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滇杨Populus yunnanensis为杨柳科Salicaceae杨属Populus青杨派树种，主要分布于云南中北部和南部、贵州西部及四川西南部等地区[1]。因速生性强、易无性繁殖和适应性强等优良特性[2]，滇杨在中国西南地区具有重要的经济、生态和社会效益[3]。但传统的滇杨遗传育种面临易感染黑斑病以及易遭蛀干虫害等问题[1]。相比之下，转基因育种能够将所需基因引入植物基因组培育新品种以及创制新种质[4]。然而，有效遗传转化体系的缺乏严重制约了滇杨转基因育种和功能基因组研究。
目前，有关滇杨再生体系的建立鲜有报道，仅有张春霞等[5]、辛培尧等[6]以滇杨叶片、叶柄和茎段为外植体进行不定芽的诱导，但均难以形成愈伤组织，不利于滇杨的高效再生和遗传转化研究。而关于滇杨遗传转化的研究尚未开展。据此，本研究以滇杨叶片为外植体，探讨植物生长调节剂对叶片愈伤组织、不定芽及生根的影响，从而建立高效的滇杨再生体系。在此基础上，利用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法对滇杨进行遗传转化研究，进而解析影响滇杨转化效率的各种因素，以期为滇杨的快速繁殖、定向育种及种质资源保存提供科学依据。
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以西南林业大学苗木基地栽培的10年生滇杨优株为母株，采集1年生枝条，剪切为45 cm长度的枝段，于室温条件下水培，取嫩叶作为试验材料。
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根癌农杆菌为GV3101，含β-D-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因及卡那霉素(Kan)筛选标记的质粒载体pBI121 (pBI121-GUS)，菌株和质粒均由实验室保存。
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以嫩叶作为外植体，将叶片冲洗干净后置于体积分数为2%的次氯酸钠(NaClO)消毒150 s，用体积分数为75%的乙醇浸泡10 s，无菌水清洗3次，用无菌滤纸吸干叶片表面水分。将叶片剪切成1.0 cm2小方块(叶盘)，叶背向下接种于分化培养基上。
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将叶盘接种于含有噻苯隆(TDZ，质量浓度分别为0.001、0.002、0.005 mg·L−1)、萘乙酸(NAA，质量浓度分别为0.010和0.050 mg·L−1)的MS和1/2 MS培养基上进行诱导分化。每瓶接种4个外植体，每个处理接种10瓶，置于暗条件下培养，30 d后统计愈伤组织诱导率。
将获得的愈伤组织继续接种于上述培养基中进行不定芽诱导，置于光条件下培养， 30 d后统计不定芽诱导率。
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以1/2 MS为基本培养基，添加不同质量浓度组合的NAA (0、0.010、0.050、0.100 mg·L−1)和吲哚乙酸(IBA，0、0.010、0.050、0.100 mg·L−1)。待不定芽生长至2~3 cm时转接于生根培养基中，每瓶接种3个不定芽，每个处理接种10瓶，置于光条件下培养，30 d后统计生根率和单株生根数。
以上培养基均添加20.0 g·L−1蔗糖和4.5 g·L−1琼脂，在光照强度为2 000~2 500 lx、光照时间为12 h(光)/12 h(暗)、温度为(25±2) ℃条件下培养。
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采用液氮速冻法将pBI121-GUS质粒转化至农杆菌中，加入LB培养液，置于28 ℃恒温振荡培养箱(200 r·min−1)培养，待菌液吸光度D(600)达0.6~0.8时，吸取菌液，涂布于添加不同质量浓度头孢霉素(0、100、200、300和400 mg·L−1)的LB固体培养基上，28 ℃倒置培养48 h，观察农杆菌生长情况。同时，将叶盘接种于添加不同质量浓度头孢霉素(0、100、200、300和400 mg·L−1)的分化培养基上进行筛选，每瓶接种3个叶盘，每个处理接种10瓶。30 d后统计分化率。
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将叶盘接种于添加不同质量浓度卡那霉素(0、10、20、30和40 mg·L−1)的分化培养基中进行筛选。每瓶接种3个叶盘，每个处理接种10瓶，置于暗条件下培养，30 d后观察统计不定芽生长情况。
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取1.2.3获得的滇杨组培苗，将叶片剪切为1.0 cm2叶盘，采用吸光度D(600)为0.2、0.6和1.0的农杆菌菌液对其侵染，每种浓度侵染时间分别为5、10和15 min，侵染后分别进行共培养0、2和4 d。将共培养后的叶盘接种于含有头孢霉素和卡那霉素筛选培养基进行筛选。40 d后统计产生抗性芽的叶盘数，并统计转化率，转化率=产生抗性芽的叶盘数/叶盘总数×100%。当抗性芽高度达2~3 cm时，接种至生根培养基中培养约20 d。
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取1.2.6中的抗性植株及野生型再生苗的叶片置入GUS染色液(体积比为X-Gluc Solution∶GUS Buffer=1∶50)中，抽真空30 min，37 ℃保育24 h，体积分数为75%的乙醇脱色3 h，观察叶片着色情况。进一步将GUS染色为蓝色的植株提取基因组DNA，以野生型再生苗为阴性对照，PCR扩增GUS基因，引物序列为GUS-F：5′-TCTCAGAAGACCAAAGGGCAA-3′；GUS-R：5′-TGCGCCAGGAGAGTTGTTG-3′，片段大小为2 239 bp。PCR扩增体系：12.5 µL Taq PCR Master Mix，1.0 µL DNA模板，GUS-F和GUS-R (10.0 µmol·L−1)各1.0 µL，ddH2O补足至20.0 µL。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。
