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植物丰富的花色由植物组织和器官的特定细胞色素所呈现，随类黄酮、类胡萝卜素和甜菜色素等次生代谢产物含量变化而变化[1−2]。类黄酮包括原花青素、花色素、异黄酮、黄酮醇、黄烷酮五大类[3−4]，其中花色素生物合成途径[5]已被研究得较为清晰。花色苷生物合成是类黄酮途径的一个分支，以丙二酰辅酶A(malonyl-CoA)和苯丙氨酸(phenylalanine)为底物，经查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)、黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase, F3H)、黄烷酮3′-羟化酶(flavanone 3′-hydroxylase, F3′H)、类黄酮-3′, 5′-羟化酶(flavonoid-3′, 5′-hydroxylase, F3′5′H)、二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase, DFR)等合成酶及不同底物分别形成无色天竺葵色素、矢车菊色素和飞燕草色素；经花青素合成酶(anthocyanidin synthase, ANS)催化生成有色花色素，再经花色素酰基转移酶、糖基转移酶和甲基转移酶的转化形成不同颜色的矢车菊色素、天竺葵色素以及飞燕草色素[6−8]，最后经类黄酮糖基转移酶(flavonoid-3-O-glucosyltransferase，UFGT)将不稳定的色素转变为稳定的花色苷，由谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)转运至液泡中储存。
UFGT是类黄酮生物合成下游途径最后一个关键酶，可催化UDP-葡萄糖上的葡萄糖基转移至花色素C环C3羟基上，主要参与花色素支路和黄酮醇支路的糖基化过程[9]。近年来，有关植物UFGT的表达与花色苷积累的报道较多，UFGT可催化花色苷的形成，正调控花色苷积累。猕猴桃Actinidia chinensis糖基转移酶基因F3G77和F3GG77参与花色苷的合成[10]；唐古特白刺Nitraria tangutorum NtUFGT可将不稳定的花色素转变为稳定的花色苷，积累花色素抵抗逆境胁迫[11]；UFGT是调控紫山药Dioscorea alata颜色的关键酶基因[12]；杨梅Morella rubra UGT71AN1可利用酶促或全细胞生物催化进行糖基化结构修饰[13]；四季秋海棠Begonia semperflorens BsUFGT能够促进花色苷的合成和积累[14]；紫薇Lagerstroemia indica LiUFGT对紫薇花色基因具有直接调控的作用，在红色花瓣中表达量最高，在白色中最低[15]。大量研究表明UFGT可能与其他基因共同调控花色苷的积累。葡萄Vitis vinifera VvMYBA1通过激活VvUFGT启动子活性，调控花色苷合成积累[16]；荔枝Litchi chinensis LcMYB1直接结合LcDFR和LcUFGT1启动子激活基因表达，进而调控花色苷的生物合成[17]；芒果Mangifera indica MiMYB1可直接结合MiUFGT43启动子，激活MiUFGT43表达，从而影响采后芒果花青苷的合成[18]；石榴Punica granatum 转录因子R2R3-PgMYB通过调控PgUFGT表达来调节花色苷合成[19]。
换锦花Lycoris sprengeri为石蒜科Amaryllidaceae石蒜属Lycoris多年生球根花卉，是良好的花园地面覆盖植物，其花色为特殊的红蓝复合色，是研究多色花形成的较好材料。近年来，学者们从花色苷形成相关的关键酶基因LsF3′H和LsANS及R2R3-MYB类调控基因的克隆和表达深入，探究换锦花花色的形成机制[20−24]，基于基因沉默载体(virus-induced gene silencing，VIGS)的LsMYB4和LsMYB5基因沉默后可上调LsUFGT表达[23]，这为换锦花花色育种和新品种选育奠定了一定的理论基础。为进一步研究和解析LsUFGT1对换锦花花瓣呈色的作用，本研究采用逆转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)、RACE (rapid amplification of cDNA ends)和染色体步移 (genome walking)技术分离换锦花LsUFGT1基因及启动子序列，并利用双荧光素酶报告实验分析LsMYB4和LsMYB5转录因子对LsUFGT1基因启动子的激活功能，以期为进一步解析换锦花花瓣呈色的分子机制提供基础，为石蒜属植物基因工程花色改良提供技术指导。
