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花发育是植物生长发育阶段的重要组成部分，过程虽然复杂，但十分有序。花发育的整个过程不仅受到光照、温度和湿度等外源因素的影响, 而且内源基因的相互作用也是决定开花调节机制的关键性因子[1-2]。MADS-box基因是一种植物特有的转录调控因子，在所有器官的形态发生乃至植物整个生命周期中发挥作用，例如：叶形态发生，花和果实发育以及种子发育[3]。其中，APETALA1 (AP1)类基因除了作为花分生组织特征基因[4]，还表现为花器官特征基因，通过调控花器官的分化影响花发育[5-6]。反映这一特性的是ABC模型，A类基因控制萼片和花瓣的形成，B类基因控制花瓣和雄蕊的形成，C类基因控制雄蕊和心皮的形成[7]。AP1基因作为A类基因，调控萼片和花瓣的分化，并且与C类基因相互拮抗[8-9]。由于AP1类基因在花发育调控网络中的重要作用，使得不同物种中AP1类基因的研究更具有意义与价值。目前，在拟南芥Arabidopsis thaliana[8]、金鱼草Antirrhinum majus[5]和番茄Solanum lycopersicum[10]等植物中，对AP1类基因功能进行了较深入的研究，但是在菊科Asteraceae植物中的研究还有限。菊科植物具有典型的头状花序[11]，花序外侧舌状花两侧对称，缺乏功能性雄蕊，而中央的管状花则是辐射对称的两性花，形态结构复杂。特殊的花序结构不仅提升了虫媒传粉的效率，也增强了菊科植物的观赏价值[12]。近年来，对于菊科植物，例如菊花Chrysanthemum morifolium[13]、非洲菊Gerbera hybrida[14]和向日葵Helianthus annuus[15]等的研究表明：复杂的头状花序对于研究花器官发育的遗传调控具有重要意义。因此，本研究克隆了菊科欧洲千里光Senecio vulgaris的SvAP1基因。由于菊科植物遗传转化体系较为复杂、转化周期长且转化效率低，故将SvAP1基因异源转化茄科Solanaceae龙葵Solanum nigrum中进行功能预测与分析，旨在为菊科植物AP1类基因的分子机制提供理论基础。
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将欧洲千里光和龙葵种子均在 25 ℃、光周期 16 h (白天)/8 h (黑夜)条件下播种于人工气候室。取欧洲千里光和龙葵的不同组织样品，包括新鲜的根、茎、叶和花完全展开时期的花序等，所有样品标记分装后置于液氮中速冻，保存于−80 ℃备用。
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取欧洲千里光花完全展开时期约0.1 g的花序为材料，利用Eastep® Super总RNA提取试剂盒(普洛麦格生物产品有限公司，上海)提取总RNA，并用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳和超微量紫外分光光度计(NanoDrop2000，赛默飞世尔科技公司，美国)对RNA样品的完整性和浓度进行检测。利用反转录试剂盒EasyScript®First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (全式金生物技术有限公司，北京)，参照说明书合成cDNA，产物储存于−20 ℃ 备用。
将欧洲千里光早期头状花序样品材料送至上海翰宇生物科技有限公司获得转录组数据。根据欧洲千里光转录组数据分析得到SvAP1基因序列。利用美国国家生物技术信息中心(NCBI，
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) Primer-BLAST设计特异性引物，并在正向和反向引物中分别添加Xba Ⅰ和SacⅠ限制性内切酶酶切位点及保护碱基，特异性引物SvAP1-F和SvAP1-R由杭州有康生物科技有限公司合成(表1)。以欧洲千里光cDNA为模板，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。PCR扩增体系为：97 ℃预变性3 min；95 ℃变性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35次循环；72 ℃总延伸10 min。PCR扩增片段经切胶回收纯化后连接至pEASY-T1 Simple载体(全式金生物技术有限公司，北京)，并转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞中(唯地生物技术有限公司，上海)，根据蓝白斑筛选以及菌落PCR验证，测序获得目的基因。表 1 基因克隆与分子鉴定所用引物序列
Table 1. Primer sequences for gene cloning and molecular identification
引物名称 正向(反向)引物序列(5′→3′) 引物名称 正向(反向)引物序列(5′→3′) SvAP1-F AATCTAGAATGGGGCGGGGAAGGGTGA NPT Ⅱ-R GTGGTCGAATGGGCAGGTAG SvAP1-R AAGAGCTCTTACTTGTTCATGAGATGAAT qSvAP1-F GTTGTGTGATGCTGACGTGG Sn18s-F CGCGCGCTACACTGATGTATTCAA qSvAP1-R GCGTGTTCCAGAGTCCAGTT Sn18s-R TACAAAGGGCAGGGACGTAGTCAA Sv18s-F ATAGCAGAACGACCTGTGAA NPT Ⅱ-F AGATGGATTGCACGCAGGTTC Sv18s-R GAAGCAAGATCCAACGCAAT 说明：下划线标记处为特异性引物限制性内切酶酶切位点 -
将目的基因在NCBI网站上进行blastx检索，下载各物种中与SvAP1同源性较高基因氨基酸FASTA格式文件；利用ClustalX(2.1)[16]及MEGA-X(10.1.8)[17]软件，采用邻接法(neighbor-joining, NJ)，校验参数Bootstrap为1 000次，进行多序列比对以及系统进化树的构建，并用GeneDoc(2.7.0)软件对多序列比对进行修饰美化。
