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石蒜属Lycoris植物隶属百合目Liliflorae石蒜科Amaryllidaceae，具地下鳞茎，为多年生草本植物；全球约有20多种，中国有15种，主要分布在江苏、浙江和安徽等地[1]。石蒜属植物花型花色变异丰富，种间杂交亲和性高，对石蒜属植物进行遗传育种改良，极有希望选育出有中国特色的切花新品种[2]，市场前景和园林应用前景极为广阔。同时，石蒜鳞茎富含生物碱、黄酮及多糖等化学成分，药用价值较高[3-4]。目前，石蒜属植物新品种选育主要通过种间和种内杂交、自然群体选择，对其杂交种真实性的鉴定主要根据开花时花色和花型等农艺性状的变化来判断；但由于石蒜属植物生长周期长，种子播种后5~6 a才开花，早期鉴定及分类较为困难，从而影响销售和生产。
常用的杂种鉴定方法有形态标记法、生化标记法和DNA标记法等。形态标记耗时费力，易受环境条件和检测人员主观判断的影响；生化标记数目少且稳定性差，不能进行多年生植物杂交种的早期鉴定，无法满足生产和市场的需求；相比之下，DNA标记简单序列重复(SSR)、目标起始密码子多态性(SCoT)、内部简单序列重复(ISSR)、相关序列扩增多态性(SRAP)和荧光标记SSR能反映生物个体或种群间某些特异性DNA片段，不受生物自身生长阶段和环境条件的影响，标记数量较多，重复性好，开发成本低，不影响性状表达[5-7]，已在冬瓜Benincasa hispida[8]、甜菜Beta vulgaris[9] 、姜黄属Curcum植物 [10]、枇杷Eriobotrya japonica[11]等种质资源遗传多样性、杂交种鉴定、品种鉴定和分子身份证的构建等方面得到广泛应用。其中SSR标记是以PCR技术为基础、较成熟的遗传标记，但由于工作量大、精度低、分析量小，无法完成大批量样品的检测，而荧光标记SSR能准确获得目标DNA片段的大小(精确至1 bp)，检测结果稳定、准确且高效适用于大批量品种的检测分析，已被应用于落花生Arachis hypogaea [12]、高山杜鹃Rhododendron lapponicum [13]、百合属Lilium[14]、芒Miscanthus sinensis [15]等F1代杂交种真实性和纯度检测、遗传多样性分析、核心种质的构建等。石艳等[16]开发了石蒜属植物换锦花L. sprengeri的表达序列标签SSR(EST-SSR)标记，用于鉴定换锦花-中国石蒜L. chinensis杂交种，为石蒜属种间杂交种F1的鉴定提供了借鉴。为进一步完善石蒜属植物种间杂交种F1的鉴定技术，本研究筛选了15对EST-SSR引物，通过EST-SSR荧光标记毛细管电泳技术构建亲本换锦花、石蒜L. radiata、中国石蒜以及石蒜-换锦花、石蒜-中国石蒜杂交种等78个样品的分子身份证，并进行杂交种真实性鉴定，为石蒜属植物的亲缘关系分析、品种选育、杂交种早期鉴定及资源保护和利用等提供理论参考。
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石蒜、中国石蒜、换锦花及石蒜-中国石蒜、石蒜-换锦花杂交种F1共78个样品，均栽植于浙江农林大学石蒜属种质资源圃，于2020年8—9月盛花期采集各材料花瓣。
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采用改良CTAB法提取供试材料花瓣基因组DNA，用Nanodrop 2000测定DNA的质量和浓度，经质量浓度为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照。
分别以亲本(中国石蒜、石蒜和换锦花)基因组DNA为模板，从59对石蒜属植物通用EST-SSR引物中筛选条带清晰、重复性好且具多态性的引物进行扩增[16]。EST-SSR PCR扩增反应体系(10.0 μL)为：Taq DNA聚合酶1.0×16.67 nkat，氯化镁(MgCl2) 1.0 mmol·L−1，dNTPs 0.2 mmol·L−1，引物0.8 μmol·L−1，DNA 40 ng。PCR反应程序为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 S，退火温度30 S，72 ℃延伸30 S，35次循环；72 ℃延伸10 min；16 ℃保温30 min。用质量浓度10.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离银染显色检测扩增反应产物，显色后记录观察拍照。
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从59对多态性引物中筛选到15对具多态性的EST-SSR引物(表1)，在正向引物中分别加注FAM (蓝)、HEX (绿)、TAMRA (黄)和ROX (红)荧光，对78个样品进行多重PCR扩增。利用遗传分析仪(ABI 3730XL，ThermoFisher Scientific，美国)进行毛细管电泳检测分析。根据电泳结果，选择在亲本(中国石蒜、石蒜和换锦花)种内一致、种间具多态性、特异、单一且重复性好的引物用于杂交种鉴定。比较亲本与杂交种F1的 EST-SSR PCR扩增产物，杂交种F1具有父母本互补型或有变异型扩增带型的样品鉴定为真实杂种。计算杂交种鉴定率=真实杂交种样本数/样本总数×100％。
表 1 15 对EST-SSR引物序列和PCR产物
Table 1. Sequences and PCR products of 15 pair of SSR primers
引物 标记荧光 引物序列 (5′→3′) 重复单元 产物长度/bp 退火温度/℃ SSR7 ROX TCATGCATCGCACATGTCAC/AATGTAACCGGTCGCTCCAG (GGA)5 181 52.0 SSR15 FAM GACGCCCAAACAGCCAATTT/TGGAAAGGTTGAGCTTCGGG (CCT)5 247 52.0 SSR20 TAMRA ACAAGTTGGCCCTGTTGTCA/CATTCGATCACTCGGTCCGT (TCT)5 115 53.2 SSR32 TAMRA CCAGTCGTTCCGTTCCATCA/CTGCTGCACTTGTTCCCAAC (TTC)5 165 52.2 SSR85 TAMRA TCAACACAAGTGTCATTTCCAAT/ATGGCCCATTCAAGGTTGGT (TTA)6 108 52.6 SSR96 TAMRA CCGGCCTACAACAAAGGTCT/AAACTGTTGCAGCGACCATG (GGT)5 154 52.0 SSR115 FAM ATTCTGATCGGCGAAGGAGG/ATTTGCAAGGCGGTCAGAGA (GGC)5 235 49.0 SSR138 ROX TCACGAGAGAGGAGGGAGAA/CTCCTTGCGGATCATGGTGT (CAA)5 211 52.0 SSR142 ROX TGTCAGTTGATGGGCTTCGG/TGGTTGCAGTGACAGTTGGT (CCA)5 174 53.0 SSR147 FAM CCAAACAGCAGCTCAAGCAG/TTCGGTTTCGAGATTGGGGG (CCG)5 248 52.8 SSR198 FAM TCAGGGAATAAACCTCCGCC/ACTTGCTATCCTTGGGGCTT (ATC)5 223 51.7 SSR203 ROX ACGTGAGCAGTCCTCCTACT/GACATGCCCACTTCTCCCAA (GAG)5 204 52.0 SSR220 FAM ACTGGTGTCACTTGTGTGCA/GCTGGGCTCCCATCATTTCA (GAT)5 225 51.0 SSR221 HEX ATCTTGAGCTGCGTGTCGAA/CTCATCCACGCCTTCTCCTC (TTG)5 254 52.2 SSR253 HEX CGCCCGTGCAATTTCAAGTT/GCAAGTTGGCAACTCCACAG (AAT)5 277 52.4 -
利用Gene mapper 4.1软件整理分析EST-SSR荧光标记的毛细管电泳数据，根据每个引物对每个样品扩增后有无峰，转化成0/1格式的二元矩阵，无信号或数据缺失赋值“2”。利用POPgene 1.32计算观测等位基因数(Na)，有效等位基因数(Ne)，Nei’s基因遗传多样性指数(H)，Shannon’s指数(In)和多态性信息量(PIC)。使用NTsys2.10e计算石蒜属亲本及杂交种的Nei’s 遗传距离和SM遗传相似系数，并用非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析。