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于2018年8—9月，于浙江农林大学石蒜属植物种质资源圃，采集盛花期换锦花新鲜花瓣(粉色和蓝色部分)和花发育不同时期(小花苞、大花苞、盛花期)花瓣，液氮速冻，于−80 ℃冰箱保存备用；拟南芥Arabidopsis thaliana (抽薹7 d)用于β-葡萄糖苷酶(GUS)染色。
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使用改良CTAB+Trizol法[25]提取换锦花花瓣总RNA，用质量浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量及完整性。参照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (Takara)说明书合成5′-RACE -Ready cDNA第1链。根据换锦花花瓣转录组的LsUFGT1 (GenBank: MT664242.1)序列信息设计LsUFGT1-5′ GSP1和LsUFGT1-5′ GSP2引物(表1)，PCR扩增LsUFGT1序列5′端的未知序列，用质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，回收目的片段并连接到pMD-19T载体(Takara)上，转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆送杭州擎科生物技术有限公司测序。
表 1 引物序列
Table 1. Sequences of the primers
引物名称 引物序列(5′→3′) 引物用途 LsUFGT1-5′GSP1 AAGACCATAGAAAGAGGACCCCGC LsUFGT1基因5′端的未知序列扩增 LsUFGT1-5′GSP2 CGCTCGCTTCCAATCCCTCTGCC LsUFGT1全长-F TAGCCTGTGCCACTTCCCTT LsUFGT1基因扩增 LsUFGT1全长-R GCTGGAGAGTTCGCAATACA Q-LsUFGT1-F GGTGGTGAAGGATGAGGAAGGTAGG 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) Q-LsUFGT1-R GTTGAACCGCTCGAACCGCAATC Q-LsACTIN-F CAGACTTTCAATGTGCCCG Q-LsACTIN-R CACCATCACCAGAATCCAGC LsUFGT1-R-SP1 CGCTGATTAGACACGTGATCCTCAA 启动子克隆 LsUFGT1-R-SP2 CTCGAAGATCCTGAGGTTGGGT LsUFGT1-R-SP3 TGGCGGTGGTGGCAATCTAATC LsUFGT1-2-R-SP1 GGGAGGGGAAATATCCAAAATGGAG LsUFGT1-2-R-SP2 TTCTGATTGGGCCACGTCGTCGTTC LsUFGT1-2-R-SP3 GGTGAAGCTGCTGTTCGGTGACGTGT LsUFGT1-pro-F AAATAAAGGAAGGAGGGAGTGG LsUFGT1启动子扩增 LsUFGT1-pro-R GGCAATCTAATCCCATGGT pBI121-LsUFGT1-pro::GUS-F TGATTACGCCAAGCTTAAATAAAGGAAGGAGGGAGTGG pBI121载体构建 pBI121-LsUFGT1-pro::GUS-R CCGGGGATCCTCTAGATGGCAATCTAATCCCATGGT pGreenⅡ 62-SK-LsMYB4-F TGGCGGCCGCTCTAGATGGGTAGGTCTCCATGCTG 双荧光素酶报告实验 pGreenⅡ 62-SK-LsMYB4-R CAGCGTACCGAATTGTCAAACACTACTTCTAAAGTCCAAT pGreenⅡ 62-SK-LsMYB5-F TGGCGGCCGCTCTAGATGGGTAGATCTCCATGTTG pGreenⅡ 62-SK-LsMYB5-R CAGCGTACCGAATTGCTATCTAATTACATGTGGATTGAT pGreenⅡ 0800-LsUFGT1-pro-LUC-F CGGTATCGATAAGCTGTCGAGTGATATGAAAAGTACTCC pGreenⅡ 0800-LsUFGT1-pro-LUC-R TAGAACTAGTGGATCGGTGGATGCGCAGGTTAG 利用Primer Premier 5.0设计拼接的LsUFGT1未知序列扩增引物(表1)，以cDNA第1链为模板PCR扩增验证LsUFGT1序列是否正确。通过在线软件ORF Finder (