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分别提取欧洲千里光的不同组织(根、茎、叶和花序)的RNA并反转为cDNA。以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)。根据引物设计原则设计特异引物qSvAP1-F、qSvAP1-R，内参基因引物为Sv18s-F、Sv18s-R(表1)，参照qPCR试剂盒TransStart® Tip Green qPCR SuperMix(全式金生物技术有限公司，北京)说明书，反应体系为：cDNA(稀释10倍)1 μL，2×TransStart® Tip Geen qPCR SurperMix 5 μL，上下游引物(10 μm·L−1)各0.2 μL，双蒸水3.6 μL，95 ℃预变性30 s，95℃变性5 s，60 ℃复性30 s，共进行40个循环。试验设置3个重复反应，并采用2−∆∆Ct法计算各部位SvAP1的相对表达量，通过 SPSS 19.0[18]软件进行单因素方差分析(ANOVA)，默认置信区间为95%。
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应用Xba Ⅰ和Sac Ⅰ限制性内切酶酶切pBI121超表达载体与pEASY-T1Simple-SvAP1重组质粒，将酶切后的目的片段与载体片段进行酶连，将酶连产物转化至大肠埃希菌感受态DH5α中，挑选单克隆进行菌落PCR鉴定，提取质粒并进行单双酶切检验后转化到农杆菌GV3101中，PCR鉴定获得阳性菌落，然后采用农杆菌介导的叶盘法进行龙葵的遗传转化。
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利用特异性引物SvAP1-F、SvAP1-R (表1)进行PCR以及RT-PCR反应，对转基因龙葵进行进一步的鉴定及表达分析。采用十二烷基苯磺酸钠(SDS)法提取野生型及转基因龙葵基因组DNA，使用卡那霉素引物NPT Ⅱ-F、NPT Ⅱ-R及特异性引物SvAP1-F、SvAP1-R (表1)进行 PCR 检测；提取野生型及转基因龙葵幼嫩叶片的RNA，反转录后得到cDNA。以此为模板，使用内参引物Sn18s-F、Sn18s-R以及特异性引物SvAP1-F、SvAP1-R (表1)，进行半定量RT-PCR反应。反应体系为：97 ℃预变性3 min；95 ℃变性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30次循环；72 ℃总延伸10 min。
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解剖盛花期野生型及转基因龙葵花器官，以雌蕊为材料，进行纵向石蜡切片，探究其内部结构的变化。石蜡切片制作参照祁宏英等[19]的方法。主要步骤包括：①材料固定。利用真空泵将材料中的气体去除后将其放入FAA固定液(无水乙醇、冰醋酸、甲醛和双蒸水体积比为10∶1∶2∶7)固定24.0 h以上。②脱水、透明。固定材料取出后用体积分数为50%乙醇溶液冲洗，然后在一系列由低到高体积分数的乙醇溶液中逐级脱水，每级1.5 h，纯浓度1.0 h。将脱尽水的材料按照不同比例的无水乙醇和二甲苯逐级过渡到纯二甲苯溶液，使得材料中的无水乙醇被二甲苯替代达到透明的效果，每级1.0 h。③浸蜡。二甲苯后加入少量碎蜡，放入45 ℃ 恒温箱过夜，次日早上继续加入碎蜡，6.0 h后移至60 ℃ 恒温箱，换入熔融的纯蜡，之后每日早晚各换入1次纯蜡，让石蜡慢慢渗透到材料中。换2~3 d效果较好。④包埋、切片、粘片。将融化的石蜡迅速加入包埋框中，放入材料。调整轮转式切片机(RM2235，徕卡显微系统有限公司，上海)，切片厚度为8 μm，将切好的蜡带依次放入载玻片上，置于42 ℃ 恒温箱中烘片。⑤海氏铁矾-苏木精染色法染色及观察。经过脱蜡后采用海氏铁矾-苏木精染色法进行染色，并脱水、透明、树胶封片，用显微镜(EX20，舜宇仪器有限公司，宁波)观察。
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以欧洲千里光的cDNA为模板，经PCR扩增并对扩增片段进行测序，测序结果显示：SvAP1基因开放阅读框(ORF)区由705 bp组成，编码234个氨基酸，与转录组数据相一致。从NCBI-blastx筛选出拟南芥、金鱼草、马铃薯Solanum tuberosum和甘菊Chrysanthemum lavandulifolium等植物中SvAP1的同源基因序列，进行同源性分析。结果表明：欧洲千里光SvAP1与甘菊ClAP1 (ADK94172.1)和菊花CDM8 (AAO22981.1)同源性最高，分别为76.05%和75.21%。进一步分析发现：SvAP1具有典型的MIKC型MADS-box基因结构，结构域由MADS-box (M)、Intervening (I)、K-box (K)和C-terminal (C)等4个部分组成。在C末端具有真双子叶植物AP1类基因2个较短且相对保守的基序(motif)，其中之一为paleoAPETALA1 (paleoAP1)蛋白基序，另一个为FUL蛋白基序(图1A)，与ClAP1和CDM8保持一致。利用MEGA-X软件构建欧洲千里光SvAP1氨基酸序列的系统进化树(图1B)，结果显示：SvAP1与甘菊ClAP1、菊花CDM8、番茄SlFRUITFULLFUL (SlFUL) (NP_001294867.1)、马铃薯StAGL8 (XP_006345101.1)、辣椒Capsicum annuum CaAGL8 (NP_001311552.1)、绒毛烟草Nicotiana tomentosiformis NtAGL8 (XP_009625854.1)、拟南芥AP1 (CAA78909.1)和金鱼草SQUAMOSA (SQUA) (CAA45228.1)处于同一个分支中，亲缘关系接近。
图 1 欧洲千里光SvAP1氨基酸多序列比对以及系统进化树分析
Figure 1. Amino acid sequence alignment and phylogenetic tree analysis of SvAP1 in S. vulgaris
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通过qRT-PCR对欧洲千里光不同组织部位的表达水平进行分析。结果表明(图2)：SvAP1在欧洲千里光茎、叶和花序中都有表达，其中SvAP1在花序中的表达水平高于在茎和叶。因此，初步推测SvAP1在营养生长和生殖生长中可能都起到一定的调控作用。
图 2 SvAP1在欧洲千里光不同部位的相对表达