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所有数据采用Excel 2016进行记录处理，利用SPSS 26.0进行单因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan’s法进行差异显著性分析。
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将滇杨叶盘接种于含TDZ和NAA的MS和1/2 MS培养基上，20 d后叶盘切口处形成淡绿色瘤状组织且出现芽点。接种于MS培养基的叶盘在30 d后仅于切口处长出少量愈伤组织(图1A)，而接种于1/2 MS培养基的叶盘均分化出紧密的淡绿色愈伤组织(图1B)。因此，选取1/2 MS作为基本培养基进行愈伤组织和不定芽的诱导。
图 1 滇杨叶片愈伤组织的诱导
Figure 1. Induction of callus in leaves of P. yunnanensis
此外，将叶盘(图2A)置于含有TDZ和NAA不同质量浓度组合的1/2MS培养基上，30 d后统计愈伤组织诱导率及生长情况。结果表明(表1)：组合0.005 mg·L−1TDZ和0.010 mg·L−1 NAA培养基中的诱导效果最好，愈伤组织紧实，呈浅绿色(图2B)，且诱导率达91.70%。
图 2 滇杨不定芽诱导
Figure 2. Induction of adventitious buds in P. yunnanensis
表 1 TDZ和NAA对愈伤组织诱导的影响
Table 1. Effects of TDZ and NAA on callus induction
植物生长调节剂组合 愈伤组织
诱导率/%愈伤组织状况 TDZ/
(mg·L−1)NAA/
(mg·L−1)0.001 0.010 36.00±12.73 e 浅黄色，疏松，长势较差 0.001 0.050 55.60±12.72 d 浅黄色，疏松，长势较差 0.002 0.010 63.90±9.64 cd 浅绿色，疏松，长势一般 0.002 0.050 83.30±8.35 abc 浅绿色，紧实，长势一般 0.005 0.010 91.70±8.35 ab 浅绿色，紧实，长势较好 0.005 0.050 77.80±4.79 bc 浅绿色，紧实，长势一般 说明：数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P＜0.05)。 将上述愈伤组织转接入含有TDZ和NAA不同质量浓度组合的分化培养基中，30 d后统计不定芽诱导率及芽生长状况。由表2可知：在分化培养基中，组合0.002 mg·L−1TDZ 和0.010 mg·L−1NAA培养基诱导不定芽的效果最佳，诱导率达75.00%，与其余组合的差异均达到显著水平(P＜0.05)，且不定芽健壮、生长旺盛(图2C)。
表 2 TDZ和NAA对不定芽诱导的影响
Table 2. Effects of TDZ and NAA on adventitious bud induction
植物生长调节剂组合 不定芽
诱导率/%不定芽生长状况 TDZ/
(mg·L−1)NAA/
(mg·L−1)0.001 0.010 8.30±14.43 cd 苗矮小，生长较差 0.001 0.050 5.50±4.79 cd 苗矮小，生长较差 0.002 0.010 75.00±14.43 a 苗健壮，生长旺盛 0.002 0.050 19.50±4.79 bc 苗细弱，生长一般 0.005 0.010 27.80±12.73 b 苗细弱，生长一般 0.005 0.050 16.60±14.43 bcd 苗细弱，生长一般 说明：数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P＜0.05)。 -
从表3可见：在组合为0.010 mg·L−1NAA和0.100 mg·L−1IBA的培养基中，植株生长旺盛(图3A)，生根率高达96.70%，平均生根数为2.57条，均有较多的侧根及根毛(图3B)；其次为组合0.010 mg·L−1NAA和0.050 mg·L−1IBA培养基，苗木长势较好，生根率为83.30%，平均生根数为1.93条。此外，当NAA为0.010 mg·L−1时，随着IBA质量浓度的增加，生根率逐渐升高，平均生根数也逐渐增多，同时不定根和组培苗的长势逐渐增强。而IBA为0.010 mg·L−1时，随着NAA质量浓度的增加，生根率逐渐降低，平均生根数逐渐减少，不定根和组培苗的长势减弱。因此，组合1/2 MS、0.010 mg·L−1NAA、0.100 mg·L−1 IBA培养基适合不定芽的生根诱导。
表 3 NAA和IBA对不定芽生根的影响
Table 3. Effects of NAA and IBA on the rooting of adventitious bud
植物生长调节剂组合 生根率/% 平均生根数/条 生长状态 NAA/(mg·L−1) IBA/(mg·L−1) 0.000 0.000 63.30±5.77 bc 1.33±0.49 bc 主根细长、无侧根苗长势较好 0.010 0.000 56.70±15.28 c 0.97±0.51 c 主根短少、侧根少、苗长势一般 0.010 0.100 96.70±5.77 a 2.57±0.25 a 主根粗壮、侧根发达、苗健壮 0.010 0.050 83.30±5.77 ab 1.93±0.57 ab 主根较粗、侧根较多、苗长势较好 0.010 0.010 66.70±15.28 bc 1.10±0.44 c 主根粗壮、侧根较少、苗长势一般 0.000 0.010 70.00±10.00 bc 1.23±0.30 bc 主根短少、侧根少、苗长势一般 0.050 0.010 63.30±5.77 bc 0.77±0.15 c 茎部有短根、苗长势一般 0.100 0.010 60.00±26.46 bc 0.70±0.40 c 主根短少、侧根少、苗长势一般 说明：数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P＜0.05)。 