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.htmL )查找LsUFGT1 cDNA序列开放阅读框(open reading frame, ORF)；利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ )检索近缘物种的UFGT序列信息；利用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/ )分析蛋白质理化性质；利用NPSA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_seccons.htmL )预测蛋白质二级结构；通过DNAMAN软件进行氨基酸序列比对；使用MEGA7.0构建系统进化树。 -
采用Prime ScriptRT reagent Kit Perfect Real Time (TaKaRa)试剂盒合成cDNA第1链，利用Primer 5.0设计实时荧光定量PCR (RT-qPCR)引物(表1)，使用RT-qPCR技术检测LsUFGT1在换锦花盛花期花瓣和不同花发育时期花瓣表达模式，以LsActin为内参基因[26]，用2−ΔΔCt计算各基因的相对表达量。
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将采集的换锦花花瓣避光冻干7 d后研磨，精密称量换锦花花瓣干粉0.040 0 g，加入2 mL 体积分数为1%的CH4-HCl溶液，充分摇匀，密塞，20 ℃超声波提取30 min，12 000 r·m−1 离心15 min，收集上清液，0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液于−20 ℃冰箱保存待用，每个样本重复3次。总花色苷测定方法采用UltimateR LP-C18 column (4.6 mm×250.0 mm，5 µm)[24]，以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为标准品，重复3次，SPSS 20.0处理数据和分析差异显著性，并利用GraphPad Prism 8.0绘图。
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采用染色体步移法分离LsUFGT1启动子序列。采用CTAB法提取换锦花基因组DNA，以质量浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量。利用Primer Premier 5.0设计LsUFGT1基因启动子克隆和扩增引物(表1)，以换锦花基因组DNA为模板，采用Genome Walking Kit (Takara)扩增LsUFGT1启动子序列，以质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的片段，连接到pMD-19T载体，转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆检测并测序。通过BDGP (
https://www.fruit-fly.org/seq_tools/promoter.html )预测启动子转录起始位点，Plant CARE (https://bioinfor-matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htm L/ )分析启动子顺式作用元件。 -
采用同源重组法构建pBI121-LsUFGT1-pro::GUS表达载体，将重组质粒转入农杆菌 GV3101感受态细胞，采用整染法[27−28]瞬时侵染拟南芥植株48 h后，洗净拟南芥植株表面菌液，用GUS染色液37 ℃染色过夜，将植株于脱色液(无水乙醇和冰乙酸体积比为3∶1)中脱色2~4 h后，置于体积分数为70%的乙醇保存，观察LsUFGT1启动子在拟南芥植株的表达并拍照。
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采用无缝克隆技术构建pGreenⅡ 0800-LsUFGT1-pro-LUC 和pGreenⅡ 62-SK-LsMYB4、pGreenⅡ 62-SK-LsMYB5表达载体，使用冻融法将pGreen Ⅱ 62-SK、pGreenⅡ 0800-LUC 空载及重组质粒转入农杆菌 GV3101感受态细胞，注射烟草叶片暗培养 24 h后，正常光照培养 48 h 后用6 mm 打孔器取样；液氮研磨，根据Dual-Luciferase® Reporter Assay System试剂盒的说明书用GloMax 20/20 2020化学发光检测仪(Promega)检测萤火虫荧光素酶(Luc)和海肾荧光素酶(Ren)活性，并计算Luc/Ren比值。
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以换锦花花瓣cDNA为模板，采用RACE技术克隆LsUFGT1基因cDNA序列(图1)，LsUFGT1共1 632 bp，开放阅读框为1 398 bp，编码465个氨基酸，GenBank数据库登录号为MT664242.1。
