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防腐处理可以提高木材抗真菌、抗虫等性能[1]，使木材免受生物危害，从而延长木材的使用年限，是减少木材使用量和延长木材储碳周期的重要途径[2]。木材防腐行业经过几十年的发展取得了显著进步，目前逐渐朝着对人和环境友好的方向发展，有机防腐剂因具有高效、环保的优点而成为研究热点[3−6]。多数有机防腐剂来源于工业和农用杀菌剂，嘧菌酯(azoxystrobin)是一种低毒、高效、广谱的杀菌剂，它对非靶标生物安全，具有环境相容性好的优点[7−8]。嘧菌酯用于木竹材保护[4, 9]的研究表明：嘧菌酯对木材腐朽菌表现出较优的抑制效果，载药量为0.22~0.44 kg·m−3的防腐处理辐射松Pinus radiata 在腐朽菌侵染后的质量损失率均小于8%，且嘧菌酯对串珠镰刀菌Fusarium moniliforme和可可球二孢Botryodiplodia theobromae等木竹材霉变菌具有较好的防治效果；同时，嘧菌酯和有机碘化合物复配(质量分数为0.1%)对竹材霉菌的防治效率在90%以上[10]，因此可作为新型木材防腐剂进行开发利用。良好的抗流失性能是防腐木材保持较长耐久性的重要因素[11−14]，因此进行嘧菌酯处理木材的抗流失性能研究非常必要。
防腐材中防腐剂流失率测试的关键在于准确分析其含量。嘧菌酯检测可采用气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)分析方法[15]，HPLC分析方法因具有使用条件便捷、定量准确度高的优点成为常用的分析方法[16−17]。木材存在丰富的抽提物，处理材流失液中抽提物的色谱峰可能会对HPLC分析嘧菌酯造成干扰，所以检测处理材流失液中的嘧菌酯，需要建立一种准确、快捷的分析方法。鉴于此，本研究建立了嘧菌酯的HPLC分析方法，并对方法精准性进行评价。同时制备了嘧菌酯水基化制剂，探究水基化制剂和乙醇溶解药剂处理材抗流失性能差异；选择马尾松Pinus massoniana、杉木Cunninghamia lanceolata和107杨Populus×euramericana为处理材研究对象，探究树种类型和药剂质量分数对处理材中嘧菌酯抗流失性能的影响，旨在为嘧菌酯的户外使用提供研究基础。
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马尾松产自广西派阳山林场，树龄为38 a，气干密度为0.70 g·cm−3，含水率为8.2%；杉木产自湖南，树龄为23 a，气干密度为0.37 g·cm−3，含水率为9.2%；107杨产自山东，树龄为15 a，气干密度为0.44 g·cm−3，含水率为8.0%。选取无明显节子、年轮分布均匀的边材作为试验用材，锯切制成规格为20 mm × 20 mm × 20 mm (纵向×弦向×径向)的试件。
药剂主要为甲醇(色谱纯)和嘧菌酯(有效成分≥98%，白色粉末)，其他试剂均为分析纯。
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前期研究发现：质量分数为0.040%~0.056%的嘧菌酯处理木材(载药量为0.31~0.44 kg·m−3)，室内耐腐效果较优[4]。考虑户外处理木材的使用条件不同，本研究流失试验药剂质量分数设置为0.05%和0.15%共2个水平。
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使用Elite P230高效液相色谱仪、UV230+紫外-可见光检测器等仪器，在参考文献[15−17]的基础上，结合本研究各种木材的抽提物分离条件，确定如下色谱条件：依利特Supersil ODS2 C18色谱柱为250.0 mm×4.6 mm，5 μm；柱温为30 ℃；V(甲醇)∶V(水)=80∶20为流动相；流速为0.8 mL·min−1；检测波长为220 nm；进样量为20 μL；保留时间约6.1 min。
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准确称取0.050 0 g的嘧菌酯标准品，置于50 mL容量瓶中，加入少量甲醇使之溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀；移取上述溶液2 mL，用甲醇和水(体积比为80∶20)的混合溶剂定容至10 mL，配制成200 mg·L−1的标准溶液，再用上述混合溶剂稀释，配得质量浓度为80、40、20、5、1 mg·L−1的嘧菌酯系列标准溶液，在上述色谱条件下进样分析，绘制标准曲线。
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①嘧菌酯制剂。参考张景朋等[9]的方法，称取1.00 g嘧菌酯原药于25 mL锥形瓶中，缓慢加入1.00 g乙腈和3.00 g乙酸乙酯，在45 ℃下搅拌溶解，依次加入3.00 g乳化剂、2.00 g蒸馏水，充分搅拌后得质量分数为10%的嘧菌酯制剂。选用苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚和辛基酚聚氧乙烯醚为乳化剂，分别制备A1和A2共2种制剂，使用建立的HPLC分析方法对制剂的质量分数进行分析。2种制剂均分别用水稀释200倍、67倍得到质量分数为0.05%和0.15%的防腐工作液。②嘧菌酯乙醇溶液。称取1.00 g嘧菌酯原药，加入9.00 g乙醇溶解，搅拌均匀后得质量分数为10%的嘧菌酯乙醇溶液。使用乙醇稀释分别配置成质量分数为0.05%和0.15%的防腐工作液。