参照徐雷峰等[14]方法将获得的荧光标记EST-SSR多态性数据转换为数字(1~9)表示，当基因型数大于9时，用小写字母(a、b、c
$、\cdots $ )依次表示，无带用0表示。按照引物扩增带型数由少到多的顺序，记录各样品在15对引物上的扩增带型数据，通过个位数字或小写字母编码构建各杂交种的分子身份证。 -
荧光毛细管电泳检测发现：15对引物在25个样品中均能获得大小精确的DNA片段，筛选其中具有种内一致性且种间多态性的4对引物。由表2可知：SSR203和SSR15在3个亲本中均能得到特征条带，SSR32可在石蒜和中国石蒜中得到特征条带，SSR198可在石蒜和换锦花中得到特征条带。因此SSR203、SSR115和SSR198用来鉴定石蒜-换锦花杂交种(包括正交和反交)的真实性，SSR203、SSR115和SSR32可鉴定石蒜-中国石蒜杂交种的真实性。
表 2 4个荧光标记EST-SSR引物在石蒜属亲本上的特征条带
Table 2. Characteristic bands of 4 fluorescent labeled EST-SSR primers on the parents of Lycoris
引物 条带长度/bp 换锦花 石蒜 中国石蒜 SSR203 204 189 195 SSR115 226 230 228 SSR32 175 169 SSR198 228 221 -
利用SSR203、SSR115和SSR198对27个石蒜-换锦花杂交种F1代进行鉴定。由表3可知：SSR203从石蒜-换锦花杂交F1后代群体中鉴定到88.46%的真实杂交种，其中具有双亲特征条带(189/204 bp)的占69.23%，出现特异条带的有19.23%；SSR115从石蒜-换锦花杂交种F1群体中鉴定到84.61%的真实杂交种，其中具有双亲特征条带的占53.85%，出现特异条带的占30.77%；SSR198只鉴定到53.85%的真实杂交种。分别利用SSR203+SSR115、SSR203+SSR115+SSR198进行多重PCR，从石蒜-换锦花正反交F1杂交群体中均鉴定到96.30%的真实杂交种，大于SSR203+SSR198 (88.89%)和SSR115+SSR198 (88.89%)组合的鉴定结果。因此采用SSR203+SSR115和SSR203+SSR115+SSR198可以早期鉴定石蒜-换锦花杂交种F1的真实性。
同样，利用引物SSR203、SSR115和SSR32对石蒜-中国石蒜杂交种F1进行鉴定。SSR203鉴定石蒜-中国石蒜杂交种F1的真实杂交种占80.77%，其中具有双亲特征条带(175/169 bp)的占42.31%，具变异条带的有38.46%；SSR115和SSR32鉴定石蒜-中国石蒜杂交种F1群体的真实性分别为50.00%和69.23%。采用SSR203+SSR115、SSR203+SSR32和SR203+SSR115+SSR32多重PCR扩增，石蒜-中国石蒜杂交种F1群体的真实杂交种鉴定效率均达96.15%，高于SSR115+SSR32鉴定效率(76.92%)。因此可用SSR203+SSR115、SSR203+SSR32和SSR203+SSR115+SSR32对石蒜和中国石蒜杂交种真实性进行鉴定。
为节省成本，缩短育种周期和减少工作量，本研究采用SSR203+SSR115对石蒜-换锦花、石蒜-中国石蒜杂交种F1代进行早期鉴定。
表 3 EST-SSR引物对石蒜属种间杂交种鉴定
Table 3. Identification of interspecific hybridization of Lycoris by EST-SSR primers
引物 石蒜-换锦花杂交种的真实鉴定率/% 引物编号 石蒜-中国石蒜杂交种的真实鉴定率/% SSR203 88.46 SSR203 80.77 SSR115 84.61 SSR115 50.00 SSR198 53.85 SSR32 69.23 SSR203+SSR115 96.30 SSR203+SSR115 96.15 SSR203+SSR198 88.89 SSR203+SSR32 96.15 SSR115+SSR198 88.89 SSR115+SSR32 76.92 SSR203+SSR115+SSR198 96.30 SSR203+SSR115+SSR32 96.15 -
筛选出的15对荧光标记EST-SSR引物在78个样品中扩增效果较好(表4)，共得到扩增条带92条，扩增条带最多的是SSR32 (10条)，最少的是SSR21 (2条)，平均6.13条。多态性信息量(PIC)为0.6923~1.0000，其中SSR253最小(0.6923)，SSR20和SSR142最高(1.0000)，平均为0.9137。所有PIC值均大于0.500 0，说明均为高多态性引物，可反映杂交种间遗传差异和遗传多样性。
表 4 EST-SSR引物扩增条带的等位基因数和多态性信息量
Table 4. Number of alleles and polymorphism information of 15 EST-SSR primers
引物 Na Ne H In PIC 扩增条带/条 引物 Na Ne H In PIC 扩增条带/条 SSR7 1.974 4 1.291 4 0.218 1 0.369 4 0.974 4 6 SSR142 2.000 0 1.270 5 0.210 7 0.364 2 1.000 0 8 SSR15 1.833 3 1.167 7 0.136 8 0.250 2 0.833 3 7 SSR147 1.987 2 1.678 3 0.387 6 0.570 2 0.987 2 3 SSR20 2.000 0 1.382 5 0.273 1 0.440 4 1.000 0 5 SSR198 1.782 1 1.203 0 0.156 8 0.273 1 0.782 1 6 SSR32 1.987 2 1.193 0 0.159 5 0.293 1 0.987 2 10 SSR203 1.974 4 1.378 7 0.264 2 0.426 8 0.974 4 5 SSR85 1.897 4 1.212 6 0.168 0 0.298 0 0.897 4 6 SSR220 1.974 4 1.294 5 0.219 9 0.371 7 0.974 4 6 SSR96 1.871 8 1.082 1 0.259 2 0.409 8 0.871 8 5 SSR221 1.910 3 1.643 6 0.377 0 0.550 5 0.910 3 2 SSR115 1.846 2 0.214 9 0.167 3 0.292 0 0.846 2 7 SSR253 1.692 3 1.096 4 0.083 7 0.164 6 0.692 3 9 SSR138 1.974 4 1.252 8 0.196 0 0.340 9 0.974 4 7 平均 1.913 7 1.224 1 0.218 5 0.361 0 0.913 7 6.13 -
以15对荧光标记EST-SSR标记扩增结果计算遗传相似系数并进行UPGMA聚类分析。由图1可知：各样品遗传相似系数为0.76~0.98，在相似系数为0.77处25个亲本和53个杂交种聚为Ⅰ和Ⅱ两大类，Ⅰ类主要为换锦花、石蒜-换锦花杂交种，但包含了58、60、61、64和66等石蒜-中国石蒜杂交种，且与石蒜-换锦花杂交种聚在一起，推测5个杂交种的母本可能是石蒜。Ⅱ类包括Ⅱa(石蒜)、Ⅱc(中国石蒜)、Ⅱb(中国石蒜-石蒜杂交种)等3个亚类，说明本研究所用的15对荧光标记EST-SSR可用作石蒜、中国石蒜、换锦花及种间杂交种的早期鉴定。
图 1 基于荧光标记EST-SSR的石蒜属亲本和杂交种的聚类图
Figure 1. Cluster diagram of Lycoris parents and hybrids based on EST-SSR
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由表5可知：15对荧光标记EST-SSR引物扩增各样品，共得到153种带型，平均每条扩增10.2带型，其中SSR221扩增带型最少(2种)，SSR32扩增带型最多(30种)。根据表4对15对荧光标记EST-SSR引物扩增得到的基因型或带型赋值并排序，以此对各样品的扩增情况编码分子身份证，扩增条带位置相同则编码符号相同，说明基因型相同。由表6可知：各亲本和各杂交种均具有唯一的分子身份证，15对荧光标记EST-SSR引物可有效鉴别石蒜属亲本和种间杂交种。
表 5 15对荧光标记EST-SSR引物在亲本及杂交种F1上的扩增带型
Table 5. Amplification patterns of 15 pairs of fluorescent labeled EST-SSR primers on parents and hybrid F1
