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换锦花Lycoris sprengeri为石蒜科Amaryllidaceae石蒜属Lycoris球根植物，多为红色与蓝紫色的复色，具有较高的观赏价值，常用作园林造景花卉。植物花色呈色的主要成分由花色苷、类胡萝卜素和甜菜色素组成，其中花色苷是最重要的一种类黄酮化合物[1]。花色苷以2-苯基苯并吡喃型阳离子为苷元，沿类黄酮修饰途径衍生出3种类型，即天竺葵素(橙色)、矢车菊素(红色)和飞燕草素(蓝紫色)，其他花色苷均由此3种类型衍生而来[2-3]。不同种类与数量的花色苷在细胞液泡中的积累与储藏使植物组织表现出不同的颜色，而哪种色素含量越高，花瓣的颜色越偏向该色素，其他色素则起辅色作用[4]。研究发现可采用二极管阵列-高效液相色谱-电喷雾离子阱飞行时间串联多级质谱仪(HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn)、液质联用仪(HPLC-MS)和高效液相色谱仪(HPLC-DAD)等能够准确测定植物花色苷的主要成分，加快植物花色苷成分对花色呈色的研究。韩雪等[5]利用(HPLC-DAD-ESI/IT-TOF/MSn)从6种不同蓝莓Vaccinium品种鉴定出13种花青素类化合物。刘雨佳等[6]应用HPLC-MS和HPLC-DAD鉴定出矢车菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-芸香糖苷和天竺葵素-3-丙二酰葡萄糖苷为“法兰地”草莓Fragaria ananassa ‘Falandi’果实中主要花色苷成分，并认为温度、光照和pH值均会对草莓果实花色素苷有一定的影响。HU等[7]比较超声处理和常规溶剂萃取处理蓝莓果渣中主要花色苷为锦葵色素-3-半乳糖苷。近年来对铁皮石斛Dendrobium officinale[7-8]、风信子Hyacinthus orientalis[4]、红色菊苣Cichorium intybus[8-9]、蓝莓[9-11]、玫瑰Rosa rugosa[12]等观赏或药用植物的研究发现：花色苷具不稳定性，花朵颜色除了受内部组成色素的影响外，可能还受到光、热、pH及金属离子等理化因子的影响[13-14]。换锦花花色丰富，变化多样，但鲜有对换锦花花色呈色的花色苷成分和花色变化的影响因素的研究报道。为了进一步探索换锦花花色苷主要成分及花色变化的影响因素，本研究利用紫外分光光度法和HPLC-DAD技术分析换锦花花色苷的主要成分，并分析温度、光照、pH和金属离子等理化因素对换锦花花色苷稳定性和主要成分的影响，旨在为研究换锦花花色变化的机制和换锦花花色品种选育奠定基础。
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换锦花种植于浙江农林大学遗传学科石蒜属植物种质资源圃，于2018年8月中下旬采集换锦花盛花期花瓣。
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将换锦花花瓣于避光冻干7 d后，研磨成粉末，干燥器避光保存备用。精密称量换锦花花瓣干粉末0.040 0 g，加入2 mL体积分数为1%甲醇-盐酸提取液摇匀，密塞，20 ℃超声波提取30 min，12 000 r·min−1离心15 min，收集上清液，0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液于−20 ℃冰箱保存备用，重复3次。
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HPLC分析：使用Agilent1 200高效液相色谱系统，色谱柱Agilent Eclipse-plus C18柱(150 mm×3.0 mm，1.8 μm)，柱温40 ℃。流动相(体积分数)由A(0.1%甲酸水溶液)和B(100%乙腈)组成，流动相洗脱梯度：0 min，98.0% A；1.0 min，98% A；5.0 min，60% A；12.0 min，30% A；15.0 min，5% A；20.0 min，5% A。流动相流速为0.40 mL·min−1，样品上样量为1.00 μL。在520 nm处检测换锦花花瓣总花色苷质量分数，并以标准品半定量法进行定量。质谱检测：使用安捷伦6545 Q-TOF质谱检测器全扫描模式记录质荷比为50~1 000的数据，扫描谱图速度为2张·s−1。电喷雾(ESI)离子源使用正极和负极2种离子化模式，毛细管电压为3.5 kV，喷头电压正离子模式时为500 V，负离子模式时为1 500 V，碰撞电压110 V，喷雾器压强310 kPa，鞘气流速为8 L·min−1。采集二级质谱时的碰撞电压(CID)分别为10、20和40 V。
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利用紫外分光光度计对换锦花花色苷粗提液在波长为400~600 nm范围内扫描，确定花色苷的最大吸收波长。采用pH示差法测定换锦花提取液中的花色苷含量[15]。分别用pH 1.0的盐酸-氯化钠缓冲液和pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液将换锦花提取液稀释2倍，在510和700 nm处测定吸光度[D(510)和D(700)]，根据公式D=[D(510)−D(700)]pH 1.0−[D(510)−D(700)]pH 4.5，C=(A×M×DF×Ve)/(ε×0.576 793)和花色苷主要成分质量分数(mg·g−1)=C×Ve×n×M/(ε×m)分别计算吸光度D、提取液中总花色苷质量分数C[用矢车菊素-3-葡萄糖苷(CGE)质量分数表示(mg·g−1)]和花色苷主要成分质量分数。其中：M为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量(449.2 mg·mol−1)；DF为换锦花花瓣提取液稀释倍数；Ve为换锦花提取液总体积(L)；ε为摩尔吸光系数(29 600 L·mol−1)；0.576 793为比色皿光路直径(cm)；m为样品质量(g)。
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采用Eclipse-plus-C18 column (4.6 mm×250.0 mm，5 µm)，流动相为甲醇(A)-1%甲酸水(B)，梯度洗脱：0~20 min(A：5%~60%)，20~25 min(A：60%~100%)，25~30 min(A：100%~100%)，流速1 mL·min−1，检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量10 µL。以质量浓度为0.1 g·L−1的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和飞燕草素-3-O-葡萄糖苷标准液做为标准品。
