Host selection of Phthonoloba viridifasciata and analysis of chemical compounds in leaves of host plants

绿带妒尺蛾幼虫采自贵州赤水桫椤国家级自然保护区。将野外在桫椤上采集到的初孵幼虫放置于SPX型智能生化培养箱(SPX-280， 宁波江南仪器厂)内饲喂成2龄幼虫，饲养条件：温度(26±1) ℃，相对湿度为(70±10)%，光周期为14 h 光照/10 h黑暗(7:00—20:00为光照期，20:00—7:00为黑暗期)。预实验表明：初孵幼虫活动能力弱，而幼虫虫龄越大，由于取食经历会形成记忆对饲养植物偏爱，故选择2龄幼虫进行饥饿处理(24 h)作为待测幼虫。

直径12.0 cm的培养皿、直径1.5 cm的打孔器、绿色滤纸、镊子、圆形滤纸、养虫盒(长14.3 cm×宽8.5 cm×高4.0 cm)、黑色塑料薄膜、正己烷有机溶剂(天津市科密欧化学试剂有限公司)、HP6890/5975C气质联用仪GC/MS(美国安捷伦公司)、150 mL锥形瓶、胶头滴管等。

采样点位于贵州赤水桫椤国家级自然保护区内大水沟(28°25′10.69″N，106°01′14.85″E)，海拔为614 m。供试植物为桫椤、小黑桫椤、中华复叶耳蕨Arachniodes chinensis和肾蕨Nephrolepis auriculata。将野外采集到的当年生新鲜叶片带回室内低温保存，测定前将4种蕨类植物嫩叶用蒸馏水冲洗干净后，打孔器制作成1.5 cm大小的植物叶碟。对照为非寄主植物中华复叶耳蕨和肾蕨，以及绿色叶碟(外形与桫椤和小黑桫椤叶碟大小相同的绿色滤纸)。

光照和黑暗条件下，桫椤和小黑桫椤叶碟分别与绿色叶碟组合，各取2片叶碟共4个处理，1次1头，每处理重复测定60头。

黑暗条件下，桫椤和小黑桫椤分别与肾蕨和中华复叶耳蕨组合，共4个处理，1次1头，每处理重复测定50头；桫椤和小黑桫椤配对，各取2片叶碟，1次1头，重复测定65头。

黑暗条件下，4种蕨类植物共存时，各取2片叶碟，“十字”交叉等距离放置于培养皿底部边缘，共1个处理，1次1头，重复测定120头。

利用培养皿^[17]测定绿带妒尺蛾幼虫对不同叶碟的选择频次。选用直径为12.0 cm的培养皿，在底部铺垫相同直径的圆形滤纸，测定前在滤纸上均匀喷洒少量蒸馏水保湿。将制作好的叶碟(图1)放置，以“十”字交叉排列等距离放在培养皿的底部边缘。放置完成后，在培养皿中央接入1头已饥饿的绿带妒尺蛾幼虫，以幼虫接触叶碟并停留(3 min)作为选择的标准(一直停留在待选择区域的幼虫则记为无效选择，不计数)，每头观察15 min，记录观察幼虫对不同叶碟的趋向选择情况，每次测定结束后更换新的试虫，并清理培养皿中的实验材料，蒸馏水清洗干燥后用于下次测定^[18]。

Figure 1.  Selection device for larvae of P. viridifasciata

整个实验在室内进行，测定时间为13:00—17:00。黑暗条件将培养皿用黑色塑料薄膜遮盖。

称取5 g桫椤和小黑桫椤新鲜嫩叶，分别放置于150 mL锥形瓶中。用胶头滴管提取10 mL的正己烷加入瓶中浸湿叶片，同时每间隔5 min振荡1次，30 min后加入2 mL的正己烷(分3次润洗)经无水硫酸钠过滤，获得粗提物。重复3次。放入−20 ℃的冰箱内密封低温保存。进样前，用99.99%的高纯氮气浓缩至1 mL。

