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![](data:image/svg+xml,<svg xmlns='http://www.w3.org/2000/svg' width='210' height='179'><foreignObject width='2000' height='100%'><div xmlns='http://www.w3.org/1999/xhtml' style='font-size:16px;font-family:Helvetica'><table>
<thead>
<tr>
<td class="table_top_border" align="center">模型</td>
<td class="table_top_border" align="center">语句*</td>
</tr>
</thead>
<tbody>
<tr>
<td class="table_top_border2" align="left">5种模型</td>
<td class="table_top_border2" align="left">proc mixed data=sasuser.wdxazA或sasuser.wdxazB或sasuser.wdxazABscoring= 20; class G E；model T=G/ddfm= satterthwaite；</td>
</tr>
<tr>
<td class="table_top_border2" align="center" colspan="2">
</td></tr>
<tr>
<td class="table_top_border2" align="center">模型</td>
<td class="table_top_border2" align="center">语句</td>
</tr>
<tr>
<td class="table_top_border2" align="left">Stability Variance模型</td>
<td class="table_top_border2" align="left">random int/ sub= E；repeated G/ sub= E type= un(1)；run；</td>
</tr>
<tr>
<td align="left">Finlay-Wilkinson模型</td>
<td align="left">repeated G/ sub= E type= FA1(1)；run；</td>
</tr>
<tr>
<td align="left">Eberhart-Russell模型</td>
<td align="left">repeated G/ sub= E type= FA(1); run;</td>
</tr>
<tr>
<td align="left">AMMI-1模型</td>
<td align="left">random int/ sub= E; repeated G/ sub= E type= FA1 (1); run;</td>
</tr>
<tr>
<td class="table_bottom_border" align="left">Environmental Variance模型</td>
<td class="table_bottom_border" align="left">repeated G/ sub= E type= un; run;</td>
</tr>
</tbody>
<tfoot>
<tr><td colspan="2">说明：*本行所列语句应出现在其他语句之前</td></tr>
</tfoot>
</table></div></foreignObject></svg>)
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印楝Azadirachta indica是世界著名农药植物[1-2]。印楝素（azadirachtin）因发现于印楝而得名，是目前世界上最优秀的天然产物农药。印楝素是印楝素A，B，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N等一系列类似化合物的统称，其中印楝素A和印楝素B是主要成分。自然界中印楝素资源十分有限，来源仅限于印楝属Azadirachta植物，原产植物的生物合成仍是唯一的获得方式[3]。研究认为：印楝人工林种子印楝素性状表型变异丰富[4-6]，研究和利用印楝品种印楝素质量分数的基因型（G）与环境（E）互作效应，进行品种印楝素质量分数稳定性和适应性育种，是提高品种印楝素生产力的重要途径之一。因此，开展印楝品种印楝素质量分数稳定性研究具有重要意义。生物体能自我调节其遗传型或表现型的状态以适应于变动的环境，使其生长发育和主要性状保持相对稳定的能力称为稳定性（stability）[7]。植物品种稳定性分析发端于多点试验基因型与环境互作效应（GE）的解析。所以，对基因型与环境互作效应的准确估计是合理评估植物品种稳定性的基础。品种稳定性分析有许多模型与方法。有学者认为不同稳定性分析模型适用于不同的试验数据，模型选择对品种稳定性评价有较大影响，并提出应在多种模型分析基础上的稳定性综合评估和可统一运用SAS中的PROC MIXED程序进行分析的分析策略[8-9]。印楝种源[4-5]、优树[10-12]、品比试验品种[13]种子印楝素组分稳定性已有研究，但多点试验品种种子印楝素组分稳定性研究末见报道。本研究以多点试验7个农药型印楝品种种子印楝素组分质量分数为分析数据，基于SAS PROC MIXED程序，比较5种常用品种稳定性分析模型在印楝品种种子印楝素组分稳定性分析中的分析效果，用Akaike信息量准则（cAIC）评价和选择最佳模型；根据稳定性类型的定义和稳定性形成机制的缓冲性学说推断稳定性类型和机制，保证印楝品种印楝素质量分数稳定性分析的有效性和科学性，丰富植物品种稳定性研究理论及实践，所获结果为农药型印楝品质育种提供理论依据。
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试验数据取自本项目组开展的农药型印楝品种多点试验。试验地点为云南省元阳县、元江县和元谋县；试验品种为6个农药型印楝优良品种及平均木（ck）：冷墩0505（Ld0505），阿土0515（At0515），乌湾0401（Ww0401），大黑公0507（Dhg0507），万星0423（Wx0423），万星0416（Wx0416）和平均木（ck）。通过优树选择[10-12]、品种品比试验[13]选出；试验采用随机完全区组设计，7个品种为1小区，3重复（区组），多系授粉，株行距为4 m × 4 m。样地管理、样株抚育基本一致，种子样品的采收、调制、保存和印楝素组分质量分数测定分析由专人完成。种子印楝素A和印楝素B质量分数用宗乾收等[14]的方法分析，印楝素AB的计算式：印楝素AB=印楝素A+印楝素B。
种子印楝素A、印楝素B和印楝素AB质量分数数据首先用Exce1 2007软件进行描述统计和隶属函数法转换[11]；转换后数值再整理成一个品种-地点两向表，以变量T，G和E分别代表印楝素A或印楝素B或印楝素AB，品种和环境。其中每一个数值是相应品种在相应试验点内各重复的平均值。印楝素A，印楝素B，印楝素AB的品种-地点两向表分别以wdxazA，wdxazB，wdxazAB文件名存入SAS逻辑库的sasuser。
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Stability Variance，Finlay-Wilkinson，Eberhart-Russell，AMNM-1和Environmental Variance等5种模型是最有代表性也最为常用的稳定性分析模型。由于供试数据为品种-环境组合处理均值（无重复数据），因此，本研究的5种稳定性分析模型与方法为处理均值的模型形式，5种稳定性分析模型的一般表达式，采用胡希远等[9]的处理均值模型形式。
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上述模型统一运用SAS软件的PROC MIXED程序模块进行分析。具有UN（1），FA1（1），FA（1），FA1（1），UN方差协方差结构的线性混合模型依次等价于Stability Variance，Finlay-Wilkinson，Eberhart-Russell，AMMI-1，Environmental Variance模型[15]，固定效应方差参数采用限制性极大似然法（REML）估计，效应差异显著性t测验的自由度采用Satterthwaite法估算，即利用PROC MIXED进行数据分析时，在MODEL语句中增加“ddfm=Satterthwaite”。基于处理均值数据的各稳定性模型分析的SAS程序如表 1所示。
表 1 针对品种-环境处理均值数据5种稳定性分析模型的SAS程序编码
Table 1. Syntax for the SAS commands to fit 5 stability analysis models for cultivar-environment treatment mean data
模型 语句* 5种模型 proc mixed data=sasuser.wdxazA或sasuser.wdxazB或sasuser.wdxazABscoring= 20; class G E；model T=G/ddfm= satterthwaite； 模型 语句 Stability Variance模型 random int/ sub= E；repeated G/ sub= E type= un(1)；run； Finlay-Wilkinson模型 repeated G/ sub= E type= FA1(1)；run； Eberhart-Russell模型 repeated G/ sub= E type= FA(1); run; AMMI-1模型 random int/ sub= E; repeated G/ sub= E type= FA1 (1); run; Environmental Variance模型 repeated G/ sub= E type= un; run; 说明：*本行所列语句应出现在其他语句之前 -
上述各种模型采用REML拟合时，以似然值的信息量准则评价和选择最佳模型，如Akaike信息量准则（Akaike’s information criterion，cAIC）[9]：