图 1 LsUFGT1基因 cDNA 序列PCR扩增
Figure 1. Results of LsUFGT1 cDNA cloning
在线分析LsUFGT1蛋白分子式C
4822 H8014 N1632 O2 030S439，分子质量约153.4 kD，理论等电点(pI)为4.93，总体亲水性GRAVY为0.745，不稳定系数为46.80。可见，LsUFGT1蛋白为疏水性不稳定蛋白。利用SOPMA预测LsUFGT1二级结构，由α-螺旋(38.49%)、β-折叠(6.88%)、延伸链(16.34%)和无规卷曲(38.28%)构成(图2)，表明LsUFGT1蛋白主要由α-螺旋和无规卷曲构成。
图 2 LsUFGT1的二级结构预测图
Figure 2. Predicted secondary structure of LsUFGT1
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利用DNAMAN对换锦花LsUFGT1氨基酸序列同源性进行比对(图3)，发现换锦花LsUFGT1与水仙Narcissus tazetta KJ879945.1相似性达60.57%，与洋葱Allium cepa KC466029.1、荷兰鸢尾Iris × hollandica AB161175.1、小苍兰Fressia hybrida HM590645.1和郁金香Tulipa × gesneriana KF792732.1相似性约43%，与杂交百合Lilium hybrida KX781249.1相似性达40.27%，但与拟南芥At4G01070.1相似性为20.13%，与水稻Oryza sativa Os07g05420.1相似性为32.05%，说明换锦花LsUFGTs家族与拟南芥、水稻在种属关系以及功能上相关性较小。HMMER检测到这些物种氨基酸的保守结构区域在220~426肽链区间，含保守结构域UDPGT，说明UFGT属于UDPGT型糖基转移酶超家族的一员，具有该家族的特征区域。
图 3 LsUFGT1与其他植物的UFGT氨基酸多序列比对
Figure 3. Amino acid alignment of LsUFGTs and UFGTs from other species
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对换锦花与其他已知植物的UFGTs蛋白进行系统进化分析(图4)。结果表明：换锦花LsUFGT1与石蒜科Amaryllidaceae的水仙Narcissus tazetta KJ879945.1、百合科Liliaceae洋葱Allium cepa KC466029.1聚为一类，与拟南芥和水稻UFGTs同源性低，亲源关系较远，具有明显的种属特性。
图 4 LsUFGT1与其他植物UFGTs蛋白的系统进化树分析
Figure 4. Phylogenetic relationships between LsUFGT1 and other species UFGTs proteins
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RT-qPCR分析(图5)发现：LsUFGT1基因在不同花发育时期均能表达，且差异显著(P＜0.05)，在小花苞时期表达量最高，其次是大花苞，盛花期表达量最低，而粉瓣和蓝瓣的表达量差异不显著。因此推测LsUFGT1基因在换锦花发育前期起关键作用，且与花发育前期花色苷的生物合成密切相关，但与粉色和蓝瓣的形成相关性不大。
图 5 LsUFGT1基因的表达模式
Figure 5. Expression models of LsUFGT1 gene
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HPLC测定的花瓣总花色苷质量浓度随花发育时间呈显著递减趋势(P＜0.05，图6A)，与LsUFGT1基因的表达趋势一致，小花苞期的总花色苷质量浓度最高；换锦花同朵花的粉瓣的总花色苷质量浓度显著高于蓝瓣(P＜0.05，图6B)，LsUFGT1相对表达量与花色苷质量浓度呈正相关(图6C)，推测LsUFGT1可能参与换锦花花发育前期花色苷的生物合成，而影响花瓣着色。
图 6 换锦花花瓣总花色苷质量浓度
Figure 6. Total anthocyanin content of petals in L. sprengeri
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获得长1 184 bp的LsUFGT1启动子序列(图7)，利用BDGP预测LsUFGT1基因的转录起始位点，发现起始位点为ATG前87个碱基处A，LsUFGT1启动子有TATA box以及CAAT box等基本顺式作用元件，还有Box-4、G-box、GA-box、TCT光响应元件；ABRE、TGACG-motif、CGTCA-motif、TCA-element、TGA-element激素响应元件和逆境胁迫响应元件LTR、MBS等(表2)，其中CCAAT-box、MBS与MYB结合。