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将换锦花花色苷提取液配成适当比例的溶液，通过紫外分光光度法分别检测温度和光照对换锦花花色苷溶液稳定性的影响。测定配好的换锦花花色苷提取液在各自检测波长下的吸光度，作为初始吸光度D0。恒温培养箱设定30、40、50、60、70 ℃共计5个温度梯度作单因素处理。待测样品提取液于避光环境在各温度条件下隔1 h测定1次，连续监测6 h，取出后快速恢复至室温，测定并且记录吸光度(D)的变化情况，重复3次。
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测定配好的花色苷提取液在各检测波长下的吸光度，作为初始吸光度D0。设置3种光源：①自然光[室内向阳窗台温度(29.5±0.5) ℃]；②日光灯光照度(3 680±81) lx，温度(24.5±0.5) ℃；③避光处理，温度(24.5±0.5) ℃；隔1 h取样1次，连续监测6 h，测定记录吸光度(D)的变化情况，重复3次。
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取1.8 mL换锦花花色苷提取液分别加入氢氧化钠或盐酸溶液，使花色苷溶液形成不同pH梯度：pH为1.0~13.0，梯度间隔为1。观察花色苷提取液颜色的变化，记录吸光度，重复3次。
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取1.8 mL换锦花花色苷提取液分别加入不同浓度金属离子缓冲液至2.0 mL，混匀，观察反应液颜色变化后避光平衡2 h。在400~600 nm内，采样间隔2 nm扫描，确定最大吸收峰以及对应的吸光度。所用金属离子分别为Fe3+、Fe2+、Ca2+、Al3+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、K+，各溶液的离子最终浓度为0、0.001 0、0.005 0、0.010 0、0.050 0、0.100 0 mol·L−1，重复3次。
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在不同的理化因素(温度、光照、pH、金属离子浓度)处理下的溶液按照1.3.4的条件进行HPLC分析，重复3次。
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采用Origin 8.0软件进行数据整理和绘图，采用中药色谱指纹图谱软件进行HPLC数据整理和分析。
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对换锦花花瓣代谢组分析可知：换锦花花瓣中花色苷元成分的种类及其具体含量(表1)，其中主要为矢车菊素(cyanidin)、飞燕草素(delphinidin)和天竺葵素(pelargonidin)三大类，而葡萄糖苷是主要的花色苷苷元，因此选择矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和飞燕草素-3-O-葡萄糖苷为标准品，利用HPLC检测换锦花花色苷在不同理化因素下3种成分及质量浓度的变化规律。
表 1 换锦花花瓣花色苷类化合物成分
Table 1. Anthocyans composition of L. sprengeri petals
编号 化合物名称 峰面积 苷元类型 1 矢车菊素3-O-葡萄糖苷 cyanidin-3-O-glucoside 64.32 矢车菊素cyanidin 2 矢车菊素双葡萄糖苷 cyanidin3, 5-diglucoside 22.92 3 矢车菊素-3-芸香糖苷 cyanidin-3-rutinoside 16.50 4 矢车菊素-3-桑布双糖苷 cyanidin-3-sambubioside 14.05 5 矢车菊素-3-鼠李糖苷 cyanidin-3-rhamnoside 11.74 6 矢车菊素-3-阿拉伯糖苷 cyanidin-3-arabinoside 6.62 7 矢车菊素-3-苦甙-5-鼠李糖苷 cyanidin-3-sophroside-5-rhamnoside 4.07 8 矢车菊素-3-O-[(4-羟基-E-肉桂酰)-(6)-D-吡喃葡萄糖苷] cyanidin-3-O-
[(4-hydroxy-E-cinnamoyl)-(6)-D-glucopyranoside]1.34 9 飞燕草素-3-O-葡萄糖苷 delphinidin-3-O-glucoside 33.17 飞燕草素delphinidin 10 飞燕草素-3-O-(6''-O-α-鼠李吡喃糖基-β-吡喃葡萄糖苷delphinidin-3-O-
(6''-O-alpha-rhamnopyranosyl-beta-glucopyranoside)16.19 11 飞燕草素-3-桑布双糖苷 delphinidin-3-sambubioside 9.35 12 飞燕草素双葡萄糖苷 delphinidin-3, 5-diglucoside 3.66 13 飞燕草素-3-O-芸香糖苷-5-O-葡萄糖苷 delphinidin-3-O-rutinoside-5-O-glucoside 0.12 14 天竺葵素 pelargonidin 15.55 天竺葵素pelargonidin 15 芍药花素双葡萄糖苷 peonidin-3, 5-diglucoside 11.08 芍药花素 peonidin 16 矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷 petunidin-3-O-glucoside 3.29 矮牵牛素 etunidin -
根据pH式差法计算换锦花花色苷质量分数为3.56 mg·g−1。经扫描换锦花花色苷提取液的吸收波长为400~600 nm，最大吸收峰为530 nm，因此，选用530 nm为换锦花花色苷的最大吸收波长(λvis max)。
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在不同温度下，换锦花花色苷提取液吸光度随时间的变化呈现先上升后下降的趋势(图1A)。在30~70 ℃中水浴1 h后，换锦花花色苷吸光度均显著上升，且温度为30 ℃时，随着加热时间的延长，花色苷吸光度继续上升到5 h以后开始降解，比原花色苷溶液吸光度提升22.17%，而40~70 ℃则是随着温度的升高以及加热时间的延长，花色苷的降解速率逐渐加快，提取液的吸光度[D(530)]比处理1 h时的吸光度分别降低了6.02%、4.75%、5.80%、9.91%。因此，不同的温度对换锦花花色苷稳定性的影响呈现一定变化规律，低温下且升温时间短时，花色苷比较稳定，且有提高花色苷质量浓度的趋势，可能是花色苷溶液在低温条件下稳定，且对花色苷有一定的增色作用。随着温度的升高和加热时间的延长，其吸光度显著下降，砖红色溶液逐渐变淡，可能是高温破坏花色苷结构引起花色苷物质褪色的原因[16]。
图 1 温度和光照对换锦花总花色苷稳定性的影响
Figure 1. Effects of temperature and light on the stability of anthocyanin in L. sprengeri