Figure 2. Relative expression of SvAP1 in different tissues of S. vulgaris
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为了研究SvAP1的功能，通过农杆菌介导的遗传转化获得的9个独立抗性植株中，选取表型变化明显的3株抗性植株，提取DNA后进行目的基因和卡那霉素抗性基因的双重扩增。结果显示：扩增的大小均与预期相符合(图3A和图3B)，表明筛选出的3株抗性植株为转基因抗性植株。以野生型植株SvAP1表达为对照，对转基因植株中SvAP1表达进行RT-PCR分析，结果显示(图4A)：相比于对照植株，3株转基因抗性植株中的SvAP1表达量都出现了不同程度的升高。其中，SvAP1-3转基因龙葵中SvAP1表达量最低，SvAP1-4转基因龙葵SvAP1表达量较高，SvAP1-9转基因龙葵SvAP1表达量最高。由此可知：SvAP1在转基因抗性植株中得到了有效表达，可进行下一步的表型分析。观察筛选到的3株表型明显的转基因抗性植株发现：与同一时期野生型龙葵相比，转基因龙葵的茎和叶无明显变化，而花器官发育异常且果实数目减少(图4B)。
图 3 野生型及转基因龙葵PCR检测
Figure 3. PCR detection of wild type S. nigrum and different transgenic lines
图 4 野生型和转基因龙葵RT-PCR及表型分析
Figure 4. RT-PCR and phenotypes analysis of wild type S. nigrumand different transgenic lines
正常的野生型龙葵花序由外到内依次为5个萼片、5个花瓣、5个雄蕊以及1个雌蕊，雌蕊被雄蕊包裹于最内轮，仅柱头部分可见(图5A)。形态学观察发现，转基因龙葵雌蕊发育异常，其中弱表型SvAP1-3转基因龙葵花序与野生型无明显差异(图5B)；中表型SvAP1-4转基因龙葵子房明显膨大，将雄蕊挤压至花瓣一侧，且雌蕊花柱基部与子房顶部连接处膨胀(图5C)；强表型SvAP1-9转基因龙葵雄蕊被膨大的子房挤压至向花瓣方向倾斜生长，雌蕊状组织增多(图5D)。
图 5 野生型及转基因龙葵花序
Figure 5. Inflorescence in wild type S. nigrum and different transgenic lines
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为了进一步探究SvAP1的异位表达对雌蕊发育的影响，对野生型及强表型SvAP1-9转基因龙葵花器官进行解剖，并对雌蕊进行显微镜观察发现：野生型龙葵雌蕊包括柱头、花柱和子房，花柱中部以下被白色绒毛，基部与卵状子房相连(图6A)；强表型SvAP1-9转基因龙葵花柱数目增多，子房膨大且有心皮组织增生冲破子房壁暴露于子房顶部，外侧有花柱包裹(图6B)。为了分析转基因龙葵雌蕊内部结构的变化，对野生型以及强表型转基因龙葵的雌蕊进行纵向石蜡切片观察，结果显示：野生型龙葵花柱基部与胎座相连，两者基本位于子房中轴线处，卵圆状胚珠经珠柄与胎座相连相对平均分布于胎座两侧(图6C)；强表型SvAP1-9转基因龙葵子房膨大，子房顶部增生的心皮组织发育较为完全。进一步分析强表型SvAP1-9转基因龙葵增生的心皮组织细胞结构：中心部分与子房胎座组织细胞结构相类似，呈不规则卵圆状紧密分布；靠近外缘部分细胞明显变小且更加紧凑呈层状排列，与子房壁细胞结构相类似(图6D)。由此推测，强表型SvAP1-9转基因龙葵增生的心皮组织形成了类似子房的结构。综上所述推测：SvAP1在龙葵中的异位表达对雌蕊发育产生影响，可能造成子房膨大且花柱与子房数目增多。
图 6 野生型和转基因龙葵雌蕊及其石蜡切片
Figure 6. Wild type S. nigrum and different transgenic lines pistil and their paraffin section
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花是植物的生殖器官，被认为是植物进化中重要的形态创新，花器官的发育对于花形态的建成具有重要作用，而且受许多调控因子的影响[20]。菊科独特的头状花序结构使其成为研究植物花器官发育的重要材料。MADS-box家族基因在调控花分生组织和花器官发育中起着重要作用，因此其在菊科植物头状花序形成中的调节作用一直是近年来的研究热点[21]。其中，AP1类基因是花发育调节机制的调控枢纽，作为花器官特征基因在菊花[13]和碎米荠Cardamine hirsute[22]等植物中被研究报道。
真双子叶植物AP1类基因分为euAP1、euFRUITFULL (euFUL)和AGAMOUS-like79 (AGL79)等3个亚支，其中euAP1分支基因具有euAP1蛋白基序，euFUL与AGL79分支基因具有paleoAP1蛋白基序[23]。本研究所获得的欧洲千里光SvAP1基因在C末端段具有paleoAP1蛋白基序，且系统进化关系分析表明：SvAP1与ClAP1、 CDM8、SlFUL、StAGL8、CaAGL8、NtAGL8、AP1和SQUA位于同一进化枝，其中与ClAP1和CDM8同源性最高。有报道指出：CDM8[13]、SlFUL[24]、CaAGL8[25]和NtAGL8[26]均属于euFUL类AP1分支，AP1[8]和SQUA[5]属于euAP1类AP1分支。综上所述可推测：SvAP1属于AP1类基因，即SQUA亚家族。LITT等[23]认为：多数具有paleoAP1蛋白基序的基因表达模式比具有euAP1蛋白基序的基因更为广泛，存在于营养组织和生殖组织，包括茎、叶、花分生组织、所有花器官和果实等。甘菊ClAP1研究较少，关于同源性较高的CDM8[13]研究表明：其在营养器官和生殖器官中都可以检测到表达，主要在茎、叶和花中表达，参与营养生长到生殖生长的调控。为了进一步研究SvAP1是否具有类似的表达模式，对欧洲千里光进行组织特异性表达分析。qRT-PCR反应显示：SvAP1基因表达模式比拟南芥AP1更为广泛，在欧洲千里光茎、叶和花中都可以检测到SvAP1表达，与CDM8相类似，可能对营养生长与生殖生长的发育都起到了调控作用。
