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石蒜属Lycoris植物隶属百合目Liliflorae石蒜科Amaryllidaceae，具地下鳞茎，为多年生草本植物；全球约有20多种，中国有15种，主要分布在江苏、浙江和安徽等地[1]。石蒜属植物花型花色变异丰富，种间杂交亲和性高，对石蒜属植物进行遗传育种改良，极有希望选育出有中国特色的切花新品种[2]，市场前景和园林应用前景极为广阔。同时，石蒜鳞茎富含生物碱、黄酮及多糖等化学成分，药用价值较高[3-4]。目前，石蒜属植物新品种选育主要通过种间和种内杂交、自然群体选择，对其杂交种真实性的鉴定主要根据开花时花色和花型等农艺性状的变化来判断；但由于石蒜属植物生长周期长，种子播种后5~6 a才开花，早期鉴定及分类较为困难，从而影响销售和生产。
常用的杂种鉴定方法有形态标记法、生化标记法和DNA标记法等。形态标记耗时费力，易受环境条件和检测人员主观判断的影响；生化标记数目少且稳定性差，不能进行多年生植物杂交种的早期鉴定，无法满足生产和市场的需求；相比之下，DNA标记简单序列重复(SSR)、目标起始密码子多态性(SCoT)、内部简单序列重复(ISSR)、相关序列扩增多态性(SRAP)和荧光标记SSR能反映生物个体或种群间某些特异性DNA片段，不受生物自身生长阶段和环境条件的影响，标记数量较多，重复性好，开发成本低，不影响性状表达[5-7]，已在冬瓜Benincasa hispida[8]、甜菜Beta vulgaris[9] 、姜黄属Curcum植物 [10]、枇杷Eriobotrya japonica[11]等种质资源遗传多样性、杂交种鉴定、品种鉴定和分子身份证的构建等方面得到广泛应用。其中SSR标记是以PCR技术为基础、较成熟的遗传标记，但由于工作量大、精度低、分析量小，无法完成大批量样品的检测，而荧光标记SSR能准确获得目标DNA片段的大小(精确至1 bp)，检测结果稳定、准确且高效适用于大批量品种的检测分析，已被应用于落花生Arachis hypogaea [12]、高山杜鹃Rhododendron lapponicum [13]、百合属Lilium[14]、芒Miscanthus sinensis [15]等F1代杂交种真实性和纯度检测、遗传多样性分析、核心种质的构建等。石艳等[16]开发了石蒜属植物换锦花L. sprengeri的表达序列标签SSR(EST-SSR)标记，用于鉴定换锦花-中国石蒜L. chinensis杂交种，为石蒜属种间杂交种F1的鉴定提供了借鉴。为进一步完善石蒜属植物种间杂交种F1的鉴定技术，本研究筛选了15对EST-SSR引物，通过EST-SSR荧光标记毛细管电泳技术构建亲本换锦花、石蒜L. radiata、中国石蒜以及石蒜-换锦花、石蒜-中国石蒜杂交种等78个样品的分子身份证，并进行杂交种真实性鉴定，为石蒜属植物的亲缘关系分析、品种选育、杂交种早期鉴定及资源保护和利用等提供理论参考。
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石蒜、中国石蒜、换锦花及石蒜-中国石蒜、石蒜-换锦花杂交种F1共78个样品，均栽植于浙江农林大学石蒜属种质资源圃，于2020年8—9月盛花期采集各材料花瓣。
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采用改良CTAB法提取供试材料花瓣基因组DNA，用Nanodrop 2000测定DNA的质量和浓度，经质量浓度为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照。
分别以亲本(中国石蒜、石蒜和换锦花)基因组DNA为模板，从59对石蒜属植物通用EST-SSR引物中筛选条带清晰、重复性好且具多态性的引物进行扩增[16]。EST-SSR PCR扩增反应体系(10.0 μL)为：Taq DNA聚合酶1.0×16.67 nkat，氯化镁(MgCl2) 1.0 mmol·L−1，dNTPs 0.2 mmol·L−1，引物0.8 μmol·L−1，DNA 40 ng。PCR反应程序为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 S，退火温度30 S，72 ℃延伸30 S，35次循环；72 ℃延伸10 min；16 ℃保温30 min。用质量浓度10.0％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离银染显色检测扩增反应产物，显色后记录观察拍照。
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从59对多态性引物中筛选到15对具多态性的EST-SSR引物(表1)，在正向引物中分别加注FAM (蓝)、HEX (绿)、TAMRA (黄)和ROX (红)荧光，对78个样品进行多重PCR扩增。利用遗传分析仪(ABI 3730XL，ThermoFisher Scientific，美国)进行毛细管电泳检测分析。根据电泳结果，选择在亲本(中国石蒜、石蒜和换锦花)种内一致、种间具多态性、特异、单一且重复性好的引物用于杂交种鉴定。比较亲本与杂交种F1的 EST-SSR PCR扩增产物，杂交种F1具有父母本互补型或有变异型扩增带型的样品鉴定为真实杂种。计算杂交种鉴定率=真实杂交种样本数/样本总数×100％。
表 1 15 对EST-SSR引物序列和PCR产物
Table 1. Sequences and PCR products of 15 pair of SSR primers
引物 标记荧光 引物序列 (5′→3′) 重复单元 产物长度/bp 退火温度/℃ SSR7 ROX TCATGCATCGCACATGTCAC/AATGTAACCGGTCGCTCCAG (GGA)5 181 52.0 SSR15 FAM GACGCCCAAACAGCCAATTT/TGGAAAGGTTGAGCTTCGGG (CCT)5 247 52.0 SSR20 TAMRA ACAAGTTGGCCCTGTTGTCA/CATTCGATCACTCGGTCCGT (TCT)5 115 53.2 SSR32 TAMRA CCAGTCGTTCCGTTCCATCA/CTGCTGCACTTGTTCCCAAC (TTC)5 165 52.2 SSR85 TAMRA TCAACACAAGTGTCATTTCCAAT/ATGGCCCATTCAAGGTTGGT (TTA)6 108 52.6 SSR96 TAMRA CCGGCCTACAACAAAGGTCT/AAACTGTTGCAGCGACCATG (GGT)5 154 52.0 SSR115 FAM ATTCTGATCGGCGAAGGAGG/ATTTGCAAGGCGGTCAGAGA (GGC)5 235 49.0 SSR138 ROX TCACGAGAGAGGAGGGAGAA/CTCCTTGCGGATCATGGTGT (CAA)5 211 52.0 SSR142 ROX TGTCAGTTGATGGGCTTCGG/TGGTTGCAGTGACAGTTGGT (CCA)5 174 53.0 SSR147 FAM CCAAACAGCAGCTCAAGCAG/TTCGGTTTCGAGATTGGGGG (CCG)5 248 52.8 SSR198 FAM TCAGGGAATAAACCTCCGCC/ACTTGCTATCCTTGGGGCTT (ATC)5 223 51.7 SSR203 ROX ACGTGAGCAGTCCTCCTACT/GACATGCCCACTTCTCCCAA (GAG)5 204 52.0 SSR220 FAM ACTGGTGTCACTTGTGTGCA/GCTGGGCTCCCATCATTTCA (GAT)5 225 51.0 SSR221 HEX ATCTTGAGCTGCGTGTCGAA/CTCATCCACGCCTTCTCCTC (TTG)5 254 52.2 SSR253 HEX CGCCCGTGCAATTTCAAGTT/GCAAGTTGGCAACTCCACAG (AAT)5 277 52.4 -