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防腐处理参照GB/T 29905—2013《木材防腐剂流失率试验方法》进行[18]。处理前将试件进行编号、称量(精确至0.01 g)，将试件放入500 mL烧杯中，用重物压稳，注入防腐处理液，置于真空干燥箱中，抽真空至−0.09 MPa，保持10 min，卸压后常压浸泡5 min。处理完毕后取出试件，用滤纸擦去表面残留药液，称取处理后质量(精确至0.01 g)，于常温下气干至含水率小于20%。
试件中嘧菌酯总质量计算公式为：m=(m2－m1) ×c×1 000。其中：m为试件中嘧菌酯的总质量(mg)；m1为试件处理前质量(g)；m2为试件处理后质量(g)；c为防腐液中嘧菌酯的质量分数(%)。
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流失试验参照GB/T 29905—2013《木材防腐剂流失率试验方法》进行[18]。将相同处理条件的6块试样作为1组，置于500 mL烧杯中，加入180 mL蒸馏水，试样浸没在蒸馏水液面以下，用磁力搅拌器搅拌，在6、24、48 h时更换1次蒸馏水，之后每隔48 h更换1次蒸馏水，共计14 d。收集每次更换的滤出液，合并后用于质量浓度分析。
分别取各组收集的流失液50 mL，用旋转蒸发器除水后，加入适量色谱甲醇和蒸馏水混合溶剂充分溶解，经0.45 μm聚四氟乙烯膜过滤后用于HPLC分析。采用外标法，根据1.2.2绘制的标准曲线和HPLC色谱图面积计算流失液中嘧菌酯质量浓度，流失液分析进行3次重复，计算平均值。
嘧菌酯流失率计算公式为：L = kv/m × 100%。其中：L为防腐剂的流失率(%)；k为流失液中待测成分的质量浓度(mg·L−1)；v为流失液的体积(L)；m为试件中嘧菌酯总质量(mg)。
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将甲醇溶解的嘧菌酯标准溶液放置于石英比色皿，以甲醇作为空白样，采用紫外-可见光分光光度计，测定嘧菌酯标准溶液在波长190~900 nm下的吸光度。得到嘧菌酯的全波长扫描图(图1)，发现嘧菌酯的吸收峰在220 nm处获得较高的灵敏度，因此本研究选择220 nm作为检测波长。
图 1 嘧菌酯的全波长扫描图
Figure 1. Full wavelength scanning of azoxystrobin
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木材抽提物色谱峰一般出峰时间较早[19]，分析条件要首先保证抽提物色谱峰和嘧菌酯色谱峰完全分开，同时能使嘧菌酯较早出峰，可以节省分析时间。采用V(甲醇)∶V(水)=80∶20为流动相，流速为0.8 mL·min−1的分析条件。从图2A可见：甲醇溶解的嘧菌酯标准溶液的色谱图中，基线较稳，保留时间为6.14 min，无拖尾，但是出现前沿峰。前沿峰的出现会造成定量分析准确性下降，这一般是由于样品溶剂的洗脱能力大大强于流动相或者柱效能下降造成的[20]。此处可能是使用了甲醇溶解嘧菌酯，因为甲醇洗脱能力强于流动相造成前沿峰的出现。如图2B所示：流动相溶解嘧菌酯进样分析的色谱图中，前沿峰消失，峰形对称，保留时间为6.11 min，同时用流动相溶解稀释制剂A1和A2进行分析，发现除了嘧菌酯色谱峰外，无其他辅助成分的干扰峰(图2C和2D)，可实现嘧菌酯的准确分析。
图 2 嘧菌酯样品色谱图
Figure 2. Chromatograms of azoxystrobin samples
此外，检测流失液中的嘧菌酯质量浓度，需确保木材抽提物的色谱峰对嘧菌酯色谱峰定量分析无影响。将马尾松、杉木和107杨防腐处理材的流失液进行液相分析(图3)可见：3种处理材流失液的高效液相色谱图中，虽然不同木材的抽提物种类不同，但是3种木材总抽提物的色谱峰均在5 min之前出峰完成，对嘧菌酯定量分析无干扰，所以此色谱条件能实现对流失液中嘧菌酯的准确分析。
图 3 防腐材流失液色谱图
Figure 3. Chromatograms of treated woods
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在1.2.1的色谱条件下，对不同质量浓度的嘧菌酯标准溶液进行测定，以质量浓度(x，mg·L−1)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线如图4。在嘧菌酯为1~80 mg·L−1时，得到线性方程为y=135.610x −18.537，决定系数(R2)=0.999 6，线性相关性强。
图 4 嘧菌酯标准曲线
Figure 4. Standard curve of azoxystrobin
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准确称取0.106 0 g制剂A1，置于20 mL容量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，摇匀，再将此溶液用流动相稀释10倍，制得待分析样品，取6份平行试样进行HPLC分析；准确称取0.111 2 g的制剂A2，进行上述相同操作。从表1可见：制剂A1中嘧菌酯的平均质量分数为10.15%，标准偏差为0.06%，变异系数为0.59%；制剂A2中嘧菌酯的平均质量分数为10.13%，标准偏差为0.05%，变异系数为0.45%。表明平行分析结果之间数据非常接近，分析方法精密度高。
表 1 精密度试验结果
Table 1. Precision test results
试样 平行试样质量分数/% 标准偏差/% 变异系数/% 1 2 3 4 5 6 平均值 制剂A1 10.06 10.17 10.13 10.23 10.20 10.12 10.15 0.06 0.59 制剂A2 10.17 10.18 10.11 10.09 10.07 10.15 10.13 0.05 0.45 -
