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石蒜属Lycoris植物为多年生球根花卉，花型奇特且类型繁多，花色丰富，冬春花败观其叶，夏秋叶枯赏其花，观赏价值高[1]。此外，石蒜属植物含有的生物碱、石蒜碱颇具医药研究开发潜力[2−3]。石蒜新品种‘梦幻少女’Lycoris chinensis × radiata ‘Astro Girl’是中国石蒜L. chinensis和石蒜L. radiata的种间杂交种，其花色以乳黄白色为底色，雾粉渐变于花瓣末端，花朵形态优雅折曲，同样渐变色的花丝抽展而出，呈现梦幻、活力、雅致的观赏感，极具研究和推广价值，但‘梦幻少女’染色体数目(2n=19)为非整倍数，自然条件下种球繁殖效率低，速度慢。
植物组织培养技术成为目前推广新品种和良种的重要手段。该技术具有材料耗费量少、繁殖系数高、不受季节限制、周期短和快速批量成苗的特点，能够良好地保持繁殖母本遗传基因型，从而获得优良稳定材料。至今已建立多种石蒜属植物的组培快繁体系[4]，但主要以带基盘的双鳞片或鳞茎为外植体，通过诱导不定芽来建立离体快繁体系，繁殖系数相对较低。通过体胚发生途径，可获得数量更多、发育速度更快、遗传性更稳定的再生植株，在栎属Quercus[5]、松科Pinaceae[6−7]及云杉属Picea[8]等植物建立的体胚发生体系，加速了林木育种改良、苗木工程绿化、有效成分提取及种质资源保护与利用等方面的应用。然而，多数植物体胚的研究仍存在体胚形成再生植株困难和发育不同步等瓶颈[9]。关于石蒜属植物体胚相关的研究，仅王彩霞等[10]通过诱导忽地笑Lycoris aurea鳞茎盘端1/3鳞茎的愈伤组织，进而分化体胚，而关于石蒜属其他种的体胚研究还相对较少。鉴于此，本研究分析了石蒜‘梦幻少女’体胚发生过程中的细胞学与生理特性，探索其体胚繁殖体系及发育机理，为石蒜属植物工厂化育苗提供技术支撑。
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将石蒜鳞茎球不同部位组织为外植体，诱导愈伤组织。在愈伤组织连续增殖继代中，筛选稳定增殖的淡黄色、半透明的胚性愈伤组织，再将胚性愈伤组织进行体细胞胚的诱导与增殖培养，筛选出D23培养基[基础培养基(MS)+2.00 mg·L−16-苄氨基嘌呤(6-BA) +0.05 mg·L−12,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+30.00 g·L−1蔗糖+6.20 g·L−1琼脂]为最佳的体胚诱导与增殖培养基。培养条件：光周期14 h·d−1，光照1 500 lx，温度(27±2) ℃，以下研究培养条件相同。
2022年7月选取生长一致的胚性愈伤组织，接种至D23培养基进行培养，间隔5 d (0、5、10、15、20、25、30、35和40 d)挑选长势相对一致的材料，体视镜(OLYMPUS SZX 7)显微观察并拍照，同时，取10 g材料液氮速冻后于−80 ℃超低温冰箱中保存，用于生理生化指标测定，重复3次。
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石蜡切片参照李丹等[11]的方法改良后进行，取材固定3 d以上，梯度乙醇脱水、浸蜡，之后于65 ℃融化石蜡连续浸蜡8 d，新蜡包埋、切片(厚度9 μm)、制片，40 ℃烤片至干燥，常温保存备用。
脱蜡复水，染色(苏木素中染色4~5 min，盐酸水溶液分化5 s，氨水水溶液返蓝30 s内，自来水浸洗)，依次于体积分数为85%、95%的乙醇脱水各5 min，伊红染液染色5 min，乙醇脱水，中性树胶封片，于徕卡(LEICA DM4000)显微镜观察拍照。
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称取0.1 g样品置2.0 mL离心管中，加入1.0 mL磷酸缓冲液(pH 7.4)和适量研磨珠，于−10 ℃预冷的冷冻研磨机中研磨，4 ℃ 8 000 r·min−1离心 20 min，取上清液，冰上保存备用。
采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试剂盒(GIVEI，极威生物科技公司，上海)测定淀粉、总蛋白质和酶活性[12]。在预先包被抗体的孔板中，依次加样、温浴、清洗、显色后，于酶标仪(SPECTRA MAX 190)上测定D(450)，计算样品的质量浓度或活性。
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参考林绍艳等[13]方法将1.0 g·L−1腐胺、精胺和亚精胺混合标准品溶液，稀释成10.0 mg·L−1，再逐级稀释2、4、8、16、32、64、128倍，上机测定其峰面积，并以多胺质量分数为自变量，峰面积为因变量，绘制标准曲线。
称取0.1 g各样品冻干粉末于离心管中，加入预冷的体积分数为10%的乙腈2.0 mL，涡旋混匀，9 000 r·min−1离心5 min，0.22 μm滤膜过滤，使用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测量样品的多胺质量分数。
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采用Excel 2022整理数据，SPSS 23.0对生理生化指标进行单因素方差分析和多重比较(邓肯检验)，使用GraphPad prism 9.0制图。
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组织学观察表明：在接种的第0~15天时，胚性愈伤组织呈浅黄色透明状。刚接种时，愈伤组织表面为鲜润、淡白色的颗粒状团块，胚性细胞在愈伤组织表层或亚表层散状分布，内层多为较大的非胚性细胞疏松排列；接种第5天时，愈伤组织逐渐适应培养环境，表面湿润，表层附近的胚性细胞开始活跃分裂，且密集分布；第10天时，愈伤组织发生了一定程度的增殖，球形胚初步形成并向外凸出；第15天时，愈伤组织主要发生增殖与分化球形胚，少量心形胚和棒状胚形成，心形胚维管束形成，与母体愈伤组织形成生理隔离(图1)。
图 1 体胚发生过程的0~40 d组织细胞学变化
Figure 1. Histocytological changes of somatic cell embryogenesis during 0 − 40 days