$${c_{{\rm{AIC}}}} = - 2\ln L + 2q。$$ (1) 式（1）中：lnL为模型拟合极大似然值的自然对数值；q为模型中待估计方差协方差参数的数目。式（1）中右边第1项可解释为衡量模型对试验数据拟合优良度的一个度量，第2项可解释为对增加模型参数个数的一种平衡。当有若干个模型可供应用时，数据拟合效果好，而又尽可能节省参数数目的模型，即cAIC值最小的模型为最佳模型。在利用SAS中的PROC MIXED程序进行分析时，cAIC值将由该程序自动给出。
按照刘录祥等[16]的稳定性类型的定义界定印楝品种种子印楝素组分质量分数稳定性类型，根据ALIARD等[7]的缓冲性学说，结合当前最新研究成果，解释印楝品种种子印楝素组分质量分数稳定性形成机制。
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表 2为7个品种-环境组合处理均值的描述统计结果。方差、标准误是比较理想的描述数据变异程度的特征值，也是常用的以品种平均数为参照数的稳定性参数。从方差、标准误可以看出，在试验环境范围内7个印楝品种种子印楝素主要组分质量分数的变异幅度或稳定性不同。
表 2 品种-环境组合处理均值的描述统计
Table 2. Description statistics of cultivar-environment combination process
试验 印楝素A/(mg·g-1) 环境指数 环境指数离差 Ww0401 Dhg0507 Wx0416 Wx0423 Ld0505 At0515 ck 元阳 6.5 6.5 5.5 6.3 8.6 7.1 4.5 -5.25 0.01 元江 7.0 6.6 5.9 6.4 7.8 7.3 5.0 -5.24 0 元谋 7.1 7.0 5.5 6.0 8.2 7.8 4.9 -5.23 -0.01 平均值 6.9 6.7 5.6 6.2 8.2 7.4 4.8 -5.24 - 方差 0.001 0 0.000 7 0.000 5 0.000 4 0.001 6 0.001 3 0.000 7 - - 标准误/% 3.21 2.65 2.31 2.08 4.00 3.61 2.65 - - 平均标准误比数ai 1.10 0.90 0.79 0.71 1.37 1.23 0.90 - - 试验 印楝素B/(mg·g-1) 环境指数 环境指数离差 Ww0401 Dhg0507 Wx0416 Wx0423 Ld0505 At0515 ck 元阳 2.2 1.4 1.0 1.1 2.4 2.1 0.9 -1.19 -0.01 元江 1.8 1.4 0.9 1.0 2.5 2.4 0.9 -1.19 -0.01 元谋 1.4 1.3 1.0 1.0 2.3 1.6 0.9 -1.21 0.01 平均值 1.8 1.4 1.0 1.0 2.4 2.0 0.9 -1.20 - 方差 0.001 6 0 0 0 0.000 1 0.001 6 0 - - 标准误/% 4.00 0.58 0.58 0.58 1.00 4.04 0 - - 平均标准误比数ai 2.60 0.38 0.38 0.38 0.65 2.63 0 - - 试验 印楝素AB/(mg·g-1) 环境指数 环境指数离差 Ww0401 Dhg0507 Wx0416 Wx0423 Ld0505 At0515 ck 元阳 8.7 7.9 6.5 7.4 11.0 9.2 5.3 -6.43 0 元江 8.8 8.0 6.8 7.4 10.3 9.7 5.7 -6.42 0.01 元谋 8.5 8.3 6.5 7.0 10.5 9.4 5.8 -6.43 0 平均值 8.7 8.1 6.6 7.3 10.6 9.4 5.6 -6.43 - 方差 0.000 2 0.000 4 0.000 3 0.000 5 0.001 3 0.000 6 0.000 7 - - 标准误/% 1.53 2.08 1.73 2.31 3.61 2.52 2.65 - - 平均标准误比数ai 0.65 0.89 0.74 0.98 1.54 1.07 1.13 - - 说明：-表示该项不存在 标准误与平均标准误比数（ai）也是常用的以品种平均数为参照数的稳定性参数。根据表 2各印楝品种种子印楝素组分质量分数的ai大小，可进行印楝品种印楝素质量分数稳定性大小的初步排序。
印楝素A：Wx0423（0.71）＞Wx0416（0.79）＞Dhg0507（0.90）=ck（0.90）＞Ww0401（1.10）＞At0515（1.23）＞Ld0505（1.37）。
印楝素B：ck（0.00）＞Dhg0507（0.38）=Wx0416（0.38）=Wx0423（0.38）＞Ld0505（0.65）＞Ww0401（2.60）＞At0515（2.63）。
印楝素AB：Ww0401（0.65）＞Wx0416（0.74）＞Dhg0507（0.89）＞Wx0423（0.98）＞At0515（1.07）＞ck（1.13）＞Ld0505（1.54）。
从7个品种种子印楝素组分质量分数的方差、标准误、标准误与平均标准误比数所呈现的稳定性大小综合看：Ld0505，At0515，Ww0401印楝素A和印楝素B质量分数的稳定性较低；而Dhg0507，Wx0423，Wx0416，ck印楝素A和印楝素B质量分数的稳定性较高。
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表 3是5种模型对印楝品种印楝素组分稳定性参数的估计结果。结果表明：5种模型在品种印楝素组分稳定性评判上表现出既相似又有差异的稳定性参数估计性能，表现为Finlay-Wilkinson和AMMI-1模型均能完成印楝素A，印楝素B和印楝素AB的稳定性参数估计，Eberhart-Russell模型只能完成印楝素A和印楝素AB的稳定性参数估计，Stability Variance模型仅能完成印楝素A的稳定性参数估计，而Environmental Variance模型不能完成印楝素A，印楝素B和印楝素AB的稳定性参数估计；Finlay-Wilkinson和AMMI-1模型不仅能完成品种印楝素A，印楝素B和印楝素AB的稳定性参数估计，且稳定性参数估计结果基本一致（稳定性参数大小基本相同）。7个印楝品种种子印楝素质量分数稳定性大小的排序如下。
表 3 不同分析模型的稳定性参数估计结果
Table 3. Parameter estimates of cultivar variability for different analysis models
试验 模型 不同品种稳定性参数 Ww0401 Dhg0507 W>0416 W>0423 Ld0505 At0515 ck Stability Variance 0.000 77 0.003 05 0.003 15 0.007 43 0.023 03 0.004 24 0.000 28 Finlay-W ilkinson 0.074 64 0.045 58 0.021 00 -0.018 95 -0.074 26 0.066 96 0.058 51 印楝素A Eberhart - Russell 0.073 75 0.032 27 0.036 87 -0.004 61 -0.092 19 0.050 70 0.064 53 AMMI-1 0.074 64 0.045 58 0.021 00 -0.018 95 -0.074 26 0.066 96 0.058 51 Environmental Variance - - - - - - - Stability Variance - - - - - - - Finlay-Wilkinson 0.216 90 0.035 28 -0.016 34 0.018 94 0.051 62 0.225 40 -2.19E-8 印楝素B Eberhart-Russell - - - - - - - AMMI-1 0.216 90 0.035 27 -0.016 34 0.018 94 0.051 61 0.225 40 -5.64E-6 Environmental Variance - - - - - - - Stability Variance - - - - - - - Finlay-Wilkinson 1.29E-19 0.016 00 0.019 02 -0.012 87 -0.060 47 0.038 14 0.041 45 印楝素AB Eberhart-Russell 0.020 26 -0.005 06 0.030 39 0.020 26 -0.045 58 0.040 52 0.015 19 AMMI-1 4.4E-20 0.016 00 0.019 02 -0.012 87 -0.060 47 0.038 14 0.041 45 Environmental Variance - - - - - - - 说明：-表示该项不存在 印楝素A：Wx0423（|-0.018 95|）＞Wx0416（0.021 00）＞Dhg0507（0.045 58）＞ck（0.058 51）＞At0515（0.066 96）＞Ld0505（|-0.074 26|）＞Ww0401（0.074 64）。
印楝素B：ck（|-2.19E-8|）＞Wx0416（|-0.016 34|）＞Wx0423（0.018 94）＞Dhg0507（0.035 28）＞Ld0505（0.051 62）＞Ww0401（0.216 90）＞At0515（0.225 40）。
印楝素AB：Ww0401（1.29E-19）＞Wx0423（|-0.012 87|）＞Dhg0507（0.016 00）＞Wx0416（0.019 02）＞At0515（0.038 14）＞ck（0.041 45）＞Ld0505（|-0.060 47|）。
Finlay-Wilkinson和AMMI-1模型的品种印楝素A和印楝素B质量分数的稳定性参数大小排序基本一致，Dhg0507，Wx0423，Wx0416，ck较Ld0505，At0515，Ww0401稳定；品种印楝素AB质量分数是印楝素A和印楝素B质量分数之和，其稳定性参数大小排序并没有表现出相应的排序。这些特性与方差、标准误、ai呈现的稳定性特性基本一致。
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表 4是5种模型得到的印楝品种效应（均值）的差异性检验结果。5种模型在印楝品种种子印楝素组分的差异性检验上有既相似又有差异的差异性检验性能。表现为Finlay-Wilkinson和AMMI-1模型均能完成品种印楝素A，印楝素B和印楝素AB的差异性检验检验，Eberhart-Russell模型只能完成品种印楝素A和印楝素AB的差异性检验检验，Stability Variance模型仅能完成品种印楝素A的差异性检验检验，而Environmental Variance模型不能完成品种印楝素A，印楝素B和印楝素AB的差异性检验检验；Finlay-Wilkinson和AMMI-1模型不仅能完成品种印楝素A，印楝素B和印楝素AB的差异性检验，且差异性检验结果基本一致（F值基本相同），品种印楝素A和印楝素AB的差异达极显著水平（P＜0.01），品种印楝素B的差异达显著水平（0.05＞P＞0.01）。表明Finlay-Wilkinson和AMMI-1模型对印楝品种种子印楝素质量分数参数的估计结果是科学的，7个印楝品种种子印楝素质量分数差异性真实存在。
