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随着工农业的发展及人类的活动加剧，重金属污染已经严重危害到人类的健康[1-2]。目前，植物修复因其绿色环保受到广泛的关注，但由于受到土壤中重金属生物有效性的影响，植物修复效率低下[3-4]。利用螯合剂来活化土壤中的重金属，促进植物对重金属的吸收，是提高植物修复效率的方法之一[5]，其中，乙二胺四乙酸（EDTA）是使用最广泛的一种螯合剂，能够显著提高铅（Pb），铜（Cu），镉（Cd）等重金属的活性[6-8]。CHIGBO等[9]在铜污染的土壤中施加EDTA强化植物修复后显著提高了土壤中铜的有效态含量，同时显著促进了植物对铜的吸收积累。有研究表明：EDTA的生物降解性差，可能会对环境造成一定污染[10]。草酸、柠檬酸等生物降解性较好的小分子有机酸也被广泛用于植物修复中[11]。DUQUÈNE等[12]研究发现，使用5 mmol·kg-1柠檬酸、柠檬酸铵、草酸等有机酸显著增加了土壤溶液中重金属的质量浓度。相对于其他超积累植物或者重金属富集植物，毛竹Phyllostachys edulis拥有巨大的生物量，并且已被证明作为植物修复材料的可能性[13-14]。本研究采用镀锌厂重金属污染土壤和毛竹苗进行土柱淋洗试验，研究施加螯合剂EDTA和有机酸后毛竹叶片叶绿素荧光特性，毛竹重金属质量分数变化，土壤溶液重金属质量分数及EDTA质量浓度的动态变化，为螯合剂强化重金属污染土壤植物修复提供科学依据。
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供试土壤来自浙江省杭州市富阳区云纳热镀锌厂附近农田（29°53′17″N，119°53′24″E），采集0~20，20~40，40~60 cm等3个土层的重金属污染土壤，风干过5 mm筛，其土壤基本理化性质见表 1。供试植株：由种子培养生长在基质中的毛竹幼苗，选择长势相似且无病虫害的幼苗，用蒸馏水去除附着的基质，在含有1/2 Yoshida营养液（pH 5.8）的黑色塑料盆中预培养。营养液隔5 d更新1次，保持24 h通气。
土层/cm pH值 w碱解氮/(mg·kg-1) w有效磷/(mg·kg-1) w速效钾/(mg·kg-1) w锌/(mg·kg-1) w铜/(mg·kg-1) w镉/(mg·kg-1) 0~20 1 367.10 296.20 2.21 20~40 7.16 30.10 4.41 98.64 300.00 58.90 0.56 40~60 133.78 34.11 0.24 Table 1. Physicochemical properties of soil
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将不同土层的土壤装入土柱中，并且在5，20，40，60 cm土层处装入土壤溶液收集器[15]。栽植毛竹苗3株·土柱-1，并且控制土柱土壤含水率，整个实验培养周期为2个月，在实验结束前10 d，一次性分别添加人工螯合剂和有机酸。所添加的人工螯合剂为质量摩尔浓度1.5 mmol·kg-1（E1.5）和3.0 mmol·kg-1（E3.0）的EDTA-Na2；有机酸根据毛竹苗根系分泌物配制，为m（草酸）：m（柠檬酸）：m（乳酸）=5：1：1的混合物[16]，质量摩尔浓度为15.0 mmol·kg-1（S15）和30.0 mmol·kg-1（S30），以不添加螯合剂和有机酸为对照（ck），共5个处理，重复3个·处理-1，并随机排放。整个试验在浙江农林大学温室大棚内完成。为避免pH值不同所引起的活化差异，所添加的EDTA和有机酸的pH值均调节成供试土壤pH值[17]。
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在添加螯合剂前1 d，收集土柱各土层的土壤溶液，作为初始溶液，然后一次性加入EDTA和有机酸，并在第1，3，5，7，9天收集土壤溶液[18]，共6次。收集到的土壤溶液取10 mL酸化，利用ICP-OES测定土壤液中重金属质量分数，其余冷冻保存冰箱备用。
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在试验结束前2 d，选择晴朗天气，利用便携式叶绿素荧光仪在9:00-12:00测定每株毛竹第3片叶片叶绿素荧光特征。Fo为初始荧光；Fm为最大荧光产量；Fv/Fm为PSⅡ最大光化学量子产量；Fv/Fo为PSⅡ潜在光化学效率。