在培养的第20~40天时，胚性愈伤组织转变为光亮、浅黄色。在第20天时，愈伤组织继续增殖、分化为球形胚，且球形胚加速膨大，维管束形成；同时，部分球形胚明显分化至心形胚、棒状胚。第25天时，体胚之间的排列开始变得疏松，簇状的体胚形态发育速度不均一。与培养第0~20天相比，体胚形态成熟转化速度明显加快，大部分球形胚发育至心形胚、棒状胚、子叶胚雏形，体积膨大。第30天时，胚性愈伤组织增殖不明显，继续分化少量新的球形胚，大部分体胚发育至子叶胚的初步形态且继续膨大；第35天时，胚性愈伤组织活性开始减弱，簇状体细胞胚的形态发育速度再次加快，差异较明显，同时存在球形胚、心形胚、棒状胚和子叶胚，子叶胚形态轮廓更加成熟，结构上外边缘的胚性细胞分布密集，总体上棒状胚的数量相对较多；第40天时，形体较大的体胚继续成熟，部分体胚退化至非胚性愈伤组织，子叶胚中间分化出具有两极性的轴状胚性细胞团。
在0~40 d的体胚发生过程中，球形胚从发生到短暂膨大维持约20 d，进一步分化为心形胚、棒状胚和子叶胚。在膨大的球形胚后期或心形胚时期基部会形成维管束，后期子叶胚可发育为小鳞茎。
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由图2可见：在体胚发生过程中，淀粉质量浓度呈先下降后稳定的趋势。在体胚发生早期(0~20 d)和体胚成熟期(20~40 d)，淀粉质量浓度存在显著差异(P＜0.05)。
图 2 体胚发生过程中淀粉和总蛋白质质量浓度的变化
Figure 2. Changes of starch and total protein content during somatic cell embryogenesis
根据体胚发生过程中的形态与组织学特征(图1)，在体胚早期(0~20 d)，球形胚形成时，淀粉质量浓度发生了明显积累；球形胚发育至心形胚、棒状胚时，淀粉质量浓度大幅下降。在子叶胚时期(20~35 d)，随着子叶胚的形成、体积膨大和体胚成熟，淀粉质量浓度持续下降，呈现负相关关系。第35~40天时，可能由于营养供给不足、次生物质积累少等导致部分体胚退化为愈伤组织，部分子叶胚出现明显的两极分化，此时淀粉质量浓度明显上升。
总蛋白质质量浓度在体胚发生早期(0~20 d)时保持不变，在20~25 d迅速上升，而后呈下降趋势。体胚早期发育阶段总蛋白质质量浓度差异不显著，第25天时出现峰值后回落，子叶胚分化到成熟期间(20~40 d)时，总蛋白质质量浓度差异显著(P＜0.05)。
在体胚早期(0~20 d)，愈伤组织增殖、体胚前期形态转化(球形胚、心形胚和棒状胚)阶段，总蛋白质质量浓度维持在一定的阈值，变化不明显。愈伤组织和体胚混合体为淡黄色(第20天时转为光亮色泽)。子叶胚时期(20~35 d)，总蛋白质质量浓度骤升式积累(子叶胚形成期)；子叶胚逐渐成熟且膨大时，总蛋白质质量浓度下降，说明子叶胚形成与总蛋白质质量浓度呈正相关，子叶胚成熟阶段则相反；在第35~40天时，总蛋白质质量浓度有所回升。
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由图3可见：体胚发生过程中，过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性存在显著差异(P＜0.05)。POD和CAT活性变化与总蛋白质质量浓度的变化趋势相似，在体胚发生早期(0~20 d)保持不变，在20~25 d时迅速提高，而后下降。POD活性下降到30 d时保持相对不变；CAT活性在30~40 d时呈持续下降趋势。POD和CAT活性在体胚发生的0~25 d时活性变化与体细胞的形态变化相对应，且和总蛋白质质量浓度变化趋势相似。子叶胚成熟期(25~40 d)，POD活性先下降，此时大部分体胚发育至子叶胚且继续膨大(25~30 d)，之后子叶胚成熟阶段POD活性变化较小(30~40 d)；而CAT活性随着子叶胚的成熟逐渐下降(25~40 d)，表明POD和CAT活性与子叶胚的形成呈正相关，POD活性与子叶胚初步膨大呈负相关，CAT活性与子叶胚的成熟呈负相关。
图 3 体胚发生过程中抗氧化酶活性的变化
Figure 3. Changes of antioxidant enzyme activity during somatic embryogenesis
SOD活性呈现2个峰值后略有回升。在培养第5天和第20天时出现明显峰值，体胚分化早期(0~15 d)和分化中后期(15~40 d)，SOD活性差异显著(P＜0.05)。在体细胞胚早期(0~15 d)，胚性愈伤组织处于增殖阶段中，SOD活性提高；在球形胚的形成与增殖阶段中，SOD活性逐渐下降。在心形胚和棒状胚的形成阶段(15~20 d)，SOD活性提高。在子叶胚的形成及成熟阶段(20~40 d)，SOD活性急剧下降；当内部聚集性的两极开始形成时，SOD活性又有所回升。
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由图4可知：腐胺(Put)、精胺(Spm)和亚精胺(Spd)质量分数变化整体呈M型。腐胺在培养第10天和第35天时出现峰值。精胺在第10天和第30天时出现峰值。亚精胺在第15天和第30天时出现峰值。体胚发育的不同时期多胺质量分数差异显著(P＜0.05)。
图 4 体胚发生过程中多胺氧化酶活性与多胺质量分数的变化
Figure 4. Changes of polyamine oxidase activity and polyamine content during somatic embryogenesis
在球形胚形成时期(5~10 d)，多胺(PAs)质量分数快速上升，球形胚发育至子叶胚期(10~30 d)时，腐胺质量分数下降；精胺质量分数在子叶胚期前呈下降趋势，至子叶胚时期呈上升趋势；球形胚时期，亚精胺质量分数逐渐上升，至心形胚、棒状胚时期急剧下降，子叶胚膨大、成熟时期亚精胺质量分数呈上升趋势。在子叶胚成熟后期(30~40 d)，腐胺质量分数为急剧上升后下降，精胺和亚精胺质量分数为下降后上升。
腐胺、精胺和亚精胺质量分数变化共同决定多胺的变化趋势，多胺的峰回变化主要表现为愈伤组织增殖、体胚早期分化和子叶胚期成熟3个时期，多胺主要在体胚早期分化和发育阶段大量积累，说明多胺可能共同调控体胚的形成。
在体胚发生过程中多胺氧化酶活性呈M型变化趋势。在第10天和第30天出现峰值，在体胚分化早期(0~15 d)和子叶胚成熟后期(30~40 d)，多胺氧化酶活性差异显著(P＜0.05)。
在体胚分化早期(0~15 d)，胚性愈伤组织增殖时，多胺氧化酶活性下降；球形胚形成时，多胺氧化酶活性快速上升呈明显的正相关作用；球形胚短暂增殖时，多胺氧化酶活性快速下降。在子叶胚期(20~40 d)，子叶胚形成及成熟初期，多胺氧化酶活性又上升；在子叶胚后续膨大成熟时，多胺氧化酶活性急剧下降。