基因型数 SSR15 SSR253 SSR138 SSR32 SSR20 SSR142 SSR198 SSR85 SSR147 SSR7 SSR220 SSR221 SSR96 SSR203 SSR115 0 − − − − − − − − − − − − − − − 1 241 263/268 202 166/172 116 247 220/228 83/105 245 173/188 224 249/255 149/154 189 226 2 241/244 269 202/206 166/175 117/120 247/253 221 89/94 245/248 182 224/228 255 151 189/195 226/228 3 242 272/277 202/209 166/181 118 247/254 221/228 100 245/251 182/185 224/234 151/154 189/204 226/230 4 242/250 274 206 166/188 118/121 247/256 221/230 107/110 248 182/188 224/237 151/156 195 226/231 5 244 274/277 206/209 169 171/120 247/259 222/228 108 251 185/188 224/244 151/157 195/204 226/242 6 244/246 274/279 206/212 169/172 121 247/260 228 108/110 188 228 154 201/207 227/231 7 244/250 277 206/215 169/175 247/262 229 110 191 228/237 154/156 204 228 8 245 277/279 206/218 169/178 247/267 230 203 237 154/157 207 228/230 9 246/254 278 209 169/188 247/270 238/244 156 230 a 248 279 209/215 169/191 270 157 230/242 b 250 291 209/212 169/194 231 c 250/254 212 172 237 d 254 212/215 172/175 e 215 172/178 f 215/221 172/181 g 172/191 h 175 i 175/178 j 175/188 k 175/191 l 175/194 m 178 n 178/185 o 178/188 p 178/191 q 185 r 185/188 s 188 t 188/191 u 188/194 说明：基因型数用1~9表示，大于9时用小写字母依次表示，0表示无条带；−表示没有带型 表 6 石蒜、中国石蒜、换锦花及种间杂交种分子身份证代码
Table 6. Molecular ID codes of parent L. radiata, L. chinensis, L. sprengeri and interspecific hybrids
编号 亲本 编号 石蒜-换锦花杂交种 编号 中国石蒜-石蒜杂交种 1 6aek3267522161a 26 574n37053312833 53 eb8m31013242120 2 5a4e3467331131a 27 57fi43053412330 54 50b74177124232a 3 7a7k32a7542231a 28 5b4p44653312423 55 a1b737063342300 4 7a7k4267342131a 29 525q4177023230a 56 82b73777335234b 5 2ad14467322241a 30 57bi42363321b43 57 3b7i31071341310 6 7adj4767521131a 31 57bn44051211040 58 544c61051342541 7 ca423767321171a 32 57fi43351312433 59 104737671642328 8 ca4e3467531231a 33 5bbi44161212031 60 507764053212633 9 77fi6467536271a 34 507u42365212b33 61 5b4344053212431 10 5afi3267332271a 35 505662663222733 62 50b737771342328 36 74d427353232333 63 02dc42771342728 11 53am25451212a71 37 52aa22051212252 64 52bf2277335283b 12 537m45451212a71 38 57bt22353212336 65 e07741771342328 13 54ap62251312b71 39 5bbf21353222833 66 2a838703252738 14 542p61451212b71 40 5bbh63361222633 67 0bfc3a77327232a 15 543u63251312b71 41 525841061252275 68 70f731a3367272a 16 55a243251312a71 42 fafg42b53322314 69 d0ek34a73312728 17 50ao63251312871 43 566421b61212734 70 d0d743a7122261c 18 57a225a51212a71 44 0abs17765222533 71 50bd4346326262c 19 557t22251312b71 45 5afu4216122208d 72 00c047a03262328 20 5ae442251312b71 46 075k64653212333 73 00bi33703562080 47 0bbt35353312833 74 5b4r47703312060 21 e00d31062022040 48 50bm43353112334 75 1bfl44704312060 22 00053a042082047 49 40f743a73242738 76 0cf747005312080 23 0015380717a2247 50 504d24251212733 77 8b6d42703572060 24 0015380417a2247 51 50bi41851222433 78 5bb641771342080 25 00c531001682247 52 504l44b53212634 说明：1~10为换锦花；11~20为石蒜；21~25为中国石蒜；26~52为石蒜-换锦花杂交种；53~78为石蒜-中国石蒜杂交种 -
SSR荧光标记在毛白杨Populus tomentosa[17]和建兰Cymbidium ensifolium [18]等核心种质构建、落花生[12]和山茶属Camellia植物[19]等分子身份证构建以及三叶青Tetrastigma hemsleyanum [20]、杂交兰[21]等种质资源遗传多样性研究中得到验证。本研究表明：利用荧光标记EST-SSR检测石蒜属各亲本及杂交种的真实性、分析其间遗传关系，精准高效，结果可靠。
本研究利用15对荧光标记EST-SSR引物从石蒜、中国石蒜、换锦花和种间杂交种共78个样品中扩增到92个条带，平均每对引物6.13条；15对ESR-SSR引物多态性信息量均大于0.5000，平均为0.9137，较好地反映了杂交种间的遗传差异和遗传多样性，与茶Camellia sinensis[22]、百合[14, 23]等的研究结果类似。利用荧光标记EST-SSR引物鉴定石蒜-换锦花、石蒜-中国石蒜杂交种F1代，发现SSR203+SSR115等引物对杂交种鉴定的真实性分别达96.30%和96.15%，与SSR203+SSR115+SSR198和SSR203+SSR115+SSR32等引物鉴定结果相同，因此用SSR203+SSR115引物对石蒜-换锦花、石蒜-中国石蒜杂交种F1进行鉴定，可大大缩短育种周期，减少工作量并节约成本。
分子身份证构建以 DNA 指纹图谱为基础，是识别种质资源的标志，可以更加简单明了地识别和检索种质资源[24]。本研究利用15对荧光标记EST-SSR引物共扩增出92个条多态性条带，153种带型，按照统计方便、书写简洁、字符串长短适中、易于检索及充分利用引物的原则，采用基因型赋值编码法[14]对石蒜属亲本和杂交种单一位点带型或杂合带型进行编码，构建石蒜属植物亲本和杂交种的分子身份证，较好地区分了78份石蒜属植物材料，说明该方法适用于石蒜属植物的鉴定。
