黄白色为底色，雾粉渐变于花瓣末端，花朵形态优雅折曲，同样渐变色的花丝抽展而出，呈现梦幻、活力、雅致的观赏感，极具研究和推广价值，但‘梦幻少女’染色体数目(2n=19)为非整倍数，自然条件下种球繁殖效率低，速度慢。
植物组织培养技术成为目前推广新品种和良种的重要手段。该技术具有材料耗费量少、繁殖系数高、不受季节限制、周期短和快速批量成苗的特点，能够良好地保持繁殖母本遗传基因型，从而获得优良稳定材料。至今已建立多种石蒜属植物的组培快繁体系[4]，但主要以带基盘的双鳞片或鳞茎为外植体，通过诱导不定芽来建立离体快繁体系，繁殖系数相对较低。通过体胚发生途径，可获得数量更多、发育速度更快、遗传性更稳定的再生植株，在栎属Quercus[5]、松科Pinaceae[6−7]及云杉属Picea[8]等植物建立的体胚发生体系，加速了林木育种改良、苗木工程绿化、有效成分提取及种质资源保护与利用等方面的应用。然而，多数植物体胚的研究仍存在体胚形成再生植株困难和发育不同步等瓶颈[9]。关于石蒜属植物体胚相关的研究，仅王彩霞等[10]通过诱导忽地笑Lycoris aurea鳞茎盘端1/3鳞茎的愈伤组织，进而分化体胚，而关于石蒜属其他种的体胚研究还相对较少。鉴于此，本研究分析了石蒜‘梦幻少女’体胚发生过程中的细胞学与生理特性，探索其体胚繁殖体系及发育机理，为石蒜属植物工厂化育苗提供技术支撑。
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将石蒜鳞茎球不同部位组织为外植体，诱导愈伤组织。在愈伤组织连续增殖继代中，筛选稳定增殖的淡黄色、半透明的胚性愈伤组织，再将胚性愈伤组织进行体细胞胚的诱导与增殖培养，筛选出D23培养基[基础培养基(MS)+2.00 mg·L−16-苄氨基嘌呤(6-BA) +0.05 mg·L−12,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+30.00 g·L−1蔗糖+6.20 g·L−1琼脂]为最佳的体胚诱导与增殖培养基。培养条件：光周期14 h·d−1，光照1 500 lx，温度(27±2) ℃，以下研究培养条件相同。
2022年7月选取生长一致的胚性愈伤组织，接种至D23培养基进行培养，间隔5 d (0、5、10、15、20、25、30、35和40 d)挑选长势相对一致的材料，体视镜(OLYMPUS SZX 7)显微观察并拍照，同时，取10 g材料液氮速冻后于−80 ℃超低温冰箱中保存，用于生理生化指标测定，重复3次。
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石蜡切片参照李丹等[11]的方法改良后进行，取材固定3 d以上，梯度乙醇脱水、浸蜡，之后于65 ℃融化石蜡连续浸蜡8 d，新蜡包埋、切片(厚度9 μm)、制片，40 ℃烤片至干燥，常温保存备用。
脱蜡复水，染色(苏木素中染色4~5 min，盐酸水溶液分化5 s，氨水水溶液返蓝30 s内，自来水浸洗)，依次于体积分数为85%、95%的乙醇脱水各5 min，伊红染液染色5 min，乙醇脱水，中性树胶封片，于徕卡(LEICA DM4000)显微镜观察拍照。
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称取0.1 g样品置2.0 mL离心管中，加入1.0 mL磷酸缓冲液(pH 7.4)和适量研磨珠，于−10 ℃预冷的冷冻研磨机中研磨，4 ℃ 8 000 r·min−1离心 20 min，取上清液，冰上保存备用。
采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试剂盒(GIVEI，极威生物科技公司，上海)测定淀粉、总蛋白质和酶活性[12]。在预先包被抗体的孔板中，依次加样、温浴、清洗、显色后，于酶标仪(SPECTRA MAX 190)上测定D(450)，计算样品的质量浓度或活性。
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参考林绍艳等[13]方法将1.0 g·L−1腐胺、精胺和亚精胺混合标准品溶液，稀释成10.0 mg·L−1，再逐级稀释2、4、8、16、32、64、128倍，上机测定其峰面积，并以多胺质量分数为自变量，峰面积为因变量，绘制标准曲线。
称取0.1 g各样品冻干粉末于离心管中，加入预冷的体积分数为10%的乙腈2.0 mL，涡旋混匀，9 000 r·min−1离心5 min，0.22 μm滤膜过滤，使用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测量样品的多胺质量分数。
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采用Excel 2022整理数据，SPSS 23.0对生理生化指标进行单因素方差分析和多重比较(邓肯检验)，使用GraphPad prism 9.0制图。
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组织学观察表明：在接种的第0~15天时，胚性愈伤组织呈浅黄色透明状。刚接种时，愈伤组织表面为鲜润、淡白色的颗粒状团块，胚性细胞在愈伤组织表层或亚表层散状分布，内层多为较大的非胚性细胞疏松排列；接种第5天时，愈伤组织逐渐适应培养环境，表面湿润，表层附近的胚性细胞开始活跃分裂，且密集分布；第10天时，愈伤组织发生了一定程度的增殖，球形胚初步形成并向外凸出；第15天时，愈伤组织主要发生增殖与分化球形胚，少量心形胚和棒状胚形成，心形胚维管束形成，与母体愈伤组织形成生理隔离(图1)。
图 1 体胚发生过程的0~40 d组织细胞学变化
Figure 1. Histocytological changes of somatic cell embryogenesis during 0 − 40 days
在培养的第20~40天时，胚性愈伤组织转变为光亮、浅黄色。在第20天时，愈伤组织继续增殖、分化为球形胚，且球形胚加速膨大，维管束形成；同时，部分球形胚明显分化至心形胚、棒状胚。第25天时，体胚之间的排列开始变得疏松，簇状的体胚形态发育速度不均一。与培养第0~20天相比，体胚形态成熟转化速度明显加快，大部分球形胚发育至心形胚、棒状胚、子叶胚雏形，体积膨大。第30天时，胚性愈伤组织增殖不明显，继续分化少量新的球形胚，大部分体胚发育至子叶胚的初步形态且继续膨大；第35天时，胚性愈伤组织活性开始减弱，簇状体细胞胚的形态发育速度再次加快，差异较明显，同时存在球形胚、心形胚、棒状胚和子叶胚，子叶胚形态轮廓更加成熟，结构上外边缘的胚性细胞分布密集，总体上棒状胚的数量相对较多；第40天时，形体较大的体胚继续成熟，部分体胚退化至非胚性愈伤组织，子叶胚中间分化出具有两极性的轴状胚性细胞团。
在0~40 d的体胚发生过程中，球形胚从发生到短暂膨大维持约20 d，进一步分化为心形胚、棒状胚和子叶胚。在膨大的球形胚后期或心形胚时期基部会形成维管束，后期子叶胚可发育为小鳞茎。