表 4 不同分析模型F检验的结果
Table 4. F test of cultivar based on different analysis models
试验 NDF 模型 Stability Variance Finlay-Wilkinson Eberhart-Russell AMMI-1 Environmental Variance DDF F P DDF F P DDF F P DDF F P DDF F P 印楝素A 6 10.2 172.90 < 0.000 1 2.55 85.77 0.004 3 2.01 273.91 0.003 6 2.55 85.77 0.004 3 - - - 印楝素B 6 - - - 2.18 55.59 0.013 3 - - - 2.18 55.59 0.013 3 - - - 印楝素AB 6 - - - 2.20 275.19 0.002 2 2.36 706.66 0.000 5 2.20 275.19 0.002 2 - - - 说明：NDF(Num DF)和DDF(Den DF)分别为F检验的第1自由度和第2自由度。-表示该项不存在 -
5种模型固定效应方差参数采用REML拟合，依据极大似然理论的信息量准则（cAIC）进行最佳模型的评价与选择。表 5为5种模型拟合得到的cAIC值。结果表明：5种模型在印楝品种印楝素组分固定效应方差参数拟合效果上有既相似又有差异的拟合性能。表现为Finlay-Wilkinson和AMMI-1模型的品种印楝素A，印楝素B和印楝素AB稳定性参数寻优均能收敛，Stability Variance模型的品种印楝素B和印楝素AB参数寻优不能收敛，Eberhart-Russell模型的品种印楝素B参数寻优不能收敛，而Environmental Variance模型的品种印楝素A，印楝素B和印楝素AB参数寻优均不能收敛。Finlay-Wilkinson和AMMI-1模型的品种印楝素A，印楝素B和印楝素AB稳定性参数寻优不仅均能收敛，且拟合结果基本一致（cAIC值基本相同）和拟合效果表现最佳（cAIC值均较小），具有较好的统计性能，而其余3种模型部分或全部印楝素组分统计表现不佳（cAIC值均较大），部分或全部未表现出统计性能。
表 5 不同稳定性分析模型的cAIC值
Table 5. cAIC values of different stability models (smaller cAIC value indicates better fitting models)
试验 模型 Stability variance Finlay-Wilkinson Eberhart- Russell AMMI-1 Environmental variance 印楝素A -12.5 -17.3 -12.5 -17.3 - 印楝素B - -5.8 - -5.8 - 印楝素AB - -34.4 -17.3 -34.4 - 说明：-表示参数寻优未达到收敛 -
从7个品种印楝素组分稳定性的差异性检验结果（表 4）看，品种印楝素A，印楝素B和印楝素AB稳定性的差异性达显著水平，表明品种印楝素A，印楝素B和印楝素AB的稳定性随环境条件的变化会发生可预测的改变。按照刘录祥等[16]的稳定性类型的定义，品种印楝素组分质量分数稳定性均属于动态稳定性。进一步从7个品种不同环境的印楝素组分质量分数与相应的环境指数（表 2）看，Wx0416，Wx0423，Ld0505，ck的印楝素A和印楝素B质量分数与相应的环境指数并没有平行一致性（质量分数高低不随环境指数大小的变化而变化），动态稳定性差；而Ww0401，Dhg0507，At0515的印楝素A和印楝素B质量分数与相应的环境指数具有平行一致性（质量分数高低随环境指数大小的变化而变化），动态稳定性好。
7个品种是纯合的基因型或遗传上同质的群体，根据ALIARD等[7]的稳定性形成机制缓冲性学说，各品种印楝素A，印楝素B和印楝素AB的稳定性绝大部分依赖于个体缓冲性，也就是说品种各株系本身包括复杂的不同遗传型，每个遗传型能适应不同范围的环境条件，即具备个体缓冲性。这可能与印楝的异花授粉特性有关。
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基于SAS PROC MIXED程序的品种稳定性分析策略与方法，具体是运用SAS软件PROC MIXED程序的5种常用品种稳定性分析模型模块进行品种稳定性参数估计、品种效应差异检验和模型评价与选择。本研究试验范围地处热带和亚热带干热河谷，7个参试品种在热带—亚热带气候和多系授粉的条件下，品种印楝素组分质量分数的稳定性随环境条件的变化会发生可预测的改变。印楝素A的稳定性排序为Wx0423＞Wx0416＞Dhg0507＞ck＞At0515＞Ld0505＞Ww0401，印楝素B的稳定性排序为ck＞Wx0416＞Wx0423＞Dhg0507＞Ld0505＞Ww0401＞At0515；印楝素AB质量分数是印楝素A和印楝素B质量分数之和，但其稳定性排序并没有表现出相应的排序，这可能因其是复合性状（由若干构成性状经代数运算得到性状值的性状）的缘故，因为复合性状的遗传效应比构成性性状（单独测量得到性状值的性状）更复杂。研究还表明：Wx0416，Wx0423，Ld0505，ck的印楝素A和印楝素B质量分数高低不随环境指数大小的变化而变化，动态稳定性差；而Ww0401，Dhg0507，At0515的印楝素A和印楝素B质量分数高低随环境指数大小的变化而变化，动态稳定性好。
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5种模型统一运用SAS软件的PROC MIXED程序模块进行分析时，以似然值的信息量准则（cAIC）评价和选择最佳模型。cAIC值是衡量模型对试验数据拟合优良度的一个度量和对增加模型参数个数的一种平衡。cAIC值最小表示数据拟合效果好，而又尽可能节省参数数目，该模型为最佳模型。5种稳定性分析模型在印楝品种印楝素组分稳定性分析中的分析性能既相似又有差异，表现为Finlay-Wilkinson和AMMI-1模型的稳定性参数大小、差异性检验F值基本相同和稳定性参数寻优均能收敛，Akaike信息量准则基本一致（cAIC值基本相同、且均较小）；而Stability Variance，Eberhart-Russell，Environmental Variance模型的稳定性参数大小、差异性检验F值各不相同和稳定性参数寻优部分或全部不能收敛，Akaike信息量准则不一致（cAIC值各异、且均较大）。Finlay-Wilkinson和AMMI-1模型适于印楝品种种子印楝素质量分数稳定性分析，其余模型则不适用。
需要说明的是，Finlay-Wilkinson和AMMI-1具有相似稳定性评判结果，这可能是两者虽然形式不同（有无环境主效应uj分析项），但实际地点间环境主效应uj差异不显著所致。而Finlay-Wilkinson和Eberhart-Russell虽然形式相同，但dij和fij假设不同，导致稳定性参数估计性能不同。Environmental Variance模型由于待估参数较多，在数据较少或品种数多于试验环境数时难以取得模型估计值[9]。Stability Variance模型由于它是从基因型与环境互作效应入手估算品种稳定性参数，仅表示了互作大小，没有反映出基因型随环境变化的反应方式；由于不同品种可能处在不同的基因型值水平，其稳定性参数间难以直接比较，结果也不如回归法精确[17-18]。另外，AMMI-1模型是品种稳定性非线性方法的代表，是一个模型系列，本研究只对具有一项乘积项的AMMI模型即AMMI-1模型进行了比较分析，其他AMMI模型分析的效果尚需进一步研究。
还需特别指出的是，上述基于SAS软件中PROC MIXED程序的5种稳定性分析都是基于传统的固定效应模型，采用品种-环境组合的处理均值数据（无重复数据）进行分析，是一种稳定性分析的简化方法[9]。基于SAS软件中PROC MIXED程序中的“ESTIMAT”语句，采用多点试验有重复观测值数据可进行随机效应模型（random-effects model）的区域试验品种评价，对随机效应采用最佳线性无偏预测（BLUP），准确地说是经验性最佳线性无偏预测（eBLUP），随机效应方差参数采用限制性极大似然法（REML）估计，能够利用方差参数提供的信息减小试验误差对效应排序的影响，从而使效应排序比利用BLUE的效应排序更准确。因此，近年来不断有学者建议在作物品种试验分析中将品种、环境和品种-环境互作效应三者之一或全部看作随机效应，并采用线性混合模型BLUP进行评价[19]。为了使印楝素质量分数的稳定性分析更加科学，尚需开展经验性最佳线性无偏预测（eBLUP）。
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刘录祥等[16]认为：品种稳定性分为动态稳定性和静态稳定性。按照稳定性类型划分标准，本研究7个品种印楝素A，印楝素B和印楝素AB质量分数均值的差异性达显著水平，表明品种印楝素A，印楝素B和印楝素AB的稳定性随环境条件的变化会发生可预测的改变即动态稳定性。