使用HP6890/5975C气质联用仪 GC/MS(美国安捷伦公司)对2种桫椤植物嫩叶粗提物样品进行化学成分分析。色谱柱为Agilent HP-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱，初始温度70 ℃(保留2 min)，以5 ℃·min⁻¹升温至110 ℃，再以10 ℃·min⁻¹升温至310 ℃，运行时间为45 min；汽化室温度为250 ℃；载气为高纯氦气(99.999%)；柱前压为0.127 5 MPa，载气流量为1.0 mL·min⁻¹，不分流，溶剂延迟时间为6 min。离子源为电子轰击离子源(EI)，离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；电子能量为70 eV；发射电流为34.6 μA；倍增器电压为1 729Ｖ；接口温度为280 ℃；质量范围为29~500。

用Excel统计数据，用R语言进行数据分析，使用卡方检验比较绿带妒尺蛾幼虫对不同处理的趋性选择，用Origin 2021作图。对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist17和Wiley275标准质谱数据，用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对含量。选择率=(选择虫数/测试虫总数)×100%^[10]

如表1所示：无论在光照或黑暗条件下，绿带妒尺蛾幼虫对2种蕨类植物叶碟的选择频次均极显著大于对绿色叶碟的选择频次(P＜0.01)，说明寄主植物气味可对绿带妒尺蛾幼虫产生引诱作用。光照环境下对桫椤和小黑桫椤的选择率略低于黑暗环境下的选择率，可能是在视觉作用下，绿带妒尺蛾幼虫被外形相似的绿色叶碟所“蒙骗”，导致光照条件下选择绿色叶碟的频次略大于在黑暗下的选择频次，视觉可能在寄主选择中也发挥着一定得作用。

由表2显示：黑暗条件下，绿带妒尺蛾幼虫对桫椤分别与中华复叶耳蕨、肾蕨组合，小黑桫椤分别与中华复叶耳蕨、肾蕨组合的趋性选择均差异极显著(P＜0.01)，说明绿带妒尺蛾幼虫能依靠寄主植物气味信息准确识别寄主。绿带妒尺蛾幼虫对桫椤和小黑桫椤的选择频次无显著差异(P＞0.05)，说明2种植物的气味都可以对绿带妒尺蛾幼虫产生一定的吸引作用。

如表3所示：黑暗条件下，在4种蕨类叶碟共存时，绿带妒尺蛾幼虫对不同蕨类叶碟的选择频次差异显著(P＜0.05)，其中对桫椤的选择频次最高，占总频次的38.3%。这说明在多植物环境下，绿带妒尺蛾幼虫可以准确判断最适宜的寄主植物，桫椤叶片所释放的挥发物对绿带妒尺蛾幼虫的定向选择具有更强烈的引诱作用。

通过GC-MS分析得到桫椤和小黑桫椤嫩叶浸提物的总离子流图TIC(图2)。初步确定2种桫椤的化学组分主要是烃类、醇类、醛类等，共检测出34种化合物。其中桫椤的化合物成分有23种，小黑桫椤的化合物成分有19种，同时2种桫椤共有物质有8种。由表4可知：2种桫椤的主要成分为烃类，桫椤中相对含量最高的是二十五烷(7.75%)，小黑桫椤相对含量最高的是正二十七烷(8.84%)。其次是醇类，桫椤有5种，小黑桫椤2种，桫椤和小黑桫椤共有 γ-谷甾醇、豆甾烷醇，γ-谷甾醇(5.25%)和豆甾烷醇(8.21%)在小黑桫椤的挥发性成分中所占比例要高于桫椤，而叶醇(3.04%)仅在桫椤中存在。醛类、有机酸类、脂类、胺类在桫椤和小黑桫椤中的相对含量均相对较低，对甲氧基肉桂酸辛酯在桫椤中的相对含量仅有0.35%，庚醛在小黑桫椤中的相对含量仅为0.1%。说明在化合物组成上，桫椤和小黑桫椤既存在相似性，同时也具有一定的差异性。

Figure 2.  Total ion current diagram of the young leaves of A. spinulosa and A. metteniana