以RAPD、ISSR和SCoT等分子标记技术分析石蒜属植物种质资源的遗传多样性，建立遗传距离和遗传相似系数矩阵，构建相应分子树状图和指纹图谱[2, 25-26]，其目的主要是为了杂交种的亲本配制、野生资源的高效利用等。本研究利用15对荧光标记EST-SSR引物扩增了78个石蒜属植物的遗传物质，发现各样本遗传相似系数为0.76~0.98；UPGMA聚类分析发现：相似系数为0.77时，25个亲本和53个杂交种聚为两大类，Ⅰ类包括亲本换锦花、石蒜-换锦花的杂交种，Ⅱ类又分为Ⅱa、Ⅱb和Ⅱc 等3个亚类，包括石蒜、中国石蒜-石蒜杂交种和中国石蒜，说明15对荧光标记EST-SSR可将石蒜、中国石蒜、换锦花及种间杂交种有效聚类，结合杂交种的遗传多样性认为：荧光标记EST-SSR可有效鉴定石蒜属杂交种F1，并厘清其间的遗传关系。
Construction of molecular identification card of Lycoris interspecific hybrids
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摘要:
目的 鉴定石蒜属Lycoris种间杂交种F1的真实性。 方法 利用荧光标记表达序列标签简单序列重复(EST-SSR)方法，构建亲本石蒜L. radiata、中国石蒜L. chinensis、换锦花L. sprengeri和石蒜-中国石蒜、石蒜-换锦花杂交种F1共78个样品的分子身份证，并分析遗传关系。 结果 15对多态性强的荧光标记EST-SSR引物得到扩增条带92条，每对引物平均扩增6.13条；多态性信息量(PIC)为0.6292~1.0000，平均为0.9137。引物SSR203+SSR115对石蒜-换锦花、石蒜-中国石蒜杂交种F1代的真实性鉴定率分别为96.30%和96.15%。非加权组平均法(UPGMA)聚类分析表明：石蒜、中国石蒜、换锦花及其种间杂交种的遗传相似系数为0.76~0.98，在相似系数为0.77处25个亲本和53个杂交种聚为Ⅰ和Ⅱ两大类，Ⅰ类包括亲本换锦花、石蒜-换锦花杂交种，Ⅱ类包括石蒜、中国石蒜以及中国石蒜-石蒜杂交种，Ⅱ类又可分为Ⅱa、Ⅱb和Ⅱc等3个亚类。利用荧光标记EST-SSR基因型编码，构建了78个石蒜属亲本及杂交种的分子身份证。 结论 荧光标记EST-SSR可用于石蒜属种间杂交种的早期鉴定。图1表5参26 -
关键词:
- 石蒜属 /
- 杂种鉴定 /
- 简单序列重复(SSR) /
- 分子身份证
Abstract:Objective This study is aimed to identify the authenticity of F1, an interspecific hybrids among Lycoris. Method With 78 samples collected of F1, an interspecific hybrids among L. radiata, L. chinensis and L. sprengeri, expressed sequence tag simple sequence repeat (EST-SSR) was employed to construct their molecular identification cards before an analysis was conducted of their genetic relationships. Result fluorescence labeled EST-SSR primers yielded 92 amplified bands that averaged 6.13 per pair; polymorphism information (PIC) was 0.629 2 to 1.000 0 and averaged 0.913 7. The authenticity identification rate of primers SSR203+SSR115 for the F1 generation of L. radiata-L. sprengeri and L. chinesis-L. radiata was 96.30% and 96.15%, respectively. UPGMA cluster analysis showed that the genetic similarity coefficients of parents (L. radiata, L. chinensis and L. sprengeri) and their hybrids ranged from 0.76 to 0.98, and with the similarity coefficient being 0.77, the 25 parents and 53 hybrids could be clusted into 2 groups, namely group Ⅰ and group Ⅱ. Group Ⅰ included L. sprengeri parents and hybrids between L. radiata and L. sprengeri whereas group Ⅱ, including L. radiata, L. chinensis and the hybrids between L. radiata and L. chinensis, could be divided into three subclades: Ⅱa, Ⅱb and Ⅱc. The unique molecular identity cards of 78 Lycoris parents and hybrids were constructed based on the fluorescent EST-SSR genotypes coding. Conclusion Fluorescence labelled EST-SSR can be used for early identification of interspecific hybrids in Lycoris, which can provide important reference for variety identification and cross breeding of Lycoris. [Ch, 1 fig. 5 tab. 26 ref.] -
Key words:
- Lycoris /
- hybrid identification /
- EST-SSR /
- molecular identification card
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棉纤维是由外珠被表皮层的单细胞分化发育而成，分为长绒(lint)和短绒(fuzz)2种，长绒是高级棉纱纺织品的主要原材料，短绒主要用做制作纤维素、絮棉、纸张及纺织品的原料。在已有的四倍体棉种中，陆地棉Gossypium hirsutum和海岛棉Gossypium barbadense已经被驯化为栽培种[1-3]。目前世界上97%的棉纤维都产自陆地棉，产量高且适应性广，但是纤维品质中等；海岛棉产量低，适应性差，栽培范围不广泛，但是其纤维更长且品质高。如何获得优质高产的棉种，一直是遗传育种学家关注的焦点。而随着遗传学、细胞学和分子生物学等学科的交叉融合，棉纤维生长发育分子机制已成为国内外研究的热点。探明棉花种子表皮细胞生长发育的分子基础，对于提高棉花产量及改良纤维品质至关重要。早期有关棉纤维发育研究大多集中于遗传定位。大量与纤维品质和产量相关的数量性状位点(QTL)通过图位克隆的方法被发现于各个染色体[4-5]，而光子显性基因Li1，Li2，N1和Fbl以及光子隐性基因n2，sma-4(fz)和sma-4(ha)[6]等一直备受关注。近年来，深度测序技术的兴起，对棉纤维发育的分子机制的研究起了有效的推动作用。随着深度测序技术的不断革新，棉花全基因组测序不断完善[7]，全基因组微卫星序列得以注释[8]，单核苷酸多态性(SNP)芯片的开发成为可能[9]，使得遗传定位工作更加便捷[9-10]。转录组学、蛋白组学及表观遗传学领域三方位的深度测序有效构建了核糖核酸(RNA)水平和蛋白质水平、编码区域和非编码序列之间的联系，并发现一系列的转录因子、编码转脂蛋白的基因、钙信号转导相关基因、多糖合成相关蛋白、大量的微核糖核酸(miRNA)以及脱氧核糖核酸(DNA)甲基化作用等共同参与棉纤维发育过程[11-16]。本文将从棉纤维发育各时期的形态结构变化及特征，经典遗传学研究，深度测序技术在转录组学、蛋白组学及表观遗传学领域的运用，以及棉纤维发育各个时期所涉及的相关调控基因等4个方面对棉纤维发育机制的研究进展进行综述。
1. 棉纤维发育各时期的形态结构变化特征
棉纤维细胞发育进程是一个多基因调控的有序的系统发生过程，整个细胞分化过程可被分为棉纤维起始、伸长、次生壁合成与增厚、脱水成熟等4个时期[17-20]。