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光照方式和光照时间长短对换锦花花色苷稳定性有一定影响。不同光照处理的换锦花花色苷的吸光度随着光照时间的延长均呈下降趋势(图1B)，日光灯照射下换锦花花色苷提取液吸光度下降最快，花色苷提取液颜色变淡。日光灯和自然光照相比，避光保存花色苷提取液的吸光度变化不显著。避光、自然光、日光灯条件下换锦花花色苷的吸光度比原提取液吸光度分别下降3.57%、6.85%、11.25%。换锦花花色苷提取液在3种光照下的稳定性从强到弱依次为避光、自然光、日光灯，符合花色苷类色素对光敏感且稳定性差的特征[17]。
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研究结果表明：换锦花花色苷提取液的颜色和吸光度受pH的影响较大。pH≤3.0时，换锦花花色苷提取液为红色，溶液吸光度较高。花色苷主要以二苯基苯并吡喃阳离子的结构存在。当pH近中性时，溶液颜色接近无色，花色苷提取液的吸光度逐渐降低，这时花色苷主要以无色的查尔酮结构存在。在碱性条件下(pH≥7.0)，花色苷提取液颜色逐渐变成蓝色，最后变为黄色，提取液的吸光度随着pH增大而逐渐升高。当pH≥11.0后，提取液吸光度又逐渐下降(图2A和图2B)，花色苷中的酚类物质生成性质活泼的醌，主要以蓝色醌式结构存在[18-19]，所以提取液颜色开始向蓝黄色转变。
图 2 pH对换锦花花色苷提取液颜色和吸光度的影响
Figure 2. Effects of pH value on color and absorbance value of anthocyanins in L. sprengeri
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不同金属离子对花色苷的稳定性影响不同(图3)。大部分高浓度金属离子可破坏花色苷的结构。Fe3+、Ca2+、Al3+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、K+ 等7种金属离子对花色苷稳定性的影响趋势基本一致，当浓度＜0.001 mol·L−1时，花色苷吸光度随金属离子浓度的增大而增大，当浓度＞0.001 mol·L−1后，其吸光度逐渐下降且逐渐稳定；但Al3+、Fe3+、Cu2+均可引起换锦花花色苷溶液的变色现象。随着Al3+浓度增加，花色苷溶液颜色由粉红色变为淡橙色；随着Fe3+浓度增加，花色苷溶液颜色逐渐向橙黄色过渡，最终转为黄褐色；随着Cu2+浓度增加，花色苷溶液颜色由红色逐渐转为亮蓝色。Ca2+、Zn2+、Mg2+和K+使花色苷提取液颜色保持不变，但随着金属离子浓度增高，花色苷溶液颜色变浅。换锦花花色苷吸光度则随着Fe2+浓度的增加不断增加，且花色苷溶液的颜色随着Fe2+浓度增加颜色逐渐加深变为橙黄色。
图 3 金属离子对换锦花花色苷提取液颜色和吸光度的影响
Figure 3. Effect of metal ions on color and absorbance value of anthocyanins in L. sprengeri
8种金属离子在0~0.01 mol·L−1浓度范围内对换锦花花色苷增色效应明显，能够帮助稳定花色苷的构型[20-21]。图3中能明显能看出Fe2+离子对花色苷提取液的影响最大，对花色苷的增色作用随着离子浓度的增加而加强，可能是因为花色苷具有邻位羟基结构，能够和金属离子形成螯合物[22]，且这种螯合物的稳定性高于花色苷，一旦生成不易逆转，从而影响花色苷的稳定性。其他几种金属离子随着浓度的增加，对换锦花花色苷皆有一定的破坏作用。所以，一定浓度金属离子对花色苷有正向增色作用，但仍应尽量避免花色苷与高浓度金属离子接触。
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基于代谢组分析结果，选择矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和飞燕草素-3-O-葡萄糖苷为标准品，换锦花花色苷中这3种成分的质量分数分别为2.95、0.41和0.42 mg·g−1。图4A为换锦花花色苷提取液在280 nm处的HPLC色谱图，得到矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和飞燕草素-3-O-葡萄糖苷峰面积及其具体出峰时间。利用Formula Predictor 4.2软件对3种不同的花色苷结构进行检索，得到矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和飞燕草素-3-O-葡萄糖苷苷元结构(图4B)。
图 4 换锦花花色苷提取液HPLC色谱图及成分结构
Figure 4. HPLC chromatogram and specific compositions structure of anthocyanin extract in L. sprengeri
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换锦花3种花色苷随着温度的升高和时间的延长呈现不同的变化趋势(图5)，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质量分数逐渐降低、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷质量分数逐渐上升、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷质量分数变化不明显，与提取液颜色变化趋势一致。花色苷提取液于30~70 ℃处理6 h后，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质量分数分别降低了20.11%、43.99%、41.65%、56.57%、71.85%。相同条件下，30~60 ℃时天竺葵素-3-O-葡萄糖苷质量分数比对照分别提高了150.42%、352.80%、502.74%、393.02%。花色苷提取液颜色由砖红色逐渐变为橙红色，可能是由于温度升高导致矢车菊素-3-O-葡萄糖苷失去1个羟基基团而转变为1个羟基基团的天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，在70 ℃ 2 h后天竺葵素-3-O-葡萄糖苷质量分数急剧下降，可能是高温破坏了天竺葵素-3-O-葡萄糖苷结构；飞燕草素-3-O-葡萄糖苷质量分数变化不明显，可能由于飞燕草素-3-O-葡萄糖苷的结构中有较稳定的3个羟基基团。
图 5 温度对换锦花花色苷具体成分稳定性影响
Figure 5. Effect of temperature on the stability of specific components of anthocyanins in L. sprengeri