植物挥发性物质是一类组成复杂、分子量为100~200的混合物质，主要包括烷烃类、醇类、醛类、酸类等，并以一定的比例组成植物独有的化学指纹图谱对植食性昆虫产生嗅觉刺激^[19]。本研究发现：桫椤和小黑桫椤叶片具有相似的化学指纹图谱，化合物成分组成都以烃类为主，其次是醇类、醛类、酸类、脂类等。植物挥发物在植食性昆虫寄主选择中发挥着重要作用^[20]。植食性昆虫依据植物挥发物对特定植物进行定向选择，最终识别寄主植物进行取食或产卵^[21]。本研究发现：在光照和黑暗环境下，桫椤和小黑桫椤分别与绿色叶碟组合时，绿带妒尺蛾幼虫对桫椤和小黑桫椤有明显的趋向选择，可见桫椤和小黑桫椤释放的气味对绿带妒尺蛾幼虫有引诱作用。植食性昆虫在寄主选择时，视觉和嗅觉发挥着重要作用^[22]。如苹果实蝇Rhagoletis pomonella寻找寄主植物时，嗅觉会与视觉相互作用^[23]。在光照条件下，寄主植物和绿色叶碟共存时，尽管外形相似，绿带妒尺蛾幼虫依然可以准确选择寄主植物。

植物挥发物作为引导植食性昆虫的一种利他素，为植食性昆虫—植物二级营养关系建立过程中的信息化学物^[24]。植食性昆虫凭借植物的化学图谱识别寄主植物和非寄主植物^[25]。在一定距离内，昆虫通过嗅觉感官感知浓度达到一定阈值水平的化合物组成所代表的植物信息^[26]。本次研究表明：当寄主植物和非寄主植物对比时，绿带妒尺蛾幼虫可以准确识别寄主植物，说明幼虫可被寄主植物所吸引^[27]。如曹凤勤等^[28]研究B型粉虱Bemisia tabaci对不同植物挥发物的行为反应结果表明：寄主植物挥发物对其有明显引诱作用。黄胸蓟马Thrips hawaiiensis对寄主植物挥发物有特殊偏好^[29]。荔枝Litchi chinensis叶片气味对粗胫翠尺蛾Thalassodes immissaria具有导向作用^[30]。当2种寄主植物对比时，绿带妒尺蛾幼虫对两者的选择并无差异，可能同为桫椤属蕨类植物，两者在化合物组成和含量上存在相似性。本研究通过GC-MS分析桫椤和小黑桫椤叶片的化合物成分证实，2种桫椤共有8种化合物。

从进化的角度来看，昆虫面临着强大的选择压力，如在寻找寄主时，往往要面对复杂的气味环境^[31]。昆虫的感觉系统和搜索机制已经进化到处理复杂的化学物质，从而有效地定位合适的宿主来最大化自身的适应性^[32]。如在6种植物共存时，烟叶蛾初孵幼虫可准确识别最适宜寄主植物烟草Nicotiana tabacum^[33]。本研究中，在4种蕨类都存在时，绿带妒尺蛾幼虫可准确识别最适宜寄主植物桫椤，说明对寄主气味存在高度的特异性和敏感性^[34]。在桫椤中存在的叶醇具有一定的青草气味，同时也作为昆虫警报、集合利用的信息素，并且还可作为防御、忌避、通信和环境安全的重要工具^[35-36]，这可能是绿带妒尺蛾幼虫更趋向桫椤的原因之一。同时，在鳞翅目昆虫中，由于幼虫活动能力受限，主要依赖于成虫对寄主植物的产卵选择^[37]，如产卵假说认为雌性成虫更容易将卵产在有利于后代发育的寄主植物上^[38]。田间采集情况发现，幼虫主要集中分布在桫椤叶上，但成虫具体如何产卵选择，还需进一步研究。

绿带妒尺蛾幼虫鉴别寄主植物和非寄主的能力较强，能被桫椤和小黑桫椤所吸引，同时桫椤释放的挥发物对其具有更强烈的引诱作用。GC-MS结果显示：在桫椤中存在的叶醇和壬醛有望作为绿带妒尺蛾的引诱剂成分。