1.1 棉纤维起始期
长绒纤维细胞一般在开花前或开花当天就开始突起，而短绒纤维的突起要稍迟几天，两者的分化过程基本相似[21]。RAMSEY等[22]通过观察开花前16 d到开花当天胚珠的亚显微结构，发现开花前16 d到前3 d表皮细胞无差异，说明纤维原始细胞的分化与突起晚于开花前3 d。而在开花前2~3 d纤维原始细胞受生长素(IAA)和赤霉素(GA3)的刺激开始产生纤维[11]，开花当天，纤维原始细胞的分化与突起已基本完成。棉花纤维原始细胞分化与突起多少决定种子表面纤维数量，从而决定了棉纤维的产量。
1.2 棉纤维伸长期
研究发现一般只有25%~30%的棉花种子表皮细胞(约2万个)能正常突起伸长，形成成熟的纤维[23-24]。棉纤维的伸长几乎和突起同时进行，从开花当天开始，发生在细胞壁膨胀过程，纤维的最终长度取决于纤维伸长速率和持续时间2个方面[25]，一般持续20~30 d，该过程通过一种扩散生长机制实现并指导纤维细胞的极化生长[26-27]。纤维伸长分为非极性膨胀和极性伸长2个阶段：非极性膨胀期决定了纤维的细度，纤维细胞向四周扩展直至形成纤维的最终直径[28]；极性伸长期可使纤维长度达到最终长度的80%[29]，这一时期生化反应最为活跃，主要决定纤维的长度，是影响纤维品质的关键时期[24]。
1.3 棉纤维次生壁合成与增厚期
棉纤维次生壁合成与增厚期和纤维伸长期存在一段时期的重叠[17]，在开花后16 d开始，持续到开花后40 d，在这段时期，纤维素大量沉积，次生壁不断加厚[30]。伴随着纤维素沉积的加速，纤维伸长逐渐减弱，该过程是影响纤维强度和韧性的关键时期。
1.4 棉纤维脱水成熟期
在次生壁合成与增厚期后就进入了纤维脱水成熟期，发生在开花后40~50 d，棉铃开裂至充分吐絮，纤维失水，形成转曲[31]。成熟的棉纤维由外向内依次为初生壁、次生壁和中腔。
2. 棉花纤维生长发育的遗传学研究
遗传规律研究和基因遗传定位是经典遗传学中2项重要的基础工作。在棉纤维遗传规律研究中发现，相同性状的材料基因型不同，其遗传模式也不同，而棉纤维发育相关基因的遗传定位又可被分成质量性状和数量性状(QTL)的定位。
2.1 棉纤维遗传规律研究
CARVER[32]和KEARNEY等[33-34]研究发现棉花光子性状主要由2对独立的位点控制，显性光子基因(N1)和隐性光子基因(n2)，宋丽等[35]证实这2种光子基因均符合单基因遗传模型。既无长绒也无短绒的L40突变体的光子性状为不完全显性[36]。既无长绒也无短绒的突变体Xu142 fl的短绒的发育受N1和n2 2对基因控制，长绒的发育受Li3基因位点控制[37]。陆地棉短绒突变体Li1和Li2均为单基因显性遗传[38-40]。孙亚莉等[41]选取大量的陆地棉和海岛棉的光子材料对棉花光子性状进行了遗传分析，其研究发现棉花短绒多少与生态环境有关系，且不同品种光子材料的遗传模式也不同，不论海岛棉还是陆地棉材料均存在显性、部分显性和隐性遗传。对3个陆地棉隐性性状的材料进一步研究表明：这3个材料的遗传规律均不同，‘库光子’的光子性状由2对隐性等位基因控制，并且有互补效应；‘陆无絮’的光子性状由2对隐性等位基因控制，基因间呈积加作用；SA65的光子性状由单隐性基因控制。
2.2 棉纤维基因的QTL定位
纤维品质性状包括长度、整齐度、伸长率、强度、细度、颜色和马克隆值等多个方面。随着分子标记的不断开发与应用，在棉花染色体A组和D组染色体上都有大量棉纤维品质和产量相关的QTL被发现(表 1)。从表 1可知：纤维品质和产量性状的QTL几乎遍布了每一条染色体，且不同实验室使用不同的群体所得到的结果也有很大差异。同时，研究也发现这些性状受环境的影响很大，某些QTL在不同环境条件下有变化，甚至检测不到，导致已定位的QTL间重复性差[10, 42]，这也说明纤维品质及产量性状的遗传非常复杂。研究也发现了一些稳定的主效QTL，如第10号染色体的棉纤维强度主效QTL(FS1)，解释了超过30.00%的表型变异[43]；第19号染色体影响衣分的QTL(qLI17)，解释24.30%的表型变异[34]；第8号染色体上颜色相关QTL(Ge6_Rd_8_3_10.60_[+])，解释48.00%的表型变异[5]；以及第14号染色体上与长度相关的QTL(qFL-Chr14-3)，解释15.05%的表型变异[10]，等等。此外，有些QTL虽然微效，但在不同环境下都能稳定存在，比如WANG等[42]在8，11，12和21号染色上发现的6个QTL：qFL-A8-1(长度相关)，qFS-A8-1(强度相关)，qFS-A12-1(强度相关)，qFS-A12-2(强度相关)，qFS-D11-1(强度相关)和qFM-A11-1(马克隆值相关)。这些稳定存在的QTL都值得科研工作者进一步关注和研究。
表 1 不同群体中与棉纤维品质和产量相关的QTL分布Table 1. QTL related to cotton fiber quality and yield in different populations性状 QTL所在染色体或连锁群 检出限(LOD) 变异率1% 群体 出处 长度 Chr04，Chrl8，Chr22 2.00~2.74 7.80~12.60 陆地棉TM-1×海岛棉3-79的F2群体 KOHEL等[44] Chr20，LGA02(Chr08)，LGA03 (Chr11)，LGA05 2.63~5.40 2.90~13.70 陆地棉Siv’ on×海岛棉F-177的F2和F3群体 PATERSON等[4] Chr04 3.50 24.00 陆地棉Acala 44×海岛棉Pima S-7的F2群体 MEI等[45] Chr01，Chr03，Chr04，Chr06，Chr09，Chr13，Chr14，Chr18，Chr19，Chr20，Chr21，Chr23，Chr24，Chr26 3.30~9.50 6.00~40.00 陆地棉Guazuncho-2×海岛棉VH8-4602RIL LACAPE等[5] Chr05，Chr07，Chr08，Chr11，Chr12，Chr19，Chr21，Chr23，Chr26 4.57~6.05 2.47~8.49 陆地棉TM-1×海岛棉Hai7124的CSILs群体 WANG等[42] Chr10，Chr14，Chr15 2.50~7.71 6.21~15.05 陆地棉HS46 ×陆地棉MAR CABU-CAG8US-1-88 RIL LI等[10] 整齐度 Chr04，Chr14，Chr15，Chr22，LGA03 (Chr11)，LGA05 1.65~3.79 2.10~13.30 陆地棉Siv’on×海岛棉F-177的F2和F3群0体 PATERSON等[4] Chr05，Chr09，Chr12，Chr15，Chr16，Chr18，Chr19，Chr20，Chr23，Chr26 3.50~7.80 9.00~32.00 陆地棉Guazuncho-2×海岛棉VH8-4602 RIL LACAPE等[5] Chr09 2.68~4.17 5.58~10.94 陆地棉HS46 ×陆地棉MARCABU- CAG8US-1-88的RIL LI等[10] 伸长率 Chr05，Chr10，Chr15，Chr23，LGA02 (Chr8)，LGA03(Chr11)，LGD07 2.32~5.77 3.40~8.90 陆地棉Siv’on×海岛棉F-l77的F2和F3群体 PATERSON等[4] Chr09 5.16 42.00 陆地棉Acala 44×海岛棉Pima S-7的F2群体 MEI等[45] Chr02，Chr06，Chr09，Chr10，Chr12，Chr13，Chr15，Chr19，Chr20，Chr21，Chr23，Chr26 3.40~6.70 6.00~21.00 陆地棉Guazuncho-2×海岛棉VH8-4602RIL LACAPE等[5] Chr14，Chr20，Chr24 2.49~7.80 5.35~32.28 陆地棉HS46 ×陆地棉MARCABU-CAG8US-1-88 RIL LI等[10] 强度 Chr03，Chr14，Chr15，Chr25 2.08~2.69 10.40~23.10 陆地棉TM-1×海岛棉3-79的F2群体 KOHEL等[10] Chr10 4.79~5.80 53.00~53.80 异质棉7235×陆地棉TM-1的F2群体 ZHANG等[43] Chr01，Chr04，Chr14，Chr17，Chr18，Chr20，Chr22，Chr23，Chr25，LGA01 (Chr13)，LGA02(Chr08)，LGA03(Chr11)，LGA05，LGD02(Chr21)，LGD03(Chr24)，LGD04，LGD07 0.21~6.22 2.50~17.40 陆地棉Siv’on×海岛棉F-177的F2和F3群体 