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换锦花不同花色苷质量分数随着光照和时间的变化而变化(图6)，在避光、自然光和日光灯条件下，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质量分数均呈下降趋势，与原提取液相比分别下降了26.75%、28.58%、31.02%；天竺葵素-3-O-葡萄糖苷质量分数则分别升高了232.63%、225.75%、330.90%。在避光和自然光照条件下飞燕草素-3-O-葡萄糖苷变化趋势平缓，但在日光灯光照1 h后呈现下降趋势，5 h后飞燕草素-3-O-葡萄糖苷质量分数呈直线下降，到6 h时仅为原提取液质量分数的4.35%。日光灯下的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和飞燕草素-3-O-葡萄糖苷质量分数减少最快，天竺葵素-3-O-葡萄糖苷质量分数上升最快。可见在3种不同光源中，日光灯对花色苷具体成分影响很大。这一结果和不同温度条件下花色苷质量分数变化趋势一致，随着光照强度和时间的增加，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷逐渐降低、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷逐渐上升、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷除了日光灯下过长时间照射外急剧下降，短时间内没有明显的变化。可能是由于飞燕草素-3-O-葡萄糖苷B环结构中有3个较为稳定羟基基团[23]。长时间强光照射破坏了飞燕草素-3-O-葡萄糖苷B环结构的羟基基团，导致其质量分数骤然下降。
图 6 光照对换锦花花色苷具体成分稳定性影响
Figure 6. Effect of light on the stability of specific components of anthocyanins in L. sprengeri
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换锦花矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和飞燕草素-3-O-葡萄糖苷的峰值随着提取液酸碱度的变化而变化。花色苷提取液pH为1.0~13.0时，随着pH的增加，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷峰值逐渐降低，飞燕草素-3-O-葡萄糖苷峰值逐渐升高，而天竺葵素-3-O-葡萄糖苷峰值变化不明显(图7)。由此可见，酸碱度对天竺葵素-3-O-葡萄糖苷结构的稳定性影响较大，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷结构在酸性条件下较稳定，而飞燕草素-3-O-葡萄糖苷的结构则在碱性条件下比较稳定。
图 7 pH对换锦花花色苷具体成分稳定性的影响
Figure 7. Effect of pH on the stability of specific components of anthocyanins in L. sprengeri
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花色苷是重要的功能性天然色素，可使植物各器官部位呈红色和蓝色的酚类物质[24]，但性质极不稳定，易受到内部和外部环境条件的影响。本研究通过不同光照、温度、pH及金属离子浓度等外部理化因素对换锦花总花色苷稳定性进行试验，并利用HPLC分析了花色苷的主要成分、质量分数及稳定性。
在温度≤30 ℃条件下，换锦花花色苷较为稳定，且对花色苷具有一定的辅色效应，高温可加快花色苷的分解。可以认为：2-苯基苯并吡喃环阳离子和查尔酮之间的可逆转化导致花色苷的热降解；高温条件下平衡是向着查尔酮方向移动的，而有色的2-苯基苯并吡喃环阳离子和醌型碱形式明显减少[25]。与温度相比，光照对换锦花花色苷稳定性的影响不明显。避光条件下花色苷的稳定性几乎不受影响，自然光次之，日光灯影响最大。换锦花花色苷溶液在酸性条件下比较稳定，pH为1.0时，换锦花花色苷溶液吸光度最高，溶液为红色，且比较稳定性。pH≥4.0后，花色苷溶液逐渐由红色变为无色，最终随着pH的增加溶液颜色转向蓝黄色，吸光度随之先降低后增加。Fe3+、Ca2+、Al3+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、K+、Fe2+等8种金属离子在0~0.01 mol·L−1浓度下，对换锦花花色苷溶液均有一定的增色效应，能够帮助稳定花色苷的构型，但随着金属离子浓度的继续增加，只有Fe2+对花色苷有正向增色作用，其他金属离子均对花色苷起破坏作用。所以换锦花在温度低于30 ℃，避光且pH≤3.0的条件下能较好保存，同时尽量避免接触高浓度金属离子。
换锦花花瓣中花色苷主要成分为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷，其中矢车菊素产生红色，天竺葵素产生橙色，飞燕草素产生蓝紫色[1]。花色苷具有很强抗氧化作用的主要活性基团是分子中的酚羟基[26]。GARCIA-ALONSO等[23]认为：葡萄酒中飞燕草-3-O-葡萄糖苷B环上具有3个羟基，具有最强的抗氧化活性，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷次之，天竺葵素-3-O-葡萄糖苷最弱。在不同的温度和光照条件下，飞燕草素-3-O-葡萄糖苷是最为稳定的，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和天竺葵素-3-O-葡萄糖苷对光照和温度比较敏感，且天竺葵素-3-O-葡萄糖苷质量分数变化更大。随着时间的延长和温度、光照强度的增加，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质量分数显著下降。天竺葵素-3-O-葡萄糖苷则恰恰相反，其质量分数逐渐升高，超过一定限度才开始下降，说明适当的温度和光照对天竺葵素-3-O-葡萄糖苷有正向稳定作用[27]，与换锦花在高温和强光条件下提取液颜色由深红转变为橙红相一致。花色苷的含氧杂环上是氧正离子，以正阳盐形式存在，其结构在不同pH下会发生变化[28-29]，在pH为1.0~13.0时，换锦花提取液颜色由红色变为无色，最终随着pH的增加，颜色又向蓝色转变，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质量浓度也随着pH的增加呈明显下降趋势，飞燕草素-3-O-葡萄糖苷峰值也随着pH的增加呈明显上升趋势。推测在酸性条件下，飞燕草素-3-O-葡萄糖苷中的醌型碱结构被破坏；在碱性条件下，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷中的2-苯基苯并吡喃环阳离子遭破坏。天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的变化规律有待进一步研究。