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由图2可见：在体胚发生过程中，淀粉质量浓度呈先下降后稳定的趋势。在体胚发生早期(0~20 d)和体胚成熟期(20~40 d)，淀粉质量浓度存在显著差异(P＜0.05)。
图 2 体胚发生过程中淀粉和总蛋白质质量浓度的变化
Figure 2. Changes of starch and total protein content during somatic cell embryogenesis
根据体胚发生过程中的形态与组织学特征(图1)，在体胚早期(0~20 d)，球形胚形成时，淀粉质量浓度发生了明显积累；球形胚发育至心形胚、棒状胚时，淀粉质量浓度大幅下降。在子叶胚时期(20~35 d)，随着子叶胚的形成、体积膨大和体胚成熟，淀粉质量浓度持续下降，呈现负相关关系。第35~40天时，可能由于营养供给不足、次生物质积累少等导致部分体胚退化为愈伤组织，部分子叶胚出现明显的两极分化，此时淀粉质量浓度明显上升。
总蛋白质质量浓度在体胚发生早期(0~20 d)时保持不变，在20~25 d迅速上升，而后呈下降趋势。体胚早期发育阶段总蛋白质质量浓度差异不显著，第25天时出现峰值后回落，子叶胚分化到成熟期间(20~40 d)时，总蛋白质质量浓度差异显著(P＜0.05)。
在体胚早期(0~20 d)，愈伤组织增殖、体胚前期形态转化(球形胚、心形胚和棒状胚)阶段，总蛋白质质量浓度维持在一定的阈值，变化不明显。愈伤组织和体胚混合体为淡黄色(第20天时转为光亮色泽)。子叶胚时期(20~35 d)，总蛋白质质量浓度骤升式积累(子叶胚形成期)；子叶胚逐渐成熟且膨大时，总蛋白质质量浓度下降，说明子叶胚形成与总蛋白质质量浓度呈正相关，子叶胚成熟阶段则相反；在第35~40天时，总蛋白质质量浓度有所回升。
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由图3可见：体胚发生过程中，过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性存在显著差异(P＜0.05)。POD和CAT活性变化与总蛋白质质量浓度的变化趋势相似，在体胚发生早期(0~20 d)保持不变，在20~25 d时迅速提高，而后下降。POD活性下降到30 d时保持相对不变；CAT活性在30~40 d时呈持续下降趋势。POD和CAT活性在体胚发生的0~25 d时活性变化与体细胞的形态变化相对应，且和总蛋白质质量浓度变化趋势相似。子叶胚成熟期(25~40 d)，POD活性先下降，此时大部分体胚发育至子叶胚且继续膨大(25~30 d)，之后子叶胚成熟阶段POD活性变化较小(30~40 d)；而CAT活性随着子叶胚的成熟逐渐下降(25~40 d)，表明POD和CAT活性与子叶胚的形成呈正相关，POD活性与子叶胚初步膨大呈负相关，CAT活性与子叶胚的成熟呈负相关。
图 3 体胚发生过程中抗氧化酶活性的变化
Figure 3. Changes of antioxidant enzyme activity during somatic embryogenesis
SOD活性呈现2个峰值后略有回升。在培养第5天和第20天时出现明显峰值，体胚分化早期(0~15 d)和分化中后期(15~40 d)，SOD活性差异显著(P＜0.05)。在体细胞胚早期(0~15 d)，胚性愈伤组织处于增殖阶段中，SOD活性提高；在球形胚的形成与增殖阶段中，SOD活性逐渐下降。在心形胚和棒状胚的形成阶段(15~20 d)，SOD活性提高。在子叶胚的形成及成熟阶段(20~40 d)，SOD活性急剧下降；当内部聚集性的两极开始形成时，SOD活性又有所回升。
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由图4可知：腐胺(Put)、精胺(Spm)和亚精胺(Spd)质量分数变化整体呈M型。腐胺在培养第10天和第35天时出现峰值。精胺在第10天和第30天时出现峰值。亚精胺在第15天和第30天时出现峰值。体胚发育的不同时期多胺质量分数差异显著(P＜0.05)。
图 4 体胚发生过程中多胺氧化酶活性与多胺质量分数的变化
Figure 4. Changes of polyamine oxidase activity and polyamine content during somatic embryogenesis
在球形胚形成时期(5~10 d)，多胺(PAs)质量分数快速上升，球形胚发育至子叶胚期(10~30 d)时，腐胺质量分数下降；精胺质量分数在子叶胚期前呈下降趋势，至子叶胚时期呈上升趋势；球形胚时期，亚精胺质量分数逐渐上升，至心形胚、棒状胚时期急剧下降，子叶胚膨大、成熟时期亚精胺质量分数呈上升趋势。在子叶胚成熟后期(30~40 d)，腐胺质量分数为急剧上升后下降，精胺和亚精胺质量分数为下降后上升。
腐胺、精胺和亚精胺质量分数变化共同决定多胺的变化趋势，多胺的峰回变化主要表现为愈伤组织增殖、体胚早期分化和子叶胚期成熟3个时期，多胺主要在体胚早期分化和发育阶段大量积累，说明多胺可能共同调控体胚的形成。
在体胚发生过程中多胺氧化酶活性呈M型变化趋势。在第10天和第30天出现峰值，在体胚分化早期(0~15 d)和子叶胚成熟后期(30~40 d)，多胺氧化酶活性差异显著(P＜0.05)。
在体胚分化早期(0~15 d)，胚性愈伤组织增殖时，多胺氧化酶活性下降；球形胚形成时，多胺氧化酶活性快速上升呈明显的正相关作用；球形胚短暂增殖时，多胺氧化酶活性快速下降。在子叶胚期(20~40 d)，子叶胚形成及成熟初期，多胺氧化酶活性又上升；在子叶胚后续膨大成熟时，多胺氧化酶活性急剧下降。
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许多植物中同时存在内起源和外起源2种方式，如芍药Paeonia lactiflora[14]、香榧Torreya grandis ‘Merrillii’[15]。本研究石蒜品种‘梦幻少女’体胚发生为外起源，球形胚发生多为愈伤组织的外表层或亚外层，但不能完全排除内起源的可能。‘梦幻少女’体胚形态发育的过程经历了球形胚—心形胚—棒状胚—子叶胚，这与荔枝Litchi chinensis[16]、油棕Elaeis guineensis[17]、火炬松Pinus taeda[18]和白刺花Sophora davidii[19]等植物的体胚形态发生过程相似。
体胚与母体愈伤组织产生生理隔离是植株再生的重要前提，否则易出现胚畸形、退化、死亡等问题[20]。在荔枝、鹅掌楸Liriodendron chinense的早期原胚期[16, 21]，以及枣Ziziphus jujuba[20]和苏玛栎Quercus shumardii[22]等的部分球形胚期均出现生理隔离形成的现象。本研究对‘梦幻少女’体胚发生过程的组织学特征观察发现：球形胚、心形胚形成维管束，与母体愈伤组织形成生理隔离。