图 3 滇杨不定芽生根诱导
Figure 3. Induction of adventitious rooting in P. yunnanensis
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图4可见：当头孢霉素质量浓度为0时，农杆菌生长迅速，但随着头孢霉素质量浓度的增加，农杆菌的数量逐渐减少，当头孢霉素质量浓度≥200 mg·L−1时，可较好地抑制农杆菌的生长，此时，农杆菌数量为0 (图4)。此外，将叶盘接种至含有不同质量浓度头孢霉素(0、100、200、300和400 mg·L−1)培养基中进行培养，结果表明头孢霉素质量浓度为0时，叶盘分化率为97.20%，随着头孢霉素质量浓度的增加，叶盘的分化率无显著差异(表4)。因此，选取200 mg·L−1头孢霉素作为后续抑制农杆菌生长的最佳质量浓度。
图 4 不同质量浓度头孢霉素对农杆菌的抑制
Figure 4. Inhibition of different concentration of cefotaxime on A. tumefaciens
表 4 头孢霉素对滇杨不定芽分化的影响
Table 4. Effect of cefotaxime on regeneration of the adventitious buds of P. yunnanensis
头孢霉素质量
浓度/(mg·L−1)诱导率/% 生长状况 0 97.20±4.79 a 不定芽多，生长正常 100 88.90±12.73 a 不定芽较多，生长正常 200 83.30±8.35 a 不定芽较多，生长正常 300 83.30±8.35 a 不定芽较多，生长正常 400 83.30±8.35 a 不定芽较多，生长正常 说明：数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P＜0.05)。 -
由表5可知：当卡那霉素质量浓度为0时，叶盘分化率为88.90%。随着卡那霉素质量浓度的增加，叶盘分化率急剧下降。当卡那霉素质量浓度≥20 mg·L−1时，叶盘生长速度缓慢，叶盘开始变黄甚至褐化，且分化率均为0。因此，选取20 mg·L−1卡那霉素对滇杨转化植株进行抗性筛选。
表 5 不同质量浓度卡那霉素对叶盘分化的影响
Table 5. Effects of different concentrations of kanamycin on leaf disc differentiation
卡那霉素质量
浓度/(mg·L−1)诱导率/% 生长状况 0 88.90±12.73 a 产生大量不定芽 10 38.90±12.73 b 产生少量不定芽 20 0.00±0.00 c 生长速度缓慢，无不定芽的形成 30 0.00±0.00 c 叶盘变黄 40 0.00±0.00 c 叶盘变黑死亡 说明：数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P＜0.05)。 -
由图5可知：菌液D(600)=0.2时的转化率显著高于0.6和1.0时 (P＜0.05)，此时转化率最高(50%)，随着D(600)的增加，转化率明显降低，可能由于较高的D(600)对叶盘产生了毒害作用(图5A)；侵染时间为5 min时，转化率显著高于10和15 min，随着侵染时间的增加，转化率呈下降趋势(图5B)；共培养2 d时，转化率最高，而较短的共培养时间和较长的共培养时间均导致转化效率降低，这是由于时间较短不利于基因与外植体整合，而时间较长会对叶盘造成伤害(图5C)。因此，菌液D(600)为0.2，侵染时间为5 min，共培养时间为2 d时，转化效率最高。
图 5 不同因素对滇杨转化率的影响
Figure 5. Effects of different factors in the transformation efficiency of P. yunnanensis
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通过农杆菌转化共获得44株抗性植株，分别取抗性植株叶片和茎段进行GUS染色。图6表明：有20株的叶片和茎段均显蓝色，说明GUS基因已成功转入滇杨并且能顺利表达。进一步提取经GUS染色鉴定的基因组DNA，进行GUS基因(预期2 239 bp)的PCR扩增，结果显示：经染色鉴定为阳性的植株均可扩增出清晰的GUS基因条带(图7)。最终获得阳性植株20株，阳性率为45.45%。
图 6 再生植株GUS染色结果
Figure 6. GUS staining results of regenerated plants
图 7 GUS基因PCR检测
Figure 7. PCR analysis of GUS gene
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杨树Populus作为乔木树种的模式植物，一些种的再生体系已得到广泛研究，其中辽宁杨P.×liaoningensis和河北杨P. hopeiensis在以叶片为外植体进行愈伤组织诱导和不定芽分化时，均以MS为最佳培养基[7−8]，而大青杨P. ussuriensis和毛果杨P. trichocarpa则以WPM培养基较为适宜[9−10]。本研究采用MS为基本培养基时，滇杨叶片外植体褐化较严重，而1/2 MS基本培养基中的外植体呈嫩绿色，说明1/2 MS培养基适合滇杨叶片外植体的培养，该结果也与张春霞等[5]的研究结果一致。表明不同杨树种的外植体愈伤组织和不定芽生长所需要的无机元素和营养物质具有差异性[11−13]。