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许多植物中同时存在内起源和外起源2种方式，如芍药Paeonia lactiflora[14]、香榧Torreya grandis ‘Merrillii’[15]。本研究石蒜品种‘梦幻少女’体胚发生为外起源，球形胚发生多为愈伤组织的外表层或亚外层，但不能完全排除内起源的可能。‘梦幻少女’体胚形态发育的过程经历了球形胚—心形胚—棒状胚—子叶胚，这与荔枝Litchi chinensis[16]、油棕Elaeis guineensis[17]、火炬松Pinus taeda[18]和白刺花Sophora davidii[19]等植物的体胚形态发生过程相似。
体胚与母体愈伤组织产生生理隔离是植株再生的重要前提，否则易出现胚畸形、退化、死亡等问题[20]。在荔枝、鹅掌楸Liriodendron chinense的早期原胚期[16, 21]，以及枣Ziziphus jujuba[20]和苏玛栎Quercus shumardii[22]等的部分球形胚期均出现生理隔离形成的现象。本研究对‘梦幻少女’体胚发生过程的组织学特征观察发现：球形胚、心形胚形成维管束，与母体愈伤组织形成生理隔离。
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在体胚发生过程中，淀粉、可溶性蛋白质、酶活性等的变化是相关基因表达和调控的结果[23]。在体胚发生过程中，作为能量物质，淀粉积累在细胞代谢、形态分化和发育等方面均起着重要的作用[23]。仙客来Cyclamen persicum在球形胚时期出现淀粉积累高峰[24]。人参Panax ginseng在成熟胚中淀粉积累量最高[25]。在本研究中，淀粉积累的高峰出现在‘梦幻少女’的球形胚时期，说明淀粉积累可能促进了球形胚的形成。
在体胚发生过程中，蛋白质同样是重要的物质和能量代谢基础。大蒜Allium sativum愈伤组织分化球形胚时，可溶性蛋白质质量浓度上升，在体胚后续发育至植株再生期间，可溶性蛋白质质量浓度不断下降，表明球形胚时期可溶性蛋白质的积累主要用于后续的发育和成熟阶段[26]。本研究中‘梦幻少女’体胚发生前期总蛋白质质量浓度保持稳定，在第25天时快速出现高峰，代谢活动加强，之后快速下降，表明迅速积累的总蛋白质可能为子叶胚形成和成熟提供了能量，该结果与橡胶树Hevea brasiliensis[27]、樱桃番茄Lycopersicon esculentum[28]等体胚发生研究的结果相一致。
POD、CAT和SOD为植物代谢中的重要酶类。POD可以促进木质素合成，与呼吸作用相关，进而推进体胚的形态发育[28]；SOD作为一种保护酶和诱导酶，对胚胎发育具有促进作用，在体胚发育早期快速积累起到保护组织和细胞的作用[29]；CAT具有提高抗逆性、提高抗氧化能力和延缓植物衰老的作用。本研究中POD、SOD活性的变化趋势与总蛋白质质量浓度相似，POD在体胚发生的早期变化不明显，在子叶胚形成时快速积累，说明POD的积累可能有利于子叶胚形成；SOD的峰值出现在培养的第5天和第20天，可能促进球形胚和子叶胚形态分化；CAT活性在培养第25天开始下降，此时子叶胚开始不断成熟。POD、SOD和CAT活性的整体变化趋势相似，说明子叶胚的成熟可能需要消耗多种抗氧化酶。
多胺的变化是影响体细胞胚发育的重要因素[30]。荔枝体胚中腐胺在球形胚时期发生了迅速的积累上升[16]。龙眼Dimocarpus longan愈伤组织分化为球形胚期间，腐胺、亚精胺和精胺均快速上升，其中腐胺变化占主导地位[31]。在本研究中，‘梦幻少女’球形胚时期，腐胺、亚精胺和精胺质量分数迅速提高，多胺的积累可能共同促进球形胚的分化。心形胚、棒状胚时期，腐胺、精胺和亚精胺质量分数都明显下降，说明子叶胚的形成需要同时消耗这3种物质。这与枸杞Lycium chinense[32]的研究结果相似，枸杞球形胚至成熟胚阶段，腐胺和精胺质量分数有所下降。在本研究的子叶胚初期，腐胺下降至谷底，精胺和亚精胺上升至新的峰值，此时多胺的变化可能共同促进体胚的成熟，多胺的变化趋势与龙眼[31]相似。多胺氧化酶与多胺中的亚精胺变化趋势相似，第10~15天和第30天出现峰值，体胚形态明显转化时发生明显的积累或消耗变化，这有利于球形胚形成和子叶胚成熟，多胺氧化酶活性变化趋势与荔枝[16]的相似。
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在石蒜品种‘梦幻少女’体胚发生的0~40 d，体胚形态经历了原胚—球形胚—心形胚—棒状胚—子叶胚的过程。体胚发生过程中的生理特性变化显著，淀粉变化可能是球形胚形成、体胚形态发育与成熟的重要影响因素。在子叶胚形成及成熟时期，总蛋白质、过氧化酶活性和多胺变化可能发挥着相应的密切联合作用。多胺的积累和多胺氧化酶活性的提高可能促进体胚早期发育。在子叶胚形成及成熟时期，腐胺、精胺和亚精胺的变化相互发挥着密切的联合作用。
Cytological and physiological characteristics of somatic embryogenesis in Lycoris
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摘要:
目的 探究石蒜‘梦幻少女’Lycoris chinensis × radiata ‘Astro Girl’体胚发生过程中的细胞学和生理生化指标的变化规律，明确‘梦幻少女’体胚发生的特征，提高石蒜属Lycoris植物种球繁殖效率，为石蒜属新品种工厂化生产提供技术支撑。 方法 采用石蜡切片、酶联免疫吸附测定技术和超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术，测定了0~40 d‘梦幻少女’体胚发生过程中的形态和组织学特征、体胚可溶性淀粉及总蛋白质、抗氧化酶活性和多胺等生理生化指标的变化。 结果 ①体胚发生过程中，从球形胚到短暂膨大约20 d，进一步分化为心形胚、棒状胚和子叶胚，膨大的球形胚后期或心形胚时期基部会形成维管束。②体胚发生过程中，总蛋白质和淀粉、抗氧化酶活性发生显著变化，淀粉变化与球形胚的形成呈正相关，与体胚形态建成和体胚成熟呈负相关。总蛋白质、过氧化物酶(POD)活性及过氧化氢酶(CAT)活性变化与子叶胚形成呈正相关，与子叶胚的成熟发育呈负相关。超氧化物歧化酶(SOD)活性变化与球形胚、子叶胚时期呈负相关，与心形胚、棒状胚时期呈正相关，表明储能作用的淀粉、蛋白质及与植物生理密切相关的抗氧化酶对体胚发生起着重要的作用。