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在体胚发生过程中，淀粉、可溶性蛋白质、酶活性等的变化是相关基因表达和调控的结果[23]。在体胚发生过程中，作为能量物质，淀粉积累在细胞代谢、形态分化和发育等方面均起着重要的作用[23]。仙客来Cyclamen persicum在球形胚时期出现淀粉积累高峰[24]。人参Panax ginseng在成熟胚中淀粉积累量最高[25]。在本研究中，淀粉积累的高峰出现在‘梦幻少女’的球形胚时期，说明淀粉积累可能促进了球形胚的形成。
在体胚发生过程中，蛋白质同样是重要的物质和能量代谢基础。大蒜Allium sativum愈伤组织分化球形胚时，可溶性蛋白质质量浓度上升，在体胚后续发育至植株再生期间，可溶性蛋白质质量浓度不断下降，表明球形胚时期可溶性蛋白质的积累主要用于后续的发育和成熟阶段[26]。本研究中‘梦幻少女’体胚发生前期总蛋白质质量浓度保持稳定，在第25天时快速出现高峰，代谢活动加强，之后快速下降，表明迅速积累的总蛋白质可能为子叶胚形成和成熟提供了能量，该结果与橡胶树Hevea brasiliensis[27]、樱桃番茄Lycopersicon esculentum[28]等体胚发生研究的结果相一致。
POD、CAT和SOD为植物代谢中的重要酶类。POD可以促进木质素合成，与呼吸作用相关，进而推进体胚的形态发育[28]；SOD作为一种保护酶和诱导酶，对胚胎发育具有促进作用，在体胚发育早期快速积累起到保护组织和细胞的作用[29]；CAT具有提高抗逆性、提高抗氧化能力和延缓植物衰老的作用。本研究中POD、SOD活性的变化趋势与总蛋白质质量浓度相似，POD在体胚发生的早期变化不明显，在子叶胚形成时快速积累，说明POD的积累可能有利于子叶胚形成；SOD的峰值出现在培养的第5天和第20天，可能促进球形胚和子叶胚形态分化；CAT活性在培养第25天开始下降，此时子叶胚开始不断成熟。POD、SOD和CAT活性的整体变化趋势相似，说明子叶胚的成熟可能需要消耗多种抗氧化酶。
多胺的变化是影响体细胞胚发育的重要因素[30]。荔枝体胚中腐胺在球形胚时期发生了迅速的积累上升[16]。龙眼Dimocarpus longan愈伤组织分化为球形胚期间，腐胺、亚精胺和精胺均快速上升，其中腐胺变化占主导地位[31]。在本研究中，‘梦幻少女’球形胚时期，腐胺、亚精胺和精胺质量分数迅速提高，多胺的积累可能共同促进球形胚的分化。心形胚、棒状胚时期，腐胺、精胺和亚精胺质量分数都明显下降，说明子叶胚的形成需要同时消耗这3种物质。这与枸杞Lycium chinense[32]的研究结果相似，枸杞球形胚至成熟胚阶段，腐胺和精胺质量分数有所下降。在本研究的子叶胚初期，腐胺下降至谷底，精胺和亚精胺上升至新的峰值，此时多胺的变化可能共同促进体胚的成熟，多胺的变化趋势与龙眼[31]相似。多胺氧化酶与多胺中的亚精胺变化趋势相似，第10~15天和第30天出现峰值，体胚形态明显转化时发生明显的积累或消耗变化，这有利于球形胚形成和子叶胚成熟，多胺氧化酶活性变化趋势与荔枝[16]的相似。
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在石蒜品种‘梦幻少女’体胚发生的0~40 d，体胚形态经历了原胚—球形胚—心形胚—棒状胚—子叶胚的过程。体胚发生过程中的生理特性变化显著，淀粉变化可能是球形胚形成、体胚形态发育与成熟的重要影响因素。在子叶胚形成及成熟时期，总蛋白质、过氧化酶活性和多胺变化可能发挥着相应的密切联合作用。多胺的积累和多胺氧化酶活性的提高可能促进体胚早期发育。在子叶胚形成及成熟时期，腐胺、精胺和亚精胺的变化相互发挥着密切的联合作用。
Cytological and physiological characteristics of somatic embryogenesis in Lycoris
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摘要:
目的 探究石蒜‘梦幻少女’Lycoris chinensis × radiata ‘Astro Girl’体胚发生过程中的细胞学和生理生化指标的变化规律，明确‘梦幻少女’体胚发生的特征，提高石蒜属Lycoris植物种球繁殖效率，为石蒜属新品种工厂化生产提供技术支撑。 方法 采用石蜡切片、酶联免疫吸附测定技术和超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术，测定了0~40 d‘梦幻少女’体胚发生过程中的形态和组织学特征、体胚可溶性淀粉及总蛋白质、抗氧化酶活性和多胺等生理生化指标的变化。 结果 ①体胚发生过程中，从球形胚到短暂膨大约20 d，进一步分化为心形胚、棒状胚和子叶胚，膨大的球形胚后期或心形胚时期基部会形成维管束。②体胚发生过程中，总蛋白质和淀粉、抗氧化酶活性发生显著变化，淀粉变化与球形胚的形成呈正相关，与体胚形态建成和体胚成熟呈负相关。总蛋白质、过氧化物酶(POD)活性及过氧化氢酶(CAT)活性变化与子叶胚形成呈正相关，与子叶胚的成熟发育呈负相关。超氧化物歧化酶(SOD)活性变化与球形胚、子叶胚时期呈负相关，与心形胚、棒状胚时期呈正相关，表明储能作用的淀粉、蛋白质及与植物生理密切相关的抗氧化酶对体胚发生起着重要的作用。③体胚发生过程中多胺氧化酶(PAO)活性和多胺(PAs)变化显著，腐胺(Put)、精胺(Spm)和亚精胺(Spd)的变化共同决定多胺的变化趋势，多胺和多胺氧化酶活性主要在体胚分化早期发生明显积累，与球形胚分化呈正相关；在子叶胚的形成期，精胺与亚精胺呈正相关；在子叶胚成熟期，腐胺、精胺和亚精胺3个指标呈现腐胺先下降后上升，精胺、亚精胺先上升后下降的趋势。 结论 在‘梦幻少女’体胚发生的0~40 d，体胚形态经历了原胚—球形胚—心形胚—棒状胚—子叶胚的过程。其中，生理特性变化显著，淀粉的积累或消耗可能是球形胚形成、体胚后续形态发育与成熟的重要影响因素。在子叶胚形成及成熟时期，总蛋白质、过氧化酶活性和多胺的变化可能发挥着相应密切的联合作用。多氨氧化酶活性与多胺的活跃积累可能有利于体胚早期发育。