植物生长调节剂的种类和质量浓度对植物愈伤组织和不定芽的诱导至关重要[14−15]。本研究选取了不同质量浓度的TDZ和NAA进行组合添加至愈伤组织及不定芽诱导培养基中，发现TDZ质量浓度为0.005 mg·L−1时，叶盘的愈伤组织诱导率较高，而当TDZ质量浓度为0.001 mg·L−1时，愈伤组织诱导率较低。同时，适宜质量浓度的NAA (0.010 mg·L−1)与低质量浓度的TDZ (0.002 mg·L−1)对不定芽的诱导有明显的促进作用。该结果与乌日罕等[8]对河北杨的研究结果一致。此外，杨树不定芽的生根是其再生的关键步骤[16]，青海青杨P. cathayana var. qinghai、胡杨P. euphratica和金叶杨P. nigra ‘Jinye’的最佳生根培养基为1/2 MS + IBA，生根率可达90%以上[17−19]，而彭言劼等[20]筛选出大叶杨P. lasiocarpa的最适生根培养基为1/2 MS + NAA。辛培尧等[21]研究发现：滇杨不定芽在1/2 MS + 0.020 mg·L−1NAA生根培养基中进行培养，10 d开始生根。本研究在1/2 MS + 0.010 mg·L−1 NAA + 0.100 mg·L−1 IBA培养基中，不定芽提前至5 d开始生根，且根系粗壮，须根多，生根率高达96.7%。说明采用IBA与NAA的组合更有利于滇杨不定芽的生根诱导。
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在卡那霉素抗性筛选中，发现当卡那霉素质量浓度为20 mg·L−1时，滇杨叶盘的生长受到严重抑制，而李春利等[22]研究表明：当卡那霉素质量浓度为30 mg·L−1时，毛白杨P. tomentosa愈伤组织不能分化形成不定芽。说明不同树种的不同受体材料对筛选剂的敏感度不同，因此选择合适的筛选剂质量浓度对获得转化植株至关重要[23]。此外，LI等[24]选用250 mg·L−1头孢霉素作为毛果杨的抑菌浓度。而本研究发现：200 mg·L−1头孢霉素就能完全抑制农杆菌生长，且对滇杨不定芽的生长影响较小。农杆菌质量浓度、侵染时间及共培养时间对植物的遗传转化效率起到重要作用[25−27]。本研究对这3个因素分析发现：当菌液吸光度为0.2，侵染时间为5 min，共培养为2 d时，最有利于滇杨的遗传转化，这与LI等[24]在毛果杨中的研究结果相似。
本研究以滇杨叶片为外植体，探讨了植物生长调节剂对叶片愈伤组织、不定芽诱导及其生根的影响，成功建立了滇杨离体叶片再生体系，并在此基础上，通过卡那霉素抗性筛选，利用农杆菌介导法从菌液吸光度、侵染时间和共培养时间开展了较为系统的研究，构建了滇杨的遗传转化体系。
Regeneration system and genetic transformation of Populus yunnanensis
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摘要:
目的 建立高效的滇杨Populus yunnanensis离体叶片再生及遗传转化体系，有助于滇杨基因工程育种研究。 方法 以滇杨叶片为外植体，研究不同植物生长调节剂组合对叶片愈伤组织和不定芽诱导及生根的影响，从而获得滇杨再生组培苗；进一步以农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法探讨菌液吸光度、侵染时间和共培养时间等对滇杨遗传转化效率的影响。 结果 滇杨愈伤组织诱导的最适培养基为1/2 MS + 0.005 mg·L−1噻苯隆(TDZ) + 0.010 mg·L−1萘乙酸(NAA)，诱导率达91.7%；不定芽诱导的最佳培养基为1/2 MS + 0.002 mg·L−1 TDZ + 0.010 mg·L−1 NAA，诱导率为75.0%；生根最适培养基为1/2 MS + 0.010 mg·L−1 NAA + 0.100 mg·L−1吲哚乙酸(IBA)，生根率高达96.7%，平均生根数为2.57条。利用pBI121-GUS载体转化滇杨，最适转化菌液吸光度D(600)为0.2，侵染时间为5 min，共培养时间为2 d；在分化过程中，抑制农杆菌生长的头孢霉素(Cef)最佳质量浓度为200 mg·L−1，抗性筛选中最佳培养基的卡那霉素(Kan)质量浓度为20 mg·L−1。对再生植株进行β-D-葡萄糖苷酸酶(GUS)组织化学染色和PCR鉴定，获得20株阳性植株，转化阳性率为45.45%。 结论 本研究成功建立了滇杨离体叶片再生和遗传转化体系。图5表5参27 Abstract:Objective This study is aimed to establish a highly efficient system for regeneration and genetic transformation of in vitro leaves of Populus yunnanensis so as to help genetic engineering breeding research in P. yunnanensis. Method First, with P. yunnanensis leaves as explants, an investigation was conducted of the effects of different combinations of exogenous hormone concentrations on the induction of callus, adventitious bud differentiation and rooting so as to obtain regenerated seedlings of P. yunnanensis. Then, Agrobacterium tumefaciens mediated method was used to explore the effects of bacterial concentration, infection time and co-culture time on the genetic transformation efficiency of P. yunnanensis. Result The optimal medium for callus induction was 1/2 MS + 0.005 mg·L−1 thidiazuron (TDZ) + 0.010 mg·L−1 1-naphthylacetic acid (NAA), with an induction rate of 91.7%. The optimal medium for the induction of adventitious bud was 1/2 MS + 0.002 mg·L−1 TDZ + 0.010 mg·L−1 NAA, with an induction rate of 75.0% whereas the optimal medium for rooting was 1/2 MS + 0.010 mg·L−1 NAA + 0.100 mg·L−1 3-indolebutyric acid (IBA), and the rooting rate was as high as 96.7%, with an average number of 2.57 roots. The optimal concentration of transforming bacterium D(600) was 0.2, the infection time was 5 min, and the co-cultivation time was 2 days. During differentiation, the optimal concentration of cefotaxime to inhibit the growth of A. tumefaciens was 200 mg·L−1, and the optimal concentration of kanamycin in the screening medium for resistant buds was 20 mg·L−1. The regenerated plants were identified by β-glucuronidase (GUS) staining and PCR, identified 20 positive plants, with a positive transformation rate of 45.45%. Conclusion The leaf regeneration system and genetic transformation system of P. yunnanensis were successfully established. [Ch, 5 fig. 5 tab. 27 ref.] -
Key words:
- Populus yunnanensis /
- leaf /
- callus /
- regeneration system /
- genetic transformation
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凋落物分解是调节森林生态系统养分循环的基本生态过程[1]，也是控制森林生态系统碳循环的关键决定因素[2]。凋落物分解过程受环境气候、凋落物质量、微生物等多种因素的影响[3-4]。近年来，人类活动引起的全球变化对凋落物分解的影响已成为研究的热点，尤其是酸雨对凋落物分解影响的变化受到国内外学者的普遍关注[4-5]。有研究发现：酸雨对凋落物分解的影响与养分还原、生态系统碳循环和碳平衡、退化生态系统的恢复、生态系统对酸雨的临界负荷等方面具有密切的联系[6]，它通过酸解凋落物有机成分而改变凋落物的物理化学结构，从而影响凋落物分解速率，最终改变整个地球碳循环进程[7]。森林凋落物分解速率对环境变化特别是氮沉降和温度增加等[8-9]的研究逐渐丰富，以凋落物分解速率为指标评估酸雨对凋落物分解的影响研究也逐渐开展。目前测定凋落物分解速率的主流方法是分解袋法，即观测分解袋内给定样品量的凋落物的质量损失率，然后根据指数模型来推算分解速率。凋落物分解常数k值是表征凋落物分解速率的常用指标，k值越大，凋落物分解速率越快，反之则越慢[10]。酸雨对凋落物分解会因树种的不同而有明显的差异，酸雨处理下，阔叶树种叶凋落物分解速率比针叶树种的叶凋落物分解速率快[11]，马尾松Pinus massoniana凋落物分解比其他树种对酸雨酸碱度更敏感[12]。中国南方是继欧洲和北美以外的世界第三大酸雨区[13]。近几年关于酸雨与凋落物的研究主要集中在单个树种凋落叶上，而对不同林分整体林下凋落物的关注较少[14]，同时多侧重于叶凋落物质量所引起的凋落物分解速率的变化，鲜有研究酸雨导致的综合影响。酸雨胁迫对西南地区林分凋落物分解的变化规律尚不明确。因此，本研究选取中国西南酸雨区重庆缙云山的针阔混交林和常绿阔叶林作为研究对象，研究不同酸碱度酸雨处理下凋落物的干质量残留率和分解速率随时间变化的动态过程，分析缙云山针阔混交林与常绿阔叶林凋落物分解在缓解酸雨过程中的特点和规律，以期掌握森林土壤碳库循环，为优化森林管理，指导林分配置提供科学依据。
1. 研究区与方法
1.1 研究区概况
研究区位于三峡库区(重庆段)重庆市缙云山国家级自然保护区，嘉陵江小三峡之温塘峡西岸。缙云山位于重庆市西北部的北碚、沙坪坝、壁山3个区县境内(29°41′~29°52′N，106°17′~106°24′E)，海拔为175.0~951.5 m，总面积为76 km2。缙云山具有典型的亚热带季风湿润性气候特征，雨量丰富，年均降水量为1 611.8 mm，年均相对湿度为85%以上，年均酸雨pH 4.53，年均日照时数1 293 h。缙云山地形平缓，土层较薄，主要土壤为黄壤和水稻土两大类，土壤pH 3.5~4.5。保护区内植物资源丰富，森林覆盖率高，林分凋落物保护较好，经营性活动如采伐、施肥、抚育等基本停止。主要植被类型为常绿阔叶林、针阔混交林、常绿阔叶灌丛、暖性针叶林、针阔混交林、竹林，以及亚热带灌草丛等。主要树种为马尾松、四川大头茶Gordonia acuminate、杉木Cunninghamia lanceolata、四川山矾Syraplocos setchuanensis、白毛新木姜子Neolitea aurata等。
1.2 材料与方法
1.2.1 样地选取与凋落物样品采集