在空白溶液和已知质量浓度的嘧菌酯样品中分别添加不同质量浓度的嘧菌酯标准品，配成一定质量浓度的样品溶液，在上述色谱条件下进行分析，计算回收率。从表2可见：嘧菌酯的回收率为98.2%~100.4%，平均回收率为99.7%，表明该方法准确度较高。综上所述，该分析方法标准曲线线性相关性好，精密度及准确度较高，可应用于有效成分嘧菌酯质量分数的分析。
表 2 准确度试验结果
Table 2. Accuracy recovery test results
试样
编号本底值/
(mg·L−1)加入标样量/
(mg·L−1)理论值/
(mg·L−1)实测值/
(mg·L−1)回收率/
%1 0 10 10.00 9.82 98.2 2 0 20 20.00 19.94 99.7 3 0 40 40.00 39.66 99.1 4 28.16 10 38.16 38.24 100.2 5 28.16 20 48.16 48.28 100.3 6 28.16 40 68.16 68.42 100.4 -
从图5A可见：乙醇溶解嘧菌酯溶液的处理材中，嘧菌酯的抗流失性较好，各处理材中嘧菌酯的流失率相对较低，即防腐剂在处理材中的固着性能较好。具体地，在质量分数为0.05%和0.15%的药剂处理下，马尾松嘧菌酯的流失率分别为18.8%和14.7%，107杨嘧菌酯的流失率分别为17.4%和14.7%，杉木嘧菌酯的流失率分别为21.0%和20.1%。表明嘧菌酯在马尾松和107杨中的流失率水平相当，而杉木的高于马尾松和107杨。
图 5 质量分数为0.05%和0.15%的药剂下嘧菌酯3种制剂处理木材的流失率
Figure 5. Leaching rates of treated wood by 3 formulations of azoxystrobin with content of 0.05% and 0.15%
如图5B所示：嘧菌酯制剂A1的处理材中，嘧菌酯的流失率均小于20.0%，抗流失性能较优。马尾松和杉木处理材的流失率分别为8.4%~10.9%和8.2%~9.6%，两者均低于107杨处理材的流失率(11.9%~19.0%)。
如图5C所示：嘧菌酯制剂A2的处理材中，嘧菌酯的流失率均小于15%，抗流失性能较强。在质量分数为0.05%的药剂处理下，马尾松、杉木和107杨处理材的流失率分别为11.1%、12.9%和14.9%，3种处理材差异不大；在质量分数为0.15%的药剂处理下，马尾松、杉木和107杨3种处理材的流失率分别8.9%、8.7%和8.8%，3种处理材基本相同。
嘧菌酯3种制剂的处理表现出同样的流失规律，3种不同树种均为低质量分数制剂处理材的流失率大于高质量分数制剂处理材。2种不同质量分数制剂处理材的药剂流失量基本一致，而防腐液质量分数较高时处理材载药量较高，造成药剂流失量占载药量的比例更低。而木材种类对流失率的影响在每种制剂中的表现没有明确规律，只有在制剂A1的处理材中，107杨流失率明显高于马尾松和杉木，另外2种制剂处理材在不同树种之间的流失率差别较小。
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为了比较嘧菌酯制剂和乙醇溶液处理木材流失率的差异，以质量分数为0.05%和0.15%的制剂处理下流失率的平均值作为嘧菌酯在此树种上的流失率。如图6所示：乙醇溶解、制剂A1和制剂A2处理的107杨药剂流失率非常接近，但以制剂A2处理材稍低；对马尾松和杉木而言，乙醇溶解嘧菌酯处理材的药剂流失率高于制剂A1和制剂A2。表明将嘧菌酯制备成水基化制剂处理木材不会造成流失率的升高，可用于处理户外木材及其制品。
图 6 嘧菌酯处理木材的流失率
Figure 6. Leaching rates of azoxystrobin from treated wood
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有研究认为：有机防腐药剂处理木材的流失性能主要与其在水中的溶解度相关[21]，嘧菌酯在水中溶解度为6 mg·L−1(20 ℃)[22]，而醚菌酯在水中的溶解度仅为2 mg·L−1(20 ℃)，醚菌酯在水中极小的溶解度可能是各处理材中醚菌酯流失率均较小的原因。醚菌酯是甲氧基丙烯酸酯的另一代表化合物，其处理马尾松、107杨等木材的药剂流失率为3.1%~18.4%[23]，而本研究处理木材嘧菌酯的流失率为8.7%~21.0%，可见，醚菌酯抗流失性能优于嘧菌酯。三唑类化合物是已被广泛应用的有机木材防腐剂，关于其抗流失性能已有较多研究，其中戊唑醇和丙环唑制剂处理马尾松防腐材的流失率分别为28.0%~41.0%和18.0%~26.0%，环丙唑醇等其他三唑化合物流失率高达34.0%~43.0%[24]，嘧菌酯抗流失性能明显高于三唑类化合物，这可能与三唑化合物在水中的溶解度高达31~110 mg·L−1(20 ℃)有关[21]。此外，通过三唑化合物和铜复配制剂处理木材可增加三唑固着性能，或者三唑制剂中添加疏水剂处理木材可减少水中溶解防腐剂的量，这2种方法均可降低处理材中三唑化合物的流失率[24]。如果嘧菌酯等制剂处理材用于水流失严重的环境区域，亦可考虑进行上述处理进一步降低其流失率。
然而，木材防腐剂流失是一个非常复杂的过程，不仅受药剂溶解度的影响，还与药剂、助剂和木材之间的相互作用有关[25−26]。不同木材的构造与性质差异较大也会有一定影响，嘧菌酯在木材上表现出不同的流失性，具体原因需要深入研究。
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本研究通过高效液相色谱分析方法建立了检测嘧菌酯质量分数的方法，2个分析样品的变异系数为0.45%和0.59%，样品的回收率为98.2%~100.4%，具有较高的精密度及准确度，可用于嘧菌酯质量分数的准确分析。马尾松、杉木和107杨3种处理材的嘧菌酯流失率差异不大，且均表现为低质量分数制剂处理材的流失率大于高质量分数制剂处理材；同时，与乙醇溶解制剂相比，嘧菌酯制成的水基化制剂处理木材不会造成流失率升高，因此嘧菌酯制剂可用于户外处理木材及其制品。