就品种稳定性形成机制，许多研究者从遗传学、形态生理学和物候学等方面进行过探讨，创立了缓冲性学说[7]和因子补偿学说[16]。比较而言，缓冲性学说基于品种个体基因型和群体遗传组成；而因子补偿学说则不考虑品种本身的遗传组成，只基于影响性状的主要构成因子。它们各自反映了品种稳定性的不同侧面，2种解释都成立。本研究各品种均为无性系，是纯合的基因型或遗传上同质的群体，各品种间印楝素A，印楝素B和印楝素AB的稳定性绝大部分依赖于个体缓冲性。也就是说品种各株系本身包括复杂的不同遗传型，每个遗传型能适应不同范围的环境条件，即具备个体缓冲性。这可能与印楝的异花授粉特性有关。自然授粉状态下印楝异交率高于90%，而无性系多系杂交后各无性系间种子印楝素组分质量分数具有异质性（P＜0.01）[13]。印楝素主要储存在印楝种子胚乳（endosperm）中[20]，属于子代组织部分，隶属于胚乳，是胚乳性状，其遗传表达除受子代胚乳基因型（三倍体）控制外，还可能受子代胚基因型（二倍体）或母体基因型（二倍体）控制，或兼而有之及上位性、环境互作，遗传特性独特。按现代遗传学和表观遗传学观点，遗传物质改变即基因组变异（polymorphism）和表观遗传变异（epigenetic variation）决定着植物的表型。小于50个碱基对（base pair，bp）的变异，包括单核苷酸变异（single nucleotide variant，SNV）和小插入缺失（small indel）；大于50 bp的基因组变异称为结构变异（structural variant，SV），包括缺失（deletion），插入（insertion），倒位（invsersion），易位（translocation）以及更复杂的结构变化；大段的基因组拷贝数变异（copy number variation，CNV）也可以视为结构变异的一种，即非平衡性结构变异（unbalanced SV），与之对应的是倒位、易位引起的不改变基因片段在全基因组拷贝数的平衡性结构变异（balanced SV）等基因组变异决定着植物的表型[21]。组蛋白修饰、DNA甲基化和miRNA等表观遗传变异也决定着植物的表型[22]。以此推测，印楝品种印楝素质量分数稳定性的遗传机制可能受遗传控制，包括基因和表观遗传调控机制。印楝基因组测序已完成，但印楝素的生物合成途径至今仍未完全解析[20, 23-25]，控制印楝素合成和积累的关键基因或QTL仍未知。印楝品种印楝素质量分数稳定性的遗传机制尚需进一步研究。
稳定性作为高生产力水平下植物育种所追求的重要目标，是植物遗传育种工作者十分关心的问题。由于基因型与环境互作效应的存在，减少了同一基因型在不同环境条件下一致表现，从而使得基因型与表现型的相关性降低，在遗传育种试验中，降低了从表现型试验结果用以推断基因型的可信程度。开展植物育种工作，需要根据育种目标对基因型与环境互作效应加以仔细分析和充分利用。稳定性包括适应性和稳产性2个方面，对品种稳定性或适应性的评价主要依赖于稳定性参数的大小，而没有考虑品种平均产量高低的因素。实际上，当一个品种的平均产量相对于其他品种很高时，即使它的稳定性参数较大也是可以接受的，而只有当一个品种的产量较低时，它的稳定性才显得更重要。因此，在利用各种模型分析品种稳定性时，除了关注纯粹的稳定性参数大小外，还要结合各品种的平均产量等因素具体分析，才能对品种的稳定性或适应性做出更具实际意义的评价。如Ld0505和At0515的印楝素AB质量分数稳定性差，但其印楝素AB的产量较高，是推广良种的首选，分别在元阳和元江可获得更大收益。
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Finlay-Wilkinson和AMMI-1模型适于印楝品种种子印楝素质量分数稳定性分析，其余模型则不适用；Ww0401，Dhg0507，At0515的稳定性较Wx0416，Wx0423，Ld0505，ck好；印楝品种种子印楝素组分质量分数稳定性均为动态稳定性，稳定性绝大部分依赖于个体缓冲性。
Stability of azadirachtin contents in neem cultivars based on SAS PROC MIXED
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摘要: 基于SAS PROC MIXED的印楝Azadirachta indica品种印楝素质量分数的稳定性，探索建立高效、科学的印楝品种印楝素质量分数稳定性的分析方法，探究稳定性类型和机制。在元阳、元江、元谋，7个印楝品种、单株小区、三重复、完全随机区组、多系受粉，运用HPLC技术分析种子印楝素组分质量分数，基于SAS软件PROC MIXED程序的Stability Variance，Finlay-Wilkinson，Eberhart-Russell，AMMI-1和Environmental Variance 5种模型，进行品种种子印楝素质量分数稳定性参数估计、品种效应差异性检验和稳定性参数寻优，用Akaike信息量准则（cAIC）评价和选择最佳模型，推断稳定性类型和机制。结果表明：5种模型中Finlay-Wilkinson和AMMI-1模型的品种印楝素A和印楝素B质量分数的cAIC值最小，均分别为-17.3和-5.8；7个品种的印楝素A和印楝素B质量分数的稳定性参数大小基本一致，稳定性排序分别为Wx0423 > Wx0416 > Dhg0507 >平均木（ck）> At0515 > Ld0505 > Ww0401和平均木（ck）> Wx0416 > Wx0423 > Dhg0507 > Ld0505 > Ww0401 > At0515；品种印楝素A和印楝素B质量分数的品种效应差异显著性分别为极显著（P < 0.01）和显著（P < 0.05），证明品种印楝素A和印楝素B的稳定性随环境条件的变化会发生可预测的改变即动态稳定性，其遗传机制受遗传控制。Finlay-Wilkinson和AMMI-1适于印楝品种种子印楝素质量分数稳定性分析，而Stability Variance，Eberhart-Russell，Environmental Variance模型并不适用；品种印楝素A和印楝素B质量分数的稳定性均为动态稳定性，稳定性绝大部分依赖于个体缓冲性。多种模型分析基础上的稳定性综合评估更高效更科学。Abstract: The analysis method, type, and mechanism of the stability of azadirachtin content in neem (Azadirachta indica) cultivars were discussed in order to explores the methods to establish the stability analysis of the quality and quantity fraction of neem cultivars, and probes into the stability types and mechanisms. Based on data obtained from the mass fraction of azadirachtin in seven neem clonal seeds, the effects of five analytical models (Stability Variance, Finlay-Wilkinson, Eberhart-Russell, AMMI-1, and Environmental Variance) from the stability assessment of azadirachtin components were compared using a SAS PROC MIXED procedure. An Akaike Information Criterion (cAIC) of maximum likelihood value was also conducted to evaluate and select the optimal model and to deduce stability types and mechanisms. Seeds were collected from 6 superior cultivars (Ld0505, At0515, Ww0401, Dhg0507, Wx0423, Wx0416)of pesticide type neem and average neem (ck), and the experiment was designed with random complete block design, with 7 cultivars being one plot and 3 repetitions (plants spacing 4 m×4 m), and then azadirachtin concentrations in seed kernels were tested. The results showed that the cAIC values of azadirachtin A and azadirachtin B of Finlay-Wilkinson and AMMI-1 models were the minimum, respectively -17.3 and -5.8. The stability parameters of the mass fraction of azadirachtin A and azadirachtin B were basically the same, and the stability sequencing was Wx0423 > Wx0416 > Dhg507 > average wood (ck) > At0515 > Ld0505 > Ww0401 and average wood (ck) > Wx0416 > Wx0423 > Dhg0507 > Ld0505 > Ww0401 > At0515. The significant difference in effect between azadirachtin A and azadirachtin B was extremely significant (P < 0.01) and significant (P < 0.05), respectively. It was proved that the stability of azadirachtin A and azadirachtin B would change predictably with the change of environmental conditions, namely dynamic stability, and their genetic mechanism was controlled by heredity. Finlay-Wilkinson and AMMI-1 are suitable for the Stability analysis of the quality quantity fraction of neem seeds, while the Stability Variance, Eberhart-Russell and Environmental Variance models are not applicable. The stability of azadirachtin A and azadirachtin B was dynamic, and the stability was mostly dependent on individual buffering. The comprehensive evaluation of stability based on multi-model analysis is more efficient.