图4参32 Abstract:Objective This study, with an exploration of the changes of cytology and physiological and biochemical indexes during somatic embryogenesis of Lycoris chinensis × radiate ‘Astro Girl’, which can improve the coefficient and quality of tissue culture and rapid propagation of ‘Astro Girl’, is aimed to provide technical support for the factory production of new Lycoris varieties. Method Paraffin section, enzyme-linked immunosorbent assay and ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) were used to determine the changes of somatic embryo morphology, histology and corresponding physiological and biochemical indexes such as content of soluble starch and total protein, antioxidant enzyme activity and polyamine content during somatic embryo culture (0 − 40 d) of ‘Astro Girl’. Result (1) During the process of somatic embryogenesis, the globular embryo lasted for about 20 days from initiation to transient expansion, before it was further differentiated into heart-shaped embryo, rod-shaped embryo and cotyledon embryo with vascular bundles formed at the base of the enlarged globular embryo or heart-shaped embryo. (2) During somatic embryogenesis, significant changes occurred in the content of total protein and starch and the activity of antioxidant enzymes. The change of starch content was positively correlated with the formation of globular embryo and negatively correlated with somatic embryo morphogenesis and somatic embryo maturation, whereas the changes of total protein (TP) content, peroxidase (POD) activity and catalase (CAT) activity were positively correlated with cotyledon embryo formation but negatively correlated with cotyledon embryo maturation. The activity of superoxide dismutase (SOD) was negatively correlated with globular embryo and cotyledon embryo, but positively correlated with heart-shaped embryo and rod-shaped embryo. Such results showed that starch, protein and antioxidant enzymes which are closely related to plant physiology play an important role in somatic embryogenesis. (3) The activity of polyamine oxidase (PAO) and the content of polyamine (PAs) changed significantly during somatic embryogenesis, and the contents of putrescine (Put), spermine (Spm) and spermidine (Spd) determined the change trend of polyamine content. Polyamine content and polyamine oxidase activity mainly accumulated in the early stage of somatic embryo differentiation, which was positively correlated with globular embryo differentiation, and the changes of spermine and spermidine content were positively correlated during cotyledon embryo formation. In the mature stage of cotyledon embryo, putrescine, spermine and spermidine decreased at first and then increased, while spermine and spermidine increased at first and then decreased. Conclusion During the 0 − 40 days of somatic embryogenesis of ‘Astro Girl’, the main morphology of somatic embryo developed from proembryo, globular embryo, heart-shaped embryo and rod-shaped embryo to cotyledon embryo, among which, the physiological characteristics changed significantly, and the accumulation or consumption of starch content may be an important factor affecting the formation of globular embryo and the subsequent morphological development and maturation of somatic embryo. During the formation and maturation of cotyledon embryo, the changes of total protein content, peroxidase activity and polyamine content may play a closely joint role. The active accumulation of polyamine oxidase activity and polyamine content may be beneficial to the early development of somatic embryos. [Ch, 4 fig. 32 ref.] -