Analytical method of azoxystrobin by HPLC and leaching performance of treated wood
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摘要:
目的 探究嘧菌酯(azoxystrobin)的高效液相色谱(HPLC)分析方法及抗流失性能，旨在确定嘧菌酯处理材的抗流失性能，为其户外使用提供研究基础。 方法 采用紫外检测器及C18反相色谱柱，通过优化检测波长、流动相组成及配比、柱温及流动相流速等色谱条件，确定分析嘧菌酯的色谱条件，采用外标法对嘧菌酯质量浓度进行检测，并进行标准曲线相关系数、精密度、准确度等分析；参照GB/T 29905—2013《木材防腐剂流失率试验方法》开展流失试验，并利用建立的分析方法测定各处理材流失液中嘧菌酯的质量浓度，以确定防腐材的抗流失性能。 结果 优化得到嘧菌酯分析的色谱条件：V(甲醇)∶V(水)=80∶20为流动相，流速为0.8 mL·min−1，检测波长为220 nm。嘧菌酯标准溶液在质量浓度为1~80 mg·L−1内，标准曲线相关系数为0.999 6，线性相关性强；2个分析样品的变异系数为0.45%和0.59%，样品的回收率为98.2%~100.4%。抗流失试验结果表明：处理材中嘧菌酯的抗流失性较好，马尾松Pinus massoniana、杉木Cunninghamia lanceolata和107杨Populus×euramericana处理材的流失率分别为8.4%~18.8%、8.2%~21.0%和8.8%~19.0%。3种处理材之间的嘧菌酯流失率差异不大，均表现为低质量分数制剂处理材的流失率大于高质量分数制剂处理材的规律；乙醇溶解嘧菌酯处理材的流失率稍高于2种水基化制剂处理材的流失率。 结论 采用HPLC测定嘧菌酯的质量浓度，标准曲线线性相关性强，精密度和准确度高，能准确分析嘧菌酯的质量浓度；嘧菌酯的2种水基化制剂的抗流失性能较好，可用于户外木材及其制品。图6表2参26 -
关键词:
- 木材保护 /
- 嘧菌酯 /
- 高效液相色谱(HPLC) /
- 防腐材 /
- 抗流失性
Abstract:Objective This study, with an exploration of the high performance liquid chromatography (HPLC) analysis method and leaching resistance of the azoxystrobin formulation, is aimed to provide a research basis for its outdoor utilization. Method On the one hand, UV detector and C18 reversed-phase chromatographic column were used for detection before an investigation was conducted of the chromatographic conditions, such as detection wavelength, flow phase composition and ratio, column temperature and flow phase flow rate with further discussion so as to optimize the chromatographic conditions suitable for the analysis of azoxystrobin. On the other hand, the mass concentration of azoxystrobin was detected by external standard method, and the standard curve correlation coefficients, precision and accuracy were evaluated after which the leaching procedure was adopted according to the Chinese standard GB/T 29905−2013 Laboratory Method of Determining the Leachability of Wood Preservatives, and leaching rate of azoxystrobin in treated wood were tested by the established analytical method. Result The optimized chromatographic conditions for analysis of azoxystrobin were as follows: flow phase methanol-water ratio of 80∶20, flow rate of 0.8 mL·min−1, and UV detection wavelength of 220 nm. There was a good linear relationship between azoxystrobin concentration and chromatographic peak area in the range of 1−80 mg·L−1 for azoxystrobin standard solution, with a determination coefficient of 0.999 