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Key words:
- forest tree breeding /
- neem(Azadirachta indica) /
- cultivars /
- azadirachtin /
- stability /
- models /
- mechanisms
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烟草Nicotiana tabacum是中国重要的经济作物之一。中国烟草种植面积高达100万hm2，烟叶产量达450~500万t·a-1，其中烟秆产量约为150万t·a-1[1]，由于管理比较粗犷，烟叶收获后大量烟秆被堆砌焚烧，不仅造成农林秸秆资源的巨大浪费，且焚烧产生的烟气对大气环境造成了严重影响。另一方面，有研究发现，中国部分烟草种植区土壤受到了不同程度的重金属污染，如贵阳和安顺镉的单项污染指数分别为1.581和1.103[2]，当烟叶中含有过量重金属时，抽吸过程中，重金属会以气溶胶或金属氧化物的形式通过主流烟气进入人体，造成潜在危害[3]；此外，连作会使重茬种植后的烟草生长迟缓、植株矮小、产量品质降低、土传病虫害加重等现象[4-5]，严重影响当地烟农的经济收益。因此，寻找一种既能解决烟秆有效利用，同时又能降低土壤重金属生物有效性，并能提高重金属污染烟田经济价值的方法尤为重要。生物质炭是富含碳的生物质在缺氧或者无氧的条件下通过高温裂解或者不完全燃烧，生成的一种含碳量大、孔隙结构复杂的固体物质[6-7]。近年来，有研究表明：生物质炭可以提高土壤肥力[8]，降低二氧化碳排放量[9]；其含有的高比表面积、孔隙结构、碱性阳离子和官能团，对重金属有良好的修复作用[10]；还可以改善土壤团聚体、降低土壤容重[11]，促进土壤微生物活性[12]，提高土壤酶活性[13]。因此，生物质炭化资源化利用不仅是低端农林废物如烟秆高值化利用的新技术途径，也是土壤学、环境科学、生态学等专业领域研究的一个重大热点。本研究利用贵州省毕节地区烟叶收获后的废弃烟秆制备成的烟秆炭改良重金属污染土壤，进行烟草种植试验，主要考察①烟秆炭对重金属污染土壤理化性质的影响；②烟秆炭对重金属污染土壤金属有效性的影响；③烟秆炭对烟叶生产及重金属质量分数的影响。希望通过本试验研究，为烟秆废弃物的炭化资源化再生使用及重金属污染土壤的修复利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试土壤采自浙江富阳朱家坞一块重金属复合污染水稻田。该采样点受到周边铜冶炼小作坊废水直排和大气沉降污染，因长期施用石灰，呈弱碱性。采样时取0~20 cm的表层土，带回实验室后剔除植物根系等杂物，风干后混匀、磨碎、过2 mm尼龙筛备用。实验用生物质炭是以贵州毕节地区烟叶收获后的废弃烟秆为原料在600 ℃下热裂解1 h制成，炭化后的产物过2 mm筛储备待用。土壤样品碱解氮、有效磷、有机质分别为132.67，13.31，63 600 mg·kg-1，pH值为pH 7.68，铜、铅、镉分别为296.66，5.91，291.39 mg·kg-1。烟秆炭的总氮、炭、氢、硫分别为20.1，597.5，32.6，3.6 g·kg-1，pH 10.51，铜、镉、铅分别为38.16，1.33，6.93 mg·kg-1，比表面积为368.92 m2·g-1，孔隙度为0.30 cm2·g-1，孔径大小为3.71 nm-1。
1.2 试验设计
盆栽试验在浙江农林大学温室大棚进行。用土4.0 kg·盆-1，烟秆炭用量按0(对照TB0), 20, 40, 80 g·kg-1[m(炭): m(土)]计算施入(分别以TB20，TB40，TB80计)，重复4次·处理-1。随机区组排列，并且隔15 d调换1次以保证每盆烟草苗生长受外界环境条件的影响基本一致。基肥选择硝酸铵、过磷酸钙和硫酸钾，用量分别为0.30, 0.80和0.30 g·盆-1，将基肥与土壤、烟秆炭充分混匀后装入塑料桶中(高32 cm，直径21 cm)。烟草种植采用直播方式，于2016年3月27日播种，苗高至10 cm时间苗，留长势一致的烟苗1株·盆-1。试验期间每天为每盆植物补充蒸馏水，使土壤含水量保持在田间最大持水量的65%左右。盆栽试验于8月6日结束。
1.3 样品采集
植物样的采集：先采收烟叶，然后将植株连根拔起，带回实验室区分根系和地上部，充分漂洗干净，待水珠自然风干后称量各部位鲜质量，然后装入牛皮纸袋105 ℃杀青30 min，60 ℃烘干至恒量，用植物粉碎机(CS-700，中国)粉碎后过0.125 mm筛，装入塑料封口袋中保存待测。
土壤样的采集：用环刀(长40 cm，直径1 cm)按梅花采样法采集盆栽土壤，采样约500 g·盆-1，充分混匀后带回实验室阴干，用行星式球磨机(QM-3SP04-1，中国)磨碎后过0.125 mm筛，转入塑料封口袋中保存待测。
1.4 样品分析
土壤pH值采用酸度计(FE20，中国)测定[m(土): m(水)= 1.0: 2.5]；有效磷测定采用Olsen法，经过0.5 mol·L-1碳酸氢钠(NaHCO3)浸提[m(土): m(水)=1: 20]，比色法测定；有机碳采用低温外热重铬酸钾氧化-比色法[14]。
土壤重金属有效态提取采用二乙三胺五乙酸(DTPA)浸提法[m(土): m(水)=1: 20)，重金属质量分数用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES，Prodigy 7，美国)测定[15]。烟叶中重金属质量分数采用硝酸(HNO3)消解，ICP-OES测定[15]。测定过程分别采用土壤(GBW07447)和植物标准物质(GBW10012)进行质量控制。
土壤脲酶的测定采用苯酚钠-次氯酸钠比色法；碱性磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法，缓冲液选柠檬酸缓冲液(pH 7.0)；脱氢酶采用TTC分光光度法。为衡量土壤酶综合活性值，对土壤氧化还原酶活性求取集合平均数，计算公式为：$ {G_{{\rm{Mea}}}} = \sqrt[3]{{脲酶活性 \times 脱氢酶活性 \times 碱性磷酸酶活性}} $[16]。
烟秆炭碳、氮、氢和硫质量分数用元素自动分析仪(Vario EL Ⅲ，德国)测定。炭比表面积由比表面积及孔隙度分析仪(SI-MP-10，美国)测定。烟秆炭官能团由傅里叶变换近红外光谱仪(FT-IR，IR Prestige 21，日本)测定。
1.5 数据分析
应用SPSS 17.0进行数据统计分析，采用单因素方差分析和Duncan's多重比较评价不同处理对土壤pH值、有效磷、碱解氮质量分数和有效态重金属质量分数等指标影响的显著性。采用Person法分析重金属有效性与土壤理化性质之间的相关性。应用Origin 8.5和Excel软件作图。
2. 结果与分析
2.1 烟秆炭的基本性状
烟秆炭主要成分是碳(≈60%)，含有少量的氮、氢、硫，pH 10.51，呈碱性，比供试土壤高2.83个单位。烟秆炭比表面积(BET)高达368.92 m2·g-1，与稻草炭(500 ℃裂解30 min，比表面积为29.97 m2·g-1)[17]和死猪炭(800 ℃裂解1 h，比表面积为29.15 m2·g-1)[18]相比有较高的比表面积，能为金属离子提供更多的吸附点位。由图 1可知：生物质炭表面含有丰富的芳香族和脂肪族官能团[19]，这些含氧官能团决定了生物质炭具有亲水、疏水性，并增强其对酸碱的缓冲能力，也是土壤pH升高的关键因素。
2.2 不同烟秆炭施用量对土壤pH值及养分质量分数的影响
表 1显示：施用烟秆炭可以显著提高土壤pH值，且随着炭施加量的增加，土壤pH值显著提高。其中处理TB80效果最为显著，与对照相比土壤pH显著提高了0.38个单位。土壤有机质的变化趋势与pH值一致(表 1)，但土壤溶解性有机碳质量分数只有在烟秆炭施加量增加到80 g·kg-1时，才呈现显著性提高(23.4%)。