利用Gene mapper 4.1软件整理分析EST-SSR荧光标记的毛细管电泳数据，根据每个引物对每个样品扩增后有无峰，转化成0/1格式的二元矩阵，无信号或数据缺失赋值“2”。利用POPgene 1.32计算观测等位基因数(Na)，有效等位基因数(Ne)，Nei’s基因遗传多样性指数(H)，Shannon’s指数(In)和多态性信息量(PIC)。使用NTsys2.10e计算石蒜属亲本及杂交种的Nei’s 遗传距离和SM遗传相似系数，并用非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析。
参照徐雷峰等[14]方法将获得的荧光标记EST-SSR多态性数据转换为数字(1~9)表示，当基因型数大于9时，用小写字母(a、b、c
$、\cdots $ )依次表示，无带用0表示。按照引物扩增带型数由少到多的顺序，记录各样品在15对引物上的扩增带型数据，通过个位数字或小写字母编码构建各杂交种的分子身份证。 -
荧光毛细管电泳检测发现：15对引物在25个样品中均能获得大小精确的DNA片段，筛选其中具有种内一致性且种间多态性的4对引物。由表2可知：SSR203和SSR15在3个亲本中均能得到特征条带，SSR32可在石蒜和中国石蒜中得到特征条带，SSR198可在石蒜和换锦花中得到特征条带。因此SSR203、SSR115和SSR198用来鉴定石蒜-换锦花杂交种(包括正交和反交)的真实性，SSR203、SSR115和SSR32可鉴定石蒜-中国石蒜杂交种的真实性。
表 2 4个荧光标记EST-SSR引物在石蒜属亲本上的特征条带
Table 2. Characteristic bands of 4 fluorescent labeled EST-SSR primers on the parents of Lycoris
引物 条带长度/bp 换锦花 石蒜 中国石蒜 SSR203 204 189 195 SSR115 226 230 228 SSR32 175 169 SSR198 228 221 -
利用SSR203、SSR115和SSR198对27个石蒜-换锦花杂交种F1代进行鉴定。由表3可知：SSR203从石蒜-换锦花杂交F1后代群体中鉴定到88.46%的真实杂交种，其中具有双亲特征条带(189/204 bp)的占69.23%，出现特异条带的有19.23%；SSR115从石蒜-换锦花杂交种F1群体中鉴定到84.61%的真实杂交种，其中具有双亲特征条带的占53.85%，出现特异条带的占30.77%；SSR198只鉴定到53.85%的真实杂交种。分别利用SSR203+SSR115、SSR203+SSR115+SSR198进行多重PCR，从石蒜-换锦花正反交F1杂交群体中均鉴定到96.30%的真实杂交种，大于SSR203+SSR198 (88.89%)和SSR115+SSR198 (88.89%)组合的鉴定结果。因此采用SSR203+SSR115和SSR203+SSR115+SSR198可以早期鉴定石蒜-换锦花杂交种F1的真实性。
同样，利用引物SSR203、SSR115和SSR32对石蒜-中国石蒜杂交种F1进行鉴定。SSR203鉴定石蒜-中国石蒜杂交种F1的真实杂交种占80.77%，其中具有双亲特征条带(175/169 bp)的占42.31%，具变异条带的有38.46%；SSR115和SSR32鉴定石蒜-中国石蒜杂交种F1群体的真实性分别为50.00%和69.23%。采用SSR203+SSR115、SSR203+SSR32和SR203+SSR115+SSR32多重PCR扩增，石蒜-中国石蒜杂交种F1群体的真实杂交种鉴定效率均达96.15%，高于SSR115+SSR32鉴定效率(76.92%)。因此可用SSR203+SSR115、SSR203+SSR32和SSR203+SSR115+SSR32对石蒜和中国石蒜杂交种真实性进行鉴定。
为节省成本，缩短育种周期和减少工作量，本研究采用SSR203+SSR115对石蒜-换锦花、石蒜-中国石蒜杂交种F1代进行早期鉴定。
表 3 EST-SSR引物对石蒜属种间杂交种鉴定
Table 3. Identification of interspecific hybridization of Lycoris by EST-SSR primers
引物 石蒜-换锦花杂交种的真实鉴定率/% 引物编号 石蒜-中国石蒜杂交种的真实鉴定率/% SSR203 88.46 SSR203 80.77 SSR115 84.61 SSR115 50.00 SSR198 53.85 SSR32 69.23 SSR203+SSR115 96.30 SSR203+SSR115 96.15 SSR203+SSR198 88.89 SSR203+SSR32 96.15 SSR115+SSR198 88.89 SSR115+SSR32 76.92 SSR203+SSR115+SSR198 96.30 SSR203+SSR115+SSR32 96.15 -
筛选出的15对荧光标记EST-SSR引物在78个样品中扩增效果较好(表4)，共得到扩增条带92条，扩增条带最多的是SSR32 (10条)，最少的是SSR21 (2条)，平均6.13条。多态性信息量(PIC)为0.6923~1.0000，其中SSR253最小(0.6923)，SSR20和SSR142最高(1.0000)，平均为0.9137。所有PIC值均大于0.500 0，说明均为高多态性引物，可反映杂交种间遗传差异和遗传多样性。
表 4 EST-SSR引物扩增条带的等位基因数和多态性信息量
Table 4. Number of alleles and polymorphism information of 15 EST-SSR primers
引物 Na Ne H In PIC 扩增条带/条 引物 Na Ne H In PIC 扩增条带/条 SSR7 1.974 4 1.291 4 0.218 1 0.369 4 0.974 4 6 SSR142 2.000 0 1.270 5 0.210 7 0.364 2 1.000 0 8 SSR15 1.833 3 1.167 7 0.136 8 0.250 2 0.833 3 7 SSR147 1.987 2 1.678 3 0.387 6 0.570 2 0.987 2 3 SSR20 2.000 0 1.382 5 0.273 1 0.440 4 1.000 0 5 SSR198 1.782 1 1.203 0 0.156 8 0.273 1 0.782 1 6 SSR32 1.987 2 1.193 0 0.159 5 0.293 1 0.987 2 10 SSR203 1.974 4 1.378 7 0.264 2 0.426 8 0.974 4 5 SSR85 1.897 4 1.212 6 0.168 0 0.298 0 0.897 4 6 SSR220 1.974 4 1.294 5 0.219 9 0.371 7 0.974 4 6 SSR96 1.871 8 1.082 1 0.259 2 0.409 8 0.871 8 5 SSR221 1.910 3 1.643 6 0.377 0 0.550 5 0.910 3 2 SSR115 1.846 2 0.214 9 0.167 3 0.292 0 0.846 2 7 SSR253 1.692 3 1.096 4 0.083 7 0.164 6 0.692 3 9 SSR138 1.974 4 1.252 8 0.196 0 0.340 9 0.974 4 7 平均 1.913 7 1.224 1 0.218 5 0.361 0 0.913 7 6.13 -
以15对荧光标记EST-SSR标记扩增结果计算遗传相似系数并进行UPGMA聚类分析。由图1可知：各样品遗传相似系数为0.76~0.98，在相似系数为0.77处25个亲本和53个杂交种聚为Ⅰ和Ⅱ两大类，Ⅰ类主要为换锦花、石蒜-换锦花杂交种，但包含了58、60、61、64和66等石蒜-中国石蒜杂交种，且与石蒜-换锦花杂交种聚在一起，推测5个杂交种的母本可能是石蒜。Ⅱ类包括Ⅱa(石蒜)、Ⅱc(中国石蒜)、Ⅱb(中国石蒜-石蒜杂交种)等3个亚类，说明本研究所用的15对荧光标记EST-SSR可用作石蒜、中国石蒜、换锦花及种间杂交种的早期鉴定。
图 1 基于荧光标记EST-SSR的石蒜属亲本和杂交种的聚类图
Figure 1. Cluster diagram of Lycoris parents and hybrids based on EST-SSR