6. The coefficient variation of samples were 0.45% and 0.59%, and the recovery rates of the samples were 98.2%−100.4%. The leaching rate of azoxystrobin from Pinus massoniana, Cunninghamia lanceolata and Populus×euramericana were 8.4%−18.8%, 8.2%−21.0% and 8.8%−19.0%, respectively, with little difference in leaching rates between the three treated woods. The leaching rate of azoxystrobin in the treated Pinus massoniana, C. lanceolata and Populus×euramericana were all below 21% and the leaching resistance were excellent. All of the three tree species exhibit a pattern where the leaching rate of low concentration treated woods is greater than that of high concentration treated woods whereas the leaching rate of the treated wood with ethanol-dissolved azoxystrobin was slightly higher than that of the water-based formulations. Conclusion The HPLC method for determining azoxystrobin mass concentration showed good linear correlation of the standard curve, high precision, and recovery rate, which can be used for analysis of azoxystrobin mass concentration. The leaching resistance of the two water-based formulations of azoxystrobin was good and can be used for outdoor treatment of wood and its products. [Ch, 6 fig. 2 tab. 26 ref.] -
硝化和反硝化是土壤中氮素损失的潜在途径。随着人类活动的加剧，土壤中的硝化和反硝化作用会向大气中释放更多的温室气体氧化亚氮。由人为活动所产生的氧化亚氮中，耕地土壤的释放量贡献了65%左右[1]。反硝化作用（denitrification）是指把硝酸盐等较复杂的含氮化合物转化为氮气、一氧化氮和二氧化氮的过程，这是厌氧条件下（ > 60%的土壤孔隙水含量）陆地氧化亚氮产生的主要生物过程。在过去的1个多世纪里，人们通常认为反硝化过程都是由进行无氧呼吸的细菌进行的，但近年来的研究发现，真菌也可以进行反硝化作用[2]。在分离获得的真菌中，已经发现很多种具有产生氧化亚氮的能力。虽然在纯培养条件下，真菌产生氧化亚氮活性与细菌相比要低几个数量级[3]，但是对土壤氧化亚氮产生能力的测定结果表明，真菌产氧化亚氮的能力远超细菌[4-5]。Laughlin等[4]研究表明：在草地及耕作泥炭土中使用放线菌酮抑制真菌活性时，土壤氧化亚氮排放通量减少了80%，而用链霉素抑制土壤细菌活性后，土壤氧化亚氮排放通量仅减少30%左右。真菌在土壤氧化亚氮排放中的重要贡献可能是由于其生物量在土壤微生物中占据着非常大的优势。土壤原位氧化亚氮排放通量与土壤真菌生物量呈显著正相关，而与反硝化细菌及其他土壤性质没有明显的相关[6]。已经有一些关于草地、湿地以及耕地等生态系统土壤真菌氧化亚氮排放的研究，但是对于林地土壤的研究尚不多见[4-5, 7-8]。部分经济林的集约经营程度越来越高，它们对土壤微生物，特别是对土壤真菌的干扰也非常剧烈。由于真菌可以耐受更低的pH值，且在林地土壤中的生物量也往往高于细菌，因此真菌在南方酸性森林土壤氧化亚氮排放过程中可能具有更大的贡献[9-10]。毛竹Phyllostachy edulis是中国南方的主要竹种[11]，地下根鞭发达，穿透能力极强，可以帮助毛竹不断向周边森林蔓延并替代原有森林。此外，毛竹林的经济价值较高，目前农户对其的集约经营程度也在不断提高。由于真菌对人为干扰较为敏感，原有天然林改变为毛竹林必将导致土壤真菌群落结构的变化，进而导致土壤氧化亚氮排放通量的改变。本研究利用选择性抑制方法，研究毛竹林及阔叶林土壤细菌及真菌对氧化亚氮排放的贡献率，揭示不同微生物在林地土壤温室气体排放中的作用及其影响机制，从而对阔叶林演变成毛竹林进行生态风险评估，为合理经营毛竹林，减少温室气体排放提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 样品采集
在浙江省临安市天目山国家级自然保护区进行野外调查，在相似地形地貌条件下分别选取4块毛竹林地（moso bamboo forest，MB）和4块阔叶林地（broad-leaved forest, BL）。所有样地土壤均为花岗岩发育的红壤，毛竹林地土壤为粉黏土（黏粒43.27%，粉粒40.34%，砂粒16.39%），阔叶林地土壤为粉黏壤土（黏粒38.50%，粉粒48.68%，砂粒12.82%）。采用5点采样法采取土样，采集表层（0~20 cm）土壤，装入自封袋带回实验室。去除大的动植物残体及石砾后，样品过2 mm钢筛混匀，四分法后弃去多余样品。样品分为2份，1份立即进行室内培养试验和磷脂脂肪酸分析，另1份风干后测定土壤pH值、有机质、全氮质量分数等基本理化性质。