BERBEL等[27]认为：AP1基因的“CFAA”基序并非是判断AP1类基因功能的决定性依据，不同的C端基序蛋白也可以发挥AP1基因相类似功能，“CFAA”只是增强了AP1类基因的活性，在多个物种中都有被报道，例如豌豆Pisum sativum的PEAM4[27]、大豆Glycine max的GmAP1[28]、百合Lilium longiflorum的LMADS6、LMADS7[29]和绒毛烟草的NtAGL8[26]等。因此，具有paleoAP1蛋白基序的基因也可能作为花器官特征基因影响花器官的发育。例如：LI等[30]发现：从红花玉兰Magnolia wufengensis中分离出的MawuAP1影响心皮及果实发育，主要在心皮的膨大中起作用，从而影响果实的发育；孙迎坤等[31]发现：山茶花Camellia japonica的CjAPL1转化拟南芥的阳性植株花器官发育异常，花柱和雄蕊数增加；邓柠檬等[32]发现：金钗石斛Dendrobium nobile的DnAPL1在转基因拟南芥中的表达会导致花器官数目增加，且萼片和花瓣形状发生变化。本研究发现：转基因龙葵花雌蕊发育异常，在强表型中可以观察到子房膨大且雌蕊状组织增多。因此推测，SvAP1在花器官形成中具有重要作用，且与ABC模型中A类基因超表达对于花器官发育造成的影响有所不同。在ABC模型中，A类基因的超表达会抑制C类基因的表达，从而对雄蕊与雌蕊的发育产生影响：雄蕊向花瓣同源异形转化且雌蕊转变为萼片状或叶片状器官。在本研究中，SvAP1在龙葵中的超表达同样影响了雌蕊的发育，但呈现出相对不同的表型，且雄蕊的发育无明显变化，这可能与欧洲千里光花器官调控机制与花序结构的复杂性有关。雌蕊的异常发育导致果实发育受到影响，在转基因龙葵中果实数目与同一时期野生型龙葵相比明显变少。
开花植物花调控网络十分庞大，不同基因之间存在较为复杂的相互作用关系。研究表明：在拟南芥中AP1
与SEPALLATA3 (SEP3)[32]、AGAMOUS (AG)[21]、FRUITFULL (FUL)[33]和UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO)[34]等多种花器官发育相关基因存在相互作用，其中部分基因与心皮发育的调控有关。有研究报道：AP1类基因的异位表达可能对内源基因的表达产生了抑制或者促进作用，例如：毛白杨Populus tomentosa的AtAP1M3[35]和山茶花的CjAPL1[31]等。因此推测，SvAP1雌蕊发育异常也可能与基因之间的相互作用有关。为了进一步验证SvAP1的异位表达是否对于其他内源基因的表达产生了影响，从而共同导致雌蕊的变化，还需要进行转基因龙葵相关内源基因的表达分析。 本研究通过异源转化龙葵，初步预测了菊科欧洲千里光AP1类基因SvAP1作为花器官特征基因对花器官发育的影响。欧洲千里光组织特异性表达分析显示：SvAP1可能参与了营养生长与生殖生长的调控，其在龙葵中的异位表达却对龙葵的营养生长并没有起到明显的作用，推测这可能与物种之间的差异性有关，因此，为了深入探究SvAP1基因在欧洲千里光中的作用机制，需要后续研究进一步验证。
Cloning and functional analysis of SvAPETALA1 in Senecio vulgaris
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摘要:
目的 花器官发育是影响花观赏价值的重要因素，AP1类基因调控植物花器官的形成。研究菊科Asteraceae欧洲千里光Senecio vulgaris的SvAP1基因在花器官形成中的重要作用，旨在探究菊科复杂花序结构产生的调控机制。 方法 以欧洲千里光为材料克隆获得了SvAP1基因，通过多序列比对、构建系统进化树、实时荧光定量PCR (qRT-PCR)反应、构建超表达载体、组织学染色观察等方法与技术，对SvAP1基因进行功能预测与分析。 结果 SvAP1基因开放阅读框长度为705 bp，编码234个氨基酸。多序列比对与系统进化分析显示：SvAP1基因属于MADS-box基因AP1类亚家族，C末端具有paleoAP1保守基序(motif)。欧洲千里光组织特异性表达分析表明：SvAP1基因在营养器官和花序中都有表达。转基因龙葵Solanum nigrum的形态学观察和石蜡切片技术分析显示：与野生型龙葵相比，转基因龙葵雌蕊发育异常，表现为子房膨大且雌蕊状组织增多。 结论 欧洲千里光SvAP1基因在龙葵中的超表达影响雌蕊发育，与ABC模型中A类基因超表达对植物花器官发育造成的影响存在差异，即转基因龙葵雄蕊无明显变化且雌蕊未转变为萼片状或叶片状器官。这可能与欧洲千里光花器官调节机制和花序结构的复杂性有关。由此可知，欧洲千里光SvAP1基因可能作为花器官特征基因在花器官形成中具有重要作用。图6表1参35 -
关键词:
- 欧洲千里光 /
- 转基因龙葵 /
- SvAPETALA1 /
- 花器官发育
Abstract:Objective Floral organ development is an important factor affecting the ornamental value of flowers, and APETALA1 (AP1) genes regulate the formation of floral organs. This study aims to explore the important role of SvAP1 gene of Senecio vulgaris (Asteraceae) in floral organ formation, so as to reveal the regulatory mechanism of the complex inflorescence structure in Asteraceae. Method SvAP1 gene was cloned from S. vulgaris. The function of SvAP1 gene was predicted and analyzed by multiple sequence alignment, phylogenetic tree construction, qRT-PCR, overexpression vector construction, and histological staining observation. Result The open reading frame (ORF) of SvAP1 gene was 705 bp in length, and encoded 234 amino acids. Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis showed that SvAP1 gene belonged to AP1 subfamily of MADS-box gene, and the C-terminus had a conserved motif of paleoAP1. Tissue specific expression analysis of S. vulgaris showed that SvAP1 gene was expressed in both vegetative organs and inflorescences. Morphological observation and paraffin section analysis of transgenic Solanum nigrum showed that compared with wild S. nigrum, the pistil development of transgenic S. nigrum was abnormal, which was characterized by enlarged ovary and increased pistil-like tissue. Conclusion The overexpression of SvAP1 gene in S. nigrum affects the pistil development, which is different from the effect of over expression of class A gene in ABC model on floral organ development, that is, the stamens of transgenic S. nigrum have no obvious changes and the pistils aren’t transformed into sepal or leaf-like organs, which may be related to the complexity of the floral organ regulation mechanism and the inflorescence structure of S. vulgaris. In conclusion, SvAP1 gene may play an important role in floral organ formation as a characteristic gene of floral organ. [Ch, 6 fig. 1 tab. 35 ref.] -
Key words:
- Senecio vulgaris /
- transgenic Solanum nigrum /
- SvAPETALA1 /
- floral organ development
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随着环境保护要求的不断提高，环保型木材防腐剂越来越受到重视，此类防腐剂多以高效低毒的有机农药为主成分，配合其他助剂制备成有机型或水基型防腐剂[1-2]。三唑类杀菌剂，如丙环唑、戊唑醇、环丙唑醇、氟环唑和苯醚甲环唑等，既可以单独使用，又可以与铜制剂复配[3-4]，是目前常用的木材防腐剂；这些三唑类杀菌剂杀菌谱不尽相同，作用机制也有所差异，应用较广泛的是丙环唑和戊唑醇[5-6]。常见的木材防霉剂有异噻唑啉酮类如卡松、1,2-苯并异噻唑-3-酮(BIT)、4,5-二氯-2-正辛基-3-异噻唑啉酮(DCOI)等，有机碘类如碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)，三唑类等[7]，杀菌谱也不尽相同；常用的仓储水果防霉剂如溴菌腈和抑霉唑[8-9]，防霉活性较高，但较少应用于木材防霉。菊酯类杀虫剂是常见的防治白蚁的药剂，具有用量少、成本较低、废弃物易回收、环境相对友好等优点；高效氯氟氰菊酯在菊酯类杀虫剂中活性较高、稳定性较强、耐雨水冲刷性能较好。因含有大量羟基等亲水基团[10]，木材变色、发霉、腐朽、变形等问题频发，品质降低[11-13]，常用亚麻油、桐油、豆油、核桃油等含甘油三脂肪酸酯的植物油[14]和沥青、石蜡等含长链烷烃的矿物油用作木材防水；现代工业多将植物油与动植物蜡等复配成木蜡油[15]，用作木材的表面防水处理剂。如马红霞等[16]使用56号石蜡制备木材防水剂，当石蜡质量浓度为5%时，防水效率可达54%；由此可见，石蜡可作为良好的木材防水剂。液体石蜡是经原油分馏得到的无色无味的液态烃类混合物，室温下为液态，用作防水剂时可省去加热融化环节，节约了能源和时间。木材在使用过程中需要多重保护，如防腐、防霉、防虫和防水等，存在工序繁琐、成本高昂等问题，为满足木材不同生物危害防治需要，本研究拟制备一种同时具有防腐、防霉、防虫和防水多项功能的水基型有机木材保护复合制剂，通过室内抑菌圈法筛选不同杀菌剂的抑菌活性，从中挑选活性较好、杀菌谱互补的防腐成分与防霉成分进行复配，并筛选两者的最佳配比；将其与杀虫成分和防水成分复配，制备成可以兑水自动乳化的乳油制剂。制备的复合制剂稳定性好，兼具防水、防腐、防霉、防白蚁等性能，同时处理工序简单，可达到常规生物危害防治要求的目的，为木材保护提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 杀菌剂、杀虫剂和防水剂
杀菌剂包括氟环唑(FCZ)、戊唑醇(TEB)、丙环唑(PPZ)、苯醚甲环唑(DCZ)、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)、溴菌腈(BMN)、抑霉唑(IMZ)。杀虫剂为高效氯氟氰菊酯(CLT)。防水剂为液体石蜡(化妆品级)。以上试剂购自上海麦克林生化科技有限公司。
1.1.2 测试菌种
木材腐朽菌有褐腐菌密粘褶菌Gloeophyllun trabeum、白腐菌彩绒革盖菌Coriolus versicolor。木材混合霉菌有黑曲霉Aspergillus sp.、木霉Trichoderma sp.、青霉Penicillium sp.。木材变色菌可可球二孢Botryodiplodia theobromae。所有菌株均为实验室保存的生物测试标准用菌株。
测试树种为辐射松Pinus radiata。
1.2 试验方法
预实验通过满细胞法确定辐射松边材吸液(水)量为750~850 kg·m−3；根据三唑类药剂防腐有效载药量(200.0~400.0 g·m−3)[17]，换算药剂质量浓度为150.0~300.0 mg·L−1，确定试验用药质量浓度为200.0 mg·L−1。
