Effect of conservation of C-terminal sequence of Solanum nigrum UNUSUAL FLORAL ORGANS family SnUFO2 on flower development

以野生型植株及其转基因植株为材料，在室温25 ℃及光周期16 h/8 h的条件下栽培，备用。

根据龙葵转录组数据筛选出SnUFO2基因序列，设计上下游引物并利用在线网站NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)添加酶切位点BamHⅠ和SacⅠ以及保护碱基(表1)。引物序列送杭州有康生物科技有限公司合成。

利用RNA提取试剂盒(普洛麦格生物产品有限公司，上海)提取盛花期野生型龙葵植株相同生长时期花苞的RNA，使用EasyScript^®First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒(全式金生物技术有限公司，北京)获得cDNA，以其为模板克隆SnUFO2基因。PCR反应程序：97 ℃预变性3 min；95 ℃变性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃总延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，并纯化回收目的片段。目的片段连接到pEASY Blunt simple (全式金生物技术有限公司，北京)载体后，转入大肠埃希菌Escherichia coli DH5α 感受态中(唯地生物技术有限公司，上海)。通过菌落PCR筛选阳性单菌落，摇菌送杭州擎科生物有限公司测序。测序返回数据拼接后与转录组测序序列进行比对，获得2条目的基因序列。

通过在线网站Pfam (http://pfam.xfam.org/)蛋白质家族数据库进行结构域分析。将克隆得到的2条SnUFO2序列在美国国家生物信息中心(NCBI)上通过Blastx进行同源基因检索。利用MEGA7^[17]进行氨基酸序列比对和系统进化树构建。进化树构建采用邻接法，Bootstrap检验1 000次。将筛选到的不同物种中UFO基因和龙葵中2条SnUFO2序列输入在线网站MEME Suite (https://meme-suite.org/meme/)，选择合适的Motif数量后导出结果，并用TBtools^[18]软件美化。

于野生型龙葵植株盛花期取样，分别采集植株不同部位，包括根、茎、叶和花苞并提取RNA，以反转录后的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR反应。内参基因为龙葵的APRT基因，SnAPRT和SnUFO2*定量引物如表1所示。根据RT-qPCR试剂盒TransStart^® Tip Green qPCR SuperMix(全式金生物技术有限公司，北京)说明书设置反应体系：cDNA 1 μL ，上下游引物(10 μmol·L⁻¹)各0.2 μL，2×TransStart^® Tip Green qPCR SuperMix 5 μL，双蒸水补足至10 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共反应45个循环。数据计算方法采用$2^{ - \Delta \Delta C_t}$法计算相对表达量。

利用BamHⅠ和SacⅠ(赛默飞世尔科技公司，上海)将目的片段和pBI121载体进行双酶切，纯化回收后在16 ℃下过夜连接，并转入大肠埃希菌感受态。菌落经PCR验证后，提取阳性重组质粒，通过单双酶切验证超表达载体。

SDS法提取转化苗基因组DNA，以野生型龙葵为对照，通过PCR检测阳性转基因植株。通过尼康相机(COOLPIX P7100)拍照记录转基因植株和花序表型变化，Leica体视显微镜(M165FC)拍照记录转基因植株花表型变化。

采用海氏铁矾-苏木精染色法^[19]，在野生型与转基因植株盛花期取2.5 mm左右的花苞置于FAA固定液中固定，依次经50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%体积分数的乙醇脱水，再依次经体积梯度比1∶2、1∶1、2∶1的二甲苯无水乙醇混合液和纯二甲苯透明后，浸蜡3 d，使石蜡缓慢进入材料中，将材料包埋至蜡块中。使用Leica转轮式切片机(RM2235)切片，用苏木精染色后封片。

以野生型龙葵盛花期花苞的cDNA为模板，克隆得到2条SnUFO2序列，都含有F-box结构域。一条序列与转录组测序结果一致，为龙葵中SnUFO2基因，编码456个氨基酸；另一条序列为短截版的SnUFO2基因，该基因在1 294~1 295 bp处有1个碱基G的插入，导致翻译提前终止，编码433个氨基酸，记为SnUFO2*。将SnUFO2*基因、全长SnUFO2基因和不同物种中UFO的同源基因构建系统进化树。SnUFO2*、SnUFO2基因和番茄、辣椒Capsicum annuum和矮牵牛Petunia × hybrida中的UFO基因在同一进化分支，同源关系较近，而与水稻Oryza sativa，拟南芥中的UFO基因同源关系较远(图1A)。

Figure 1.  SnUFO2* phylogenetic tree analysis and Motif analysis

利用MEME软件对SnUFO2*和SnUFO2蛋白进行Motif预测发现，这些蛋白相似性极高，预测到高度相似的Motif可能行使UFO蛋白最保守的功能(图1B)。SnUFO2*与其他UFO蛋白相比，Motif 8的缺失可能导致该基因的功能与其他物种中UFO基因的功能存在差异。通过氨基酸序列比对发现：SnUFO2*C末端比SnUFO2基因少了23个氨基酸，这段序列在茄科物种中高度保守，可能影响龙葵正常的花发育进程(图2)。

Figure 2.  Amino acid sequence alignment of S. nigrum SnUFO2*

UFO基因是重要的花器官特征基因，在花发育初期发挥作用。为了探究SnUFO2*基因在龙葵营养器官及生殖器官中的表达水平，提取盛花期的根、茎、叶和花苞进行RT-qPCR分析。以龙葵APRT为内参基因，RT-qPCR结果表明：SnUFO2*在根、茎、叶中的表达量低，在花苞中相对表达量较高，推测SnUFO2*基因可能主要参与花器官发育(图3)。