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收获的毛竹用20.0 mmol·L-1EDTA-Na2浸泡20 min，去除附着的重金属，将毛竹分为根茎叶3部分，粉碎，称取0.1 g的样品，用硝酸/高氯酸消煮定容至50 mL并过滤，用ICP-OES测定重金属质量分数。
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EDTA质量浓度测定参考郭晓方等[19]、郑睿行等[20]方法：取1.0 mL样品至管中，加1.0 mL氯化铁溶液（2.5 mmol·L-1）和1.0 mL抗坏血酸（含4.0 mg抗坏血酸），稀释至5.0 mL，水定容摇匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤，立即液相色谱法测定。液相色谱为日本LC-20AT，分析柱：C18 Inertsil ODS-SP色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），岛津；保护柱：Inertsil ODS-SP（5 μm，4.0 mm × 10 mm），岛津；流动相：水-甲醇（80+20）含有0.02 mol·L-1四丁基溴化铵，0.03 mol·L-1乙酸钠缓冲液（磷酸调pH 4）；流速：0.8 mL·min-1，检测波长：258 nm。
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采用Excel 2013和SPSS 21.0软件进行数据处理，用SigmaPlo 12.5软件作图。采用方差分析和最小差异显著法（LSD）对数据进行统计分析，差异显著性水平为P < 0.05。
1.1. 供试材料
1.2. 实验设计与处理
1.3. 土壤溶液的收集
1.4. 植物叶绿素荧光的测定
1.5. 毛竹重金属质量分数测定
1.6. 土壤溶液中EDTA质量浓度的测定
1.7. 数据分析
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由表 2可知：施加EDTA和有机酸后，Fo略微上升，与对照组之间无显著差异；而Fm，Fv /Fm和Fv /Fo不同程度地下降，且添加3.0 mmol·kg-1EDTA和有机酸后，Fm，Fv /Fm和Fv /Fo显著降低，在30.0 mmol·kg-1有机酸下Fm，Fv /Fm和Fv /Fo下降幅度最大，分别降低了11.7%，5.3%和19.2%。可见，30.0 mmol·kg-1的有机酸处理对毛竹叶片叶绿素荧光特性抑制效果最为显著。
处理 Fo Fm Fv/Fm Fv/Fo ck 178.11±6.61 a 801.44±38.43 a 0.779±0.007 a 3.502±0.201 a E1.5 182.75±7.34 a 762.63±31.06 ab 0.760±0.013 ab 3.179±0.237 ab E3.0 187.33±14.91 a 733.17±49.10 bc 0.743±0.027 bc 2.941±0.448 b S15 181.63±14.38 a 718.50±36.91 c 0.747±0.018 bc 2.973±0.273 bc S30 185.13±7.44 a 707.75±35.21 c 0.737±0.018 c 2.830±0.265 c 说明：同列相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，同列不同字母表示差异显著(P＜0.05) Table 2. Changes of chlorophy fluorescence parameter of moso bamboo leaves after adding EDTA and organic acids
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从图 1可以看出：添加EDTA后毛竹对3种重金属的吸收显著增加，且随着EDTA质量摩尔浓度增加而增加；添加有机酸后，毛竹对重金属的吸收无显著差异。毛竹从土壤吸收的重金属主要集中在根部，其次在茎，最少在叶，并且毛竹对镉的转运效率最高，对铜的转运效率最低。