PATERSON等[4] Chr03，Chr04，Chr05，Chr07，Chr09，Chr12，Chr14，Chr15，Chr16，Chr18，Chr19，Chr21，Chr23，Chr26 3.30~8.50 7.00~31.00 陆地棉Guazuncho-2×海岛棉VH8-4602RIL LACAPE等[5] Chr05，Chr07，Chr08，Chr09，Chr11，Chr12，Chr13，Chr14，Chr15，Chr16，Chr17，Chr18，Chr21，Chr23 7.32~22.54 5.07~15.82 陆地棉TM-1×海岛棉Hai7124的CSILs群体 WANG等[42] 细度 Chr01，Chr02，Chr03，Chr12，Chr16，LGD01 2.16~4.04 16.70~43.90 陆地棉TM-1×海岛棉3-79的F2群体 KOHEL等[44] Chr02，Chr04，Chr05，Chr06，Chr09，Chr14，Chr15，Chr17，Chr20，Chr23，Chr25，LGA01 (Chr13)，LGA05，LGA06，LGD01，LGD02(Chr2l)，LGD03(Chr24)，LGD04，LGD05，LGD07 2.21~9.78 2.20~30.30 陆地棉Siv’on×海岛棉F-l77的F2和F3群体 PATERSON等[4] Not determined 5.11 43.20 陆地棉Acala 44×海岛棉Pima S-7的F2群体 MEI等[45] Chr01，Chr02，Chr03，Chr04，Chr05，Chr06，Chr08，Chr09，Chr10，Chr12，Chr15，Chr16，Chr17，Chr18，Chr19，Chr20，Chr21，Chr22，Chr23，Chr24，Chr25，Chr26 3.30~8.90 6.00~41.00 陆地棉Guazuncho-2×海岛棉VH8-4602RIL LACAPE等[5] 颜色 Chr06，Chr09，Chr14，Chr17，Chr18，Chr22，Chr25，LGA01，LGA02，LGA03，LGD02(Chr21) 2.66~11.67 2.50~14.90 陆地棉Siv’on×海岛棉F-177的F2和F3群体 PATERSON等[4] Chr01，Chr02，Chr06，Chr07，Chr08，Chr09，Chr11，Chr14，Chr15，Chr17，Chr18，Chr19，Chr21，Chr22，Chr25 3.30~10.60 6.00~48.00 陆地棉Guazuncho-2×海岛棉VH8-4602RIL LACAPE等[5] 马克隆值 Chr05，Chr06，Chr09，Chr11，Chr12，Chr15，Chr16，Chr19，Chr21，Chr22 4.56~9.09 0.80~8.03 陆地棉TM-1×海岛棉Hai7124的CSILs群体 WANG等[42] Chr14，Chr16 2.51~4.23 5.52~9.20 陆地棉HS46 ×陆地棉MARCABU- CAG8US-1-88 RIL LI等[10] 产量 A02(Chr08)，A03(Chr11)，Chr14，Chr23，Chr25，LG5 3.00~5.28 13.01~28.35 陆地棉Handan 208×海岛棉Pima 90的F2群体 HE等[46] 衣分 D08(Chr19) 3.45 24.34 陆地棉Handan 208×海岛棉Pima 90的F2群体 HE等[46] 然而，棉纤维相关性状QTL的分离和克隆仍然很少。有研究发现在第12条染色体上(A12/D12)与棉纤维品质相关的QTL附近的GhHOX3基因对棉纤维长度起重要调控作用[47]，以及定位于同源染色体A8(chr08)和D8(chr24)上的GhSusA1基因过表达可以增强纤维长度和强度[48]。
2.3 棉纤维基因的质量性状定位
在光子显性基因定位中发现，N1和Fbl基因位于chr12上[6]，其中N1基因被鉴定为转录因子MYB25-like[49]。光子隐性基因定位研究表明：n2定位在chr26上，sma-4(fz)位于L.G.A3的端部，sma-4(ha)位于L.G.A3中部[6]。超短纤维突变体Li1基因位于chr22上，并已通过精细定位被克隆到，是一个肌动蛋白家族基因[50-53]；而Li2基因则位于chr18上[6, 53]。
3. 棉纤维发育组学研究
棉纤维发育过程涉及到大量的基因和通路调控。利用高通量测序技术，对棉纤维发育的转录组和蛋白组分析及表观遗传研究，可以短时间内获得大量信息，捕获到许多参与不同发育阶段的特异性基因及信号通路，为下游单独研究重要基因的功能奠定良好的基础。
3.1 转录组学研究
利用棉花胚珠体外培养技术结合转录组数据分析比较，KIM等[11]在纤维起始分化时期发现了许多在野生型和无毛突变体间表达有差异的基因，包括MYB25，MYB109，PDF1，MYB25-like，HD1等转录调节因子，表明在棉纤维起始分化过程中存在复杂的信号网络调节机制。通过比较短绒突变体(Li1)与野生型之间在开花后1，3和8 d的转录组数据，LIANG等[49]在胚珠中共检测到7 852个差异表达基因，主要参与次生代谢物和脂质代谢途径，其中涉及非长链脂肪酸生物合成的37个基因在Li1突变体纤维的快速伸长发育过程中被显著抑制，这说明脂质代谢途径与纤维伸长密切相关。HOVAV等[54]评估了从开花后初级次生壁到次级次生壁合成过程中棉纤维发育的转录组变化发现，棉纤维发育过程中的基因转录水平很高，在每个阶段占到所有基因的75%~94%，并且半数以上的基因在纤维发育的至少一个阶段中上调。BOLTON等[55]利用基因芯片技术和实时荧光定量PCR技术在Li1突变体中发现超过100个基因在次生壁的生物合成过程中差异表达，其中的3个候选基因：伸展蛋白(extensin)，蔗糖合成酶(sucrose synthase)和微管蛋白(actin)的表达量明显偏离野生型的表达水平。通过陆地棉TM-1背景下的海岛棉染色体导入系与亲本纤维的转录组差异比较，FANG等[56]在CSIL-35431和CSIL-31010等2个导入系的次生壁合成过程中发现了大量与TM-1有表达差异的基因，功能富集分析表明这些基因主要富集于次生细胞壁的生物合成、葡糖醛酸合成、纤维素合成等生物途径。
3.2 蛋白质组学研究
利用蛋白组学研究，许多棉纤维发育过程中的重要蛋白被不断发掘，且此技术很好地互补了转录组只能在mRNA水平上研究纤维相关基因的劣势。HU等[12]应用相对和绝对定量(iTRAQ)LC-MS/MS分析技术研究了1 317个纤维特异性表达蛋白，其中205个蛋白在发育阶段中差异表达，190个蛋白在野生和栽培棉之间差异表达。结合转录组、iTRAQ蛋白质组和遗传图谱定位的综合分析方法，MA等[13]发现徐州142野生型与其无绒毛突变体(fl)的胚珠之间存在大量差异表达的基因和蛋白，这些差异基因和蛋白主要存在于氨基酸、核苷酸、脂肪酸和叶酸代谢以及黄酮生物合成中，说明这些代谢途径在纤维发育过程中具有重要作用。
3.3 表观遗传学研究
近年来，棉纤维发育的表观遗传学研究也取得了巨大进展。基于pre-miRNAs和已发现的miRNA靶基因数据，CHEN等[14]对83个miRNA前体及其目标调控基因进行了研究，并构建了miRNAs及其靶位点调控网络，并揭示了这些miRNA及靶基因在纤维不同发育阶段的表达模式。SONG等[15]对纤维和胚珠进行了甲基化组、转录组和小RNA组学分析，发现在胚珠和纤维发育过程中CHH甲基化变化显著。该研究发现，在胚珠中，启动子中的CHH甲基化与可诱导RNA依赖的DNA甲基化(RdDM)和胚珠偏好基因上调的siRNA呈正相关；在纤维细胞中，胚珠衍生细胞产生独立的RdDM的异染色质CHH超甲基化，抑制转座子及附近纤维相关基因的活性。使用甲基化抑制剂5-氮-2′-脱氧胞苷对胚珠进行体外培养，可以减少纤维细胞的数量和长度，这表明DNA甲基化在纤维发育中具有潜在作用。这些研究表明：启动子和转座子及附近基因中的RdDM依赖的甲基化可作为基因和转座子表达的双保险反馈机制。ZOU等[16]对参与纤维起始和伸长过程的长链非编码RNA(lncRNA)进行了系统分析，共鉴定到5 996条lncRNAs，其中长链非编码RNA(lincRNA)3 510条，天然反义转录RNA(lncNAT)2 486条，表明lncRNA对棉纤维的发育至关重要。
4. 棉纤维发育不同时期相关调控基因研究
4.1 棉纤维起始期相关基因