Key words:
- Lycoris /
- callus /
- somatic embryo /
- physiology and biochemistry
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城市绿地对改善城市生态环境恶化等问题具有举足轻重的作用[1]。目前，对城市绿地生态效益的研究因受生态系统服务功能多样、区域环境及人类社会活动需求差异等因素影响，呈现出评估方法众多但评价内容、指标及结果差异性大等问题[2-3]。随着大数据等现代技术的应用，城市绿地生态效益价值的评估已经由原来的传统方法逐渐发展到计算机模型测算法[4-5]。由美国林务局2006年开发的i-Tree模型因树种匹配灵活、分析结果精确、评估对象尺度多元等优点，自推出至今在国际上尤其是北美国家已得到了大量的应用[6]。近年来中国合肥[7]、杭州[8]、南京[9]等地已有大量基于该模型的生态效益研究成果，但呈现出以研究城市森林等大区域尺度及城市社区行道树等小微尺度为主的特征，仅有魏云龙[10]、施炜婷等[11]、施健健等[5]对城市公园、广场这类中小尺度的绿地进行评估，且仅以研究单种生态效益功能或植物个体生态效益为主。本研究以临安吴越钱王陵公园为研究对象，运用i-Tree模型对公园植物群落结构及节能、改善空气质量、吸收二氧化碳(CO2)、截留雨水等4个方面的生态效益价值进行定量评估，以期为钱王陵公园及当代城市公园植物群落提升建设过程中群落及树种选择提供一定参考，丰富该模型在城市绿地生态效益研究的理论与内容。
1. 研究地区与研究方法
1.1 研究地概况
临安区位于杭州市西部，29°56'~30°23'N，118°51'~119°52'E，属亚热带季风气候，年平均降水量1 613.90 mm，降水日158.0 d，全年平均气温16.4 ℃，全年日照时数1 847.3 h。钱王陵公园坐落在临安区锦城太庙山南坡，2018年作为杭州地区唯一代表入选浙江省级考古遗址公园，在塑造城市形象、传承历史文化、市民公共游憩活动等方面起重要作用；该园建成至今已有20余a，占地10.30 hm2，海拔92.0 m[12]。园内植物生长稳定，群落结构水平和垂直结构差异明显，群落景观多样，类型丰富。
1.2 调查内容与方法
本研究调查对象为钱王陵公园内的典型人工植物群落。在对公园全面勘查的基础上，于2019年8−9月采用典型取样法，设置32个20 m×20 m，面积为400 m2的典型样地，按照L1至L32顺序对样地编号(表1)；采用每木测量法，对样地内的植物种类、数量、胸径、树高、冠幅、健康状况以及立地条件、水体、道路、铺装广场的占比状况进行调查[5]，后期整理汇总。
表 1 钱王陵公园植物群落基本类型Table 1 Basic types of plant communities in Qianwangling Park群落类型 垂直结构类型 样地编号(群落名称) 针阔混交型 乔-灌-草 L1(水杉Metasequoia glyptostroboides+樟树群落)、L2(圆柏Sabina chinensis+樟树群落)、L3(雪松 Cedrus deodara+樟树群落)、L4(塔柏Sabina chinensis ‘Pyramidalis’+圆柏+樟树群落)、L5(塔 柏+樟树群落)、L6(塔柏+樟树+棕榈Trachycarpus fortunei群落)、L9(桂花Osmanthus fragrans+水 杉群落)、L11(水杉+柳杉Cryptomeria fortunei+樟树群落)、L14(水杉+枫香Liquidambar formosana群落)、L18(樟树+罗汉松Podocarpus macrophyllus群落) 乔-灌 L7(水杉+广玉兰群落Magnolia grandiflora)、L17(马尾松Pinus massoniana+深山含笑Michelia maudiae群落) 乔-草 L25(马尾松+樟树群落) 常绿阔叶型 乔-灌-草 L8(桂花群落)、L13(樟树+广玉兰+桂花群落)、L16(樟树+广玉兰群落)、L21(樟树+广玉兰-山茶 Camellia japonical群落)、L26(樟树+桂花群落)、L30(樟树+女贞Ligustrum lucidum+桂花群落) 乔-草 L23(樟树+女贞群落)、L28(樟树+棕榈群落) 常绿落叶阔叶混交型 乔-灌-草 L10(樟树+山樱花Prunus serrulata群落)、L15(樟树+银杏Ginkgo biloba群落)、L26(樟树+枫香+ 构树Broussonetia papyrifera群落(L20) 乔-草 L19(樟树+枫香+油茶Camellia oleifera群落)、L22(樟树+枫香+棕榈群落)、L24(樟树+枫香群落)、 L27(樟树+栓皮栎Quercus variabilis群落) 乔-灌 L12(樟树+榔榆Ulmus parvifolia群落) 竹阔混交型 乔-灌-草 L29(毛竹Phyllostachys edulis+枫香群落)、L32(毛竹+樟树-山茶群落)、L31(毛竹+樟树群落) 1.3 i-Tree模型生态效益评估原理
评估采用i-Tree V5.0版本的streets模块。将模型内测算树木节能效益的电费和天然气经济指标价格修正为2018年临安区居民生活用电的平均价格0.59元·kW−1·h−1和天然气平均价格3.66元·m−3；碳吸收、改善空气质量、截留雨水效益的计算参照魏云龙[10]基于该模型同一模块对花港观鱼公园生态效益测算价格指标，用于导入及输出的美元效益价值量采用2019年8月及9月美元对人民币平均汇率(1美元兑换7.04元人民币)进行换算[13]。基于临安亚热带季风气候条件及杭州地区该模型相关研究[5, 10]，匹配沿海平面(coastal plain)气候区作为背景开展评估，对树种数据库中没有的树种依据其属性进行同属或同叶型的树种匹配，最后将整理好的树种实测数据整理成Access数据库，并处理成mdb格式文件导入模型中开展评估。
2. 结果与分析
2.1 群落类型及空间结构分析