图 7 LsUFGT1启动子序列克隆电泳图
Figure 7. Electrophoresis map of promoters clone of LsUFGT1
表 2 LsUFGT1启动子元件
Table 2. Elements in LsUFGT1 promoter
元件 植物 基序 数量 功能 ABRE 拟南芥 ACGTG 1 脱落酸响应元件 ARE 玉米 AAACCA 1 厌氧诱导所必需顺式作用元件 Box-4 皱叶欧芹 ATTAAT 2 参与光响应的保守DNA部分 CAAT-box 豌豆、拟南芥 CAAAT、CCAAT 3 启动子和增强子顺式作用元件 CAT-box 拟南芥 GCCACT 1 分生组织表达相关的顺式作用调控元件 CCAAT-box 大麦 CAACGG 1 大麦MYB结合位点 CGTCA-motif 大麦 CGTCA 1 茉莉酸甲酯响应顺式作用元件 G-box 玉米 CACGTC 1 光响应顺式作用元件 GA-motif 拟南芥 ATAGATAA 1 部分光响应元件 GC-motif 玉米 CCCCCG 2 缺氧特异诱导的增强子样元件 GT1-motif 燕麦 GGTTAAT 1 光响应元件 LTR 大麦 CCGAAA 2 低温反应的顺式作用元件 MBS 拟南芥、烟草 CAACAG 1 参与干旱调控MYB结合位点 TATA-box 拟南芥、水稻、欧洲油菜 TACAAAA、ATTATA、TATA、ATATAT 5 转录起始位点上游-30的启动子核心元件 TCA-element 烟草 CCATCTTTTT 1 水杨酸反应的顺式作用元件 TCT-motif 拟南芥 TCTTAC 1 部分光响应元件 TGA-element 甘蓝 AACGAC 1 生长素响应元件 说明：拟南芥.Arabidopsis thaliana，玉米.Zea mays，豌豆.Pisum sativum，水稻. Oryza sativa，大麦.Hordeum vulgare，燕麦.Avena sativa，欧洲油菜.Brassica napus，烟草. Nicotiana tabacum，甘蓝. Brassica oleracea。 -
图8A显示：经GUS组织化学染色检测，阴性对照拟南芥植株染色后未检测到GUS活性(图8C)，而阳性对照(图8B)和pBI121-LsUFGT1-pro::GUS植株(图8D)在拟南芥叶片和根部呈现蓝色，表明长为1 184 bp的 LsUFGT1基因启动子区域具有启动下游基因的活性。
图 8 瞬时转化拟南芥GUS组织化学染色结果
Figure 8. GUS histochemical staining results of transiently transformed Arabidopsis thaliana
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将LsMYB4、LsMYB5基因和LsUFGT1启动子序列分别连接到pGreenⅡ 62-SK和pGreenⅡ 0800-LUC中，进行双荧光素酶活性检测，以pGreenⅡ 0800-LsUFGT1-pro-LUC+62-SK-empty为对照，发现LsUFGT1-pro具有启动子活性；而将pGreenⅡ 62-SK-LsMYB4/LsMYB5分别和pGreenⅡ 0800-LsUFGT1-pro-LUC载体共同转化烟草叶片，发现LsMYB4、LsMYB5转录因子分别能显著(P＜0.05)和极显著(P＜0.01)抑制LsUFGT1启动子的活性(图9)，因此推测LsMYB4和LsMYB5均对LsUFGT1具有反向调节的作用。
图 9 双荧光素酶报告
Figure 9. Dual-luciferase reporter assay
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花青素是一种重要的植物色素，作为类黄酮途径的末端产物，由内质网膜系列酶催化合成，其中，UFGT在花青素生物合成途径中催化植物细胞中不稳定的花青素转化成稳定的花色苷[29]。已有研究发现：红叶山茶‘金华美女’ Camellia japonica‘Jinhua Meinü’叶片生长过程中，CjUFGT持续催化花青素合成，花青素苷大量积累，导致叶片颜色变深[30]；四季秋海棠BsUFGT在烟草Nicotiana tabacum ‘NC89’中过表达能够提高花瓣的颜色和花色苷矢车菊素-3-O-芸香糖苷(cyanidin-3-O- rutinoside, Cy-3R)含量[14]；黑果枸杞Lycium ruthenicum LrUFGT1的表达具有组织特异性，且主要在花和紫果中表达，表达量随花朵的发育先增加后减少，表明 LrUFGT1 可能参与了黑果枸杞花朵的呈色，影响黑果枸杞果实和花瓣的着色[31]；菊花Chrysanthemum morifolium CmUFGT表达与彩斑突变体CQ17-mu植株花瓣中紫色条斑呈色有关[32]；特异性敲除蝴蝶兰Phalaenopsis equestris PeUFGT3，其花朵中花色苷含量显著降低，同时花朵颜色变浅[33]。本研究发现LsUFGT1与换锦花花瓣花色苷含量呈正相关，换锦花不同发育期LsUFGT1表达差异显著，呈递减趋势。