选取针阔混交林、常绿阔叶林2种典型林分作为研究对象, 样品采集、保存和测定方法严格参照《土壤理化分析》[15]，标准样地概况见表1。分别选取10 m×10 m的采样框并用孔径1 mm尼龙网围栏，于2016年5月在2种样地内随机选取5 m×5 m样方各3个，用凋落物收集器直接收集凋落物，收集主要树种与伴生树种的落叶、枯枝、落果、碎屑等，收集到的凋落物在60 ℃恒温下烘至恒量后称量备用。再将采集的凋落物称量20 g装入由尼龙制成的20 cm×20 cm的分解网袋(网孔1 mm)内，由于实验地点内无径流，无大风天气，故编号挂牌后直接将所有尼龙网袋平放在采集针阔混交林与常绿阔叶林凋落物的样方凋落物层中，使其下方接触矿质土壤，上面用凋落物覆盖，每个5 m×5 m的小样方中设置6个摆放点，对应6次取样时间，模拟凋落物分解的自然状况[16]。
表 1 样地基本情况Table 1 Basic situation of the sample plot林分 表层土壤/cm 海拔/m 坡向 坡度/(°) 龄级 郁闭度 主要树种 伴生树种 针阔混交林 4.00 760 西北 16~25 Ⅵ 0.9 马尾松、四川大头茶、 四川山矾 柃木、四川杨桐、光叶 山矾、白毛新木姜子 常绿阔叶林 3.65 825 西北 26 Ⅵ 0.9 四川大头茶、四川杨桐、 白毛新木姜子 小叶栲、贵州鼠李、四 川山矾、柃木 说明：研究区域均为人工林，以10 a为1个龄级，用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ······表示。四川杨桐Adinandra bockiana、柃木 Eurya japonica、光叶 山矾 Symplocos lancifolia、小叶栲 Castanopis carlesii、贵州鼠李Rhamnus esquirolii 1.2.2 模拟酸雨淋溶
根据重庆缙云山降水化学组成[17]，使用去离子水配制模拟酸雨，其中
${\rm{SO}}_4^{2-}$ 和NO−摩尔比为5∶1。针阔混交林、常绿阔叶林2种典型林分内均设置4个处理：对照(按照自然状态降雨年均pH 4.50设置，ck)、pH 4.00、pH 3.25和pH 2.50。其中，按照降雨pH最低值设置pH 3.25，考虑极端状况下降雨pH可能降低，设置pH 2.50处理。每个处理3次重复，共设 24个分解袋。根据重庆缙云山多年平均降水量计算淋溶总量与淋溶频率[9]，喷淋酸雨，每月施酸2次，每次每个样品施酸2 L，均匀喷洒覆盖样品周围1 m2范围。分别在样品放置后的第30天(6月2日)、第60天(7月2日)、第94天(8月3日)、第122天(9月2日)、第150天(10月1日)和第185天(11月3日)，取回1次凋落物分解袋，每次每个酸雨酸碱度取样3袋，合计24袋。用清水快速洗净残留凋落物表面附着的泥沙，清理外界长入分解袋内的根系杂物，于80 ℃烘箱中烘干称量，测定残留凋落物的质量。1.2.3 凋落物残留率与分解周期计算
凋落物累积分解残留率采用Olson负指数衰减模型[18]计算：
$$ y=\frac{{M}_{t}}{{M}_{0}}=a{{\rm{e}}}^{-mt}\mathrm{。} $$ 其中：y为凋落物残留率(%)，t为凋落物分解时间(a)，Mt为时间t后凋落物残留质量(g)，M0为凋落物样品未分解时质量(g)，a为拟合系数，m为分解系数。用凋落物分解常数k值估算凋落物分解的半衰期与全衰期，计算公式如下 [19]：
$$ {t}_{0.5}=\frac{\mathrm{ln}0.5}{-k}\mathrm{；} $$ $$ {t}_{0.95}=\frac{\mathrm{ln}0.95}{-k} 。$$ 其中：t0.5为凋落物分解至50%(半衰期)需要的时间(a)，t0.95为凋落物分解至95%(全衰期)需要的时间(a)。
1.2.4 数据处理
采用Excel 2019软件整理数据，采用SPSS 26.0软件进行统计分析，采用LSD最小差异显著法多重比较。
2. 结果与分析
2.1 酸雨胁迫对2种凋落物干质量残留率的影响
由图1和图2可见：针阔混交林干质量残留率(经历相同分解时间)在pH 4.00、pH 3.25的酸雨处理下小于ck，在pH 2.50的酸雨处理下大于ck，且差异显著(P＜0.05)。受控试验表明：凋落物在经过0.5 a的分解后，针阔混交林ck、pH 4.00、pH 3.25和pH 2.50酸雨处理的干质量残留率分别为81.21%、79.14%、81.65%和84.52%，干质量损失率分别为18.79%、20.86%、18.35%和15.48%；常绿阔叶林ck、pH 4.00、pH 3.25和pH 2.50酸雨处理的残留率分别为76.61%、75.36%、77.43%和79.13%，干质量损失率分别为23.39%、24.64%、22.57%和20.87%。在经过0.5 a的分解后，ck、pH 4.00、pH 3.25和pH 2.50酸雨处理后的针阔混交林干质量残留率均高于常绿阔叶林，分别高4.60%、3.78%、4.22%和5.39%。
图 1 2种典型林分凋落物干质量残留率动态Figure 1 Changes in dry weight remaining of leaf litter decomposition of three typical tree species
图 2 2种典型林分凋落物干质量平均损失率Figure 2 Average dry weight loss rate of litter of two typical forests在相同pH值酸雨处理下，针阔混交林、常绿阔叶林凋落物在6—7月(即30~60 d)干质量残留率曲线平缓，8—9月(即94~122 d)曲线下降幅度较大，表明在相同pH值处理下，针阔混交林、常绿阔叶林在6—7月分解缓慢，5月、8—9月凋落物分解较为迅速。随着时间的推移，针阔混交林在9月(122 d)后凋落物分解速率降低，呈平缓趋势，常绿阔叶林在9月后凋落物分解速率仍达到较高水平，下降明显。在相同月份下，凋落物干质量残留率在pH 2.50处理下最高，pH 4.00处理最低。
2.2 酸雨胁迫对2种凋落物分解常数k值的影响