Figure 1. Effect of EDTA and organic acids on moso bamboo accumulated heavy metal
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由图 2所示：在对照处理中，土壤溶液中铜质量分数随着采集时间的增加始终在低于0.1 mg·kg-1的范围内波动。在土壤中添加螯合剂后，土壤溶液中铜的质量分数显著增加。在EDTA处理中，3.0 mmol·kg-1EDTA对铜的活化作用较强，在添加EDTA后第1天各土层土壤溶液中铜质量分数显著上升，且5 cm土层处土壤溶液中铜质量分数变化最大，与对照相比分别增加了1 215和1 639倍。随着时间的推移，5 cm表层土层土壤溶液中铜质量分数先升高，在第3天的时候达到最大，然后再随时间的增加而降低；在20 cm及更深的土层中，土壤液中的铜不断累积。添加有机酸后，只有表层土壤表现出明显的活化作用。在5 cm土层中，15.0 mmol·kg-1有机酸处理后，土壤溶液中铜质量分数随着时间增加逐渐减少，15.0 mmol·kg-1有机酸处理后，土壤溶液中铜质量分数随着时间增加先增加后减少，在20 cm处，仅在添加有机酸的第1天铜质量分数显著增加。在整个土柱试验中，土壤溶液中铜主要集中在表层土壤。
Figure 2. Change of Cu contents in soil solution of different soil layers
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由图 3可知：对照土壤溶液中锌质量分数随着采集时间无显著变化，添加EDTA螯合剂后，土壤溶液中锌质量分数显著增加，且相比添加有机酸作用更加明显。在EDTA处理中，高质量浓度EDTA对锌的活化作用较强，在添加1.5和3.0 mmol·kg-1EDTA后第1天各土层土壤溶液中锌质量分数显著上升。随着时间的增加，5和60 cm土层处锌质量分数逐渐降低，在20和40 cm土层，土壤溶液中的锌质量分数随着时间的增加而增大。添加有机酸后，在5和20 cm土层土壤溶液中锌质量分数显著增加。
Figure 3. Change of Zn contents in soil solution of different soil layers
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由图 4可见：对照土壤溶液中镉质量分数始终在很低的范围内波动。在土壤中添加螯合剂EDTA后，各土层土壤溶液中镉质量分数显著增加，对镉的活化作用显著强于有机酸处理。在添加EDTA后第1天各土层土壤溶液中镉质量分数显著上升，且5 cm土层土壤溶液中镉质量分数变化最大，相比对照分别增加了353和1 012倍。随时间的增加，各土层土壤溶液中镉与锌的质量分数变化趋势一致。添加有机酸对各土层土壤镉都有活化作用，且表层土壤最显著，随时间的增加镉质量分数不断降低。在整个淋洗柱中，土壤溶液中镉质量分数随土壤深度的增加而减少。
Figure 4. Change of Cd contents in soil solution of different soil layers
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由图 5所知：添加1.5和3.0 mmol·kg-1EDTA后，土壤溶液中EDTA主要集中在5 cm土层。随着时间的增加，5 cm土层处EDTA质量浓度显著降低，5 d后达到稳定，分别为110.9~122.9 mg·L-1和257.8~263.3 mg·L-1；20 cm土层EDTA质量浓度为47.7~55.6 mg·L-1和84.4~124.5 mg·L-1，无显著变化；40 cm土层EDTA施加第1天达到最高，分别为22.3和50.7 mg·L-1，之后显著下降达到稳定；60 cm土层EDTA质量浓度相对较小，分别为2.9~6.2 mg·L-1和7.3~10.7 mg·L-1，差异不显著。
Figure 5. Change of EDTA contents in soil solution of different soil layers
2.1. EDTA及有机酸对毛竹叶绿素荧光特性的影响
2.2. EDTA及有机酸强化毛竹吸收重金属
2.3. EDTA及有机酸对重金属在不同土层内迁移的影响