花色苷生物合成还受转录因子MYB、bHLH和WD40单独或形成MBW复合体协同调控，转录因子往往直接结合到花色苷形成基因启动子调控花色苷积累[34]。启动子是基因转录调控的核心组件，位于基因上游区域，专门负责激活RNA聚合酶，从而精准调控基因的表达[35]。常通过瞬时表达法将启动子表达载体导入植物受体，短时间内通过检测报告基因在受体植物中的表达位置和活性，从而研究启动子片段功能。李琴琴等[36]利用GUS组织化学染色发现瞬时转化烟草中卵叶牡丹Paeonia qiui proPqDFR和proPqANS均具有启动子活性；姜宁等[37]研究发现proVvAGL12启动子片段在拟南芥中具有启动活性，能够激活GUS在转基因拟南芥植株叶片、茎段、花器官、根和果荚部位的表达；周琳等[38]经GUS组织化学染色和酶活性检测，发现牡丹PsDFR启动子缺失片段都具有启动子活性。本研究克隆的LsUFGT1pro启动子序列能够启动GUS在拟南芥植株的表达，说明LsUFGT1基因起始密码子上游1 184 bp序列具有启动下游基因的活性。此外，前期研究发现换锦花LsMYB4和LsMYB5基因沉默后会导致换锦花花瓣LsUFGT1的表达上调[23]，本研究双荧光素酶报告实验发现LsMYB4和LsMYB5能够显著抑制LsUFGT1启动子活性，这与荔枝LcUFGT1的启动子受到LcMYB1的调控而影响花色苷的积累相一致[17]。
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本研究克隆到长1 632 bp的LsUFGT1基因cDNA和1 184 bp启动子序列，LsUFGT1基因在换锦花花发育和不同花色花瓣的基因表达与总花色苷含量的变化相一致，LsMYB4和LsMYB5转录因子对LsUFGT1基因的表达起着负调控的作用。本研究结果为进一步研究换锦花花色形成的机制提供了理论依据，对深入研究换锦花花色相关基因调控模式具有重要的基础意义。
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换锦花类黄酮糖基转移酶基因LsUFGT1及其启动子克隆与表达
DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20240508
Cloning and expression of the gene and promoter of LsUFGT1 from Lycoris sprengeri
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摘要:
目的 花色苷是决定植物花色的重要成分，类黄酮糖基转移酶(UFGT)在花色苷生物合成途径下游发挥作用，将不稳定的花色素转变为稳定的花色苷。通过分析换锦花Lycoris sprengeri LsUFGT1基因功能，为进一步解析换锦花花瓣呈色的机制提供理论基础。 方法 采用基因克隆、逆转录PCR、染色体步移法、组织化学染色和双荧光素酶报告实验等多种分子生物学技术，研究LsUFGT1基因和其启动子序列的功能。 结果 ①获得长1 632 bp的LsUFGT1基因cDNA序列，开放阅读框长1 398 bp，编码465个氨基酸；LsUFGT1与水仙 Narcissus natatorium NtUFGT1同源性最高，达60.57%。② LsUFGT1表达量与总花色苷含量的变化趋势一致，在小花苞时期表达量最高，在粉瓣和蓝瓣中表达量差异不显著。③ 获得的LsUFGT1启动子序列长1 184 bp，含MYB结合位点、光响应、激素响应及逆境胁迫响应等顺式作用元件，拟南芥Arabidopsis thaliana β-葡萄糖苷酶(GUS)染色结果表明LsUFGT1启动子区域具有启动子活性。④ 双荧光素酶报告实验发现LsMYB4和LsMYB5能够显著抑制LsUFGT1启动子活性(P＜0.05)。 结论 LsMYB4和LsMYB5直接结合LsUFGT1启动子反向调控换锦花花色苷的积累。图9表2参38 -
关键词:
- 换锦花 /
- 类黄酮糖基转移酶(UFGT) /
- 花色苷 /
- 功能分析