③体胚发生过程中多胺氧化酶(PAO)活性和多胺(PAs)变化显著，腐胺(Put)、精胺(Spm)和亚精胺(Spd)的变化共同决定多胺的变化趋势，多胺和多胺氧化酶活性主要在体胚分化早期发生明显积累，与球形胚分化呈正相关；在子叶胚的形成期，精胺与亚精胺呈正相关；在子叶胚成熟期，腐胺、精胺和亚精胺3个指标呈现腐胺先下降后上升，精胺、亚精胺先上升后下降的趋势。 结论 在‘梦幻少女’体胚发生的0~40 d，体胚形态经历了原胚—球形胚—心形胚—棒状胚—子叶胚的过程。其中，生理特性变化显著，淀粉的积累或消耗可能是球形胚形成、体胚后续形态发育与成熟的重要影响因素。在子叶胚形成及成熟时期，总蛋白质、过氧化酶活性和多胺的变化可能发挥着相应密切的联合作用。多氨氧化酶活性与多胺的活跃积累可能有利于体胚早期发育。图4参32 Abstract:Objective This study, with an exploration of the changes of cytology and physiological and biochemical indexes during somatic embryogenesis of Lycoris chinensis × radiate ‘Astro Girl’, which can improve the coefficient and quality of tissue culture and rapid propagation of ‘Astro Girl’, is aimed to provide technical support for the factory production of new Lycoris varieties. Method Paraffin section, enzyme-linked immunosorbent assay and ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) were used to determine the changes of somatic embryo morphology, histology and corresponding physiological and biochemical indexes such as content of soluble starch and total protein, antioxidant enzyme activity and polyamine content during somatic embryo culture (0 − 40 d) of ‘Astro Girl’. Result (1) During the process of somatic embryogenesis, the globular embryo lasted for about 20 days from initiation to transient expansion, before it was further differentiated into heart-shaped embryo, rod-shaped embryo and cotyledon embryo with vascular bundles formed at the base of the enlarged globular embryo or heart-shaped embryo. (2) During somatic embryogenesis, significant changes occurred in the content of total protein and starch and the activity of antioxidant enzymes. The change of starch content was positively correlated with the formation of globular embryo and negatively correlated with somatic embryo morphogenesis and somatic embryo maturation, whereas the changes of total protein (TP) content, peroxidase (POD) activity and catalase (CAT) activity were positively correlated with cotyledon embryo formation but negatively correlated with cotyledon embryo maturation. The activity of superoxide dismutase (SOD) was negatively correlated with globular embryo and cotyledon embryo, but positively correlated with heart-shaped embryo and rod-shaped embryo. Such results showed that starch, protein and antioxidant enzymes which are closely related to plant physiology play an important role in somatic embryogenesis. (3) The activity of polyamine oxidase (PAO) and the content of polyamine (PAs) changed significantly during somatic embryogenesis, and the contents of putrescine (Put), spermine (Spm) and spermidine (Spd) determined the change trend of polyamine content. Polyamine content and polyamine oxidase activity mainly accumulated in the early stage of somatic embryo differentiation, which was positively correlated with globular embryo