2.3.1. EDTA及有机酸对铜在不同土层内迁移的影响
2.3.2. EDTA及有机酸对锌在不同土层内迁移的影响
2.3.3. EDTA及有机酸对镉在不同土层内迁移的影响
2.4. 土壤溶液中EDTA质量浓度的变化
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叶绿素荧光是反映植物光合生理的一个指标[21]。本研究中，添加3.0 mg·L-1EDTA和有机酸后毛竹叶片最大荧光Fm，PSⅡ最大光化学效率Fv /Fm和PSⅡ潜在光化学效率Fv /Fo显著降低，表明螯合剂的添加降低了植物的光合生物素，使植物的光合系统遭到破坏。EDTA处理后的毛竹叶片荧光参数降低，主要原因可能是EDTA活化了土壤中的重金属，提高了重金属的生物有效质量分数，高质量分数的重金属损害了毛竹的生长，对毛竹细胞内叶绿体、线粒体及细胞壁等结构产生了毒害作用[13, 22]。同样添加有机酸后也降低了毛竹叶片的叶绿素荧光参数，可能有机酸分解后改变了土壤的基本理化性质，从而改变了毛竹苗的生长状况。
螯合剂可以活化土壤中难溶态重金属，改善其生物有效性[7, 27]，提高植物对土壤中重金属的吸收效率[23-24]。EDTA是一种普遍使用的螯合剂，添加EDTA显著提高了毛竹对土壤中锌、铜和镉的吸收，作用效果显著高于有机酸。这与CAY等[25]研究EDTA强化蜀葵Althaea rosea修复重金属污染土壤得出的结果相似。添加有机酸并没有明显促进毛竹对重金属的吸收，可能是由于添加的有机酸分解后改变了土壤的基本理化性质，抑制了毛竹吸收重金属，这与吴龙华等[26]的研究结果类似。本研究中，EDTA淋洗显著增加了0~20 cm土层土壤中可溶性铜、锌和镉的质量分数，由于EDTA活化效果强，土壤溶液中铜、锌和镉的质量分数相对比较高。添加EDTA增强了重金属的迁移性，导致20和40 cm处土壤溶液中铜、锌和镉的质量分数随着时间的增加而增加。YLIVAINIO等[28]研究表明：在石灰性土壤中添加EDTA可持续提高镉、铅和镍在土壤中的溶解性。在本研究中，添加有机酸初期对土壤中铜和锌的活化效果比较明显，随着时间的推移，活化效果消失甚至产生了钝化效果。可能是由于有机酸在土壤中很快被土壤微生物分解，对重金属的活化效果消失，而且可能改变了土壤的pH值，从而产生钝化效果。吴龙华等[26]研究表明：施加3.0 mmol·kg-1，pH 6.3的草酸、柠檬酸或苹果酸对土壤铜含量及其形态分配无显著影响。添加有机酸后，土壤溶液中铜和锌质量分数在40和60 cm土层处变化不显著，说明添加有机酸后铜和锌在土壤中的纵向迁移能力弱；而有机酸处理对镉具有一定的活化和迁移能力。在整个土柱试验中，EDTA处理对重金属的活化和迁移效果始终强于有机酸。李艳丽等[29]采用土柱模拟淋洗试验，研究了EDTA，柠檬酸和草酸3种淋洗剂对污染土壤中镉纵向迁移的影响，结果表明：EDTA对镉的迁移能力强于柠檬酸和草酸。
EDTA添加到土壤后会长时间残留，并迁移到更深的土壤中，从而对环境造成一定的风险[30-31]。有研究表明：可根据土壤类型，通过控制EDTA的施用量及施用时间来控制EDTA在强化修复重金属污染土壤中的残留和迁移[19]。相比EDTA，有机酸在自然界中很容易被生物降解，因此它的环境风险更小[32-33]。本研究中，EDTA主要集中在表层土壤，但第1天在40 cm土壤溶液中检测到相对较高的质量浓度，说明EDTA在土壤中迁移能力强。在第5天到第9天EDTA质量浓度相对稳定且相对较高，也说明EDTA很难被分解。
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乙二胺四乙酸（EDTA）和有机酸处理抑制了毛竹的叶绿素荧光特性，且30.0 mmol·kg-1有机酸处理的抑制程度最大，3.0 mmol·kg-1EDTA处理其次，15.0 mmol·kg-1有机酸处理最小。在整个土柱试验中，EDTA处理显著提高了土壤溶液中重金属质量分数，加重了重金属向下迁移的风险；有机酸处理对重金属的活化效果及在土壤中的迁移能力不明显。添加EDTA促进了毛竹对铜、锌、镉的吸收，而有机酸则无促进作用。添加1.5和3.0 mmol·kg-1EDTA后，土壤溶液中EDTA质量浓度主要集中在5 cm土层，且短期内很难被分解。
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