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换锦花花色苷的主要成分是矢车菊素、天竺葵素和飞燕草素；换锦花花色苷稳定性受温度、光照、pH和金属离子浓度等理化因素的影响。高温、强光和高pH可降解花色苷，导致花色苷结构之间的转变。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质量分数随着时间延长和光照、温度强度的增加而降低，天竺葵素-3-O-葡萄糖苷则呈相反趋势，飞燕草素-3-O-葡萄糖苷在光照和温度不同条件下较稳定；随着pH增加，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量逐渐降低，飞燕草素-3-O-葡萄糖苷逐渐增加。Al3+、Fe2+、Cu2+、Fe3+均使花色苷溶液有变色现象，Ca2+、Zn2+、Mg2+和K+对花色苷提取液影响不大，但金属离子在浓度0~0.01 mol·L−1时对换锦花花色苷均有一定的增色效应。随着Fe2+浓度的增加增色作用明显。
Effects of physical and chemical factors on anthocyanin stability in Lycoris sprengeri
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摘要:
目的 探讨换锦花Lycoris sprengeri花色苷组成成分及其理化因子对换锦花花色苷稳定性的影响。 方法 采用液质联用技术测定换锦花花色苷成分，并通过紫外分光光度法和高效液相色谱(HPLC-ADA)技术研究温度、光照、pH和金属离子浓度等理化因素对换锦花花瓣花色苷呈色变化规律的影响。 结果 ①矢车菊素、天竺葵素和飞燕草素是换锦花花色苷主要成分。②温度低于30 ℃、避光和pH≤3.0时换锦花花色苷溶液比较稳定；高温、强光和高pH会使花色苷降解，且随着时间的延长，降解程度越大；Al3+、Fe2+、Cu2+、Fe3+均使花色苷溶液颜色发生变化，Ca2+、Zn2+、Mg2+和K+对花色苷呈色影响不大，但金属离子浓度为0~0.01 mol·L−1时对换锦花花色苷有一定的增色效应，Fe2+浓度越高增色作用越明显。③高温、强光和pH的变化对换锦花花色苷主要成分质量分数有一定的影响。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质量分数随着时间、光照和温度的增加而降低，天竺葵素-3-O-葡萄糖苷则呈相反趋势，飞燕草素-3-O-葡萄糖苷在光照和温度不同条件下较稳定。随着pH增加，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质量分数逐渐降低，飞燕草素-3-O-葡萄糖苷逐渐增加。 结论 换锦花花色苷的主要成分是矢车菊素、天竺葵素和飞燕草素；高温、强光和高pH对花色苷有降解作用，可导致花色苷之间结构的转变。图7表1参29 Abstract:Objective This study aims to investigate the composition of anthocyanins and the effects of physical and chemical factors on the stability of anthocyanins in Lycoris sprengeri. Method The anthocyanins in the flower were determined by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). The effects of temperature, light, pH value and metal ions on the color change of anthocyanins in L. sprengeri were studied by ultraviolet spectrophotometry and HPLC-ADA. Result (1) Cyanidin, pelargonidin and delphindin were the main components of anthocyanins in L. sprengeri. (2) The anthocyanin solution was stable when temperature was lower than 30 ℃, dark and pH value ≤ 3.0. High temperature, strong light and high pH value could degrade anthocyanins, and the degradation degree increased with time. Al3+, Fe2+, Cu2+ and Fe3+ all changed the color of anthocyanin solution, and Ca2+, Zn2+, Mg2+ and K+ had little effect on the color of anthocyanins, but the metal ion concentration of 0−0.01 mol·L−1 had a certain effect on the color of anthocyanins. Hyperchromic effect of Fe2+ was more obvious when Fe2+ concentration increased. (3) High temperature, strong light and pH value had some effects on the concentration of anthocyanins. The concentration of cyanidin 3-O-glucoside decreased with the increase of time, light and temperature, while that of pelargonidin-3-O-glucoside showed the opposite trend. Delphinidin-3-O-glucoside was stable under different light and temperature conditions. With the increase of pH value, the mass concentration of cyanidin-3-O-glucoside decreased gradually, while delphinidin-3-O-glucoside increased gradually. Conclusion The main components of anthocyanins in L. sprengeri are cyanidin, pelargonidin and delphinidin. High temperature, strong light and high pH value can degrade anthocyanins, which can lead to their structural transformation. [Ch, 7 fig. 1 tab. 29 ref.] -
Key words:
- botany /