differentiation, and the changes of spermine and spermidine content were positively correlated during cotyledon embryo formation. In the mature stage of cotyledon embryo, putrescine, spermine and spermidine decreased at first and then increased, while spermine and spermidine increased at first and then decreased. Conclusion During the 0 − 40 days of somatic embryogenesis of ‘Astro Girl’, the main morphology of somatic embryo developed from proembryo, globular embryo, heart-shaped embryo and rod-shaped embryo to cotyledon embryo, among which, the physiological characteristics changed significantly, and the accumulation or consumption of starch content may be an important factor affecting the formation of globular embryo and the subsequent morphological development and maturation of somatic embryo. During the formation and maturation of cotyledon embryo, the changes of total protein content, peroxidase activity and polyamine content may play a closely joint role. The active accumulation of polyamine oxidase activity and polyamine content may be beneficial to the early development of somatic embryos. [Ch, 4 fig. 32 ref.] -
Key words:
- Lycoris /
- callus /
- somatic embryo /
- physiology and biochemistry
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据世界旅游组织(UNWTO)统计，受新型冠状病毒引发的肺炎疫情(新冠疫情)影响，2020年国际游客数量比2019年下降73％，约10亿人次，国际旅游收入损失1.3万亿美元。疫情改变了旅游行为方式[1]，使游客旅游目的地偏好发生明显变化[2]。疫情暴发后游客更倾向于自然风光类、休闲度假类与历史文化类的旅游产品[3]，放松、观光、文化是游客出游的主要动机[4]。在实施最严格保护的前提下，探究自然保护地旅游资源的可持续利用，是现阶段自然保护地体系所面临的现实问题[5]。生态旅游是中国自然保护区可持续发展的战略选择[6]，但国内自然保护区生态旅游发展处于初级阶段[7]。如何加强自然保护区生态旅游资源的保护与开发利用，避免由资源消耗型向环境破坏型和景观浪费型转变[8]，需要加强生态旅游资源与其他类型旅游资源和产业的融合[9]，构建高品质、多样化的旅游产品体系。现阶段中国自然保护地生态旅游产品以观光旅游、休闲度假为主，科普、科考、探险、观鸟等专项生态旅游产品[10]颇受欢迎，生态旅游客源市场日益向专业化、多样化、个性化发展。加强对生态旅游消费行为特征的研究[11]，把握当前及今后旅游消费者的偏好和选择意愿，可促进生态旅游产品供给与需求的有效匹配[12]。
旅游偏好是人们对旅游产品的认知和价值评价的结果，与旅游决策、旅游行为关系密切[13]。了解显示性偏好(revealed preference，RP)与陈述性偏好(stated preference，SP)是定量研究旅游偏好的前提和基础，显示性偏好关注消费者选择了哪些产品或服务，而陈述性偏好关注消费者将要选择哪些产品或服务[14]，国外研究者多关注2种偏好数据的检验和比较 [15-16]，国内有部分学者应用陈述性偏好法研究了旅游者的需求偏好[17-18]，但在旅游偏好与旅游需求、旅游感知、旅游动机与行为等相互关系上报道较少[19]。新冠疫情暴发后，学者开始关注自然保护地(区)生态旅游消费行为特征和生态旅游产品偏好，探讨生态旅游产品陈述性偏好与显示性偏好的关联性。本研究以浙江省天目山国家级自然保护区为例，对比了疫情暴发前后自然保护区游客生态旅游特征，分析疫情后生态旅游产品偏好特征，为提升自然保护区提供生态旅游产品与服务水平，满足游客对生态旅游高质量休闲体验的需求等，提供现实依据。
1. 研究区概况
1.1 天目山自然保护区概况
浙江天目山国家级自然保护区位于浙江省杭州市临安区天目山镇，总面积4 284 hm²。区内植被景观独特，动植物种类丰富，分布多种珍稀、濒危、特有、孑遗物种，主要森林植被以“高、大、古、稀、多”称绝，素有“大树王国”“物种基因库”之称。天目山自然保护区1986年被批准为“国家级森林和野生动物类型自然保护区”，1996年成为联合国教科文组织“人与生物圈”保护区网络成员，现为中国生物多样性保护示范基地、国家级自然保护区示范单位、全国科普教育基地、全国青少年科技教育基地、国家AAAA级景区。
1.2 天目山自然保护区生态旅游发展现状
2004年12月，天目山自然保护区与浙江大华建设集团有限公司正式签订旅游资源依法保护、开发和特许经营协议，天目山生态旅游转变为以企业法人为经营主体、保护区管理局为管理主体的新体制[20]。2005—2007年景区游客数量迅速上升，年均增长率达36.97%；2008—2020年景区游客数量总体呈现缓慢下降趋势，年均增长率为−5.23%；2020年，新冠肺炎疫情暴发，年接待量仅为7.19万人次，为历史最低。天目大峡谷景区2014年被天目山景区收购，2019年游客接待量达到最高，为15.86万人次，2020年锐减到6.55万人次。