表 1 不同处理下土壤pH值和养分质量分数Table 1. Soil pH and nutrient contents under different treatments处理 pH值 ω有机质/(g·kg-1) ω水溶性碳/(mg·kg-1) ω有效磷/(mg·kg-1) ω碱解氮/(g·kg-1) TB0 7.76 ± 0.06 d 29.73 ± 2.74 d 222.76 ± 16.58 b 19.71 ± 3.38 c 0.10 ± 0.003 bc TB20 7.85 ± 0.03 c 39.38 ± 2.46 c 228.51 ± 22.21 b 27.10 ± 7.66 c 0.11 ± 0.006 c TB40 7.97 ± 0.04 b 47.43 ± 7.11 b 231.26 ± 24.88 b 42.80 ± 6.76 b 0.12 ± 0.005 ab TB80 8.14 ± 0.05 a 60.08 ± 4.97 a 274.96 ± 15.49 a 67.50 ± 8.74 a 0.12 ± 0.008 a 说明：TB0为对照，英文小写字母代表同列不同处理间的显著性差异水平(P＜0.05) 另外，施用一定数量的烟秆炭也能显著增加土壤碱解氮和有效磷质量分数(表 1)。与对照相比，施加20 g·kg-1烟秆炭对土壤碱解氮和有效磷质量分数提高不明显；当施加量增加到40 g·kg-1时，土壤有效磷质量分数显著提高，当增加到80 g·kg-1时，土壤有效磷比40 g·kg-1时又增加了约60.0%；但只有将烟秆炭施加量提高到80 g·kg-1时，与对照相比土壤碱解氮质量分数才显著增加(20.0%)。
2.3 不同烟秆炭施用量对土壤重金属有效态质量分数的影响
土壤重金属有效态主要指植物有效态，它与重金属形态关系密切[20]。中国现行土壤重金属有效态的提取采用二乙三胺五乙酸(DTPA)浸提法[NY/T 890-2004]。从图 2可见：施加烟秆炭能显著降低土壤中铜、镉和铅的有效态质量分数，但不同施用量对3种重金属的钝化效果表现不同。以土壤施加40 g·kg-1的烟秆炭为分界点，施用20 g·kg-1烟秆炭就能显著降低土壤有效态铜、铅和镉质量分数，与对照相比分别下降了16.6%，18.7%和19.6%；增加炭的施用量至40 g·kg-1，土壤中有效态镉质量分数并没有持续降低，而铜和铅又显著降低了20.5%和13.2%；再提高烟秆炭的施用量至80 g·kg-1，并不能继续降低土壤DTPA可提取态铜和铅的质量分数，但是镉质量分数却显著降低了26.7%。
图 2 不同处理下DTPA有效态土壤重金属Figure 2. Concentrations of the DTPA extractable heavy metals in soils under different treatments2.4 不同烟秆炭施用量对土壤酶活性的影响
土壤酶参与碳、氮、磷、硫等各类物质的循环，是土壤新陈代谢的重要物质。土壤酶活性是反映土壤肥力和质量的重要指标。从表 2可知：土壤中施加烟秆炭会显著降低脱氢酶的活性，而一定数量的烟秆炭能显著提高土壤脲酶和磷酸酶活性。
表 2 不同烟秆炭使用量对土壤酶活性的影响Table 2. Effects of tobacco stalk biochar on soil enzymes activities under different application rates处理 脲酶/(mg·g-1·h-1) 碱性磷酸酶/(mg·g-1·h-1) 脱氢酶/(mg·g-1·h-1 土壤酶综合活性值 TB0 13.83 ± 0.41 c 0.67 ± 0.52 b 0.36 ± 0.08 a 1.49 c TB20 16.54 ± 1.75 b 0.96 ± 0.72 ab 0.25 ± 0.12 b 1.58 b TB40 16.93 ± 3.81 b 0.97 ± 0.74 ab 0.23 ± 0.04 b 1.56 b TB80 20.49 ± 3.06 a 1.50 ± 1.12 a 0.21 ± 0.03 b 1.86 a 说明：英文小写字母表示同列不同处理间的显著性差异水平(P＜0.05) 具体讲，土壤施加20 g·kg-1烟秆炭，脲酶活性显著提高了19.6%，但将烟秆炭的施用量增加到40 g·kg-1，并没有继续提高土壤脲酶活性(表 2)，只有将施用量增加到80 g·kg-1时，土壤脲酶活性才显著又提高了21.0%，与对照相比约显著提高了50%。土壤施加20 g·kg-1或40 g·kg-1的烟秆炭，并不能显著提高土壤磷酸酶活性，但将炭的施用量提高到80 g·kg-1时，土壤磷酸酶活性与对照相比显著提高了2倍多。但是施加80 g·kg-1烟秆炭，土壤磷酸酶活性与施加20和40 g·kg-1烟秆炭的土壤磷酸酶活性对比没有显著性差异。烟秆炭的施用会降低土壤脱氢酶的活性，不同比例烟秆炭施用对土壤脱氢酶活性也没有显著性差异。
因此，不同烟秆炭施用量处理对土壤酶活性综合性指标的影响效果为TB80＞TB40=TB20＞TB0。综上所述，处理TB80对土壤酶活性影响最为显著。
2.5 土壤理化性质对土壤重金属有效态的影响
由于重金属本身的化学性质各异且在土壤中存在的形态也不同，土壤理化性质对重金属有效态质量分数影响各不相同。从表 3中可知：烟秆炭施用量与铜、铅有效态质量分数呈负相关关系，其中与镉呈显著负相关关系，说明烟秆炭施用量对降低有效态镉效果更好。土壤基本理化性质如pH值和有机质、水溶性碳、碱解氮和有效磷质量分数与土壤有效态重金属铜、镉、铅均呈负相关关系。土壤有机质质量分数与有效态镉呈极显著负相关关系，pH值、有效磷质量分数与有效态镉呈显著负相关性，表明土壤有机质对镉的钝化作用比土壤pH值、有效磷质量分数大。有效态铅与有效态铜呈显著正相关性，表明土壤中铜与铅具有伴生性关系[21]。
表 3 土壤重金属有效态与烟秆炭施用量及土壤理化性质的相关性分析Table 3. Correlation between soil DTPA-extractable heavy metals and soil physical and chemical properties炭施用量 有效磷 水溶性碳 有机质 pH值 碱解氮 镉 铅 铜 -0.88 -0.86 -0.66 -0.92 -0.90 -0.74 0.91 0.99* 镉 -0.98* -0.96* -0.89 -0.99** -0.98* -0.81 1.00 0.95 铅 -0.90 -0.871 -0.71 -0.94 -0.92 -0.71 0.95 1.00 说明: *表示P＜0.05(双尾检测)；**表示P＜0.01(双尾检测) 2.6 不同烟秆炭施用量对烟草生长及烟叶重金属质量分数的影响
由表 4可见：施用烟秆炭对烟草生长各农艺指标影响各异。土壤施加烟秆炭能显著增加烟草有效叶数和叶片的宽度，但不同比例炭施用量对烟草株高和叶片的长度并没有显著影响。不同的是，烟叶鲜质量随生物炭施用量的增加而显著增加。20，40和80 g·kg-1的烟秆炭施用量收获的烟叶鲜质量分别比对照显著提高了45.0%，47.1%和61.2%。
表 4 不同烟秆炭施用量对烟草农艺指标的影响Table 4. Effects of different tobacco biochar application rates on agronomic indexes of tobacco stems处理 茎高/cm 有效叶数/片 叶宽/cm 叶长/cm 鲜叶质量/g TB0 87.25 ± 3.20 a 15.00 ± 0.00 b 16.00 ± 1.41 b 36.25 ± 2.36 a 85.00 ± 10.98 c TB20 95.75 ± 5.56 a 16.25 ± 0.96 a 19.75 ± 2.22 a 41.00 ± 4.08 a 119.00 ± 11.05 b TB40 94.00 ± 8.37 a 16.25 ± 0.96 a 22.25 ± 3.77 a 40.00 ± 3.46 a 125.00 ± 10.07 ab TB80 95.75 ± 4.35 a 16.25 ± 0.50 a 20.38 ± 1.10 a 41.13 ± 1.93 a 137.00 ± 5.72 a 说明：同列数字后面英文小写字母表示不同处理间差异性水平(P＜0.05) 烟叶是烟草的重要经济部位，叶片中重金属质量分数是衡量烟叶品质的重要指标。从图 3可见：土壤添加一定量的烟秆炭可以显著降低烟叶中重金属质量分数，其中铜和镉的变化趋势相似。在土壤施加20 g·kg-1的烟秆炭时，叶片中铜和镉的质量分数比对照(无烟秆炭添加)显著降低了13.6%和18.4%；烟秆炭施用量增加到40 g·kg-1时，与20 g·kg-1相比，烟叶中铜、镉的质量分数没有显著变化；但当烟秆炭的施用量继续增加到80 g·kg-1时，与烟秆炭低施用量(20和40 g·kg-1)相比，叶片中铜和镉质量分数反而显著上升了。与对照相比，随着土壤施加烟秆炭的量的增加，烟叶中铅质量分数有下降趋势，但各处理间并没有显著差异。