- Lycoris sprengeri /
- anthocyanins /
- physical and chemical factors /
- stability /
- HPLC
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二氧化碳(CO2)浓度升高导致的全球气候变暖已成为人类生存面临的重要生态问题[1]，覆盖陆地表面约31%的森林固定了约1/3的CO2排放量[2]，是陆地上主要的碳汇生态系统[3]，能在一定程度上缓解温室效应[4]。森林固碳是指森林植被通过光合作用将碳转化为有机质储存于树干、根系及凋落物等[5]，其中，树木木质部生长是对环境变化较敏感的固碳过程，生长过程中的木质部特征对环境因子的响应存在种间差异[6]。因此对木质部形成进行季节动态监测，有助于了解环境因子对树木生长的影响，可为预估和评价森林碳储量变化提供科学依据。
通过微树芯法可以对木质部生长季节动态进行高时间分辨率监测(天或旬)，目前相关的研究主要针对针叶树，如青杄Picea wilsorii[7]、欧洲落叶松Larix decidua[8]、祁连圆柏Juniperus przewalskii[9]、欧洲赤松Pinus sylvestris[10]，也有少数阔叶树，如夏栎Quercus robur[11]、欧洲山毛榉Fagus sylvatica[12]等。这些研究集中在高纬度或高海拔地区，径向生长持续期主要在春末至秋初，不超过6个月。有研究发现：在受气温限制的湿润地区，气温升高有利于树木生长季延长[13]。在受水分限制的温带地区，气温升高加剧树木蒸腾作用，引起水分亏缺，部分树木出现生长短期停滞现象[14]。此外，同一树种，受年龄、海拔等因素的影响，对气候变化的响应存在一定差异[15]。
同一生境下，不同树种的径向生长动态存在差异。楸树Catalpa bungei、樟树Cinnamomum camphora、白蜡Fraxinus chinensis和栾树Koelreuteria paniculata是中国温带、亚热带重要的园林绿化树种，在维护城市生态系统稳定性上有较高的生态学价值。这4个树种属于环孔材树种，目前对它们的年内木质部生长仍缺乏相关研究，因此探索其木质部形成动态有助于加深对环孔材树种木质部生长的理解。本研究用微树芯技术监测了4个树种木质部径向生长的季节性动态变化，并分析了它们与气候因子的关系，以期掌握这4个树种的木质部生长规律，为评估和提高本地区森林的固碳能力提供基础数据。
1. 材料与方法
1.1 研究区概况
研究地位于河南省洛阳市河南科技大学。该区域属于北亚热带向暖温带过渡带的大陆性季风气候[16]。根据国家气象局数据，2018年洛阳市年均气温为15.3℃，年降水量为821.2 mm(图1)，比多年同期(1960—2017年)的年均气温高1.1 ℃，降水量多223.2 mm。样地地势平坦，林下土壤以黄褐土为主[17]，灌木层与草本层植被有紫叶李Prunus cerasifera、羊茅Festuca ovina等。
图 1 2018年研究区气温和降水量日值Figure 1 Daily air temperature and precipitation of the research area in 20181.2 样品采集
在样地选取长势良好、健康的楸树、樟树和白蜡样树各3株。受样树数量较少的影响，栾树为2株。样树基本信息：楸树平均胸径为17 cm，平均树高为9 m，平均树龄为13 a；樟树平均胸径为28 cm，平均树高为12 m，平均树龄为20 a；白蜡平均胸径为14 cm，平均树高为6 m，平均树龄为15 a；栾树平均胸径为23 cm，平均树高为9 m，平均树龄为20 a。
从2018年3—12月，对选定的样树进行监测，每隔7~10 d用Trephor微生长锥(Costruzioni Meccaniche Carabin C，专利号PD2004A000324，直径2 mm)在样树胸高处南北向轮流采集微树芯[18]，共采样30次。取好的样芯立即放入软化液中，软化后样芯经自动脱水机(Leica ASP200S)脱水，组织包埋机(Leica EG1150H)包埋，轮转切片机(Leica RM2235)切片，复合染色剂(质量浓度为1%的番红水溶液，含质量浓度为0.5%固绿的体积分数为95%的乙醇溶液)染色，得到木材切片，用莱卡显微镜(Leica DM2500)观察[19]。
1.3 形成层活动和木质部分化各阶段的划分
根据木质部细胞形态不同，木质部径向生长可划分为细胞扩大期、细胞壁加厚期和细胞成熟期[20]。在树木休眠期，形成层细胞扁长，排列紧密，细胞壁薄，直径小，染色后呈蓝绿色[21]。在树木生长初期，形成层细胞开始分裂、分化，当细胞体积增大至原细胞2倍时，称为扩大期细胞，细胞染色后呈蓝绿色。随后细胞壁加厚，直至细胞呈现紫红色，此时细胞完全成熟(图2)[22]。
根据ROSSI等[23]、ČUFAR等[24]的研究，以首次出现扩大期细胞作为形成层细胞活动开始(即径向生长开始)的标志。以形成层细胞不再分裂形成新的扩大期细胞作为形成层细胞活动结束的标志。以木质部细胞全部进入成熟阶段作为径向生长结束的标志。形成层活动持续期指形成层细胞活动开始到形成层细胞活动结束所持续的时间；径向生长持续期指形成层细胞活动开始到径向生长结束所持续的时间。
1.4 数据处理
每个样芯随机选取3列径向细胞，统计形成层细胞数量并测量当年生木质部长度。每个样树选取2~3个生长末期的样芯，在当年生的第1轮导管环中选择具有代表性的3个导管，测量其直径和面积，并求得平均值。所有量测用Image J完成。使用Gompertz函数对木质部径向生长累积量进行拟合，得到年内径向生长拟合曲线，对其进行一阶求导可以得到径向生长速率[25]。数据分析用Origin 9.0[26]完成。采用Pearson相关分析树木生长与气候因子的相关性。树木生长采用相邻2次采样间的径向生长增量拟合值，环境因子为同期的日尺度气象因子均值，包括气温、地表温度、降水量、相对湿度和日照时长[27]。
2. 结果与分析
2.1 形成层活动年内变化规律
4个树种的形成层细胞数量呈先上升后下降的单峰曲线(图3)。楸树的形成层最早开始活动，在3月10日，年积日为69 d。栾树形成层活动开始时间与楸树基本一致，且最早达到形成层细胞数量最大值，在5月4日。樟树形成层细胞数量最少，仅9个，其余3个树种为11~12个。楸树形成层活动结束最早，在9月中旬，樟树最晚，在10月中旬。
图 3 4个环孔材树种的形成层细胞数量Figure 3 Number of cambial cells for four ring-porous tree species2.2 木质部年内生长变化规律
2.2.1 年内生长周期
4个树种年内径向生长在持续时间上略有差异。径向生长结束时间最早的是栾树，在10月中旬，樟树最晚，在11月初。木质部生长持续期栾树最短为220 d，樟树最长为236 d (表1)。