1.2.1 防腐、防霉成分及配比筛选
通过室内抑菌效果普筛挑选出效果较好且杀菌谱互补的杀菌剂作为防腐和防霉成分。将挑选出的防腐和防霉成分按照不同配比混合进行复配，再次测试室内抑菌效果，确定效果较好的复配比例作为药剂配伍。
1.2.2 室内抑菌圈测试
参照《中华人民共和国药典》的“抗生素微生物检定法”测试抑菌圈。将5种防腐剂(FCZ、TEB、PPZ、DCZ、IPBC)统一配制成质量分数为5.00%的乳油，分别加水稀释到200.0 mg·L−1；防霉剂IMZ配制为400.0 mg·L−1，BMN分别配制为400.0、600.0和800.0 mg·L−1。在各涂满真菌孢子液的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中，分别摆放4个装有0.3 mL待测药液的牛津杯。随着药液的扩散，培养基上的真菌菌丝会受到抑制形成抑菌圈，抑菌圈直径越大，说明药剂抑菌效果越好。
1.2.3 制剂性能测试
乳液稳定性测试。参照GB/T 1603—2001《农药乳液稳定性测定方法》，在100.0 mL室温标准硬水中慢慢加入不同体积样品，边加入边搅拌，加完后继续搅拌30 s；然后在30 ℃恒温水浴中静置1 h，观察不同稀释倍数下样品乳状液分离情况。无浮油、沉淀或沉油则视为乳液稳定性合格。
防水性能测试。将含液体石蜡质量分数为40.00%的复合制剂分别兑水，稀释液体石蜡质量分数为2.00%、4.00%、8.00%，满细胞法处理试块。辐射松边材尺寸为50 mm×20 mm×10 mm，每组8块试块，室温平衡21 d后称质量，然后蒸馏水浸泡30 min，取出试块，称质量，参照GB/T 1934.1—2009《木材吸水性测定方法》计算吸水率；测量弦向尺寸变化，参照GB/T 29901—2013《木材防水剂的防水效率测试方法》计算防水效率。
室内防腐性能测试。参照GB/T 13942.1—2009《木材耐久性能第1部分：天然耐腐性实验室试验方法》进行。将待测制剂分别兑水稀释5、10、20倍备用，辐射松边材尺寸为20 mm×20 mm×10 mm，每组6块试块，经真空−0.09 MPa处理10 min，常压浸渍10 min，参照标准测试防腐性能。试块质量损失率＜10%，属于Ⅰ级强耐腐；质量损失率为11%~24%，属于Ⅱ级耐腐；质量损失率为25%~44%，属于Ⅲ级稍耐腐；质量损失率＞45%，属于Ⅳ级不耐腐。
室内防霉性能测试。参照GB/T 18261—2013《防霉剂对木材霉菌及变色菌防治效力的试验方法》进行。将待测制剂分别兑水稀释5、10、20倍，辐射松边材尺寸为50 mm×20 mm×10 mm，每组8块试块，参照标准方法处理试块，测试防霉性能。试块表面无菌丝、霉点时，定义侵染值为0；试块表面感染面积＜1/4，定义为1；试块表面感染面积1/4~1/2，定义为2；试块表面感染面积1/2~3/4，定义为3；试块表面感染面积＞3/4，定义为4。
室内防白蚁测试。参照GB/T 18260—2015《木材防腐剂对白蚁毒效实验室试验方法》进行。将待测制剂分别兑水稀释5、10、20倍，辐射松边材尺寸为20 mm×20 mm×10 mm，每组5块试块，参照标准方法处理试块，测试室内防白蚁性能。试块蚁蛀程度为完好无损，定义试样完好等级为10；微痕蛀蚀，定义为9.5；轻微蛀蚀，截面面积＜3%的蛀蚀，定义为9；中等蛀蚀，截面面积3%~10%的蛀蚀，定义为8；中等蛀蚀，截面面积10%~30%的蛀蚀，定义为7；严重蛀蚀，截面面积30%~50%的蛀蚀，定义为6；非常严重蛀蚀，截面面积50%~75%的蛀蚀，定义为4；试块几乎完全被蛀毁，定义完好等级为0。
2. 结果与分析
2.1 有效成分筛选
从表1可以看出：5种防腐剂(FCZ、TEB、PPZ、DCZ和 IPBC)对木材腐朽菌(彩绒革盖菌和密粘褶菌)均具有较好的抑制效果，但FCZ、TEB和PPZ对变色菌(可可球二孢)和混合霉菌几乎没有抑制作用，只有DCZ对可可球二孢有抑制效果，因此优选DCZ作为防腐成分。IPBC和IMZ对所测试菌种均有较好的抑制效果，BMN和IMZ虽然对混合霉菌和变色菌有抑制作用，但抑菌圈均小于IPBC。因此，优先IPBC作为防霉成分。
表 1 各杀菌剂的室内抑菌效果Table 1 Result of inhibition zones test by bactericide杀菌剂 质量浓度/
(mg·L−1)抑菌圈大小/mm 彩绒革
盖菌密粘
褶菌可可球
二孢混合
霉菌FCZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 0 0 TEB 200.0 ＞45.0 ＞45.0 0 0 PPZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 0 0 DCZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 11.4 0 IPBC 200.0 ＞45.0 ＞45.0 34.6 21.9 BMN 800.0 37.2 35.4 12.8 10.6 600.0 38.1 29.0 9.0 9.4 400.0 26.8 31.8 8.3 7.1 IMZ 400.0 39.2 41.6 26.9 12.7 将DCZ和IPBC按质量比1∶1、1∶3、3∶1的比例配制混合药剂，测试DCZ+IPBC复配药剂对腐朽菌和霉菌的抑制效果；将其他3种三唑类防腐药剂(FCZ、TEB和PPZ)与IPBC按照质量比1∶1配制复配药剂，作为对照测试抑菌效果。由表2可以看出：DCZ+IPBC复配药剂对木材腐朽菌、变色菌和混合霉菌的抑制效果较好，其中按照1∶1比例复配的药剂效果最高。相其他三唑类与IPBC的复配药剂，抑菌效果亦有所提高。由此确认防腐/防霉复配药剂，DCZ和IPBC按照1∶1进行配制。
表 2 不同三唑类药剂与IPBC复配的抑菌效果Table 2 Result of inhibition zones test by compounded of different preservatives组分 质量浓度/
(mg·L−1)抑菌圈大小/mm 彩绒革
盖菌密粘
褶菌可可球
二孢混合