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由表5可知：15对荧光标记EST-SSR引物扩增各样品，共得到153种带型，平均每条扩增10.2带型，其中SSR221扩增带型最少(2种)，SSR32扩增带型最多(30种)。根据表4对15对荧光标记EST-SSR引物扩增得到的基因型或带型赋值并排序，以此对各样品的扩增情况编码分子身份证，扩增条带位置相同则编码符号相同，说明基因型相同。由表6可知：各亲本和各杂交种均具有唯一的分子身份证，15对荧光标记EST-SSR引物可有效鉴别石蒜属亲本和种间杂交种。
表 5 15对荧光标记EST-SSR引物在亲本及杂交种F1上的扩增带型
Table 5. Amplification patterns of 15 pairs of fluorescent labeled EST-SSR primers on parents and hybrid F1
基因型数 SSR15 SSR253 SSR138 SSR32 SSR20 SSR142 SSR198 SSR85 SSR147 SSR7 SSR220 SSR221 SSR96 SSR203 SSR115 0 − − − − − − − − − − − − − − − 1 241 263/268 202 166/172 116 247 220/228 83/105 245 173/188 224 249/255 149/154 189 226 2 241/244 269 202/206 166/175 117/120 247/253 221 89/94 245/248 182 224/228 255 151 189/195 226/228 3 242 272/277 202/209 166/181 118 247/254 221/228 100 245/251 182/185 224/234 151/154 189/204 226/230 4 242/250 274 206 166/188 118/121 247/256 221/230 107/110 248 182/188 224/237 151/156 195 226/231 5 244 274/277 206/209 169 171/120 247/259 222/228 108 251 185/188 224/244 151/157 195/204 226/242 6 244/246 274/279 206/212 169/172 121 247/260 228 108/110 188 228 154 201/207 227/231 7 244/250 277 206/215 169/175 247/262 229 110 191 228/237 154/156 204 228 8 245 277/279 206/218 169/178 247/267 230 203 237 154/157 207 228/230 9 246/254 278 209 169/188 247/270 238/244 156 230 a 248 279 209/215 169/191 270 157 230/242 b 250 291 209/212 169/194 231 c 250/254 212 172 237 d 254 212/215 172/175 e 215 172/178 f 215/221 172/181 g 172/191 h 175 i 175/178 j 175/188 k 175/191 l 175/194 m 178 n 178/185 o 178/188 p 178/191 q 185 r 185/188 s 188 t 188/191 u 188/194 说明：基因型数用1~9表示，大于9时用小写字母依次表示，0表示无条带；−表示没有带型 表 6 石蒜、中国石蒜、换锦花及种间杂交种分子身份证代码
Table 6. Molecular ID codes of parent L. radiata, L. chinensis, L. sprengeri and interspecific hybrids
编号 亲本 编号 石蒜-换锦花杂交种 编号 中国石蒜-石蒜杂交种 1 6aek3267522161a 26 574n37053312833 53 eb8m31013242120 2 5a4e3467331131a 27 57fi43053412330 54 50b74177124232a 3 7a7k32a7542231a 28 5b4p44653312423 55 a1b737063342300 4 7a7k4267342131a 29 525q4177023230a 56 82b73777335234b 5 2ad14467322241a 30 57bi42363321b43 57 3b7i31071341310 6 7adj4767521131a 31 57bn44051211040 58 544c61051342541 7 ca423767321171a 32 57fi43351312433 59 104737671642328 8 ca4e3467531231a 33 5bbi44161212031 60 507764053212633 9 77fi6467536271a 34 507u42365212b33 61 5b4344053212431 10 5afi3267332271a 35 505662663222733 62 50b737771342328 36 74d427353232333 63 02dc42771342728 11 53am25451212a71 37 52aa22051212252 64 52bf2277335283b 12 537m45451212a71 38 57bt22353212336 65 e07741771342328 13 54ap62251312b71 39 5bbf21353222833 66 2a838703252738 14 542p61451212b71 40 5bbh63361222633 67 0bfc3a77327232a 15 543u63251312b71 41 525841061252275 68 70f731a3367272a 16 55a243251312a71 42 fafg42b53322314 69 d0ek34a73312728 17 50ao63251312871 43 566421b61212734 70 d0d743a7122261c 18 57a225a51212a71 44 0abs17765222533 71 50bd4346326262c 19 557t22251312b71 45 5afu4216122208d 72 00c047a03262328 20 5ae442251312b71 46 075k64653212333 73 00bi33703562080 47 0bbt35353312833 74 5b4r47703312060 21 e00d31062022040 48 50bm43353112334 75 1bfl44704312060 22 00053a042082047 49 40f743a73242738 76 0cf747005312080 23 0015380717a2247 50 504d24251212733 77 8b6d42703572060 24 0015380417a2247 51 50bi41851222433 78 5bb641771342080 25 00c531001682247 52 504l44b53212634 说明：1~10为换锦花；11~20为石蒜；21~25为中国石蒜；26~52为石蒜-换锦花杂交种；53~78为石蒜-中国石蒜杂交种 -
SSR荧光标记在毛白杨Populus tomentosa[17]和建兰Cymbidium ensifolium [18]等核心种质构建、落花生[12]和山茶属Camellia植物[19]等分子身份证构建以及三叶青Tetrastigma hemsleyanum [20]、杂交兰[21]等种质资源遗传多样性研究中得到验证。本研究表明：利用荧光标记EST-SSR检测石蒜属各亲本及杂交种的真实性、分析其间遗传关系，精准高效，结果可靠。