表 1 4个环孔材树种的形成层活动和木质部分化动态Table 1 Phenology of cambial activity and xylem differentiation of four ring-porous tree species树种 形成层活动启动时间/d 形成层活动停止时间/d 径向生长结束时间/d 形成层活动持续期/d 径向生长持续期/d 楸树 69.0±0.0 258.0±14.6 301.0±12.1 189.0±14.6 232.0±14.8 樟树 71.0±3.5 287.0±14.0 311.0±4.2 216.0±10.1 236.0±5.2 白蜡 80.0±4.6 280.0±17.6 301.0±6.4 199.0±13.0 221.0±9.5 栾树 69.0 273.0 289.0 204.0 220.0 说明：数值为平均值±标准差。栾树仅2个植株，未列标准差。 2.2.2 径向生长量
各树种的年内径向生长曲线基本一致，呈S型(图4)，Gompertz函数拟合效果较好(表2)，R2=0.58~0.95，P＜0.000 1。年内总径向生长拟合量以楸树最大，为(8 276.0±1 744.2) μm，其次是栾树、樟树和白蜡，分别为6 727.0、(6 399.0±1 241.7)和(5 807.0±2 191.9) μm。
图 4 不同树种径向生长年内累积量实测值及其Gompertz拟合曲线Figure 4 Seasonal cumulative radial growth and its model prediction from the microcore measurements表 2 4个树种的木质部径向生长动态Table 2 Phenology of xylem for four ring-porous species树种 木质部径向生长
实测值/μm木质部径向生长
拟合值/μmR2 P 平均生长速率/
(μm·d−1)最大生长速率/
(μm·d−1)最大生长速率
出现的时间/d楸树 8 467.0±2 423.7 8 276.0±1 744.2 0.93~0.95 ＜0.000 1 55.0±17.7 90.0±28.9 126.0±1.5 樟树 5 869.0±1 548.7 6 399.0±1 241.7 0.84.0~0.91 ＜0.000 1 39.0±2.7 64.0±4.4 134.0±6.4 白蜡 5 541.0±2 260.1 5 807.0±2 191.9 0.58~0.80 ＜0.000 1 41.0±19.5 68.0±39.0 136.0±15.5 栾树 8 281.0 6 727.0 0.70~0.77 ＜0.000 1 54.3 88.8 137.0 说明：数值为平均值±标准差。栾树仅2个植株，未列标准差。 2.2.3 径向生长速率
4个树种的生长速率呈先上升后下降的单峰曲线(图5)，均在5月中旬达到峰值。由表2可见：楸树的峰值最高，为(90.0±28.9) μm·d−1，樟树最低，为(64.0±4.4) μm·d−1。楸树最早达到峰值，在5月6日(年积日126 d)，比樟树、白蜡和栾树分别早8、10和11 d。
2.3 木质部径向生长量与气候因子的相关性
由表3可见：4个树种的年内径向生长量与气温和地表温度均呈极显著正相关(P＜0.01)，降水量仅与樟树树木年内径向生长的显著正相关(P＜0.05)。
表 3 径向生长与同期气候因子相关性分析Table 3 Correlation analysis between radial growth and contemporaneous environmental factors树种 气温/℃ 地表温度/℃ 降水量/mm 相对湿度/% 日照时长/h 楸树 0.519** 0.523** 0.272 0.186 0.266 樟树 0.669** 0.663** 0.389* 0.286 0.260 白蜡 0.636** 0.629** 0.345 0.258 0.207 栾树 0.595** 0.587** 0.316 0.252 0.197 说明：**表示P＜0.01；*表示P＜0.05。 2.4 木质部导管特征
4个树种中栾树的导管直径最大(表4)，为(243.0±19.2) μm，其次是楸树和白蜡，樟树的导管直径最小，为(137.0±24.0) μm。
表 4 4个环孔材树种的导管直径与横截面积Table 4 Diameter and area of vessels in four ring-porous species树种 导管直径/μm 导管面积/μm2 楸树 240.0±14.7 46 123.0±5 278.6 樟树 137.0±24.0 15 734.0±4 919.8 白蜡 216.0±5.8 38 370.0±1 381.9 栾树 243.0±19.2 48 125.0±8 475.7 说明：数值为平均值±标准差。 3. 讨论
3.1 4个树种的形成层活动和年内径向生长动态特征
本研究中4个树种的形成层活动从3月开始，在9月中旬到10月中旬结束，活动持续期约200 d。木质部径向生长在10月底或11月初完成，持续时间约230 d。随着纬度升高，温度降低，树木的形成层活动推迟，径向生长结束提前，生长季缩短[28]。反之，在低纬度地区，树木生长季通常较长[29]。在高纬度芬兰(60°~70°N)，欧洲云杉Picea abies的形成层细胞活动持续期约100 d[30]，比本研究区持续期短。在中低纬度西双版纳(21°N)，楝树Melia azedarach形成层细胞活动持续期更长，可达280 d以上[31]。在寒冷地区，树木常采用“集约化策略”，即在较短时间以较高的生长速率完成年内生长。在温暖地区，树木木质部生长表现为“广泛策略”，即生长季较长，平均生长速率较低[25]，尤其是热带、亚热带地区，树木几乎全年生长[32]。本研究区树木生长虽未持续至全年，但较长(3月上旬至11月初)，且平均生长速率为39~55 μm·d−1，采用的生长策略偏向于“广泛策略”。
树木的生长速率最大值出现时间通常受日照时长的影响，一般在日照时间最大值的夏至附近出现[33]。在一定范围内，随着纬度升高，日照时长加长，树木最大生长速率出现的时间延后[34]。本研究中4个树种最大生长速率出现时间均在5月中旬，可能与地处中纬度有关。除日照时长外，树木的生长速率还受降水的影响[35]，因降水减少引起的干旱可能会导致生长速率减缓甚至停止[36]。这会导致树木生长速率呈双峰型曲线[37]，通常发生在夏季降水较少或由高温引起植物强蒸腾作用，出现干旱胁迫的地区[38]。分布在适宜气候下的树种，其生长速率主要表现为单峰曲线[39]。本研究中4个树种的生长速率均呈单峰曲线，这说明4个树种生长旺盛时降水充足，温度适宜，未造成干旱胁迫使生长减缓这一现象。
3.2 树木径向生长与气候因子的关系