1.2 试验设置
混合后的新鲜土样用于室内培养试验，测定细菌及真菌对土壤氧化亚氮排放通量的贡献率。试验共分为4个处理：①对照（control），不添加任何抗生素；②链霉素（streptomycin，strep），土壤中添加1.0 mg·g-1的链霉素；③放线菌酮（cycloheximide，cyclo），土壤添加2.0 mg·g-1放线菌酮；④链霉素+放线菌酮（both），土壤中同时添加1.0 mg·g-1的链霉素和2.0 mg·g-1放线菌酮。重复3次·土样-1。
1.3 试验方法
1.3.1 土样培养试验
称取相当于20.0 g干质量的新鲜土壤放进150 mL棕色试剂瓶中，加入4.0 mL不同抗生素溶液（对照仅加去离子水）使土壤抗生素质量分数达到试验设计要求。试剂瓶装好土样后，先在4 ℃条件下过夜预培养，以使抗生素逐渐扩散至整个土壤空隙中。之后，将试剂瓶移至室温培养，向土壤中分别加入100 mmol· L-1葡萄糖和100 mmol· L-1硝酸钾，使土壤含水量达到田间最大持水量的90%左右。将试剂瓶用塞上橡胶塞后，向其中充体积分数为10%的乙炔以抑制氧化亚氮继续还原成氮气。将土样与溶液充分混合后，放在培养箱中18 ℃培养7 h后，开始用针筒抽取试剂瓶内气体，岛津（GC-2014）气相色谱测定氧化亚氮通量。
1.3.2 磷脂脂肪酸分析
新鲜样品带回实验室后，立即进行冷冻干燥，测定土壤磷脂脂肪酸摩尔质量浓度。磷脂脂肪酸测定参照Wu等[12]方法。称取3.0 g冻干土样，采用氯仿提取总磷脂后，将样品装载硅胶柱（SPE-Si），分别用氯仿、丙酮和甲醇洗脱中性脂、糖脂和极性磷脂。将所有组分进行甲基化，氯仿回收，氮气吹干后气相色谱（安捷伦6890N）测定。总磷脂脂肪酸摩尔质量浓度用于表征土壤总微生物量。细菌的代表性组分为：i15:0, a15:0, 15:0, i16:0, 16:1w7c, i17:0, a17:0, cy17:0, 17:0, 18:1w7c, cy19:0w8c；真菌特征性脂肪酸为18:2w6, 9c[13]。磷脂脂肪酸摩尔质量浓度以nmol·g-1干土表示。
1.3.3 土壤理化性质分析
土壤有机质采用重铬酸钾外加热法测定；全氮采用凯氏法测定；硝态氮和铵态氮采用氯化钾浸提，流动分析仪测定；有效磷采用Bray法测定，盐酸-氟化铵溶液浸提，比色法测定；速效钾采用乙酸铵提取-火焰光度法测定；pH值采用1:2.5土水比，酸度计测定[14]。
1.4 数据分析
采用Excel 2007和SPSS 18.0处理数据，Duncan单因素方差分析法比较各处理之间的差异显著性（P < 0.05），配对样本t检验比较毛竹林与阔叶林土壤理化性质及土壤细菌与真菌反硝化能力的差异显著性，采用Pearson相关系数检验不同微生物氧化亚氮排放能力与土壤理化性质的相关关系。
2. 结果与分析
2.1 土壤理化性质
所有样地土壤均表现出不同程度的酸性，而不同毛竹林及阔叶林样地之间土壤pH值差异也较大。分析结果表明：毛竹林不同样地土壤有机质、全氮、有效磷及硝态氮质量分数均没有显著差异，而阔叶林不同样地之间土壤有机质、全氮及速效钾也没有显著差异，说明不同林分土壤有机质及全氮质量分数分布总体较为均一。对比2种林分，阔叶林土壤pH值显著低于毛竹林（P < 0.05），而有机质与有效磷质量分数显著高于毛竹林土壤（P < 0.05）。相反，毛竹林土壤速效钾质量分数显著高于阔叶林（P < 0.05，表 1）。毛竹林入侵阔叶林或阔叶林人工演替为毛竹林后，由于地上植被以及凋落物输入的改变，土壤理化性质也发生了相应的变化。此外，毛竹林人为干扰程度也在不断增加，如劈灌、翻耕、施肥以及伐竹等，都会导致养分含量的改变，如土壤有机质质量分数。肖复明等[15]研究表明：长期集约经营后，毛竹林土壤有机碳逐渐下降。而毛竹林土壤速效钾高于阔叶林，可能是由于人为施肥所造成的。
表 1 毛竹林及阔叶林土壤理化性质Table 1. Soil parameters of Phyllostachy edulis and broad-leaved forest样地 pH值 有机质/（g·kg-1） 全氮/（g·kg-1） 有效磷/（mg·kg-1） 速效钾/（mg·kg-1） 铵态氮/（mg·kg-1） 硝态氮/（mg·kg-1） 毛竹林 MB-1 5.22±0.01 a 10.60±1.17 a 1.24±0.12 a 29.60±6.38 a 60.50±4.77 a 41.83±2.34 a 10.81±0.05 a MB-2 5.02±0.01 b 11.40±0.23 a 1.16±0.09 a 28.89±7.53 a 60.17±6.66 a 54.07±2.51 b 11.32±1.81 a MB-3 5.22±0.02 a 10.72±0.48 a 1.18±0.14 a 30.23±11.21 a 49.17±4.25 b 42.61±1.13 a 10.95±0.91 a MB-4 4.96±0.01 c 11.71±1.08 a 1.33±0.11 a 25.12±6.44 a 57.67±0.58 ab 55.11±2.78 b 11.68±1.81 a 阔叶林 BL-1 4.45±0.01 a 12.39±0.16 a 1.25±0.24 a 38.70±8.36 a 52.00±3.61 a 54.07±2.51 a 12.65±0.61 a BL-2 4.60±0.01 b 14.40±0.72 a 1.33±0.10 a 46.93±10.25 a 44.50±5.89 a 38.44±2.51 b 13.51±1.96 a BL-3 4.66±0.01 c 12.10±0.11 a 1.29±0.06 a 47.72±7.13 ab 42.00±12.17 a 43.39±3.41 ab 11.25±1.12 ab BL-4 4.79±0.01 d 13.41±2.18 a 1.26±0.13 a 55.40±4.97 b 38.17±3.06 a 44.95±1.78 ab 9.58±0.81 b 配对t检验P值 0.032 0.012 0.377 0.023 0.023 0.641 0.608 说明：表中数据为平均值，同列不同字母表示样地间差异达到显著水平（P < 0.05）。毛竹林与阔叶林之间的差异经配对样本t检验其显著性。 2.2 土壤微生物量