本研究利用15对荧光标记EST-SSR引物从石蒜、中国石蒜、换锦花和种间杂交种共78个样品中扩增到92个条带，平均每对引物6.13条；15对ESR-SSR引物多态性信息量均大于0.5000，平均为0.9137，较好地反映了杂交种间的遗传差异和遗传多样性，与茶Camellia sinensis[22]、百合[14, 23]等的研究结果类似。利用荧光标记EST-SSR引物鉴定石蒜-换锦花、石蒜-中国石蒜杂交种F1代，发现SSR203+SSR115等引物对杂交种鉴定的真实性分别达96.30%和96.15%，与SSR203+SSR115+SSR198和SSR203+SSR115+SSR32等引物鉴定结果相同，因此用SSR203+SSR115引物对石蒜-换锦花、石蒜-中国石蒜杂交种F1进行鉴定，可大大缩短育种周期，减少工作量并节约成本。
分子身份证构建以 DNA 指纹图谱为基础，是识别种质资源的标志，可以更加简单明了地识别和检索种质资源[24]。本研究利用15对荧光标记EST-SSR引物共扩增出92个条多态性条带，153种带型，按照统计方便、书写简洁、字符串长短适中、易于检索及充分利用引物的原则，采用基因型赋值编码法[14]对石蒜属亲本和杂交种单一位点带型或杂合带型进行编码，构建石蒜属植物亲本和杂交种的分子身份证，较好地区分了78份石蒜属植物材料，说明该方法适用于石蒜属植物的鉴定。
以RAPD、ISSR和SCoT等分子标记技术分析石蒜属植物种质资源的遗传多样性，建立遗传距离和遗传相似系数矩阵，构建相应分子树状图和指纹图谱[2, 25-26]，其目的主要是为了杂交种的亲本配制、野生资源的高效利用等。本研究利用15对荧光标记EST-SSR引物扩增了78个石蒜属植物的遗传物质，发现各样本遗传相似系数为0.76~0.98；UPGMA聚类分析发现：相似系数为0.77时，25个亲本和53个杂交种聚为两大类，Ⅰ类包括亲本换锦花、石蒜-换锦花的杂交种，Ⅱ类又分为Ⅱa、Ⅱb和Ⅱc 等3个亚类，包括石蒜、中国石蒜-石蒜杂交种和中国石蒜，说明15对荧光标记EST-SSR可将石蒜、中国石蒜、换锦花及种间杂交种有效聚类，结合杂交种的遗传多样性认为：荧光标记EST-SSR可有效鉴定石蒜属杂交种F1，并厘清其间的遗传关系。
Construction of molecular identification card of Lycoris interspecific hybrids
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摘要:
目的 鉴定石蒜属Lycoris种间杂交种F1的真实性。 方法 利用荧光标记表达序列标签简单序列重复(EST-SSR)方法，构建亲本石蒜L. radiata、中国石蒜L. chinensis、换锦花L. sprengeri和石蒜-中国石蒜、石蒜-换锦花杂交种F1共78个样品的分子身份证，并分析遗传关系。 结果 15对多态性强的荧光标记EST-SSR引物得到扩增条带92条，每对引物平均扩增6.13条；多态性信息量(PIC)为0.6292~1.0000，平均为0.9137。引物SSR203+SSR115对石蒜-换锦花、石蒜-中国石蒜杂交种F1代的真实性鉴定率分别为96.30%和96.15%。非加权组平均法(UPGMA)聚类分析表明：石蒜、中国石蒜、换锦花及其种间杂交种的遗传相似系数为0.76~0.98，在相似系数为0.77处25个亲本和53个杂交种聚为Ⅰ和Ⅱ两大类，Ⅰ类包括亲本换锦花、石蒜-换锦花杂交种，Ⅱ类包括石蒜、中国石蒜以及中国石蒜-石蒜杂交种，Ⅱ类又可分为Ⅱa、Ⅱb和Ⅱc等3个亚类。利用荧光标记EST-SSR基因型编码，构建了78个石蒜属亲本及杂交种的分子身份证。 结论 荧光标记EST-SSR可用于石蒜属种间杂交种的早期鉴定。图1表5参26 -
关键词:
- 石蒜属 /
- 杂种鉴定 /
- 简单序列重复(SSR) /
- 分子身份证
Abstract:Objective This study is aimed to identify the authenticity of F1, an interspecific hybrids among Lycoris. Method With 78 samples collected of F1, an interspecific hybrids among L. radiata, L. chinensis and L. sprengeri, expressed sequence tag simple sequence repeat (EST-SSR) was employed to construct their molecular identification cards before an analysis was conducted of their genetic relationships. Result fluorescence labeled EST-SSR primers yielded 92 amplified bands that averaged 6.13 per pair; polymorphism information (PIC) was 0.629 2 to 1.000 0 and averaged 0.913 7. The authenticity identification rate of primers SSR203+SSR115 for the F1 generation of L. radiata-L. sprengeri and L. chinesis-L. radiata was 96.30% and 96.15%, respectively. UPGMA cluster analysis showed that the genetic similarity coefficients of parents (L. radiata, L. chinensis and L. sprengeri) and their hybrids ranged from 0.76 to 0.98, and with the similarity coefficient being 0.77, the 25 parents and 53 hybrids could be clusted into 2 groups, namely group Ⅰ and group Ⅱ. Group Ⅰ included L. sprengeri parents and hybrids between L. radiata and L. sprengeri whereas group Ⅱ, including L. radiata, L. chinensis and the hybrids between L. radiata and L. chinensis, could be divided into three subclades: Ⅱa, Ⅱb and Ⅱc. The unique molecular identity cards of 78 Lycoris parents and hybrids were constructed based on the fluorescent EST-SSR genotypes coding. Conclusion Fluorescence labelled EST-SSR can be used for early identification of interspecific hybrids in Lycoris, which can provide important reference for variety identification and cross breeding of Lycoris. [Ch, 1 fig. 5 tab. 26 ref.] -
Key words:
- Lycoris /
- hybrid identification /
- EST-SSR /
- molecular identification card