霉菌DCZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 11.4 0 DCZ+IPBC 150.0+50.0 ＞45.0 ＞45.0 22.4 15.1 DCZ+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 31.0 23.6 DCZ+IPBC 50.0+150.0 ＞45.0 ＞45.0 29.1 23.7 IPBC 200.0 ＞45.0 ＞45.0 30.6 21.9 FCZ+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 25.7 21.8 PPZ+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 25.8 22.5 TEB+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 24.0 21.0 为探索CLT对白蚁的防治效果，设计含梯度载药量的辐射松边材室内抗白蚁效果测试，拟定辐射松边材载药量分别为5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 g·m−3。由表3可知：试块中CLT载药量达10.9 g·m−3以上时，白蚁蛀蚀完好值＞8.0，质量损失率＜11%，而未添加药剂处理的对照木材，完好值仅4.6，质量损失率＞40%。因此，设计的复合制剂中防虫成分的目标载药量为7.5~30.0 g·m−3。
表 3 不同CLT载药量木材的白蚁蛀蚀结果Table 3 Result of lab anti-termite test of cyhalothrin载药量/
(g·m−3)白蚁蛀蚀
完好值质量损
失率/%载药量/
(g·m−3)白蚁蛀蚀
完好值质量损
失率/%− 4.6 42.9±14.6 15.5 8.0 10.5±1.4 5.3 8.0 11.3±0.7 21.8 9.1 5.2±1.4 10.9 8.6 5.9±1.5 32.1 8.4 5.1±1.9 说明：−表示未添加药剂 综上，本研究设计制备了含苯醚甲环唑、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、高效氯氟氰菊酯、液体石蜡等多种有效成分的木材保护复合制剂，通过调试乳化剂和助溶剂的用量和配比，最终配制出稳定、均相、透明、入水可自乳化的乳油制剂。制剂制备时按比例称取原药和乳化剂，加入助溶剂，充分溶解混匀后加入液体石蜡，搅拌均匀即可。测试使用的制剂为乳油，组成成分质量分数为0.20%苯醚甲环唑、0.20%碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、0.02%高效氯氟氰菊酯和40.00%液体石蜡。
2.2 制剂性能测试
2.2.1 乳液稳定性测试
制剂兑水稀释250倍，制剂呈乳白色，初入水时呈乳白色团雾状，可自动扩散，摇匀后呈均匀的乳状液，静置1 h未见分层、析油和沉淀，稳定性可保持3~4 h；过夜后破乳，药液表面有大量浮油，颠倒摇匀后可恢复乳液状，不影响正常使用。
2.2.2 防水性能测试
参照标准方法用该制剂处理辐射松边材，经水浸泡30 min后测试试块的吸水率和防水效率。由表4可知：未添加药剂处理的木材，吸水率为54.7%；随着制剂中石蜡质量分数升高，木材试块中石蜡含量相应增加，试块吸水率依次降低，从43.5%下降到26.6%，木材防水效率则随之增强，从44.4%提升到了77.8%。
表 4 防水剂处理后试块的防水性能Table 4 Efficiency of waterproof稀释
倍数制剂中液体石
蜡质量分数/%试块中液体石
蜡含量/(kg·m−3)吸水
率/%防水效
率/%5 8 49.1 26.6±7.4 77.8±19.1 10 4 19.4 35.0±17.3 68.9±22.1 20 2 10.5 43.5±15.1 44.4±20.6 − 0 0 54.7±5.8 0 说明：−表示未添加药剂 2.2.3 室内耐腐性能测试
由表5可知：未处理木材受白腐菌侵染后质量损失率达75.7%，受褐腐菌侵染质量损失率为19.4%，而所有处理试块质量损失率均低于6%，达到强耐腐。制剂稀释20倍后处理试块，试块中DCZ和IPBC载药量超过71.1 g·m−3，试块质量损失率可达1%，达到Ⅰ级强耐腐。值得注意的是，稀释20倍的药液处理后，试块质量损失率低于稀释5倍的药液，原因是高质量浓度制剂处理后，试块内含有大量的液体石蜡，在长达3个月的试验期内，液体石蜡自动扩散到培养基，试块质量损失增加。但取样现场也发现：高质量浓度制剂处理的试块无腐朽菌菌丝附着生长，说明添加防水剂实际进一步提升了制剂的防腐性能。
表 5 制剂处理后试块的室内耐腐性能Table 5 Result of lab sand block test on sapwood P. radiate稀释
倍数彩绒革盖菌 密粘褶菌 试块DCZ+IPBC
载药量/(g·m−3)质量损
失率/%试块DCZ+IPBC
载药量/(g·m−3)质量损
失率/%5 311.2+311.2 5.5±0.6 320.6+320.6 3.6±0.3 10 150.9+150.9 2.7±0.2 139.0+139.0 3.4±0.4 20 71.2+71.2 0.6±0.1 71.1+71.1 1.0±0.2 − 0 75.7±4.3 0 19.4±2.1 说明：−表示未添加药剂 2.2.4 室内防霉性能测试
参照标准方法用该制剂处理辐射松边材，测试室内防霉效果。由表6可知：未处理木材的霉菌和变色菌侵染值为4，该制剂稀释5倍时，试块表面的DCZ和IPBC含量均达0.165 g·m−2，处理试块变色菌和混合霉菌侵染值均为0，防治效果优良。在实际使用中可根据木材树种的天然耐腐性及所处环境适当增减制剂的用量，以达到理想的防霉效果。
表 6 室内防霉测试结果Table 6 Result of lab mildew proof test稀释
倍数可可球二孢 混合霉菌 DCZ+IPBC载药
量/(g·m−2)侵染值 DCZ+IPBC载药
量/(g·m−2)侵染值 5 0.165+0.165 0 0.202+0.202 0 10 0.106+0.106 1.5 0.148+0.148 0.5 20 0.045+0.045 4.0 0.048+0.048 3.3 − 0 4.0 0 4.0 说明：−表示未添加药剂 2.2.5 室内抗白蚁测试
由表7可知：不同稀释倍数的制剂处理后，试块质量损失率均＜3%，而未添加抗虫剂的对照试块，质量损失率为42.9%；制剂稀释5倍时，试块载药量达29.1 g·m−3，试块白蚁蛀蚀完好值为9.6；稀释20倍时，试块载药量为7.6 g·m−3， 试块白蚁蛀蚀完好值为8.9，而未处理木材的白蚁蛀蚀后完好值仅为4.7，质量损失率达42.9%，显示该制剂的防治白蚁效果优良。结合表3可知：相比单用高效氯氟氰菊酯时，复合制剂处理材在同等载药量下对白蚁的防治效果要好得多；当高效氯氟氰菊酯质量浓度为15.0、30.0 g·m−3时，该复合制剂防治白蚁的效果远远优于单剂，由此可知其他组分的加入起到了增效作用。