在棉花胚珠EST数据库中，约10%的基因与转录因子密切相关，包括56个转录因子家族成员[57]，如MYB类转录因子家族的GL1及其同源基因MYB2[58]，MYB109[59]，TTG1[60]和GL2[61]等均被发现在棉纤维发育的早期阶段高效表达。棉花GaMYB2基因可以诱导种子表皮毛的产生，且转化拟南芥可以弥补GL1突变对表皮毛起始分化造成的影响[58]。通过干扰GhMYB109的表达，PU等[62]发现棉纤维细胞分化延迟且起始数量减少，说明GhMYB109在棉花纤维分化阶段起重要作用。LOGUERICO等[63]发现GhMYB4和GhMYB5基因在纤维分化期的胚珠中特异表达。WALFORD等[64]发现GhHD1可以介导棉花表皮细胞的分化。辛婧[65]的研究表明转录因子GbSPB8可能调控棉花纤维起始发育。
4.2 棉纤维伸长期相关基因
转脂蛋白和钙信号转导相关蛋白在棉纤维伸长过程中起到极其重要的作用。MA等[66]研究发现：转脂蛋白GhLTP3和GhLTP6的表达量在纤维快速伸长期达到最高水平，此外李锡花等[67]发现GhLTP3的表达量从开花后0~15 d中表达量不断升高，在第15天达到顶峰，之后逐渐下降。赵存鹏等[68]和GAPPER等[69]研究发现：钙调蛋白CaM在低温逆境的条件下能使活性氧(ROS)、超氧游离基、过氧化氢和羟自由基等物质提高，进而使纤维细胞壁松弛，从而影响细胞伸长。CHENG等[70]发现GhCaM7-like基因在纤维快速伸长期显著表达。HUANG等[71]发现钙依赖性蛋白激酶GhCPK1在开花第10天的胚珠中高表达。这些研究都说明钙信号转导在纤维伸长过程中发挥重要作用。除了转脂蛋白和钙信号转导相关蛋白，转录调节因子也参与其中，如ZHANG等[72]发现GbMYB25与GbML1相互作用并通过调节ROS信号调节纤维伸长。HSU等[73]发现GhMYB7可以调控LTP3等脂转移蛋白编码基因。
4.3 棉纤维次生壁合成与加厚期相关基因
DELMER等[74]发现Rac9和Rac13可以控制棉花纤维素沉积方向。ZHAO等[75]发现GhRGP1在纤维发育的初生壁伸长及次生壁加厚后期优势表达，参与植物细胞壁非纤维素类的多糖合成。杨郁文等[76]发现一种Ser/Thr激酶和Try激酶的双受体蛋白GhRLK1与激活和维持次级细胞壁形成的细胞信号传导过程有关。此外，GhRDL1(RD22-Like1)与GhEXPA1互作会影响纤维细胞壁发育，GhRDL1基因过表达会产生长且质量较好的棉纤维[77]。
4.4 棉纤维脱水成熟期相关基因
目前，关于棉纤维细胞脱水成熟期的相关研究较少，对于纤维在脱水成熟过程中细胞与分子水平的变化还不清楚，只是猜想可能涉及到棉纤维细胞的程序性死亡[78]。
5. 研究展望
随着技术的革新，大量棉纤维发育相关基因和涉及的调控网络被不断发现，但是基因间的相互作用及其潜在的调控机制还有待进一步探索。近年来，棉花转基因技术日益成熟，新兴的CRISPR/Cas9基因编辑系统也于2017年3月在棉花基因组靶基因敲除中得到首次应用。JANGA等[79]利用CRISPR/Cas9系统成功将转绿色荧光蛋白(GFP)基因棉花系的GFP基因敲除；LI等[80]以棉花內源GhMYB25为目标基因，使用2种单导向RNA对该基因进行定点突变，突变率分别为100%和98.8%。这些研究表明：CRISPR/Cas9可以在棉花基因组上进行高效和高特异性地突变。随着新技术在棉花中的应用与成熟，棉纤维发育相关基因及其调控机制也有望有更多的发现。
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图 1 基于荧光标记EST-SSR的石蒜属亲本和杂交种的聚类图
Figure 1 Cluster diagram of Lycoris parents and hybrids based on EST-SSR
表 1 15 对EST-SSR引物序列和PCR产物
Table 1. Sequences and PCR products of 15 pair of SSR primers
引物 标记荧光 引物序列 (5′→3′) 重复单元 产物长度/bp 退火温度/℃ SSR7 ROX TCATGCATCGCACATGTCAC/AATGTAACCGGTCGCTCCAG (GGA)5 181 52.0 SSR15 FAM GACGCCCAAACAGCCAATTT/TGGAAAGGTTGAGCTTCGGG (CCT)5 247 52.0 SSR20 TAMRA ACAAGTTGGCCCTGTTGTCA/CATTCGATCACTCGGTCCGT (TCT)5 115 53.2 SSR32 TAMRA CCAGTCGTTCCGTTCCATCA/CTGCTGCACTTGTTCCCAAC (TTC)5 165 52.2 SSR85 TAMRA TCAACACAAGTGTCATTTCCAAT/ATGGCCCATTCAAGGTTGGT (TTA)6 108 52.6 SSR96 TAMRA CCGGCCTACAACAAAGGTCT/AAACTGTTGCAGCGACCATG (GGT)5 154 52.0 SSR115 FAM ATTCTGATCGGCGAAGGAGG/ATTTGCAAGGCGGTCAGAGA (GGC)5 235 49.0 SSR138 ROX TCACGAGAGAGGAGGGAGAA/CTCCTTGCGGATCATGGTGT (CAA)5 211 52.0 SSR142 ROX TGTCAGTTGATGGGCTTCGG/TGGTTGCAGTGACAGTTGGT (CCA)5 174 53.0 SSR147 FAM CCAAACAGCAGCTCAAGCAG/TTCGGTTTCGAGATTGGGGG (CCG)5 248 52.8 SSR198 FAM TCAGGGAATAAACCTCCGCC/ACTTGCTATCCTTGGGGCTT (ATC)5 223 51.7 SSR203 ROX ACGTGAGCAGTCCTCCTACT/GACATGCCCACTTCTCCCAA (GAG)5 204 52.0 SSR220 FAM ACTGGTGTCACTTGTGTGCA/GCTGGGCTCCCATCATTTCA (GAT)5 225 51.0 SSR221 HEX ATCTTGAGCTGCGTGTCGAA/CTCATCCACGCCTTCTCCTC (TTG)5 254 52.2 SSR253 HEX CGCCCGTGCAATTTCAAGTT/GCAAGTTGGCAACTCCACAG (AAT)5 277 52.4 
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表 2 4个荧光标记EST-SSR引物在石蒜属亲本上的特征条带
Table 2. Characteristic bands of 4 fluorescent labeled EST-SSR primers on the parents of Lycoris
引物 条带长度/bp 换锦花 石蒜 中国石蒜 SSR203 204 189 195 SSR115 226 230 228 SSR32 175 169 SSR198 228 221
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表 3 EST-SSR引物对石蒜属种间杂交种鉴定
Table 3. Identification of interspecific hybridization of Lycoris by EST-SSR primers
引物 石蒜-换锦花杂交种的真实鉴定率/% 引物编号 石蒜-中国石蒜杂交种的真实鉴定率/% SSR203 88.46 SSR203 80.77 SSR115 84.61 SSR115 50.00 SSR198 53.85 SSR32 69.23 SSR203+SSR115 96.30 SSR203+SSR115 96.15 SSR203+SSR198 88.89 SSR203+SSR32 96.15 SSR115+SSR198 88.89 SSR115+SSR32 76.92 SSR203+SSR115+SSR198 96.30 SSR203+SSR115+SSR32 96.15
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表 4 EST-SSR引物扩增条带的等位基因数和多态性信息量
Table 4. Number of alleles and polymorphism information of 15 EST-SSR primers