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无论是脊椎动物还是无脊椎动物，先天性免疫都是第一线防御机制，对抗着各类病原体的侵染。吞噬作用作为一种高度保守进程的先天性免疫机制，能够为许多细胞用来消化微生物病原体以及凋亡或坏死的细胞残骸[1-3]。在吞噬作用中，外来物质被细胞识别并结合到细胞表面，被吞噬小体吞入，并在被吞入的物质周围形成细胞器[4]。吞噬小体经过裂变以及与核内体、溶酶体，或是两者共同的限制性融合后形成成熟的吞噬溶酶体。进入吞噬溶酶体内部的病原体则被低pH值、水解作用以及自由基所消灭[5]。黑腹果蝇Drosophila melanogaster是最常见的果蝇，因拥有与哺乳动物相近的先天性免疫系统，而被认为是研究宿主与微生物相互作用的最佳基因模式生物[6-7]。近年来，果蝇Schneider细胞株（S2）细胞已被确认是一种非常适合研究细胞感染的宿主模型，在对抗衣原体Chlamydia，单胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes，查菲埃立克体Ehrlichia chaffeensis，白念珠菌Candida albicans，大肠埃希菌Escherichia coli以及金黄葡萄球菌Staphylococcus aureus等病菌[6, 8-14]的体外感染过程中，S2细胞与哺乳动物巨噬细胞的作用机制非常相近。金黄葡萄球菌是一种主要的人类病原体，致病率显著，研究显示金黄葡萄球菌可能是一种兼性胞内病原体[15]，并认为金黄葡萄球菌可以在巨噬细胞中存活数日而不影响细胞的生存情况[16]。笔者就果蝇S2细胞对热灭活大肠埃希菌（heat inactivated Esherichia coli, HIEC）及热灭活金黄葡萄球菌（heat inactivated Staphylococcus aureus, HISA）的吞噬模式展开研究，揭示了在S2细胞对抗革兰氏阳性菌时，吞噬作用在清除该类病原体时所起到的重要作用以及金黄葡萄球菌抑制消化过程从而抵御细胞吞噬的策略。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
黑腹果蝇S2细胞株从初代培养24 h的胚胎中分离获得，在体积分数为10%的小牛血清的果蝇培养基（Ivitrogen, 美国）中28 ℃培养[17]。为了确认脂多糖（LPS，Sigma，美国）或聚肽糖（PG，Sigma，美国）的活化作用是否会增强吞噬作用，将S2细胞以106个·孔-1铺开在6孔板中并粘附30 min，LPS或PG经超声处理1 h后，按1.0 mg·L-1的剂量加入到每个孔中孵育1 h，备用。
大肠埃希菌ATCC 14948菌株在LURIA-BERTANI培养基（LB）37 ℃培养24 h后，10 000 g离心10 min收集细菌。金黄葡萄球菌ATCC 25923菌株在含20.0 g·L-1氯化钠的哥伦比亚培养基中培养过夜，在盐溶液中重悬。热灭活大肠埃希菌（HIEC）或热灭活金黄葡萄球菌（HISA）以5×109个·L-1的密度接种于S2细胞，28 ℃孵育1 h。不同时间段收集S2细胞分析。
1.2 试验方法
1.2.1 样品制备与透射电子显微镜（TEM）分析
收集感染后的果蝇S2细胞（5.0~10.0 μL），在含体积分数2%多聚甲醛与2%戊二醛的0.1 mol·L-1二甲砷酸钠缓冲液（pH 7.4）固定剂中浸泡16 h，室温下不断旋转。以0.1 mol·L-1二钾砷酸钠缓冲液清洗，3次·样品-1，5 min·次-1，保持室温下旋转。随后加入体积分数2%锇（Osmium），并以0.1 mol·L-1二钾砷酸钠缓冲液清洗3次，5 min·次-1，保持室温下旋转。样品固定，20.0 g·L-1醋酸双氧铀缓冲液（pH 5.2）进行染色，室温避光染色1 h，保持旋转，随后以0.1 mol·L-1二钾砷酸钠缓冲液清洗3次，5 min·次-1并不断旋转。通过逐级增加的丙酮溶液（体积分数依次为50%，60%，70%，80%，90%，95%，100%）对样品进行脱水，室温下旋转处理，随后在100%环氧丙烯中毒处理10 min。以EMBED 812或502树脂黏结剂进行最终的渗透处理，V（环氧丙烯）:V（黏合剂）=1:1，室温旋转处理10 min；V（环氧丙烯）:V（黏合剂）=1:2，室温旋转处理20 min；100%黏合剂处理10 min。最终，样品中加入新的100%黏合剂，渗透16 h后，在干燥烘箱中以60 ℃聚合24 ~ 48 h。Hitachi 7650透射电镜（Hitachi, 日本）在70 kV下采集图像[10]。
1.2.2 激光共聚焦显微镜分析
果蝇S2细胞用体积分数10%胎牛血清（FBS）的施耐德培养基12孔板中铺板培养，并将密度为5×109个·L-1异硫氰酸荧光素标记（FITC，Invitrogen, 美国）的热灭活大肠埃希菌（HIEC）/热灭活金黄葡萄球菌（HISA），加入到S2细胞中28 ℃共培养1 h。以磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后，将混合细胞移植到多聚赖氨酸预处理的载玻片（Sigma，美国）上固定。之后，分别使用罗丹明鬼笔环肽（Invitrogen, 美国）和4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Sigma，美国）一同孵育，用以标记肌动蛋白或细胞核DNA[18]。
1.2.3 流式细胞仪检测分析
细胞培养与处理见1.2.2节。果蝇S2细胞接种细菌后，以PBS清洗，将混合细胞收集到流式管中，通过流式细胞仪检测S2细胞内的FITC荧光信号，统计S2细胞对HIEC和HISA的吞噬能力。为了研究细胞的吞噬作用对活细菌和热灭活细菌的敏感度，以胞内有1个以上FITC标记细菌的细胞在所有细胞中所占的百分比为参考值来予以评价。
1.2.4 细胞酸性指示剂（pHrodo）标签检测溶酶体酸化
在果蝇S2细胞（培养方法见1.2.2节）中加入LPS或PG，孵育S2细胞1 h，从而激活S2细胞；激活后的S2细胞以1×109个·L-1在6孔板中铺开，分别接种pHrodo标记的灭活病原菌（5×109个·L-1），28 ℃共孵育1 h。收集混合细胞，立刻在共聚焦显微镜下观察。分别统计不同处理组中，吞入pHrodo标记病原菌的S2细胞在全部细胞中所占百分比[18]。不同处理组间的差异以t检验进行统计学分析，P < 0.05为显著。
1.2.5 实时荧光定量PCR检测
果蝇S2细胞经过不同实验处理后，以PBS清洗，收集细胞，使用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取总RNA，操作步骤依据产品使用说明书[18]。即刻使用5.0 μg总核糖核酸，以M-MLV反转录酶（Takara，日本）合成为20.0 μL cDNA。实时荧光定量的检测采用基因特异引物与TaqMan探针（表 1），反应体系包括10.0 μL Premix Ex Taq（Takara，日本），1.0 μL cDNA样品，7.2 μL无酶水，各基因对应TaqMan探针0.3 μL，以及各特异性引物0.4 μL。聚合酶链式反应（PCR）程序如下：95 ℃，30 s；90 ℃，5 s，60 ℃，30 s，循环50次。数据分析使用iQTM5软件。
表 1 实时荧光定量PCR反应中引物与TaqMan探针序列Table 1 Primers and TaqMan probe sequences in qRT-PCR寡核苷酸探针 引物与探针序列 RP49-F 5'-CCGCTTCAAGGGACAGTATCTG-3' RP49-R 5'-CACGTTGTGCACCAGGAACTT-3' Rp49-探针 FAM-GGCAGCATGTGGCGGGTGCGCTT-Edipse Rel-F 5'-GCCAGAAAAACCCGTGAGTC-3' Rel-R 5'-AGGTACTTCCCCGATGTTCG-3' Rel-探针 FAM-CGACGTGGCCGCCGCAGA-Edipse Def-F 5'-CCACATGCGACCTACTCTCCA-3' Def-R 5'-AGCCGCCTTTGAACCCCT-3' Def-探针 FAM-ACCACACCGCCTGCGCCG-Eclipse Drs-F 5'-CTGGTGGTCCTGGGAGCC-3' Drs-R 5, -AGCGTCCCTCCTCCTTGC-3' Drs-探针 FAM-CCGATGCCGACTGCCTGTCC-Eclipse 1.2.6 统计学分析