图 3 不同处理对烟叶中重金属的影响Figure 3. Effects of different treatments on concentration of heavy matals in leaves on tobacco3. 讨论
3.1 烟秆炭对重金属污染土壤pH值及营养元素的影响
本研究中，施用烟秆炭可显著提高土壤pH值。原因可能归结为烟秆炭在高温裂解过程中，其灰分含有大量碱性盐基物质，当施入土壤后，盐基离子与氢离子(H+)及铝离子(Al3+)进行离子交换，生成中性盐，从而提高土壤pH值[21]。从表 1可知：使用烟秆炭可有效提高土壤养分质量分数。本研究结果表明：添加烟秆炭对提高土壤有机质质量分数有显著效果，且随着炭施用量的增加有机质显著增加。原因可能是烟秆炭本身炭质量分数高、氢/碳比小、芳香性强，化学稳定性较高，不易被微生物分解，从而有利于有机质的积累。
本研究结果显示：施入烟秆炭后，土壤有效磷、碱解氮和水溶性有机碳均比对照高。虽然土壤碱解氮质量分数显著提高，但是增幅不大。这可能是由于烟秆炭表面丰富的含氧官能团带有负电荷，吸附土壤铵(NH4+)，从而减少了氮素的损失[22]。有机质是作物所需氮、磷等必要营养元素的主要来源，土壤有效磷质量分数增加可能与有机质质量分数有关。刘方等[23]以生物质炭土壤改良剂为试材，研究了生物质炭对连作蔬菜地土壤有效养分影响的实验中发现，生物质炭能明显提高土壤有效氮和有效磷的质量分数。这与本研究结果相似。
3.2 烟秆炭对重金属污染土壤有效态重金属的影响
重金属的生物有效性大小决定着其在土壤中毒性的强弱，因此，降低重金属的生物有效性对于改善土壤质量至关重要[19]。生物质炭具有较大的比表面积和多孔的结构特征，具有良好的吸附特性，施入土壤后可以降低重金属有效性[24]。本研究结果表明：重金属有效态质量分数随着烟秆炭施加量的增加而显著减少。且烟秆炭对不同重金属的修复效果也不尽相同，处理TB40对铜、镉、铅的固定效果顺序为铜(33.7%)＞铅(29.5%)＞镉(26.4%)。JIANG等[25]采用水稻秸秆制成的生物质炭修复模拟铜、铅、镉污染老成土，结果发现：生物质炭使土壤pH值和阳离子交换量增大，使酸可提取态重金属含量降低，而氧化结合态和有机结合态含量增加，且生物质炭对铜和铅的固化效果优于镉，与本研究结果相似。这可能是生物质炭对铜离子(Cu2+)吸附机制不同于镉离子(Cd2+)和铅离子(Pb2+)的，还有可能是生物质炭表面的孔隙结构有利于铜的固定，具体机制还需进一步深入研究。YANG等[26]在使用烟秆炭修复镉、锌污染土壤的实验中发现，与对照相比，烟秆炭可以显著降低重金属镉、锌的有效态含量，且其固定效果随着烟秆炭施用量的增加而增强。有研究表明，有效磷在中性或碱性条件下易与土壤溶液中的重金属离子形成磷酸盐沉淀[27]。其次，pH值是影响土壤重金属有效性和迁移性的重要因素。土壤pH值随着炭施用量的增加可增加土壤及生物质炭表面的可变电荷，增强阳离子吸附能力和交换作用，降低重金属的解吸，还可促进重金属生成碳酸盐和磷酸盐沉淀[28]进而降低重金属的移动性。此外，有机质对重金属也表现出强烈的吸附固定能力，原因是有机质的主要成分是腐殖质，腐殖质是土壤重要的螯合或络合剂，其中羧基(—COOH)，羟基(—OH)和羰基(—C=O)等能与重金属发生络合或螯合作用，使重金属在土壤溶液中失去活性[29]。
3.3 烟秆炭对重金属污染土壤酶活性的影响
土壤酶活性可以反映土壤中生物化学反应的活跃程度以及养分物质循环状况，是衡量土壤质量的重要指标[30]。土壤有机质、pH值、养分及微生物种类等因素均可影响土壤酶活性。
脲酶是参与土壤氮素循环的重要的水解酶，主要功能是催化土壤中尿素的水解，其活性强度常被用来表征土壤氮素供应状况[30]。本研究中，土壤脲酶活性与烟秆炭施用量密切相关。随着烟秆炭施用量的增加，脲酶活性有升高的趋势，其中处理80 g·kg-1的脲酶活性最高(20.49 mg·g-1·h-1)。碱性磷酸酶参与土壤中磷的矿化和利用，主要功能是在碱性条件下将土壤中的有机磷水解成为磷酸盐，为植物和土壤中的生物提供养分[31]。本研究结果显示：施加烟秆炭可增强重金属污染土壤中碱性磷酸酶的活性。原因可能是烟秆炭施入土壤可以改善土壤理化环境，有利于土壤动物和微生物生长，从而加快了有机物质的分解，为土壤酶的产生提供了更多的底物[32]；还有可能是由于烟秆炭的施用增加了土壤活性有机碳质量分数(表 1)，从而为土壤微生物的生长提供了充足的碳源，促进了微生物繁殖，刺激了酶活性提高[33]。
生物质炭的吸附性使得生物质炭对土壤酶的作用比较复杂，一方面生物质炭对反应底物的吸附有助于酶促反应的进行而提高土壤酶活性，另一方面生物质炭对酶分子的吸附对酶促反应结合位点形成保护，而阻止酶促反应的进行[32]。脱氢酶活性能反映土壤有机质含量和微生物活性[34]。本研究结果显示：土壤脱氢酶活性随着烟秆炭的增加而显著减少。冯爱青等[35]研究表明：施用控释肥及添加生物炭可提高土壤脲酶活性，抑制土壤脱氢酶活性。原因可能是在强碱性条件下脱氢酶的蛋白构象遭到了破坏进而影响酶活性[36]。具体原因还需进一步深入研究。
3.4 烟秆炭对烟叶产量和重金属质量分数的影响
生物质炭施入重金属污染土壤中可以有效增加作物的产量。原因是生物质炭施入土壤后可以增加土壤有效养分[8]，促进微生物活性并改善土壤团聚体结构[11]，降低重金属的生物有效性[28]，从而为作物提供良好的生长环境。本研究结果表明，烟秆炭的施用可以提高烟叶产量，与众多研究结果相似[37-38]。
植物中重金属含量由土壤中重金属有效态含量及植物生理性质决定。植物体蛋白质、有机酸、有机碱及植物络合素、酶可以与植物体内的重金属形成螯合物，降低重金属的生物毒性[39]。在本研究中，适量添加烟秆炭可以降低叶片中重金属质量分数。原因可能是添加烟秆炭后降低了土壤中有效态重金属的质量分数。高瑞丽等[24]研究发现，在铅和镉复合污染土壤中添加生物质炭可显著减少有效态重金属的含量，与本实验研究结果相似。而处理TB80叶片中铜和镉质量分数却比处理TB20和TB40有所增加。原因可能是TB80的叶片生物量高，植物体中的蛋白质、有机物及植物络合素与重金属形成络合素，减轻了重金属对细胞的毒害作用，从而使烟草可以继续吸附重金属。此外，植物蒸腾作用和势能高于处理TB20和TB40，导致重金属质量分数升高。另有研究指出，不同重金属在植物不同器官的迁移能力不同[40]，这可能是铅在各处理间没有显著差异的原因，但具体的作用机制还需进一步研究。
4. 结论
综上所述，烟秆炭的施用可有效提高重金属污染土壤中pH值、有机质、碱解氮和有效磷质量分数；还可以显著提高土壤脲酶和碱性磷酸酶的活性，降低脱氢酶的活性，其中添加80 g·kg-1的烟秆炭对土壤肥力的改善及酶活性指数的提升最为显著。另外，土壤施加烟秆炭能显著增加烟草有效叶数和叶片的宽度，烟叶鲜质量随烟秆炭施用量的增加而显著增加。
烟秆炭的施用可以降低污染土壤中重金属的生物有效性，施加40 g·kg-1烟秆炭已使铜、铅的钝化效果达到最佳，但80 g·kg-1的烟秆炭使污染土壤中镉的有效性降至最低。但是，施用20 g·kg-1的烟秆炭即可显著降低烟叶中重金属铜和镉的质量分数。
本研究证明，烟秆炭作为土壤改良剂对重金属污染土壤有着良好的修复效果，且可提高重金属污染土壤中烟草的产量，提高污染农用地的经济价值，同时为因烟秆废弃而造成的环境污染等问题提供了一个合理的解决方案，也为烟秆炭在重金属污染农田中的修复提供了实践理论参考价值。
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表 1 针对品种-环境处理均值数据5种稳定性分析模型的SAS程序编码
Table 1. Syntax for the SAS commands to fit 5 stability analysis models for cultivar-environment treatment mean data
模型 语句* 5种模型 proc mixed data=sasuser.wdxazA或sasuser.wdxazB或sasuser.wdxazABscoring= 20; class G E；model T=G/ddfm= satterthwaite； 模型 语句 Stability Variance模型 random int/ sub= E；repeated G/ sub= E type= un(1)；run； Finlay-Wilkinson模型 repeated G/ sub= E type= FA1(1)；run； Eberhart-Russell模型 repeated G/ sub= E type= FA(1); run; AMMI-1模型 random int/ sub= E; repeated G/ sub= E type= FA1 (1); run; Environmental Variance模型 repeated G/ sub= E type= un; run; 说明：*本行所列语句应出现在其他语句之前 