参照《中国植被》[14]、尚玉昌[15]生态学优势种命名法、武文婷[16]对于杭州城市绿地植被类型划分原则，以植物群落本身特征作为划分依据，以生态外貌为高级分类单位，中低级单位采用优势种(以重要值为依据)，对所调查植物群落进行划分得出(表1)：竹阔混交型群落占比为9.37%，常绿落叶阔叶混交型和常绿阔叶型群落占比同为25.00%，针阔混交型群落占比最高(40.63%)；公园整体表现出以针阔混交型群落为主的植物景观风貌，营造出纪念性公园四季常青、庄严肃穆的景观氛围。
根据水平结构上的配置模式，将群落划分为纯林和混交林2种类型[17]。在水平结构上，混交林占比为93.75%，呈现出主导地位；在垂直结构上，“乔-灌-草”型复层模式群落占68.75%；双层模式群落只出现“乔-草”及“乔-灌”这2种类型，分别占21.88%和9.37%。复层型为公园植物群落的主要构建模式。
2.2 植物群落树种结构分析
参照《浙江植物志》等[18-19]，对所调查32个植物群落树种分析可知：调查植物共计113种，分属于63科98属。符合测量评估条件的乔、灌木共1 613株，隶属于39科62属74种。i-Tree模型内置的“Define Species”功能将树木分为常绿阔叶树种(BE)、落叶阔叶树种(BD)、常绿针叶树种(CE)、落叶针叶树种(CD)、常绿棕榈树种(PE)5种生长类型，且每一类型又分为大(L)、中(M)、小(S)3类[10]。由图1可知：公园内常绿树占比约是落叶树占比的4倍，群落总体表现出以常绿树为主的林相，季相变化不够丰富；公园内阔叶树种占79.11%，针叶树种占12.46%，阔叶树约为针叶树6倍，针叶树种数量偏少，不符合纪念性公园以针叶树偏多的特点。
图 1 植物群落树木生长类型Figure 1 Plant community tree growth typesBDL. 落叶阔叶大型树；BDM. 落叶阔叶中型树； BDS. 落叶阔叶小型树；BEL. 常绿阔叶大型树； BEM. 常绿阔叶中型树；BES. 常绿阔叶小型树； CEL. 常绿针叶大型树；CEM. 常绿针叶中型树； CDL. 落叶针叶大型树；PEM. 常绿棕榈中型树从数量上来看，株数排名前10位的树种分别是：樟树(22.13%)、毛竹(10.17%)、桂花(9.92%)、棕榈(8.43%)、枫香(6.01%)、山茶(4.03%)、圆柏(3.72%)、广玉兰(2.60%)、罗汉松(2.60%)、女贞(2.17%)；这10个树种数量占调查总数的71.79%；但仅有樟树、桂花、棕榈这3种乡土树种应用频度在50%以上，构成整个公园的优势树种。总体来看，钱王陵公园树种丰富，但绝大多数乔、灌木应用频度低、景观单调。
从胸径结构来看，i-Tree模型主要将树种胸径划分为7个等级。由图2可知所调查群落树种胸径主要集分布在≤45.7 cm，胸径在45.70~61.00 cm的占比1.55%，胸径在61.00~76.20 cm和76.20~94.10 cm的占比都为0.06%。公园内树种胸径呈现以中小径级为主，且随着胸径增大树种数量显著减少现象。
图 2 植物群落树种胸径等级Figure 2 Plant community tree species’ diameter at breast height gradesⅠ. DBH≤7.6 cm；Ⅱ. 7.6＜DBH≤15.2 cm； Ⅲ. 15.2＜DBH≤30.5 cm；Ⅳ. 30.5＜DBH≤45.7 cm； Ⅴ. 45.7＜DBH≤61.0 cm；Ⅵ. 61.0＜DBH≤76.2 cm； Ⅶ. 76.2＜DBH≤91.4 cm2.3 群落生态效益分析
树木通过遮光、降低风速、叶片蒸腾散热等方式，起到改善小气候、节约能源的作用[20]；光合、呼吸等作用吸收CO2和水转化为有机物并释放氧气，实现碳氧循环减缓温室效应[21]；通过树冠、树叶、树皮表面对雨水进行拦截，延缓暴雨峰值，起到减少雨水径流的效果[22]。运用i-Tree模型对钱王陵公园32个植物群落节约能源、截留雨水、吸收CO2和改善空气质量生态效益价值定量评估得出(表2)：4类生态效益年总价值为208 588.16元·a−1，平均单株生态效益为129.25元·株−1·a−1。对生态效益价值贡献最大的是吸收CO2，占47.20%；节约能源效益与截留雨水效益价值相近，分别占23.10%和27.77%；改善空气质量效益最低，仅占1.93%。这4类生态效益按照价值量从高到低排名依次为吸收CO2、截留雨水、节约能源、改善空气质量。生态效益最高的是樟树+广玉兰-山茶群落(L21)，为12 777.60元·a−1，占6.13%；最低的是樟树+银杏群落(L15)，为1 203.84元·a−1，仅占0.58%。不同类型群落生态效益价值存在较大差距，对生态效益贡献最大的为针阔混交型群落，总生态效益占比为35.47%；其次是常绿阔叶型群落，占比为27.61%；常绿落叶阔叶混交型群落占比为26.17%；竹阔混交型最少，仅占10.75%。
表 2 钱王陵公园32个植物群落总生态效益Table 2 Total ecological benefits of 32 plant communities in Qianwangling Park群落 生态效益/(元·a−1) 效益
占比/
%群落 生态效益/(元·a−1) 效益
占比/
%节约
能源吸收
CO2改善空
气质量截留
雨水总生态
效益节约
能源吸收
CO2改善空
气质量截留
雨水总生态
效益L1 1 070.08 2 168.32 98.56 1 351.68 4 688.64 2.25 L18 1 830.40 3 365.12 28.16 2 400.64 7 624.32 3.66 L2 1 520.64 3 182.08 183.04 1 879.68 6 765.44 3.24 L19 1 457.28 2 872.32 49.28 1 696.64 6 075.52 2.91 L3 1 267.20 2 696.32 133.76 1 591.04 5 688.32 2.73 L20 1 584.00 2 977.92 112.64 1 809.28 6 483.84 3.11 L4 1 112.32 2 393.60 91.52 1 337.60 4 935.04 2.37 L21 2 851.20 5 850.24 232.32 3 843.84 12 777.60 6.13 L5 781.44 1 605.12 42.24 851.84 3 280.64 1.57 L22 2 175.36 4 238.08 126.72 2 745.60 9 285.76 4.45 L6 1 041.92 2 154.24 112.64 1 203.84 4 512.64 2.16 L23 1 802.24 3 808.64 161.92 2 259.84 8 032.64 3.85 L7 1 415.04 3 196.16 154.88 1 675.52 6 441.60 3.09 L24 2 245.76 4 540.80 112.64 2 520.32 9 419.52 4.52 L8 711.04 1 921.92 126.72 682.88 3 442.56 1.65 L25 1 457.28 2 