自然保护区生态旅游收入主要由景区门票、餐饮住宿、自然教育和旅游车队经营收入等组成。总体来看，门票收入、旅游车队经营收入与游客接待人数变化趋势基本一致。自2016年开始，自然学校、幻住山房茶室、大树堂餐厅、知了酒店等相继营业，虽在总体旅游收入中占比不大，但表现出良好的成长性。2020年因疫情影响除大树堂餐厅收入略有增长，其他均不同程度下降。
2. 数据收集与处理
2.1 数据收集
参考相关研究成果[21-22]，结合对自然保护、生态旅游领域专家的咨询，设计调查问卷。问卷第一部分，调查游客对自然保护区生态旅游产品的陈述性偏好、出游目的、频次、时段等生态旅游需求特征；第二部分调查游客信息渠道、出游方式、逗留时间、旅游消费、食宿设施选择、问题认知等生态旅游行为特征，及对自然保护区生态旅游产品的显示性偏好；第三部分调查游客居住地、性别、年龄、受教育程度、职业、月收入等游客个人信息。2019年10月2—6日发放问卷300份，收回300份，有效问卷234份，有效率为78.00%。2020年10月2—6日发放问卷300份，收回300份，有效问卷251份，有效率为83.67%。生态旅游产品陈述性偏好、显示性偏好均采用Likert 5级测量，1级最低，5级最高。
2.2 数据处理
应用SPSS 23.0软件统计疫情暴发前后天目山保护区游客人口学特征；两独立样本的秩和检验(Mann-Whitney U检验)[23]分析疫情暴发前后游客生态旅游需求、行为特征；单因素方差法分析疫情暴发后游客生态旅游产品的陈述性偏好、显示性偏好特征。
分析疫情暴发后生态旅游产品陈述性偏好对显示性偏好的影响效应。先按保护区生态旅游产品亚类陈述性偏好水平的均值进行降维和分级，即均值1.00~1.49时为1，1.50~2.49为2，2.50~3.49为3，3.50~4.49为4，4.50~5.00为5；比较各陈述性偏好等级对应的显示性偏好水平，采用K-S方法检验其分布，若满足正态分布，则使用独立样本T检验，反之使用Mann-Whitney U检验[23]。
3. 结果与分析
3.1 游客人口学特征
由表1可知：相比2019年，疫情暴发后的2020年，自然保护区游客以男性为主；职业以企业人员为主，军人增幅最大，学生、离退休人员减少明显；20岁以下游客增加较明显，20~29岁游客减少较明显；大专或大学本科学历游客占比最高，略有下降；各收入段游客变化不明显。
表 1 疫情暴发前后游客人口学特征Table 1 Demographic characteristics of visitors before and after COVID-19特征 分项 占比/% 特征 分项 占比/% 2019年10月 2020年10月 2019年10月 2020年10月 性别 男 41.9 57.4 年龄/岁 ＜20 4.3 14.7 女 58.1 42.6 20~29 38.5 28.7 30~39 26.9 31.9 职业 公务员 6.8 6.8 40~49 15.4 16.3 私营企业主 6.8 12.0 50~59 11.1 6.0 企业人员 33.8 28.3 ≥60 3.8 2.4 文教/专业技术人员 8.1 14.3 自由职业 15.0 2.4 受教育程度 高中及以下 20.9 18.7 服务/销售人员 5.6 6.0 大专或本科 73.1 65.7 军人 0.4 24.7 研究生及以上 6.0 15.5 学生 10.7 1.2 工人 1.3 0.4 月收入/元 ≤5 000 40.2 33.1 农民 1.7 2.4 5 001~10 000 33.3 30.3 离退休人员 3.0 14.3 10 001~15 000 15.0 17.1 其他 6.8 0 15 001~24 999 4.3 9.6 ≥25 000 7.3 8.0 3.2 游客生态旅游需求特征
由表2可知：疫情暴发前后游客去往自然保护区旅游频次、旅游时段差异极显著(P＜0.01)，而旅游目的差异不显著。疫情暴发后游客自然保护区旅游的时间以小长假、黄金周最多，依次为周末、工作日，其中周末出游略有减少；多数游客旅游目的为自然山水观光，疫情后以增进身体健康为目的明显增加，陪伴家人、朋友出游的比例增加较明显。
表 2 疫情暴发前后游客生态旅游需求特征Table 2 Ecotourism demand characteristics of visitors before and after COVID-19特征 分项 占比/% P 特征 分项 占比/% P 2019年10月 2020年10月 2019年10月 2020年10月 旅游频次/
(次·a−1)1 18.8 16.3 0.01** 旅游目
的(多选)自然山水风光 67.9 76.1 0.20 2 53.0 38.2 观赏动植物 20.5 25.9 3 17.1 29.1 缓解紧张情绪 37.6 33.5 ≥4 11.1 16.4 学习生态知识 12.4 9.6 增进身体健康 7.7 41.8 旅游时段 周末 33.8 29.1 0.00** 了解历史文化 34.2 18.3 小长假、黄金周 54.2 55.7 户外运动探险 19.2 14.7 工作日 6.0 9.2 陪伴家人、朋友 34.2 51.0 暑假 6.0 6.0 其他 0 6.4 说明：**表示差异极显著(P＜0.01) 3.3 游客生态旅游行为特征
由表3可知：疫情对游客了解自然保护区的信息渠道、交通方式、旅游花费影响极显著(P＜0.01)，而组织方式、旅游时长、选择食宿设施类型、存在问题等其他生态旅游行为特征均无显著影响。疫情暴发后，游客获取信息渠道以亲朋介绍、“旧地重游”较多，家庭自驾游数量明显增加；出游以一日游为主，二日游游客明显减少；相比2019年，2020年人均消费500~999元的游客减少较明显，人均消费2 000元以上的游客明显增加。参与性、娱乐性不强，接待设施不完善，交通不便被认为是生态旅游发展存在的主要问题。
表 3 疫情暴发前后游客生态旅游行为特征Table 3 Ecotourism behavior characteristics of visitors before and after COVID-19特征 分项 占比/% P 特征 分项 占比/% P 2019年10月 2020年10月 2019年10月 2020年10月 了解渠道
(多选)微信微博 38.5 37.1 0.01** 食宿
类型农家乐 34.2 22.3 0.71 旅行社 24.8 13.5 民宿 41.0 29.1 亲朋介绍 43.6 53.0 酒店 17.5 15.9 曾经参与 9.8 23.5 其他 7.3 5.6 杂志报纸 9.8 9.2 其他 7.7 10.4 旅游花