磷脂脂肪酸是几乎所有活体微生物细胞膜的主要成分，周转速率极快且随细胞死亡而迅速降解[16]。因此，本试验采用土壤微生物总磷脂脂肪酸摩尔质量浓度作为土壤微生物量的指标，可以最大限度地测定土壤中的活性微生物。结果表明：无论是总微生物量、细菌及真菌生物量以及真菌/细菌比值，毛竹林与阔叶林2种林分之间均没有显著差异。同样，毛竹林的不同样地之间也没有显著差异。阔叶林土壤中，BL-4样地总微生物量与细菌生物量均显著高于BL-1样地（P < 0.05，表 2）。Pearson相关分析表明：真菌生物量与土壤pH值呈显著负相关（R2=-0.752，P < 0.05），而与土壤有机质呈极显著正相关（R2=0.965，P < 0.01）；细菌生物量与土壤速效磷显著相关（R2=0.830，P < 0.05），而土壤真菌/细菌比值与硝态氮显著相关（R2=0.815，P < 0.05）。与细菌相比，真菌可以适应更广的pH值范围，且酸性pH值有利于真菌而不利于细菌的生长[17]。因此，在酸性的毛竹林和阔叶林土壤中，真菌的活性相对较强。有机质也是影响真菌的一个重要因素。研究表明：森林转换为耕地之后导致土壤有机质降低，进而降低林地土壤真菌生物量[18]。与土壤有机质相似的是，毛竹林真菌生物量与阔叶林相比有下降的趋势，尽管没有显著差异。
表 2 毛竹林及阔叶林土壤微生物量Table 2. Soil microbial biomass of Phyllostachy edulis and broad-leaved forest样地 土壤微生物量/（nmol·g-1） 真菌生物量/（nmol·g-1） 细菌生物量/（nmol·g-1） 真菌/细菌 毛竹林 MB-1 31.06±4.80 a 3.52±0.25 a 12.13±0.88 a 0.29±0.02 a MB-2 24.75±3.96 a 3.80±0.45 a 11.80±2.54 a 0.33±0.07 a MB-4 23.50±4.25 a 3.75±0.26 a 12.94±1.35 a 0.29±0.05 a MB-3 26.67±4.76 a 4.12±0.55 a 11.56±2.00 a 0.37±0.11 a 阔叶林 BL-1 26.98±2.23 a 4.83±0.55 a 12.99±0.82 ab 0.37±0.04 a BL-2 34.27±4.93 ab 4.10±0.30 a 14.65±0.71 b 0.28±0.03 a BL-3 36.05±3.34 b 4.26±0.29 a 14.91±0.56 b 0.29±0.02 a BL-4 27.22±1.75 a 4.04±0.63 a 11.41±1.19 a 0.36±0.08 a 说明：表中数据为平均值，同列不同字母表示同一林分不同样地之间差异达到显著水平（P < 0.05）。 2.3 细菌及真菌氧化亚氮排放贡献
不同林分土壤以及同一种林分不同样地之间氧化亚氮的排放通量都存在较大差异，其中毛竹林MB-1样地土壤氧化亚氮排放通量最高，其次是MB-4，BL-3及BL-4等样地，MB-2和BL-1，BL-2等样地的氧化亚氮排放通量最低（图 1）。相关分析结果表明：土壤氧化亚氮排放通量与本研究所选择测定的部分土壤理化性质没有显著相关性。土壤氧化亚氮排放与许多因素有关，如土壤含水量、容重、pH值、有机质质量分数、氮肥施用量等等[19]。因此，本研究中不同林分甚至同一林分不同样地之间存在的巨大差异，可能是由多种土壤环境因素共同决定的，其影响因素还有待于进一步的研究。统计结果表明：毛竹林和阔叶林土壤氧化亚氮排放通量没有显著差异（t=-0.574, P=0.606）。在以往对森林土壤氧化亚氮排放通量的研究过程中，往往将土壤温度和湿度作为关键因子[20]，但近年来的研究则发现：氮素水平是一个关键因素[21]。对比2种不同林分，无论是土壤全氮还是矿质态氮均没有显著差异（表 1），这可能是2种林分氧化亚氮排放通量没有差异的主要原因。
图 1 毛竹林及阔叶林土壤氧化亚氮排放通量Figure 1. N2O fluxes in Phyllostachy edulis and broad-leaved forest soils无论是单独添加放线菌酮、链霉素还是同时添加2种抗生素，均显著抑制了土壤氧化亚氮排放通量（P < 0.05）。同时添加2种抗生素对土壤氧化亚氮排放通量的抑制率在73%~83%，但是同一林分的不同样地之间没有显著差异，而单独添加链霉素或者放线菌酮的处理对土壤氧化亚氮排放通量的抑制率变化较大。图 2结果表明：在2种林分的样地中，除了个别样地外（MB-2，BL-1），其他所有土壤真菌氧化亚氮排放通量均显著高于细菌（P < 0.05）。如在毛竹林土壤中，真菌对土壤氧化亚氮排放的贡献率为40.8%~56.2%，远高于细菌（9.0%~33.4%）。阔叶林土壤中也呈现同样的规律，真菌对土壤氧化亚氮排放贡献率为38.0%~62.8%，而细菌的贡献率为12.6%~32.4%（图 2）。目前，已有研究表明，在森林生态系统中的真菌群落对土壤氧化亚氮排放的贡献要大于草地以及人为耕作的生态系统[4-5, 8]。同时，真菌与细菌对土壤氧化亚氮排放的贡献比在不同的生态系统中存在着较大的差异[22]。毛竹林与阔叶林由于其地上植被以及人为干扰程度不一样，真菌与细菌对土壤氧化亚氮排放的贡献率也就存在着一定的差异。