本研究中每组试验均使用3个生物学重复。统计学显著性分析使用t检验，判断对照组与实验组的差异性，P < 0.05为显著，P < 0.01为极显著。
2. 结果与分析
2.1 透射电镜观察黑腹果蝇S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用
透射电镜下观察黑腹果蝇S2细胞对灭活大肠杆菌（HIEC）或灭活金黄葡萄球菌（HISA）的吞噬过程，发现孵育1 h后S2细胞即可顺利吞噬HIEC（图 1A），孵育后第1天S2细胞内HIEC已消失（图 1B）；但共孵育1 h后S2细胞未能吞噬HISA（图 1C），HISA（图 2A）与S2细胞共孵育4 d，仍保持形态完整（图 1D，图 2B，图 2C，图 2D，图 2E）。在PG或LPS激活后，S2细胞也不能有效地吞噬HISA（图 2F，图 2G，图 2H）。与健康的S2细胞相比，在接种后第4天，S2细胞吞入的HISA依然形态完整（图 2E，图 2F，图 2G，图 2H）；吞入HISA的S2细胞没有出现凋亡或破裂，表明细胞内的HISA并没有对S2细胞造成明显的损伤。
图 1 透射电镜观察黑腹果蝇S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用Figure 1 Transmission electron microscopy of phagocytosis of HIEC or HISA by S2 cells
图 2 透射电镜观察黑腹果蝇S2细胞对HISA的吞噬作用Figure 2 Transmission electron microscopy of phagocytosis of HISA by S2 cells2.2 激光共聚焦显微观察黑腹果蝇S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用
激光共聚焦显微观察发现，在S2细胞吞噬热灭活大肠杆菌HIEC 1 h后，胞内可观察到HIEC发出的绿色荧光（图 3A）；吞噬发生1 d后，S2细胞内观察不到绿色荧光粒子（图 3B）；表明HIEC已经被S2细胞清除。同样处理下，热灭活金黄葡萄球菌HISA没有被S2细胞清除。由图 3C和图 3D可知，HISA被吞噬后，被S2细胞内化到细胞内继续存在。由此可知，在S2细胞接种灭活菌后，HIEC与HISA均被S2细胞吞入，但HIEC被S2细胞清除，而HISA则没有被清除。
图 3 激光共聚焦显微镜观察黑腹果蝇S2细胞对FITC标记的HIEC或HISA的吞噬作用Figure 3 Confocal microscopy of phagocytosis of FITC-labeled HIEC or HISA by S2 cells2.3 流式细胞仪检测S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用
流式细胞仪的检测结果由图 4可知：接种1 h后，吞入了至少1个HIEC粒子的S2细胞在所有S2细胞中所占的比例接近40%，与S2细胞吞噬大肠埃希菌的结果相近；吞入至少1个HISA粒子的S2细胞在所有S2细胞中所占的比例接近25%，与S2细胞吞噬金黄葡萄球菌的结果相近。说明S2细胞吞入活细菌和热灭活细菌的敏感度并没有显著差异。
图 4 孵育1 h后黑腹果蝇S2细胞对FITC标记的病原菌的吞噬率Figure 4 Quantification of phagocytosis of FITC-labeled microbes by S2 cells at 1 h post-inoculation2.4 吞噬溶酶体酸化观察和吞噬率检测结果
细胞内的酸性环境可诱导pHrodo标记的病原菌激发出红色荧光，从而指示吞噬溶酶体的形成。激光共聚焦显微镜观察发现，接种HIEC 1 h后，S2细胞内可观察到红色荧光，表明S2细胞对HIEC的消化程序被激活，细胞内形成了酸性环境（图 5A）；图 5B中未能观察到红色荧光，表明HISA未能激活S2细胞的酸化过程。使用LPS或PG激活S2细胞，再进行接种观察，可发现在接种HISA 1 h后，未能观察到红色荧光，说明S2细胞的酸化过程仍未被激活。
图 5 激光共聚焦显微观察孵育1 h后黑腹果蝇S2细胞对pHrodo标记的HIEC及HISA的呑噬作用Figure 5 Confocal microscopy of phagocytosis of pHrodo-labeled HIEC or HISA by S2 cells at 1 h post-inoculation为揭示LPS或PG的刺激对S2细胞吞噬活性的影响，用共聚焦显微镜观察S2细胞吞噬pHrodo标记菌并统计吞噬率。结果表明：共孵育1 h后，只有接种HIEC的S2细胞内呈现酸性环境，其他的处理均不能诱导S2细胞酸化（图 6）。检测吞噬百分比发现，只有HIEC处理组的吞噬率显著高于对照组（P < 0.01）。使用LPS或PG激活S2细胞后再接种，S2细胞对HISA的吞噬率仍没有显著增加。这表明溶酶体酸化过程只发生在S2细胞吞噬HIEC的过程中，而LPS或PG刺激并不能诱导S2细胞吞噬HISA后的酸化过程（图 6）。
图 6 共孵育1 h后S2细胞对pHrodo标记的HIEC及HISA的吞噬率Figure 6 Phagocytic percentages of the pHrodo-labeled HIEC or HISA2.5 实时荧光定量PCR检测基因表达
实时荧光定量PCR反应中引物与TaqMan探针序列如表 1所示。通过实时荧光定量PCR检测不同处理条件下S2细胞内的防御素（defensin），抗真菌肽（drosomycin）和Relish的表达量变化。结果发现：防御素的表达量在HISA，HISA+LPS和HISA+PG等3个处理组中，均发生显著上调（P < 0.01）；抗真菌肽的表达量仅在HISA+PG处理组中发生显著上调（P < 0.01）（图 7）；Relish的表达量在HIEC处理组中发生显著上调（P < 0.01），但在HISA处理组中无显著变化。
图 7 黑腹果蝇S2细胞呑噬HISA作用中防御素，抗真菌肽及Relish的表达谱Figure 7 Expression profiles of drosomycin, defensin and relish in phagocytosis of HISA3. 讨论与结论
吞噬作用是动物对抗微生物病原体的一种重要免疫防御机制，由吞噬细胞来执行具体的功能[19-20]。本研究对黑腹果蝇S2细胞吞噬热灭活大肠埃希菌（HIEC）和金黄葡萄球菌（HISA）的异同进行了研究。结果表明：S2细胞能够在接种后1 d有效吞噬并清除HIEC，但却无法清除HISA；即使到了接种后4 d，S2细胞仍不能有效地清除HISA，而是任由它存在于细胞内。经PG或LPS诱导激活的S2细胞同样不能有效地清除HISA。与健康的S2细胞相比，存在于细胞内的HISA在接种4 d后并没有明显破坏S2细胞。许多研究证明在细胞培养模式下，金黄葡萄球菌能够逃逸宿主细胞的免疫系统，具有隐藏的潜能[21]，可在胞内坚持存活一段时间[22-23]。在本研究中，热灭活金黄葡萄球菌存在于S2细胞中达4 d以上，说明灭活后的金黄葡萄球菌仍存在抗吞噬的成分，这与金黄葡萄球菌存在多个抗吞噬因子有关[24-26]。统计细胞吞噬率发现，热灭活并不会影响吞噬作用对灭活细菌的敏感性，这一点已被另一项研究所证实[11]。
在消化进程中，吞噬溶酶体的pH值降低，细胞内环境酸化，可帮助吞噬作用的进行，并能够通过pHrodo染料的使用进行检测[27]。LPS是革兰氏阴性菌的主要的细胞膜成分，可以通过Imd（immune deficiency）免疫信号通路激活巨噬细胞；PG是革兰氏阳性菌细胞壁上的主要成分，可以通过Toll信号通路激活巨噬细胞。使用LPS或PG刺激接种HISA的S2细胞，细胞并未形成酸化环境。通过透射电镜与激光共聚焦显微镜的观察，明确了即使S2细胞经过LPS或PG的激活也不能有效地吞噬HISA的结果；检测S2细胞对pHrodo标记的病原菌的吞噬百分比也表明，吞噬溶酶体的酸化只发生在S2细胞对HIEC的吞噬过程中，其他处理并不能引起S2细胞的酸化。