费/元≤500 34.6 41.9 0.00** 500~999 33.3 7.2 组织方式 跟团 16.2 2.0 0.35 1 000~1 499 17.5 17.9 独自 23.1 17.1 1 500~1 999 5.6 6.4 家庭游 37.2 76.5 ≥2 000 9.0 26.6 单位组织 23.5 4.4 存在
问题
(多选)交通不便 38.5 23.5 0.10 交通方式 公共交通 7.7 8.0 0.00** 接待设施不完善 20.9 28.3 自驾 58.1 86.1 服务质量差 2.1 3.2 旅游大巴 34.2 6.0 参与性、娱乐性不强 34.6 31.9 有害生物威胁 2.6 3.2 旅游时长/d 1 41.9 49.4 0.33 当地人不友好 1.3 0.8 2 41.0 28.7 其他 17.1 9.1 3 12.8 18.7 ≥4 4.3 3.2 说明：**表示差异极显著( P＜0.01) 3.4 游客生态旅游产品偏好特征
3.4.1 疫情暴发后生态旅游产品陈述性偏好的人口学特征差异
游客人口学特征对部分生态旅游产品的陈述性偏好存在显著性差异。由表4可知：天气与气候景观(观星象、观冰雪、观日出、观雾凇、雨凇)、森林度假产品(小木屋、树屋)、自然教育产品(自然课堂、自然艺术创作)和生态康养产品(森林浴、森林瑜伽、森林冥想)等产品，不同性别游客的陈述性偏好差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)；观鸟、观星象、树屋等产品，不同年龄段游客陈述性偏好差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)；观冰雪、民宿、森林瑜伽等产品，不同受教育程度的游客陈述性偏好差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)；观星象、树屋、丛林穿越、溯溪攀岩等产品，不同职业的游客陈述性偏好差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)；观日出、观云雾、观星象、观冰雪、树屋、自然艺术创作等产品，不同收入的游客陈述性偏好差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)。
表 4 疫情后游客生态旅游产品陈述性偏好的人口学特征差异Table 4 Differences in demographic characteristics of visitors’ stated preferences for ecotourism products after COVID-19产品主类 产品亚类 产品名称 性别 年龄 受教育程度 职业 月收入 偏好均值 生态观光 地文景观 观奇峰异石 0.09 0.58 0.99 0.58 0.87 3.10 水域景观 观瀑布溪流 0.45 0.13 0.15 0.11 0.35 3.88 生物景观 观鸟 0.67 0.05* 0.37 0.58 0.38 3.23 观蝶 0.92 0.34 0.28 0.43 0.13 2.92 观珍稀植物 0.43 0.95 0.98 0.80 0.41 3.61 观森林景观 0.96 0.70 0.20 0.74 0.52 3.88 天象与气候景观 观日出 0.01** 0.09 0.09 0.06 0.00** 4.05 观云雾 0.11 0.18 0.07 0.19 0.00** 4.20 观星象 0.04* 0.00** 0.93 0.00** 0.00** 3.81 观冰雪 0.03* 0.31 0.01* 0.33 0.01* 3.94 观雾凇、雨凇 0.00** 0.15 0.07 0.51 0.43 3.85 生态度假 森林度假 小木屋 0.00** 0.13 0.27 0.30 0.23 3.45 帐篷露营 0.36 0.09 0.91 0.05 0.28 3.15 汽车露营 0.26 0.29 0.88 0.23 0.24 2.99 树屋 0.00** 0.00** 0.16 0.01** 0.00** 3.40 度假酒店 0.62 0.24 0.32 0.28 0.61 3.82 乡村度假 民宿 0.22 0.55 0.01** 0.25 0.23 3.80 农家乐 0.47 0.33 0.77 0.09 0.90 3.10 专项生态 自然教育 自然课堂 0.01* 0.40 0.34 0.02* 0.65 3.22 自然艺术创作 0.00** 0.39 0.52 0.12 0.03* 3.19 生态康养 森林浴 0.02* 0.30 0.47 0.09 0.28 3.46 森林瑜伽 0.00** 0.44 0.04* 0.35 0.31 3.01 森林冥想 0.05* 0.19 0.29 0.35 0.11 3.28 户外运动 丛林穿越 0.17 0.64 0.55 0.04* 0.39 3.59 溯溪攀岩 0.90 0.14 0.86 0.05* 0.47 3.43 户外拓展 0.75 0.13 0.96 0.29 0.45 3.45 说明：*表示差异显著(P＜0.05)；**表示差异极显著(P＜0.01) 3.4.2 疫情暴发后生态旅游产品显示性偏好的人口学特征差异
由表5可见：游客人口学特征对天目山自然保护区部分生态旅游产品的显示性偏好存在显著性差异。对倒挂莲花峰、五世同堂古银杏Ginkgo bibloba、大树王柳杉Gryptomeria japonica、白鹇Lophura nycthemera及其栖息地等景点，不同年龄段游客显示性偏好有显著差异(P＜0.05)；对半月池景点，不同受教育程度的游客显示性偏好有极显著差异(P＜0.01)；对眠牛石景点，不同职业的游客显示性偏好有显著性差异(P＜0.05)。