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表 2 品种-环境组合处理均值的描述统计
Table 2. Description statistics of cultivar-environment combination process
试验 印楝素A/(mg·g-1) 环境指数 环境指数离差 Ww0401 Dhg0507 Wx0416 Wx0423 Ld0505 At0515 ck 元阳 6.5 6.5 5.5 6.3 8.6 7.1 4.5 -5.25 0.01 元江 7.0 6.6 5.9 6.4 7.8 7.3 5.0 -5.24 0 元谋 7.1 7.0 5.5 6.0 8.2 7.8 4.9 -5.23 -0.01 平均值 6.9 6.7 5.6 6.2 8.2 7.4 4.8 -5.24 - 方差 0.001 0 0.000 7 0.000 5 0.000 4 0.001 6 0.001 3 0.000 7 - - 标准误/% 3.21 2.65 2.31 2.08 4.00 3.61 2.65 - - 平均标准误比数ai 1.10 0.90 0.79 0.71 1.37 1.23 0.90 - - 试验 印楝素B/(mg·g-1) 环境指数 环境指数离差 Ww0401 Dhg0507 Wx0416 Wx0423 Ld0505 At0515 ck 元阳 2.2 1.4 1.0 1.1 2.4 2.1 0.9 -1.19 -0.01 元江 1.8 1.4 0.9 1.0 2.5 2.4 0.9 -1.19 -0.01 元谋 1.4 1.3 1.0 1.0 2.3 1.6 0.9 -1.21 0.01 平均值 1.8 1.4 1.0 1.0 2.4 2.0 0.9 -1.20 - 方差 0.001 6 0 0 0 0.000 1 0.001 6 0 - - 标准误/% 4.00 0.58 0.58 0.58 1.00 4.04 0 - - 平均标准误比数ai 2.60 0.38 0.38 0.38 0.65 2.63 0 - - 试验 印楝素AB/(mg·g-1) 环境指数 环境指数离差 Ww0401 Dhg0507 Wx0416 Wx0423 Ld0505 At0515 ck 元阳 8.7 7.9 6.5 7.4 11.0 9.2 5.3 -6.43 0 元江 8.8 8.0 6.8 7.4 10.3 9.7 5.7 -6.42 0.01 元谋 8.5 8.3 6.5 7.0 10.5 9.4 5.8 -6.43 0 平均值 8.7 8.1 6.6 7.3 10.6 9.4 5.6 -6.43 - 方差 0.000 2 0.000 4 0.000 3 0.000 5 0.001 3 0.000 6 0.000 7 - - 标准误/% 1.53 2.08 1.73 2.31 3.61 2.52 2.65 - - 平均标准误比数ai 0.65 0.89 0.74 0.98 1.54 1.07 1.13 - - 说明：-表示该项不存在
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表 3 不同分析模型的稳定性参数估计结果
Table 3. Parameter estimates of cultivar variability for different analysis models
试验 模型 不同品种稳定性参数 Ww0401 Dhg0507 W>0416 W>0423 Ld0505 At0515 ck Stability Variance 0.000 77 0.003 05 0.003 15 0.007 43 0.023 03 0.004 24 0.000 28 Finlay-W ilkinson 0.074 64 0.045 58 0.021 00 -0.018 95 -0.074 26 0.066 96 0.058 51 印楝素A Eberhart - Russell 0.073 75 0.032 27 0.036 87 -0.004 61 -0.092 19 0.050 70 0.064 53 AMMI-1 0.074 64 0.045 58 0.021 00 -0.018 95 -0.074 26 0.066 96 0.058 51 Environmental Variance - - - - - - - Stability Variance - - - - - - - Finlay-Wilkinson 0.216 90 0.035 28 -0.016 34 0.018 94 0.051 62 0.225 40 -2.19E-8 印楝素B Eberhart-Russell - - - - - - - AMMI-1 0.216 90 0.035 27 -0.016 34 0.018 94 0.051 61 0.225 40 -5.64E-6 Environmental Variance - - - - - - - Stability Variance - - - - - - - Finlay-Wilkinson 1.29E-19 0.016 00 0.019 02 -0.012 87 -0.060 47 0.038 14 0.041 45 印楝素AB Eberhart-Russell 0.020 26 -0.005 06 0.030 39 0.020 26 -0.045 58 0.040 52 0.015 19 AMMI-1 4.4E-20 0.016 00 0.019 02 -0.012 87 -0.060 47 0.038 14 0.041 45 Environmental Variance - - - - - - - 说明：-表示该项不存在
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表 4 不同分析模型F检验的结果
Table 4. F test of cultivar based on different analysis models
试验 NDF 模型 Stability Variance Finlay-Wilkinson Eberhart-Russell AMMI-1 Environmental Variance DDF F P DDF F P DDF F P DDF F P DDF F P 印楝素A 6 10.2 172.90 < 0.000 1 2.55 85.77 0.004 3 2.01 273.91 0.003 6 2.55 85.77 0.004 3 - - - 印楝素B 6 - - - 2.18 55.59 0.013 3 - - - 2.18 55.59 0.013 3 - - - 印楝素AB 6 - - - 2.20 275.19 0.002 2 2.36 706.66 0.000 5 2.20 275.19 0.002 2 - - - 说明：NDF(Num DF)和DDF(Den DF)分别为F检验的第1自由度和第2自由度。-表示该项不存在
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表 5 不同稳定性分析模型的cAIC值
Table 5. cAIC values of different stability models (smaller cAIC value indicates better fitting models)
试验 模型 Stability variance Finlay-Wilkinson Eberhart- Russell AMMI-1 Environmental variance 印楝素A -12.5 -17.3 -12.5 -17.3 - 印楝素B - -5.8 - -5.8 - 印楝素AB - -34.4 -17.3 -34.4 - 说明：-表示参数寻优未达到收敛
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链接本文:
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