Figure 3.  Expression analysis of SnUFO2* in different tissues of wild-type S. nigrum

为探究龙葵C末端缺失的SnUFO2*基因对龙葵花发育的影响，构建了SnUFO2*的表达载体，将其转入龙葵植株中，经含有卡那霉素抗性的培养基筛选后，获得40个T₀代独立抗性株系，经PCR鉴定共获得31个转基因阳性株系。选择表型明显的不同株系转基因植株进行分析，转基因植株的根、茎和叶等未观察到明显变化(图4A)，而花器官发育异常：野生型龙葵花盛开后，花瓣呈白色，花瓣基部相连，雄蕊紧靠雌蕊生长于花中心(图4C)；弱表型转基因SnUFO2-30株系的花部分花瓣中部形成绿色条纹状组织，偶尔形成萼片状花瓣，花瓣基部裂口变大，雄蕊花药未紧靠雌蕊，杂乱分布于四周(图4B和C)；强表型SnUFO2-10株系的花瓣完全萼片化，这类花最终不能形成正常的果实和种子(图4A~C)。

Figure 4.  Phenotypic map of 35S::SnUFO2* transgenic plants

为了进一步确定转基因植株花内部结构及其细胞变化，通过对野生型和SnUFO2-10转基因植株的花苞进行石蜡切片表明：野生型株系的花苞由外到内依次存在萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊；SnUFO2-10株系花苞生成萼片状花瓣，雄蕊缺失，心皮发育异常，没有花柱和柱头产生，偶尔在发育中的心皮两侧观察到胚珠的产生(图5)。

Figure 5.  Paraffin sections of flower buds of wild-type and 35S::SnUFO2 * transgenic lines

本研究克隆了1条短截版的SnUFO2基因，探究C端序列的完整性对龙葵花发育的影响。生物信息学分析发现：SnUFO2*基因属于F-box基因家族，且C末端缺失的序列可能具有保守的功能。F-box蛋白家族通常以SCF复合体的形式参与植物各项生命活动。过往研究认为F-box蛋白的N端与SKP1类基因结合，形成SCF复合体，而C端与靶蛋白结合，通过泛素链引导至26S蛋白酶体从而降解结合蛋白^[3]。基于C端序列在F-box基因中的重要作用推测，SnUFO2* C末端23个保守的氨基酸缺失可能会影响泛素化过程。

UFO及其同源基因已被证明在植物花发育过程中发挥作用^[7-15]。通过RT-qPCR分析发现：SnUFO2*基因在龙葵的根、茎和叶中表达水平较低，而在花苞中表达量较高，推测该基因和其他UFO基因一样在花发育过程中发挥作用。于是构建SnUFO2*超表达载体并将其转入龙葵中。在矮牵牛中过表达DOUBLE TOP(DOT)基因会导致植株矮化，形成一朵单花^[20]。然而形态学观察发现：35S::SnUFO2*转基因植株未出现矮化表型，根、茎和叶也无明显变化，但是花器官发生明显变化，萼片内侧的花瓣、雄蕊和雌蕊都被萼片状的器官代替。这与C末端缺失的UFO基因突变体表型相似，在拟南芥ufo-2突变体中，UFO基因翻译提前终止，编码262个氨基酸，产生了强烈的表型变化：生成萼片状花瓣、花丝及心皮状结构^[21]。在豌豆突变体，stp-4中，STP基因只编码了252个氨基酸，导致豌豆花缺少花瓣和雄蕊，且有次生花产生^[15]。黄瓜Cucumis sativus ufo突变体中，其花瓣的位置产生了叶状器官，雄蕊发育不正常^[22]。以上研究表明：UFO基因的C末端对该基因的功能具有重要作用，虽然不同C末端缺失突变体表型不完全相同，但这可能与该基因短截的位点不同有关，也可能与物种特性有关。

花发育是一个受多基因调控的复杂生理过程，需要相关花分生组织特征基因和花器官特征基因的共同作用。SnUFO2-10花苞的石蜡切片结果显示：在4轮花器官形成过程中，除最外轮萼片部分形成正常外，花瓣萼片化，花分生组织不确定导致内轮不断产生增殖的萼片状器官。缺少C末端的 ufo突变体的共同特征为花瓣和雄蕊的缺失或是畸形发育，例如拟南芥ufo-2花瓣萼片化及雄蕊数量减少，豌豆stp突变体表现为花瓣向萼片转化^{[15, 21]}。其次是心皮发育异常或花分生组织的不确定性，例如金鱼草fimbriata620 (fim620)突变体产生的侧生花及花的萼片数目不确定和百脉根 pfo突变体产生的不断增殖的萼片状器官^{[14, 23]}。这些表型的出现与花器官特征基因中的B类和C类基因有关，因此推测UFO基因C端序列的缺失对该基因的功能造成影响，从而直接或间接影响B类和C类基因的正常表达。过往研究表明：SCF^UFO可能促进LFY基因的转录活性，且UFO基因能与LFY共同促进B、C类基因的表达^{[11-12, 20-21]}。我们认为：SnUFO2*可能通过SCF复合体的形式，影响LFY基因的表达进而促进相关花同源异型基因的表达，然而SnUFO2*基因C末端序列的缺失影响了SCF复合体的功能，从而影响4轮花器官的正常发育。转基因植株形成的萼片状花与lfy突变体表型相似，间接证明了这种猜想^[11]。

综上所述，不仅是UFO基因的F-box结构域对其功能具有重要作用，C端序列的完整性对基因功能也极其重要。之后的研究中，观察全长SnUFO2转基因植株表型的变化，尤其是花器官发育变化，对深入探究UFO基因的功能是必要的。