黑腹果蝇S2细胞的吞噬作用中包括了Toll与Imd等2条信号通路，其中Toll通路参与到抗革兰氏阳性菌的免疫作用中，该免疫应答机制中包含Defensin基因[28-29]的表达，而已知的防御素（defensin）是一类由小胱甘酸富集而成，可被诱导的抗微生物肽，有利于宿主对真菌的防御应答[30]；Drosomycin基因表达的Drosomycin是一类可诱导的抗真菌肽，同样由Toll通路调节，并在全身脂肪体中均有表达[31-32]。观察发现防御素的表达量在HISA，HISA+LPS以及HISA+PG处理中，均发生显著上调；抗真菌肽的表达量在HISA+PG处理中显著上调；由此可以推断，Toll通路在HISA+PG的刺激下被激活。但是也看到PG虽然能激活S2细胞的Toll通路，但却无法有效清除HISA，同样，胞内的HISA也不会诱导S2细胞凋亡。由此可知，金黄葡萄球菌作为一种人类病原体，对黑腹果蝇来说也是高致病的病原，与其他革兰氏阳性菌相比，它表现出了更强的对防御素的抵御能力[36]。在黑腹果蝇中，Imd通路调节着对革兰氏阴性菌的免疫应答，Relish作为NF-κB通路的转录因子，是Imd通路的终极目标[28]。本研究结果发现：Relish在HIEC处理中显著上调（P < 0.01），说明Imd通路在HIEC处理中被激活，而激活的Imd通路最终诱导S2细胞吞噬HIEC，说明Relish的表达量与S2细胞吞噬HIEC的百分率呈正相关。
有研究表明：金黄葡萄球菌能够迅速地逃避溶酶体/吞噬体的捕获，在细胞液泡内存活可长达4 d，之后逃入细胞质中[16, 37-38]。有趣的是，我们发现灭活金黄葡萄球菌同样能够在S2细胞内存活4 d，其细胞表面物质具有抗吞噬消化的活性。该结果同时暗示着无脊椎动物吞噬细胞对清除部分革兰氏阴性及革兰氏阳性菌均有所帮助，但细胞免疫对这些胞内细菌的清除效力胜于体液免疫。
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图 1 基于荧光标记EST-SSR的石蒜属亲本和杂交种的聚类图
Figure 1 Cluster diagram of Lycoris parents and hybrids based on EST-SSR
表 1 15 对EST-SSR引物序列和PCR产物
Table 1. Sequences and PCR products of 15 pair of SSR primers
引物 标记荧光 引物序列 (5′→3′) 重复单元 产物长度/bp 退火温度/℃ SSR7 ROX TCATGCATCGCACATGTCAC/AATGTAACCGGTCGCTCCAG (GGA)5 181 52.0 SSR15 FAM GACGCCCAAACAGCCAATTT/TGGAAAGGTTGAGCTTCGGG (CCT)5 247 52.0 SSR20 TAMRA ACAAGTTGGCCCTGTTGTCA/CATTCGATCACTCGGTCCGT (TCT)5 115 53.2 SSR32 TAMRA CCAGTCGTTCCGTTCCATCA/CTGCTGCACTTGTTCCCAAC (TTC)5 165 52.2 SSR85 TAMRA TCAACACAAGTGTCATTTCCAAT/ATGGCCCATTCAAGGTTGGT (TTA)6 108 52.6 SSR96 TAMRA CCGGCCTACAACAAAGGTCT/AAACTGTTGCAGCGACCATG (GGT)5 154 52.0 SSR115 FAM ATTCTGATCGGCGAAGGAGG/ATTTGCAAGGCGGTCAGAGA (GGC)5 235 49.0 SSR138 ROX TCACGAGAGAGGAGGGAGAA/CTCCTTGCGGATCATGGTGT (CAA)5 211 52.0 SSR142 ROX TGTCAGTTGATGGGCTTCGG/TGGTTGCAGTGACAGTTGGT (CCA)5 174 53.0 SSR147 FAM CCAAACAGCAGCTCAAGCAG/TTCGGTTTCGAGATTGGGGG (CCG)5 248 52.8 SSR198 FAM TCAGGGAATAAACCTCCGCC/ACTTGCTATCCTTGGGGCTT (ATC)5 223 51.7 SSR203 ROX ACGTGAGCAGTCCTCCTACT/GACATGCCCACTTCTCCCAA (GAG)5 204 52.0 SSR220 FAM ACTGGTGTCACTTGTGTGCA/GCTGGGCTCCCATCATTTCA (GAT)5 225 51.0 SSR221 HEX ATCTTGAGCTGCGTGTCGAA/CTCATCCACGCCTTCTCCTC (TTG)5 254 52.2 SSR253 HEX CGCCCGTGCAATTTCAAGTT/GCAAGTTGGCAACTCCACAG (AAT)5 277 52.4 
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表 2 4个荧光标记EST-SSR引物在石蒜属亲本上的特征条带
Table 2. Characteristic bands of 4 fluorescent labeled EST-SSR primers on the parents of Lycoris
引物 条带长度/bp 换锦花 石蒜 中国石蒜 SSR203 204 189 195 SSR115 226 230 228 SSR32 175 169 SSR198 228 221
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表 3 EST-SSR引物对石蒜属种间杂交种鉴定
Table 3. Identification of interspecific hybridization of Lycoris by EST-SSR primers
引物 石蒜-换锦花杂交种的真实鉴定率/% 引物编号 石蒜-中国石蒜杂交种的真实鉴定率/% SSR203 88.46 SSR203 80.77 SSR115 84.61 SSR115 50.00 SSR198 53.85 SSR32 69.23 SSR203+SSR115 96.30 SSR203+SSR115 96.15 SSR203+SSR198 88.89 SSR203+SSR32 96.15 SSR115+SSR198 88.89 SSR115+SSR32 76.92 SSR203+SSR115+SSR198 96.30 SSR203+SSR115+SSR32 96.15
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表 4 EST-SSR引物扩增条带的等位基因数和多态性信息量
Table 4. Number of alleles and polymorphism information of 15 EST-SSR primers
引物 Na Ne H In PIC 扩增条带/条 引物 Na Ne H In PIC 扩增条带/条 SSR7 1.974 4 1.291 4 0.218 1 0.369 4 0.974 4 6 SSR142 2.000 0 1.270 5 0.210 7 0.364 2 1.000 0 8 SSR15 1.833 3 1.167 7 0.136 8 0.250 2 0.833 3 7 SSR147 1.987 2 1.678 3 0.387 6 0.570 2 0.987 2 3 SSR20 2.000 0 1.382 5 0.273 1 0.440 4 1.000 0 5 SSR198 1.782 1 1.203 0 0.156 8 0.273 1 0.782 1 6 SSR32 1.987 2 1.193 0 0.159 5 0.293 1 0.987 2 10 SSR203 1.974 4 1.378 7 0.264 2 0.426 8 0.974 4 5 SSR85 1.897 4 1.212 6 0.168 0 0.298 0 0.897 4 6 SSR220 1.974 4 1.294 5 0.219 9 0.371 7 0.974 4 6 SSR96 1.871 8 1.082 1 0.259 2 0.409 8 0.871 8 5 SSR221 1.910 3 1.643 6 0.377 0 0.550 5 0.910 3 2 SSR115 1.846 2 0.214 9 0.167 3 0.292 0 0.846 2 7 SSR253 1.692 3 1.096 4 0.083 7 0.164 6 0.692 3 9 SSR138 1.974 4 1.252 8 0.196 0 0.340 9 0.974 4 7 平均 1.913 7 1.224 1 0.218 5 0.361 0 0.913 7 6.13