949.76 112.64 1 619.20 6 138.88 2.94 L9 1 619.20 4 026.88 168.96 1 900.80 7 715.84 3.70 L26 1 760.00 3 597.44 161.92 2 316.16 7 835.52 3.76 L10 1 344.64 3 238.40 168.96 1 415.04 6 167.04 2.96 L27 2 696.32 5 005.44 253.44 3 182.08 11 137.28 5.34 L11 1 422.08 3 048.32 35.20 1 774.08 6 279.68 3.01 L28 2 041.60 4 055.04 140.80 2 907.52 9 144.96 4.38 L12 1 119.36 2 358.40 126.72 1 217.92 4 822.40 2.31 L29 1 809.28 3 013.12 197.12 1 752.96 6 772.48 3.25 L13 675.84 1 492.48 77.44 830.72 3 076.48 1.47 L30 1 506.56 3 104.64 84.48 1 844.48 6 540.16 3.14 L14 732.16 1 555.84 84.48 725.12 3 097.60 1.49 L31 1 774.08 3 372.16 133.76 2 337.28 7 617.28 3.65 L15 260.48 577.28 28.16 337.92 1 203.84 0.58 L32 2 062.72 3 548.16 239.36 2 189.44 8 039.68 3.85 L16 1 520.64 3 160.96 147.84 1 907.84 6 737.28 3.23 总计 48 188.80 98 447.36 4 019.84 57 932.16 208 588.16 100 L17 1 520.64 3 358.08 98.56 1 837.44 6 814.72 3.27 对群落各生态效益分析可知：i-Tree模型对节能效益的评估由节约电量和节约天然气效益两部分组成，其中节约电量为62 227.20 kW·h·a−1，产生生态效益为36 706.56元·a−1；节约天然气量3 560.50 m³·a−1，产生生态效益11 482.24元·a−1，节约能源的生态效益总价值为48 188.80元·a−1，单株树木平均生态效益为29.85元·株−1·a−1；节能效益最高的是樟树+广玉兰-山茶群落(L21)，为2 851.20元·a−1；最低的是樟树+银杏群落(L15)，为260.48元·a−1；从群落类型来看，节能效益总量占比最高的是针阔混交型群落，为34.84%，该类群落在节能效益价值方面优势较高。经模型计算植物群落吸收CO2总量为81 951.00 kg·a−1，产生生态效益价值98 447.36元·a−1，单株平均吸收CO2生态效益为61.04元·株−1·a−1；对不同类型群落生态效益分析可知：针阔混交型群落生态效益占比最高，为36.26%，在吸收CO2方面表现出一定优势。模型计算群落年截留雨水量为5 192.00 m³·a−1，产生生态效益为57 932.16元·a−1，单株树木平均截留雨水生态效益为35.90元·株−1·a−1。对单株树木平均截留雨水生态效益分析可以得出，针阔混交型群落中树木平均效益超过总平均生态效益的群落数量最多且效益排名靠前，说明相对其他类型该群落类型在截留雨水上具有优势。模型计算植物群落年改善空气质量生态效益为4 019.84元·a−1，单株树木平均生态效益为2.46元·株−1·a−1，明显低于以上3个功能，其中群落间接减排空气污染物[二氧化氮(NO2)、可吸入颗粒物(PM10)、挥发性有机化合物(VOC)、二氧化硫(SO2)]生态效益最高，为6 188.16元·a−1，SO2减排量最高为220.40 kg·a−1，占66.85%；群落吸附沉积空气污染物[NO2、臭氧(O3)、PM10和SO2]效益为2 731.52元·a−1，对O3的沉积效果最强，占比为58.65%；SO2的沉积效果最差仅6.14%。此外，树木自身代谢等作用会散发挥发性有机物污染(BVOCs)对空气造成污染[23]，经计算该公园群落释放BVOCs量为213.20 kg·a−1，产生生态效益−4 899.84 元·a−1，其中樟树+广玉兰-山茶群落(L21)释放量最多，为13.30 kg·a−1；从改善空气质量综合能力来看，樟树+栓皮栎群落(L27)效果最强，产生生态效益最高，为253.44元·a−1，占6.30%，同时间接减排空气污染物的能力也最为显著。综合看来，树木在间接减排空气污染物方面上更具优势。
对群落树种单株平均生态效益分析可知，排名前10位树种为落叶阔叶树和针叶树(表3)，针叶树有水杉、雪松、马尾松，其余的为落叶阔叶树。常绿阔叶树种未出现，生态效益偏低。综合树种平均胸径及各生态效益分析可知，在平均胸径相近情况下，落叶阔叶树各项生态效益高于针叶树，即落叶阔叶树在节能、吸收CO2、改善空气质量及截留雨水方面都表现出更高优势。单株平均生态效益价值由高到低排名前10位的树种为三角枫Acer buergerianum、黄山栾树Koelreuteria paniculata、水杉、栓皮栎、雪松、马尾松、山樱花、朴树Celtis bungeana、榔榆、垂柳Salix babylonica，在植物群落构建时对于落叶阔叶树和针叶树树种的选择可优先考虑。
表 3 单株平均效益前10位树种各生态效益Table 3 Per plant benefit,top ten tree species, ecological benefits效益排名 树种名称 生长类型 单株生态效益/(元·株−1·a−1) 单株平均生态效益/
(元·株−1·a−1)平均胸径/cm 节约能源 吸收CO2 改善空气质量 截留雨水 1 三角枫 BDM(落叶阔叶中型树) 119.82 300.40 18.66 119.33 558.21 35.04 2 黄山栾树 BDM(落叶阔叶中型树) 97.72 213.73 16.12 100.95 428.52 30.26 3 水杉 CDL(落叶针叶大型树) 95.46 203.03 −1.76 119.47 416.20 41.47 4 栓皮栎 BDL(落叶阔叶大型树) 79.20 177.76 12.88 76.03 345.87 37.05 5 雪松 CEL(常绿针叶大型树) 76.88 163.40 2.60 82.09 324.97 30.33 6 马尾松 CEL(常绿针叶大型树) 75.82 161.36 1.55 84.83 323.56 33.65 7 山樱花 BDM(落叶阔叶中型树) 69.98 161.43 11.26 66.81 309.48 26.50 8 朴树 BDL(落叶阔叶大型树) 79.62 130.17 13.38 78.14 301.31 27.44 9 榔榆 BDM(落叶阔叶中型树) 63.15 148.54 10.14 60.19 282.02 24.48 10 垂柳 BDM(落叶阔叶中型树) 49.63 122.78 7.88 46.96 227.25 26.48 结合表3和表4分析可知：L21群落(樟树+广玉兰-山茶群落)树种株数占比不高(排第10位)，但群落平均胸径最高，单株生态效益高的落叶阔叶树种三角枫、栓皮栎和针叶树马尾松平均胸径都较高。