由表2可见：利用Olson负指数衰减函数模型对针阔混交林和常绿阔叶林的凋落物干质量残留率和分解时间进行拟合，R2均在0.9以上，达极显著水平，拟合效果良好。ck、pH 4.00、pH 3.25和pH 2.50各处理下针阔混交林的k值分别为0.43、0.47、0.40和0.35，而常绿阔叶林则分别为0.54、0.56、0.51 和0.46，k值随pH值的降低呈下降趋势。另外由k值可算得，ck中针阔混交林凋落物质量损失率达50%和95%的时间分别为1.62和6.98 a，常绿阔叶林则分别为1.29和5.56 a；pH 4.00酸雨处理下针阔混交林凋落物干质量损失率分别达50%和95%的时间分别为1.47和6.35 a，常绿阔叶林则分别为1.23和5.33 a；pH 3.25酸雨处理下针阔混交林凋落物干质量损失率达50%和95%的时间分别为1.75和7.56 a，常绿阔叶林则分别为1.37和5.92 a；pH 2.50酸雨处理下针阔混交林凋落物干质量损失率达50%和95%的时间分别为2.00和8.63 a，常绿阔叶林则分别为1.50和6.48 a，且针阔混交林与常绿阔叶林在各酸雨酸碱度下差异显著(P＜0.05)。针阔混交林与常绿阔叶林在pH 2.50与pH 3.25酸雨处理下的分解速率均小于ck，半衰期与周转期所需的时间均比ck长；pH 4.00酸雨处理的分解速率较ck大，半衰期与周转期所需的时间比ck短。
表 2 凋落物分解的Olson负指数衰减模型Table 2 Olson negative exponential decay model of litter decomposition林分 pH 指数模型 相关
系数R2分解
系数k半衰期
/a
全衰期
/a针阔
混交林4.50 (ck) y = 99.13e−0.43x 0.93 0.43 a 1.62 b 6.98 b 4.00 y = 97.98e−0.47x 0.95 0.47 b 1.47 ab 6.35 ab 3.25 y = 97.20e−0.40x 0.93 0.40 a 1.75 b 7.56 b 2.50 y = 99.60e−0.35x 0.98 0.35 a 2.00 b 8.63 b 常绿
阔叶林4.50 (ck) y = 99.08e−0.54x 0.98 0.54 b 1.29 a 5.56 a 4.00 y = 98.53e−0.56x 0.98 0.56 ab 1.23 a 5.33 a 3.25 y = 98.33e−0.51x 0.97 0.51 b 1.37 a 5.92 a 2.50 y = 98.20e−0.46x 0.97 0.46 b 1.50 ab 6.48 ab 说明：不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)。y为凋落物干质量残留率，x为凋落物分解时间 3. 讨论
3.1 酸雨胁迫对2种林分凋落物分解的影响
在同一观测阶段，缙云山针阔混交林、常绿阔叶林凋落物随着酸雨pH值的减小，凋落物干质量残留率均表现出先增大后减小的趋势，在pH 4.00时达到最小值，此时分解速率最大。这与程煜等[13]研究得出的不同酸碱度酸雨对凋落物分解速率的影响结果一致。可能是pH 4.00的模拟酸雨酸碱度与ck差距不大，且土壤本身存在酸缓冲能力，同时模拟酸雨中的
${\rm{NO}}_3^- $ 作为氮源添加刺激了土壤微生物，从而提高了分解效率[20]。而pH 2.50和pH 3.25的模拟酸雨酸碱度过低导致微生物活性和功能降低，且在一定范围内随着酸雨淋溶酸碱度的降低[21-22]，分解速率愈加减慢，表现为调落物分解被抑制。3.2 季节变化对2种林分凋落物分解的影响
本研究发现：相同pH值的酸雨处理下，针阔混交林、常绿阔叶林凋落物在6—7月、10—11月凋落物分解缓慢，5月、8—9月分解较为迅速。可能因为：5月属于分解初期，凋落物可溶性成分大量淋失，导致分解速率较高；6—7月，难分解的物质相对增加，温度相对变化不大，分解速率主要受微生物控制；8—9月，由于夏季温度升高，水分充足，针阔混交林、常绿阔阔叶林地表植被活性大，微生物活性提高，分解速率增大；而10—11月，气温降低，地表植被逐渐进入冬寒期，微生物活性受到影响，分解速率减缓。在同一区域内，温度和湿度是众多气候因素中制约凋落物分解的主要外在因素，水分和温度增加，凋落物的分解速率会以指数增加模式呈现[23-24]。HORNSBY等[25]在研究树木凋落物的分解速率时发现：凋落物的分解速度随着分解时温度的升高而加快，分解温度与分解速度呈正相关关系；王其兵等[26]通过测定草地凋落物分解速率的研究中也得出了相同结论。本研究分析随季节温度变化研究地的水热、pH等条件改变，从而影响了部分微生物的活性，甚至是土壤中H+的积累，进而对凋落物的分解速率产生了较大的影响。本研究中由于人工控制降水量，前期不同季节月份中水分条件差异小，湿度因素对分解速率产生的影响差异小，这使得气候变化导致的温度变化影响了2种林分凋落物的分解速率。
3.3 不同树种对凋落物分解的影响
不同酸碱度酸雨淋溶下2种典型林分凋落物干质量损失率达50%和95%的时间总体表现为常绿阔叶林早于针阔混交林。针阔混交林和常绿阔叶林凋落物k对同一酸碱度酸雨胁迫响应不同，说明不同树种的林下凋落物分解速率有差异。在经过0.5 a的分解后，常绿阔叶林凋落物分解速率大于针阔混交林，符合阔叶凋落物比针叶凋落物易于分解的一般规律。阔叶林微生物群落对外部酸的抵抗力高于针叶林[27]，其凋落物比针叶凋落物易于分解。植物种类也会影响凋落物的初始化学特性[28-29]。混合凋落物比单一凋落物含有丰富多样的碳源和其他养分物质[30]，针叶类凋落物添加阔叶类后碳源种类和数量发生改变[31]，导致土壤微生物量和微生物碳代谢强度减少，因此相对降低了凋落物的分解速率，但是这种作用的影响程度是否能够改变酸雨淋溶产生的影响还需要进一步研究。
本研究模拟酸雨喷洒时间较短，尚不能确定西南地区亚热带森林对长期酸雨胁迫如何响应及酸雨的促进或者抑制作用是否已经达到一定阈值。此外，凋落物能缓冲酸雨反应，林下植物对凋落物分解也产生一定联系作用[32]。因此，未来应同步开展多林分凋落物质量、叶片性能和林下植物对酸雨输入响应的长期野外研究，以更好地揭示长期酸雨沉降对亚热带森林的综合影响。
4. 结论
综上，重庆缙云山针阔混交林和常绿阔叶林凋落物质量残留率、半衰期和全衰期的变化特征受不同酸碱度酸雨影响显著，模拟酸雨pH 4.00处理时凋落物分解速率最大，常绿阔叶林分解速率总体高于针阔混交林。在同一区域范围内，除酸雨酸碱度、凋落物种类之外，凋落物分解速率还受到温度条件的制约。