Abstract:Objective Anthocyanins are important components that determine flower color in plants. Flavonoid-3-O-glycosyltransferase (UFGT) plays a role in the downstream of anthocyanins biosynthesis, which converts unstable pigments into stable anthocyanins. This study analyzed the function of LsUFGT1 gene in Lycoris sprengeri, which would provide a theoretical basis for further studying the flower coloration mechanism in L. sprengeri. Method Several molecular biology techniques such as gene cloning, reverse transcription PCR (RT-PCR), genome walking, histological staining, and dual luciferase reporter assay, were used to study the functions of LsUFGT1 and its promoter. Result (1) The cDNA sequence of LsUFGT1 was obtained with a length of 1 632 bp, with an open reading frame of 1 398 bp, encoding 465 amino acids; the homology between LsUFGT1 and NtUFGT1 in Narcissus ntazettatorium was up to 60.57%. (2) The expression of LsUFGT1 was consistent with the trend of total anthocyanin contents, and was the most highest at blooming period, whereas the difference in expression between the pink and blue petal parts was not significant. (3) The LsUFGT1 promoter with 1 184 bp length was cloned, which contained cis-acting elements such as MYB binding site, response to light, hormone and adverse stress. β-glucosidase (GUS) histological staining in Arabidopsis thaliana showed that the LsUFGT1 promoter had promoter activity. (4) Dual luciferase reporter assays revealed that LsMYB4 and LsMYB5 were able to significantly inhibit the activity of the LsUFGT1 promoter (P＜0.05). Conclusion LsMYB4 and LsMYB5 modulated anthocyanin accumulation by directly binding to the LsUFGT1 promoter in L. sprengeri. [Ch, 9 fig. 2 tab. 38 ref.] -
图 3 LsUFGT1与其他植物的UFGT氨基酸多序列比对
Figure 3 Amino acid alignment of LsUFGTs and UFGTs from other species
图 4 LsUFGT1与其他植物UFGTs蛋白的系统进化树分析
Figure 4 Phylogenetic relationships between LsUFGT1 and other species UFGTs proteins
图 8 瞬时转化拟南芥GUS组织化学染色结果
Figure 8 GUS histochemical staining results of transiently transformed Arabidopsis thaliana
表 1 引物序列
Table 1. Sequences of the primers