而L22群落(樟树+枫香+棕榈群落)树种株数占比较低，但群落平均胸径高，因此生态效益也相对较高。L24群落(樟树+枫香群落)、L27群落(樟树+栓皮栎群落)和L28群落(樟树+棕榈群落)树种株数占比相似(分别为4.4%、4.0%和4.3%)，而群落L27和群落L28相比，群落整体平均胸径相近，但群落L27中单株生态效益高的树木数量及平均胸径更具有优势，因此该群落效益更高；L24群落平均胸径偏低，但单株平均效益高树种株株多，因此生态效益也较高。在树种生长型方面，胸径＞30 cm的落叶阔叶和针叶高生态效益树种株数占比越高对生态效益贡献越大。综上分析，群落生态效益的高低主要取决于树种的株数、生长类型和平均胸径。从构建高生态效益植物群落角度出发，建议植物群落构建时以三角枫、黄山栾树、水杉、栓皮栎、雪松、马尾松等高单株生态效益的树木为优势种，以提高植物群落整体生态效益。
表 4 生态效益排名前5位群落指标分析Table 4 Analysis of the top five community indicators in benefit ranking排名 样地
编号群落
类型主要组
成树种单株生态效益排名前10树种
(株数及平均胸径)群落整体平均
胸径/(cm·株−1)群落树种株数
占比/%(排名)1 L21 常绿阔叶型 樟树+广玉兰+棕榈-山茶 三角枫(4株，胸径35.06 cm)、栓皮栎(1株，
胸径45.39 cm)、马尾松(2株，胸径39.33 cm)25.70 3.6(10) 2 L27 常绿落叶阔叶
混交型樟树+栓皮栎+女贞+棕榈+
黄山栾树+枫香黄山栾树(3株，胸径29.47 cm)、朴树(1株，
胸径32.16 cm)、栓皮栎(10株，胸径30.86 cm)20.56 4.0(5) 3 L24 常绿落叶阔叶
混交型枫香+樟树+棕榈 栓皮栎(3株，胸径16.73 cm)、马尾松(2株，
胸径36.22 cm)17.96 4.4(3) 4 L22 常绿落叶阔叶
混交型枫香+樟树+棕榈-山茶 马尾松(2株，胸径34.00 cm) 25.31 2.7(19) 5 L28 常绿阔叶型 樟树+女贞+棕榈 马尾松(1株，胸径42.61 cm)、三角枫(1株，
胸径34.98 cm)、雪松(1株，胸径28.83 cm)20.03 4.3(4) 3. 结论与讨论
本研究采用典型取样法及每木调查法对钱王陵公园32个植物群落内所有符合测量条件的乔、灌木进行实地调查。调查树木共计1 613株，分属39科62属74种。群落树种种类丰富，胸径结构分布合理，呈现出较明显上、中、下层分布。在水平结构上以混交型为主，垂直结构以复层模式为主，且表现出以针阔混交型群落为主的景观风貌。公园内存在常绿树、阔叶树数量占比远超落叶树、针叶树，树木生长类型分布不合理，多数灌木及草本植物生长状况不佳，林间凋落物堆积过厚等问题。这与公园建成时间久远缺乏管理与维护有关。从公园长远发展角度考虑，应基于该公园的纪念性特点，增加落叶树与松柏类针叶树种数和株数，营造庄重、肃穆的纪念氛围，以构建更加完善和稳定的植物群落结构体系。
钱王陵公园32个植物群落年总生态效益为208 588.16元·a−1，节约能源、吸收CO2、改善空气质量和截留雨水生态效益价值分别为48 188.80、98 447.36、4 019.84和57 932.16元·a−1，占比分别为23.10%、47.20%、1.93%和27.77%。这4类效益按照价值量高低排名为吸收CO2、截留雨水、节约能源、改善空气质量。结果与魏云龙[10]研究排名一致，其中吸收CO2生态效益最高，贡献最大。这与树种本身对CO2吸收能力较强有关。不同类型群落生态效益存在明显差异，针阔混交型群落总生态效益最高，占38.38%，表现出显著优势。这是由于该类型群落数量(占38.38%)及树种株数(占35.30%)最多，且水杉、马尾松、雪松等单株平均生态效益高的树种占比大。其次分别为常绿阔叶型、常绿落叶阔叶混交型和竹阔混交型群落；常绿阔叶型群落数量与常绿落叶阔叶混交型群落数量相同，占比为25%。常绿阔叶型群落总生态效益占比为27.61%，树种株数占24.1%；常绿落叶阔叶混交型群落总生态效益占比为26.71%及树种株数占26.20%。竹阔混交型群落在群落数量(占9.37%)及树种株数(占14.5%)上都为最少，导致生态效益占比最低为10.75%。
在城市绿地的建设过程中，i-Tree模型能从资源结构及生态效益方面对植物群落进行定量评估，将不同群落和树种的生态效益以货币形式更直观地展示出来，若将其引入城市绿地植物群落构建的“人工形成—自然进程—人工调控”的动态过程中，将使高生态效益绿地的建设更加具有科学性、高效性和便捷性。由于该模型是基于美国的生态环境而开发的，应用于本研究评估时在树种匹配上有一定的局限性，因此对于国内树种的研究以及完善更新模型基础数据库，使之能够更好地适用于本土树种，是今后重点研究方向。在生态服务功能评估上，由于i-Tree模型限制，只从节约能源、吸收CO2、改善空气质量、截留雨水等4个方面对钱王陵公园生态服务功能价值进行评估。植物群落生态服务功能的种类众多，还包括释放氧气、改良土壤及减少空气中负离子等，因此还需从深度和广度上加以进一步完善和提高。在成本参数上，模型中需要输入清除空气中O3、PM10和VOC等成本参数，因国内未有统一标准，参数获取难度大。在参照国内该模型的相关研究基础上，使用了模型的内置参数进行评估。在以后的研究中，应该建立符合国内情况的处理空气污染物和截留雨水相关参数指标，从而更加完善地运用评估模型对生态效益价值进行评估研究。
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图 1 体胚发生过程的0~40 d组织细胞学变化
Figure 1 Histocytological changes of somatic cell embryogenesis during 0 − 40 days
图 2 体胚发生过程中淀粉和总蛋白质质量浓度的变化
Figure 2 Changes of starch and total protein content during somatic cell embryogenesis
图 3 体胚发生过程中抗氧化酶活性的变化
Figure 3 Changes of antioxidant enzyme activity during somatic embryogenesis
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