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图 4 不同质量浓度头孢霉素对农杆菌的抑制
Figure 4 Inhibition of different concentration of cefotaxime on A. tumefaciens
图 5 不同因素对滇杨转化率的影响
Figure 5 Effects of different factors in the transformation efficiency of P. yunnanensis
表 1 TDZ和NAA对愈伤组织诱导的影响
Table 1. Effects of TDZ and NAA on callus induction
植物生长调节剂组合 愈伤组织
诱导率/%愈伤组织状况 TDZ/
(mg·L−1)NAA/
(mg·L−1)0.001 0.010 36.00±12.73 e 浅黄色，疏松，长势较差 0.001 0.050 55.60±12.72 d 浅黄色，疏松，长势较差 0.002 0.010 63.90±9.64 cd 浅绿色，疏松，长势一般 0.002 0.050 83.30±8.35 abc 浅绿色，紧实，长势一般 0.005 0.010 91.70±8.35 ab 浅绿色，紧实，长势较好 0.005 0.050 77.80±4.79 bc 浅绿色，紧实，长势一般 说明：数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P＜0.05)。 
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表 2 TDZ和NAA对不定芽诱导的影响
Table 2. Effects of TDZ and NAA on adventitious bud induction
植物生长调节剂组合 不定芽
诱导率/%不定芽生长状况 TDZ/
(mg·L−1)NAA/
(mg·L−1)0.001 0.010 8.30±14.43 cd 苗矮小，生长较差 0.001 0.050 5.50±4.79 cd 苗矮小，生长较差 0.002 0.010 75.00±14.43 a 苗健壮，生长旺盛 0.002 0.050 19.50±4.79 bc 苗细弱，生长一般 0.005 0.010 27.80±12.73 b 苗细弱，生长一般 0.005 0.050 16.60±14.43 bcd 苗细弱，生长一般 说明：数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P＜0.05)。
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表 3 NAA和IBA对不定芽生根的影响
Table 3. Effects of NAA and IBA on the rooting of adventitious bud
植物生长调节剂组合 生根率/% 平均生根数/条 生长状态 NAA/(mg·L−1) IBA/(mg·L−1) 0.000 0.000 63.30±5.77 bc 1.33±0.49 bc 主根细长、无侧根苗长势较好 0.010 0.000 56.70±15.28 c 0.97±0.51 c 主根短少、侧根少、苗长势一般 0.010 0.100 96.70±5.77 a 2.57±0.25 a 主根粗壮、侧根发达、苗健壮 0.010 0.050 83.30±5.77 ab 1.93±0.57 ab 主根较粗、侧根较多、苗长势较好 0.010 0.010 66.70±15.28 bc 1.10±0.44 c 主根粗壮、侧根较少、苗长势一般 0.000 0.010 70.00±10.00 bc 1.23±0.30 bc 主根短少、侧根少、苗长势一般 0.050 0.010 63.30±5.77 bc 0.77±0.15 c 茎部有短根、苗长势一般 0.100 0.010 60.00±26.46 bc 0.70±0.40 c 主根短少、侧根少、苗长势一般 说明：数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P＜0.05)。
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表 4 头孢霉素对滇杨不定芽分化的影响
Table 4. Effect of cefotaxime on regeneration of the adventitious buds of P. yunnanensis
头孢霉素质量
浓度/(mg·L−1)诱导率/% 生长状况 0 97.20±4.79 a 不定芽多，生长正常 100 88.90±12.73 a 不定芽较多，生长正常 200 83.30±8.35 a 不定芽较多，生长正常 300 83.30±8.35 a 不定芽较多，生长正常 400 83.30±8.35 a 不定芽较多，生长正常 说明：数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P＜0.05)。
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表 5 不同质量浓度卡那霉素对叶盘分化的影响
Table 5. Effects of different concentrations of kanamycin on leaf disc differentiation
卡那霉素质量
浓度/(mg·L−1)诱导率/% 生长状况 0 88.90±12.73 a 产生大量不定芽 10 38.90±12.73 b 产生少量不定芽 20 0.00±0.00 c 生长速度缓慢，无不定芽的形成 30 0.00±0.00 c 叶盘变黄 40 0.00±0.00 c 叶盘变黑死亡 说明：数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P＜0.05)。
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