图 2 毛竹林及阔叶林土壤真菌及细菌的氧化亚氮排放通量Figure 2. Contributions of fungi and bacteria on N2O fluxes in Phyllostachy edulis and broad-leaved forest soils与此类似的是，在2种林分的不同样地之间，土壤真菌及细菌对氧化亚氮排放通量的贡献率也有着显著的差异（P < 0.05）。如在毛竹林土壤中，尽管氧化亚氮排放通量显著低于样地MB-1（P < 0.05），但是MB-3样地的土壤真菌氧化亚氮排放贡献率达到56.2%，显著高于MB-1样地真菌排放贡献率（49.7%，P < 0.05）。而在阔叶林土壤中，BL-3和BL-4样地土壤总氧化亚氮排放通量显著高于（P < 0.05）另外2个样地的同时，其真菌氧化亚氮排放贡献率也显著高于样地BL-1和BL-2（P < 0.05）。
将土壤氧化亚氮排放通量与所有土壤理化性质及微生物生物量进行Pearson相关分析。结果表明：真菌与细菌的氧化亚氮排放贡献之间存在极显著的相关性（P < 0.01），可能与2种微生物群落反硝化的环境条件要求较为相似有关。值得注意的是，真菌及细菌氧化亚氮排放通量与其生物量之间没有显著相关性，说明生物量并非是决定氧化亚氮排放通量的关键因素。由于只有一些特定的真菌即细菌种类可以进行反硝化作用，如真菌中的镰刀菌属Fusarium spp.具有较强的氧化亚氮释放能力[23]。因此，真菌的氧化亚氮排放贡献主要与真菌群落及特定种群的反硝化活性相关。今后仍然需要从微生物物种多样性以及功能基因丰度等方面来进一步研究土壤反硝化作用的主要贡献者及其关键影响因素。以往有研究结果表明：真菌与细菌的氧化亚氮产生活性与土壤pH值关系较大，这可能是由于pH值对这2种微生物数量及活性均有着重要的影响[22, 24]。由于真菌可以适应非常宽的pH值范围，其受土壤pH值改变的影响相对细菌小，而细菌生物量在酸性条件下可能会受到抑制，因此在酸性土壤中真菌对氧化亚氮排放的贡献就会大于细菌。然而与以往结果不同的是，本研究发现土壤真菌即细菌氧化亚氮排放通量与土壤pH值没有显著相关关系，这可能与不同样地之间pH值较为接近有关。但是，真菌氧化亚氮排放通量与土壤硝态氮含量有较强的负相关关系，尽管并不显著（R2=-0.673，P=0.067）。通常，氧化亚氮通量与NO3-N呈负相关关系。随着反硝化作用的进行，NO3-N作为电子受体含量下降，还原成氧化亚氮释放出来[25]。
3. 结论与展望
抗生素选择性抑制试验结果表明：①无论是毛竹林还是阔叶林，真菌都是土壤氧化亚氮排放的主要贡献者；②阔叶林演替为毛竹林既没有改变土壤氧化亚氮排放通量，也没有影响真菌及细菌对土壤氧化亚氮排放通量的相对贡献率；③真菌和细菌氧化亚氮排放特征相似，但与生物量没有相关性。
近年来，毛竹林不断替代阔叶林的同时，经营强度也在不断增加。据统计，有40%~50%的毛竹林实行集约化栽培。与天然状态的粗放经营毛竹林相比，集约经营毛竹林的典型特点表现为清除林下杂草，土壤翻耕以及施用大量化肥等。尽管集约经营措施可以一定程度上增加毛竹地上部的生物量，提高碳储量[26]，但也有研究表明，使用化肥显著增加了毛竹林土壤二氧化碳和氧化亚氮的排放通量，且毛竹林土壤温室气体的排放速率随着化肥施用量增加呈显著增加趋势[27]，但是其内在机制仍不清楚。人为干扰如翻耕、放牧以及氮肥施用等都会影响土壤真菌群落结构和功能[28]，继而对土壤氧化亚氮排放产生潜在影响。本研究中，我们只是针对阔叶林和毛竹林进行了研究，但是不同经营年限以及经营强度对毛竹林土壤真菌氧化亚氮相对排放贡献的影响尚未涉及，今后仍需在更加广泛的范围内针对人工经营毛竹林进行采样，并结合稳定性同位素标记手段来研究真菌在森林，特别是人工经营森林生态系统氧化亚氮排放中的贡献。明确土壤真菌氧化亚氮排放相对贡献及其对毛竹林人为经营的响应特征，对于合理经营毛竹林，控制全球气候变化将具有十分重要的意义。
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图 5 质量分数为0.05%和0.15%的药剂下嘧菌酯3种制剂处理木材的流失率
Figure 5 Leaching rates of treated wood by 3 formulations of azoxystrobin with content of 0.05% and 0.15%
表 1 精密度试验结果
Table 1. Precision test results
试样 平行试样质量分数/% 标准偏差/% 变异系数/% 1 2 3 4 5 6 平均值 制剂A1 10.06 10.17 10.13 10.23 10.20 10.12 10.15 0.06 0.59 制剂A2 10.17 10.18 10.11 10.09 10.07 10.15 10.13 0.05 0.45 
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表 2 准确度试验结果
Table 2. Accuracy recovery test results
试样
编号本底值/
(mg·L−1)加入标样量/
(mg·L−1)理论值/
(mg·L−1)实测值/
(mg·L−1)回收率/
%1 0 10 10.00 9.82 98.2 2 0 20 20.00 19.94 99.7 3 0 40 40.00 39.66 99.1 4 28.16 10 38.16 38.24 100.2 5 28.16 20 48.16 48.28 100.3 6 28.16 40 68.16 68.42 100.4
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