表 5 疫情后生态旅游产品显示性偏好的人口学特征差异Table 5 Differences in demographic characteristics of visitors’ revealed preferences of ecotourism products after COVID-19产品主类 产品亚类 生态旅游产品 性别 年龄 受教育程度 职业 月收入 偏好均值 生态观光 地文景观 天目大峡谷 0.81 0.40 0.19 0.47 0.55 4.37 冰川大峡谷 0.92 0.92 0.05 0.52 0.59 4.52 倒挂莲花峰 0.30 0.05* 0.08 0.15 0.90 3.88 四面峰 0.11 0.25 0.60 0.73 0.78 3.93 眠牛石 0.70 0.28 0.33 0.03* 0.71 3.88 红蛇洞 0.74 0.08 0.18 0.08 0.57 3.94 水域景观 双清潭 0.92 0.41 0.32 0.08 0.82 3.88 半月池 0.34 0.12 0.00** 0.10 0.06 3.66 伏虎瀑 0.90 0.48 0.11 0.09 0.76 4.11 生物景观 原始森林 0.70 0.49 0.88 0.44 0.84 4.33 柳杉群 0.49 0.69 0.49 0.17 0.29 4.24 五世同堂古银杏 0.07 0.03* 0.27 0.66 0.35 4.26 大树王柳杉 0.46 0.01* 0.29 0.97 0.43 4.45 冲天树金钱松 0.23 0.31 0.91 0.73 0.59 4.21 天目铁木 0.29 0.38 0.84 0.99 0.52 4.33 黑麂及其栖息地 0.06 0.18 0.66 0.40 0.24 4.45 白鹇及其栖息地 0.05 0.03* 0.77 0.80 0.75 4.48 专项生态 自然教育 自然博物馆 0.74 0.31 0.74 0.95 0.73 4.51 大地之野自然学校 0.30 0.21 0.42 0.90 0.84 4.31 说明：*表示差异显著(P＜0.05)；**表示差异极显著(P＜0.01)。金钱松 Pseudolarix amabilis，天目铁木 Ostrya rehderiana，黑麂 Muntiacus crinifrons 3.4.3 疫情暴发后生态旅游产品陈述性偏好对显示性偏好的影响效应
由表6可见：总体上，随着游客对保护区生态旅游产品的陈述性偏好等级增加，其对天目山保护区生态旅游产品的显示性偏好水平也相应提高，说明陈述性偏好水平对显示性偏好水平有显著影响。多重比较分析表明：将游客对自然保护区生态旅游产品的陈述性偏好等级分为5级时，天目山保护区地文景观、水域景观、生物景观和自然教育产品的显示性偏好，根据显著性水平只有相应的3、3、4和4级，说明游客对生态旅游产品的陈述性偏好与显示性偏好存在不一致现象，且前两者的陈述性偏好对显示性偏好的影响效应比后两者小。
表 6 疫情后生态旅游产品陈述性偏好对显示性偏好的影响效应Table 6 Effects of revealed preferences on stated preferences of ecotourism products after COVID-19陈述性偏
好等级显示性偏好水平 地文景观 水域景观 生物景观 自然教育产品 1 2.58±0.92 c 1.72±1.16 c 2.50±1.52 cd 1.91±1.30 d 2 3.26±0.82 b 3.28±1.14 ab 3.32±0.91 d 3.04±1.00 c 3 3.45±0.78 b 3.16±0.89 b 3.83±0.74 c 3.44±1.06 c 4 3.83±0.69 a 3.46±0.94 a 4.11±0.73 b 3.88±0.88 b 5 3.59±1.09 ab 3.53±1.10 a 4.51±0.58 a 4.46±0.90 a 说明：同列不同小写字母表示不同等级间差异显著(P＜0.05) 4. 结论与建议
4.1 结论
2015年开始天目山自然保护区调整经营思路，走内涵发展道路，开发生态旅游、自然教育、文化创意等新型业态。2018年起以接待散客为主，积极开辟新兴市场。2016—2019年接待游客数量下降明显，但同期自然保护区生态旅游收入呈上升趋势，说明其他生态旅游业态的发展弥补了生态观光旅游下降带来的损失。
疫情暴发后，保护区游客从以女性为主转变为以男性为主，20岁以下游客明显增加、20~29岁游客减少较明显，以大专或大学本科学历的游客占比最高；游客多为通过亲朋介绍、“旧地重游”者，家庭自驾游数量增加，团队游明显减少，倾向于一日游或多日游，人均消费较高的游客比例增加较明显。选择小长假、黄金周出游的人数最多，主要以自然山水观光和增进身体健康为目的，多数为陪伴家人、朋友出游。
疫情暴发后，游客性别、年龄、受教育程度、职业、收入等人口学特征对部分生态旅游产品陈述性偏好有显著影响；年龄、受教育程度、职业对部分产品显示性偏好水平有显著影响。游客对保护区生态旅游产品的显示性偏好水平随着陈述性偏好等级增加而提高，陈述性偏好水平对显示性偏好水平有显著影响；天目山保护区游客对生态旅游产品的陈述性偏好与显示性偏好存在不一致现象，生物景观和自然教育产品的陈述性偏好对显示性偏好的影响效应，比地文景观和水域景观更明显。
4.2 建议
后疫情时代，旅游业要积极应对挑战，增强创新发展动力，发挥产业融合的叠加效应、追求在线融合的乘数效应，共建共生推动旅游业高质量发展[24]。因此，从以下几个方面提出天目山自然保护区生态旅游产品的开发建议：一是利用游客家庭自驾、社交休闲、山水观光、生态康养、自然教育等生态旅游产品陈述性偏好水平高的特点，开展观鸟、森林康养等特色项目，融合创新产品引导全新需求，提供多元化、高品质的生态旅游产品供给，增强游客的显示性偏好水平，提升其满意度与推荐、重游意愿。二是自然保护区应充分认识新趋势、融合新技术，依托5G、VR、AR等技术推出智慧化生态旅游产品服务，引导自然保护区从需求侧进行产品创新。比如将自然保护区大尺度山体植被垂直景观带、偶见性强的珍稀动植物等，通过“云旅游”多维度、多视角传递给潜在旅游者，增强其陈述性偏好，推动其向现实旅游者转化。三是自然保护区积极利用大数据分析手段，发挥“两微一短”(微信、微博、短视频)用户受众面广、黏性强特点，针对周边客源市场选择合适的媒体平台，加强游客生态旅游产品体验后的分享，刺激潜在需求，提升潜在消费者生态旅游产品的陈述性偏好水平。
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图 1 体胚发生过程的0~40 d组织细胞学变化
Figure 1 Histocytological changes of somatic cell embryogenesis during 0 − 40 days
图 2 体胚发生过程中淀粉和总蛋白质质量浓度的变化
Figure 2 Changes of starch and total protein content during somatic cell embryogenesis
图 3 体胚发生过程中抗氧化酶活性的变化
Figure 3 Changes of antioxidant enzyme activity during somatic embryogenesis
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