树木的径向生长受树种本身(遗传基因等)和外界环境因子(温度等)的共同影响[40−41]。本研究中，气温是影响树木径向生长的主要气候因子，降水与树木径向生长的正相关关系只存在于樟树中。这可能与研究区的地理位置有关。研究区地处北亚热带与暖温带的过渡区。已有研究表明：在较寒冷的温带区域，气温是控制树木生长的主导气候因子[42]。而在亚热带，气温对树木生长的影响作用逐渐减弱[43]。此外，研究区位于半湿润向半干旱过渡区，降水对树木生长有一定影响。但降水对楸树、白蜡和栾树影响不显著，这可能是由于研究年份降水远高于多年平均水平。樟树主分布区位于南方，喜湿，对水分的需求量远高于其他3个树种[44]。因此，在樟树分布的北缘，樟树径向生长与降水的正相关关系高于其他3个树种。此外，这可能也与樟树的半环孔材木材特性有关[45]。有研究发现：与湿润年分相比，具有大导管的环孔材树种(欧梣Fraxinus excelsior等)在干旱年份时液流速率变化平缓，仅降低12%左右。而同一生境下的散孔材树种(欧洲甜樱桃Prunus avium等)，在干旱年份液流速率下降幅度达15%~50%[46]。较强的树体水分调节能力使得环孔材树种在干旱时应对水分亏缺(土壤和大气)的敏感性低于散孔材树种[47−48]。这有助于解释介于散孔材和环孔材之间的半环孔材树种——樟树对水分的敏感性高于其他3个环孔材树种。此外，木质部解剖结构特征、木质部水力功能性状等多种因素均会影响植物对水分的敏感性[49]。根系特征也会影响树木生长对气候因子响应的差异性，有研究发现樟树的须根较细较少，根系在地下分布也较浅[50]，而其他3个树种的根系都极为发达[51]。较发达的根系有助于促进树木获得更多土壤水分[52]，这可能也是除樟树外其余3个树种与降水不具相关性的原因之一。
4. 结论
本研究使用2018年河南省洛阳市的气候数据与当地的4个环孔材树种的微树芯数据，分析了楸树、樟树、白蜡和栾树的年内径向生长动态及其对气候因子的响应。主要得到以下结论：4个树种的生长集中在3—11月，生长季内只有1个生长高峰，它们的径向生长都与气温呈极显著正相关；半环孔材樟树对气候因子的响应要强于其他3个环孔材树种，在降水这一因子上尤为明显。该研究结果有助于掌握本地区环孔材树种的木质部生长规律，为评估和提高本地区森林的固碳能力提供基础数据，加深对洛阳市环孔材树木生长-环境响应机制的认识和理解。
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图 1 温度和光照对换锦花总花色苷稳定性的影响
Figure 1 Effects of temperature and light on the stability of anthocyanin in L. sprengeri
图 2 pH对换锦花花色苷提取液颜色和吸光度的影响
Figure 2 Effects of pH value on color and absorbance value of anthocyanins in L. sprengeri
图 3 金属离子对换锦花花色苷提取液颜色和吸光度的影响
Figure 3 Effect of metal ions on color and absorbance value of anthocyanins in L. sprengeri
图 4 换锦花花色苷提取液HPLC色谱图及成分结构
1. 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷；2. 天竺葵素-3-O-葡萄糖苷；3. 飞燕草素-3-O-葡萄糖苷
Figure 4 HPLC chromatogram and specific compositions structure of anthocyanin extract in L. sprengeri
图 5 温度对换锦花花色苷具体成分稳定性影响
A. 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷；B. 天竺葵素-3-O-葡萄糖苷；C. 飞燕草素-3-O-葡萄糖苷
Figure 5 Effect of temperature on the stability of specific components of anthocyanins in L. sprengeri
图 6 光照对换锦花花色苷具体成分稳定性影响
A. 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷；B. 天竺葵素-3-O-葡萄糖苷；C. 飞燕草素-3-O-葡萄糖苷
Figure 6 Effect of light on the stability of specific components of anthocyanins in L. sprengeri
图 7 pH对换锦花花色苷具体成分稳定性的影响
1. 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷；2.天竺葵素-3-O-葡萄糖苷；3. 飞燕草素-3-O-葡萄糖苷
Figure 7 Effect of pH on the stability of specific components of anthocyanins in L. sprengeri
表 1 换锦花花瓣花色苷类化合物成分
Table 1. Anthocyans composition of L. sprengeri petals
编号 化合物名称 峰面积 苷元类型 1 矢车菊素3-O-葡萄糖苷 cyanidin-3-O-glucoside 64.32 矢车菊素cyanidin 2 矢车菊素双葡萄糖苷 cyanidin3, 5-diglucoside 22.92 3 矢车菊素-3-芸香糖苷 cyanidin-3-rutinoside 16.50 4 矢车菊素-3-桑布双糖苷 cyanidin-3-sambubioside 14.05 5 矢车菊素-3-鼠李糖苷 cyanidin-3-rhamnoside 11.74 6 矢车菊素-3-阿拉伯糖苷 cyanidin-3-arabinoside 6.62 7 矢车菊素-3-苦甙-5-鼠李糖苷 cyanidin-3-sophroside-5-rhamnoside 4.07 8 矢车菊素-3-O-[(4-羟基-E-肉桂酰)-(6)-D-吡喃葡萄糖苷] cyanidin-3-O-
[(4-hydroxy-E-cinnamoyl)-(6)-D-glucopyranoside]1.34 9 飞燕草素-3-O-葡萄糖苷 delphinidin-3-O-glucoside 33.17 飞燕草素delphinidin 10 飞燕草素-3-O-(6''-O-α-鼠李吡喃糖基-β-吡喃葡萄糖苷delphinidin-3-O-
(6''-O-alpha-rhamnopyranosyl-beta-glucopyranoside)16.19 11 飞燕草素-3-桑布双糖苷 delphinidin-3-sambubioside 9.35 12 飞燕草素双葡萄糖苷 delphinidin-3, 5-diglucoside 3.66 13 飞燕草素-3-O-芸香糖苷-5-O-葡萄糖苷 delphinidin-3-O-rutinoside-5-O-glucoside 0.12 14 天竺葵素 pelargonidin 15.55 天竺葵素pelargonidin 15 芍药花素双葡萄糖苷 peonidin-3, 5-diglucoside 11.08 芍药花素 peonidin 16 矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷 petunidin-3-O-glucoside 3.29 矮牵牛素 etunidin 
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