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表 5 15对荧光标记EST-SSR引物在亲本及杂交种F1上的扩增带型
Table 5. Amplification patterns of 15 pairs of fluorescent labeled EST-SSR primers on parents and hybrid F1
基因型数 SSR15 SSR253 SSR138 SSR32 SSR20 SSR142 SSR198 SSR85 SSR147 SSR7 SSR220 SSR221 SSR96 SSR203 SSR115 0 − − − − − − − − − − − − − − − 1 241 263/268 202 166/172 116 247 220/228 83/105 245 173/188 224 249/255 149/154 189 226 2 241/244 269 202/206 166/175 117/120 247/253 221 89/94 245/248 182 224/228 255 151 189/195 226/228 3 242 272/277 202/209 166/181 118 247/254 221/228 100 245/251 182/185 224/234 151/154 189/204 226/230 4 242/250 274 206 166/188 118/121 247/256 221/230 107/110 248 182/188 224/237 151/156 195 226/231 5 244 274/277 206/209 169 171/120 247/259 222/228 108 251 185/188 224/244 151/157 195/204 226/242 6 244/246 274/279 206/212 169/172 121 247/260 228 108/110 188 228 154 201/207 227/231 7 244/250 277 206/215 169/175 247/262 229 110 191 228/237 154/156 204 228 8 245 277/279 206/218 169/178 247/267 230 203 237 154/157 207 228/230 9 246/254 278 209 169/188 247/270 238/244 156 230 a 248 279 209/215 169/191 270 157 230/242 b 250 291 209/212 169/194 231 c 250/254 212 172 237 d 254 212/215 172/175 e 215 172/178 f 215/221 172/181 g 172/191 h 175 i 175/178 j 175/188 k 175/191 l 175/194 m 178 n 178/185 o 178/188 p 178/191 q 185 r 185/188 s 188 t 188/191 u 188/194 说明：基因型数用1~9表示，大于9时用小写字母依次表示，0表示无条带；−表示没有带型
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表 6 石蒜、中国石蒜、换锦花及种间杂交种分子身份证代码
Table 6. Molecular ID codes of parent L. radiata, L. chinensis, L. sprengeri and interspecific hybrids
编号 亲本 编号 石蒜-换锦花杂交种 编号 中国石蒜-石蒜杂交种 1 6aek3267522161a 26 574n37053312833 53 eb8m31013242120 2 5a4e3467331131a 27 57fi43053412330 54 50b74177124232a 3 7a7k32a7542231a 28 5b4p44653312423 55 a1b737063342300 4 7a7k4267342131a 29 525q4177023230a 56 82b73777335234b 5 2ad14467322241a 30 57bi42363321b43 57 3b7i31071341310 6 7adj4767521131a 31 57bn44051211040 58 544c61051342541 7 ca423767321171a 32 57fi43351312433 59 104737671642328 8 ca4e3467531231a 33 5bbi44161212031 60 507764053212633 9 77fi6467536271a 34 507u42365212b33 61 5b4344053212431 10 5afi3267332271a 35 505662663222733 62 50b737771342328 36 74d427353232333 63 02dc42771342728 11 53am25451212a71 37 52aa22051212252 64 52bf2277335283b 12 537m45451212a71 38 57bt22353212336 65 e07741771342328 13 54ap62251312b71 39 5bbf21353222833 66 2a838703252738 14 542p61451212b71 40 5bbh63361222633 67 0bfc3a77327232a 15 543u63251312b71 41 525841061252275 68 70f731a3367272a 16 55a243251312a71 42 fafg42b53322314 69 d0ek34a73312728 17 50ao63251312871 43 566421b61212734 70 d0d743a7122261c 18 57a225a51212a71 44 0abs17765222533 71 50bd4346326262c 19 557t22251312b71 45 5afu4216122208d 72 00c047a03262328 20 5ae442251312b71 46 075k64653212333 73 00bi33703562080 47 0bbt35353312833 74 5b4r47703312060 21 e00d31062022040 48 50bm43353112334 75 1bfl44704312060 22 00053a042082047 49 40f743a73242738 76 0cf747005312080 23 0015380717a2247 50 504d24251212733 77 8b6d42703572060 24 0015380417a2247 51 50bi41851222433 78 5bb641771342080 25 00c531001682247 52 504l44b53212634 说明：1~10为换锦花；11~20为石蒜；21~25为中国石蒜；26~52为石蒜-换锦花杂交种；53~78为石蒜-中国石蒜杂交种
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20210296
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