引物 Na Ne H In PIC 扩增条带/条 引物 Na Ne H In PIC 扩增条带/条 SSR7 1.974 4 1.291 4 0.218 1 0.369 4 0.974 4 6 SSR142 2.000 0 1.270 5 0.210 7 0.364 2 1.000 0 8 SSR15 1.833 3 1.167 7 0.136 8 0.250 2 0.833 3 7 SSR147 1.987 2 1.678 3 0.387 6 0.570 2 0.987 2 3 SSR20 2.000 0 1.382 5 0.273 1 0.440 4 1.000 0 5 SSR198 1.782 1 1.203 0 0.156 8 0.273 1 0.782 1 6 SSR32 1.987 2 1.193 0 0.159 5 0.293 1 0.987 2 10 SSR203 1.974 4 1.378 7 0.264 2 0.426 8 0.974 4 5 SSR85 1.897 4 1.212 6 0.168 0 0.298 0 0.897 4 6 SSR220 1.974 4 1.294 5 0.219 9 0.371 7 0.974 4 6 SSR96 1.871 8 1.082 1 0.259 2 0.409 8 0.871 8 5 SSR221 1.910 3 1.643 6 0.377 0 0.550 5 0.910 3 2 SSR115 1.846 2 0.214 9 0.167 3 0.292 0 0.846 2 7 SSR253 1.692 3 1.096 4 0.083 7 0.164 6 0.692 3 9 SSR138 1.974 4 1.252 8 0.196 0 0.340 9 0.974 4 7 平均 1.913 7 1.224 1 0.218 5 0.361 0 0.913 7 6.13
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表 5 15对荧光标记EST-SSR引物在亲本及杂交种F1上的扩增带型
Table 5. Amplification patterns of 15 pairs of fluorescent labeled EST-SSR primers on parents and hybrid F1
基因型数 SSR15 SSR253 SSR138 SSR32 SSR20 SSR142 SSR198 SSR85 SSR147 SSR7 SSR220 SSR221 SSR96 SSR203 SSR115 0 − − − − − − − − − − − − − − − 1 241 263/268 202 166/172 116 247 220/228 83/105 245 173/188 224 249/255 149/154 189 226 2 241/244 269 202/206 166/175 117/120 247/253 221 89/94 245/248 182 224/228 255 151 189/195 226/228 3 242 272/277 202/209 166/181 118 247/254 221/228 100 245/251 182/185 224/234 151/154 189/204 226/230 4 242/250 274 206 166/188 118/121 247/256 221/230 107/110 248 182/188 224/237 151/156 195 226/231 5 244 274/277 206/209 169 171/120 247/259 222/228 108 251 185/188 224/244 151/157 195/204 226/242 6 244/246 274/279 206/212 169/172 121 247/260 228 108/110 188 228 154 201/207 227/231 7 244/250 277 206/215 169/175 247/262 229 110 191 228/237 154/156 204 228 8 245 277/279 206/218 169/178 247/267 230 203 237 154/157 207 228/230 9 246/254 278 209 169/188 247/270 238/244 156 230 a 248 279 209/215 169/191 270 157 230/242 b 250 291 209/212 169/194 231 c 250/254 212 172 237 d 254 212/215 172/175 e 215 172/178 f 215/221 172/181 g 172/191 h 175 i 175/178 j 175/188 k 175/191 l 175/194 m 178 n 178/185 o 178/188 p 178/191 q 185 r 185/188 s 188 t 188/191 u 188/194 说明：基因型数用1~9表示，大于9时用小写字母依次表示，0表示无条带；−表示没有带型
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表 6 石蒜、中国石蒜、换锦花及种间杂交种分子身份证代码
Table 6. Molecular ID codes of parent L. radiata, L. chinensis, L. sprengeri and interspecific hybrids
编号 亲本 编号 石蒜-换锦花杂交种 编号 中国石蒜-石蒜杂交种 1 6aek3267522161a 26 574n37053312833 53 eb8m31013242120 2 5a4e3467331131a 27 57fi43053412330 54 50b74177124232a 3 7a7k32a7542231a 28 5b4p44653312423 55 a1b737063342300 4 7a7k4267342131a 29 525q4177023230a 56 82b73777335234b 5 2ad14467322241a 30 57bi42363321b43 57 3b7i31071341310 6 7adj4767521131a 31 57bn44051211040 58 544c61051342541 7 ca423767321171a 32 57fi43351312433 59 104737671642328 8 ca4e3467531231a 33 5bbi44161212031 60 507764053212633 9 77fi6467536271a 34 507u42365212b33 61 5b4344053212431 10 5afi3267332271a 35 505662663222733 62 50b737771342328 36 74d427353232333 63 02dc42771342728 11 53am25451212a71 37 52aa22051212252 64 52bf2277335283b 12 537m45451212a71 38 57bt22353212336 65 e07741771342328 13 54ap62251312b71 39 5bbf21353222833 66 2a838703252738 14 542p61451212b71 40 5bbh63361222633 67 0bfc3a77327232a 15 543u63251312b71 41 525841061252275 68 70f731a3367272a 16 55a243251312a71 42 fafg42b53322314 69 d0ek34a73312728 17 50ao63251312871 43 566421b61212734 70 d0d743a7122261c 18 57a225a51212a71 44 0abs17765222533 71 50bd4346326262c 19 557t22251312b71 45 5afu4216122208d 72 00c047a03262328 20 5ae442251312b71 46 075k64653212333 73 00bi33703562080 47 0bbt35353312833 74 5b4r47703312060 21 e00d31062022040 48 50bm43353112334 75 1bfl44704312060 22 00053a042082047 49 40f743a73242738 76 0cf747005312080 23 0015380717a2247 50 504d24251212733 77 8b6d42703572060 24 0015380417a2247 51 50bi41851222433 78 5bb641771342080 25 00c531001682247 52 504l44b53212634 说明：1~10为换锦花；11~20为石蒜；21~25为中国石蒜；26~52为石蒜-换锦花杂交种；53~78为石蒜-中国石蒜杂交种
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