表 7 室内抗白蚁测试结果Table 7 Result of lab anti-termite test稀释
倍数木材中高效氯氟氰菊酯
载药量/(g·m−3)质量损
失率/%白蚁蛀蚀
完好值5 29.1 2.8±0.5 9.6 10 14.7 2.6±0.3 9.2 20 7.6 2.5±0.7 8.9 − 0 42.9±14.6 4.7 说明：−表示未添加药剂 3. 讨论
针对不同的木材败坏防治需求，本研究制备了一种具有防腐、防霉、防虫、防水多功能的复合制剂，类型为乳油，有效成分为苯醚甲环唑、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、高效氯氟氰菊酯和液体石蜡。
该制剂兑水稀释后呈乳液状，稳定性可保持3~4 h，符合GB/T 1603—2001 《农药乳液稳定性测定方法》的规定。石蜡作为常见的防水剂被广泛应用，多数所使用的时熔点较高的固体石蜡[18]，而该制剂以液体石蜡为防水组分，优点是室温下即为液体，无需加热融化，缺点是液体石蜡密度较小，相较常规药剂，兑水稀释后稳定性差，药液兑水约 4 h 后就会分层破乳；不过，稍微搅拌即可恢复乳状，基本不影响正常使用。该制剂防水性能较好，然而应注意的是防水剂含量很大，大剂量液体石蜡的使用，存在一定的消防隐患，后期应配合表面阻燃处理。石蜡基防水剂的主要防水机制是通过石蜡的疏水作用[19]，石蜡的使用同时增强了木材的尺寸稳定性[20]，石蜡分子量较大，不易进入木材内部，因此需要将其乳化成细小的乳状液，然而，乳化剂的过量使用可能会有石蜡的疏水性降低的风险，需要在以后的开发中引起重视。结合室内耐腐试验菌丝生长状况可以发现：防水剂液体石蜡的加入，可以明显增加药剂的防腐性能，而木材中石蜡的含量很高，当木材与环境中土壤或者水体接触时，石蜡会从木材中自由扩散到环境中，可能会增加药剂流失的风险。
室内防霉测试结果来看，将制剂稀释 5 倍使用，即辐射松试块苯醚甲环唑和碘丙炔醇丁基氨甲酸酯载药量均为 0.165 g·m −2 时，混合霉菌的生长才能被完全抑制，这与李晓文等[21]的IPBC防霉效果结论一致。室内防霉测试所选的温湿度条件适合霉菌生长，且霉菌的孢子液人为接种，因此，通常可以通过室内防霉测试的药剂，在实际生产中的防霉效果也会很好。
室内防白蚁测试结果可知：制剂稀释 20 倍后，试块受白蚁蛀蚀程度仍较低，质量损失率较小，防蚁性能优异。同时，比较单独使用高效氯氟氰菊酯和添加防水剂后的防白蚁效果可以看出：防水剂的添加明显增加了药剂的防白蚁效果。分析原因可能是石蜡是一种化石能源，白蚁不喜食。
4. 结论
为满足木材不同生物危害防治需要，本研究制备出一种含石蜡水基型有机多功能木材防腐剂，可以一次处理基本满足木材常规保护的要求。该木材保护复合制剂同时具有防腐、防霉、防虫、防水多功能，剂型为乳油，质量分数分别为0.20%的苯醚甲环唑和碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、0.02%的高效氯氟氰菊酯和40.00%的液体石蜡。
当环境中生物危害较轻时，可将该复合制剂稀释20倍使用，当生物危害较重时，可将复合制剂稀释5倍甚至直接使用。将制剂稀释5到10倍处理木材，即木材中液体石蜡为25.0~50.0 kg·m−3，苯醚甲环唑和碘丙炔醇丁基氨甲酸酯为150.0~300.0 g·m−3，高效氯氟氰菊酯载药量为15.0~30.0 g·m−3，可满足多大多数生物危害的防治需求。
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图 1 欧洲千里光SvAP1氨基酸多序列比对以及系统进化树分析
Figure 1 Amino acid sequence alignment and phylogenetic tree analysis of SvAP1 in S. vulgaris
图 2 SvAP1在欧洲千里光不同部位的相对表达
Figure 2 Relative expression of SvAP1 in different tissues of S. vulgaris
图 3 野生型及转基因龙葵PCR检测
Figure 3 PCR detection of wild type S. nigrum and different transgenic lines
图 4 野生型和转基因龙葵RT-PCR及表型分析
Figure 4 RT-PCR and phenotypes analysis of wild type S. nigrumand different transgenic lines
图 5 野生型及转基因龙葵花序
Figure 5 Inflorescence in wild type S. nigrum and different transgenic lines
图 6 野生型和转基因龙葵雌蕊及其石蜡切片
Figure 6 Wild type S. nigrum and different transgenic lines pistil and their paraffin section
表 1 基因克隆与分子鉴定所用引物序列
Table 1. Primer sequences for gene cloning and molecular identification
引物名称 正向(反向)引物序列(5′→3′) 引物名称 正向(反向)引物序列(5′→3′) SvAP1-F AATCTAGAATGGGGCGGGGAAGGGTGA NPT Ⅱ-R GTGGTCGAATGGGCAGGTAG SvAP1-R AAGAGCTCTTACTTGTTCATGAGATGAAT qSvAP1-F GTTGTGTGATGCTGACGTGG Sn18s-F CGCGCGCTACACTGATGTATTCAA qSvAP1-R GCGTGTTCCAGAGTCCAGTT Sn18s-R TACAAAGGGCAGGGACGTAGTCAA Sv18s-F ATAGCAGAACGACCTGTGAA NPT Ⅱ-F AGATGGATTGCACGCAGGTTC Sv18s-R GAAGCAAGATCCAACGCAAT 说明：下划线标记处为特异性引物限制性内切酶酶切位点 
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