引物名称 引物序列(5′→3′) 引物用途 LsUFGT1-5′GSP1 AAGACCATAGAAAGAGGACCCCGC LsUFGT1基因5′端的未知序列扩增 LsUFGT1-5′GSP2 CGCTCGCTTCCAATCCCTCTGCC LsUFGT1全长-F TAGCCTGTGCCACTTCCCTT LsUFGT1基因扩增 LsUFGT1全长-R GCTGGAGAGTTCGCAATACA Q-LsUFGT1-F GGTGGTGAAGGATGAGGAAGGTAGG 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) Q-LsUFGT1-R GTTGAACCGCTCGAACCGCAATC Q-LsACTIN-F CAGACTTTCAATGTGCCCG Q-LsACTIN-R CACCATCACCAGAATCCAGC LsUFGT1-R-SP1 CGCTGATTAGACACGTGATCCTCAA 启动子克隆 LsUFGT1-R-SP2 CTCGAAGATCCTGAGGTTGGGT LsUFGT1-R-SP3 TGGCGGTGGTGGCAATCTAATC LsUFGT1-2-R-SP1 GGGAGGGGAAATATCCAAAATGGAG LsUFGT1-2-R-SP2 TTCTGATTGGGCCACGTCGTCGTTC LsUFGT1-2-R-SP3 GGTGAAGCTGCTGTTCGGTGACGTGT LsUFGT1-pro-F AAATAAAGGAAGGAGGGAGTGG LsUFGT1启动子扩增 LsUFGT1-pro-R GGCAATCTAATCCCATGGT pBI121-LsUFGT1-pro::GUS-F TGATTACGCCAAGCTTAAATAAAGGAAGGAGGGAGTGG pBI121载体构建 pBI121-LsUFGT1-pro::GUS-R CCGGGGATCCTCTAGATGGCAATCTAATCCCATGGT pGreenⅡ 62-SK-LsMYB4-F TGGCGGCCGCTCTAGATGGGTAGGTCTCCATGCTG 双荧光素酶报告实验 pGreenⅡ 62-SK-LsMYB4-R CAGCGTACCGAATTGTCAAACACTACTTCTAAAGTCCAAT pGreenⅡ 62-SK-LsMYB5-F TGGCGGCCGCTCTAGATGGGTAGATCTCCATGTTG pGreenⅡ 62-SK-LsMYB5-R CAGCGTACCGAATTGCTATCTAATTACATGTGGATTGAT pGreenⅡ 0800-LsUFGT1-pro-LUC-F CGGTATCGATAAGCTGTCGAGTGATATGAAAAGTACTCC pGreenⅡ 0800-LsUFGT1-pro-LUC-R TAGAACTAGTGGATCGGTGGATGCGCAGGTTAG 
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表 2 LsUFGT1启动子元件
Table 2. Elements in LsUFGT1 promoter
元件 植物 基序 数量 功能 ABRE 拟南芥 ACGTG 1 脱落酸响应元件 ARE 玉米 AAACCA 1 厌氧诱导所必需顺式作用元件 Box-4 皱叶欧芹 ATTAAT 2 参与光响应的保守DNA部分 CAAT-box 豌豆、拟南芥 CAAAT、CCAAT 3 启动子和增强子顺式作用元件 CAT-box 拟南芥 GCCACT 1 分生组织表达相关的顺式作用调控元件 CCAAT-box 大麦 CAACGG 1 大麦MYB结合位点 CGTCA-motif 大麦 CGTCA 1 茉莉酸甲酯响应顺式作用元件 G-box 玉米 CACGTC 1 光响应顺式作用元件 GA-motif 拟南芥 ATAGATAA 1 部分光响应元件 GC-motif 玉米 CCCCCG 2 缺氧特异诱导的增强子样元件 GT1-motif 燕麦 GGTTAAT 1 光响应元件 LTR 大麦 CCGAAA 2 低温反应的顺式作用元件 MBS 拟南芥、烟草 CAACAG 1 参与干旱调控MYB结合位点 TATA-box 拟南芥、水稻、欧洲油菜 TACAAAA、ATTATA、TATA、ATATAT 5 转录起始位点上游-30的启动子核心元件 TCA-element 烟草 CCATCTTTTT 1 水杨酸反应的顺式作用元件 TCT-motif 拟南芥 TCTTAC 1 部分光响应元件 TGA-element 甘蓝 AACGAC 1 生长素响应元件 说明：拟南芥.Arabidopsis thaliana，玉米.Zea mays，豌豆.Pisum sativum，水稻. Oryza sativa，大麦.Hordeum vulgare，燕麦.Avena sativa，欧洲油菜.Brassica napus，烟草. Nicotiana tabacum，甘蓝. Brassica oleracea。
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20240508
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图(9) / 表(2)
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