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毛竹PheMADS15基因的克隆及功能分析

程占超 马艳军 侯丹 刘俊 高健

程占超, 马艳军, 侯丹, 刘俊, 高健. 毛竹PheMADS15基因的克隆及功能分析[J]. 浙江农林大学学报, 2017, 34(3): 421-426. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.006
引用本文: 程占超, 马艳军, 侯丹, 刘俊, 高健. 毛竹PheMADS15基因的克隆及功能分析[J]. 浙江农林大学学报, 2017, 34(3): 421-426. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.006
CHENG Zhanchao, MA Yanjun, HOU Dan, LIU Jun, GAO Jian. Isolation and functional analysis of the PheMADS15 gene in Phyllostachys edulis[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2017, 34(3): 421-426. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.006
Citation: CHENG Zhanchao, MA Yanjun, HOU Dan, LIU Jun, GAO Jian. Isolation and functional analysis of the PheMADS15 gene in Phyllostachys edulis[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2017, 34(3): 421-426. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.006

毛竹PheMADS15基因的克隆及功能分析

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.006
基金项目: 

国家高技术研究发展计划(“863”计划)项目 2013AA102607-4

国家自然科学基金资助项目 31570673

详细信息
    作者简介: 程占超, 博士, 从事林木遗传育种研究。E-mail:chengzhan_chao@126.com
    通信作者: 高健, 研究员, 博士, 博士生导师, 从事林木遗传育种研究。E-mail:gaojian@icbr.ac.cn
  • 中图分类号: S722.3

Isolation and functional analysis of the PheMADS15 gene in Phyllostachys edulis

图(4)
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出版历程
  • 收稿日期:  2016-06-14
  • 修回日期:  2016-07-31
  • 刊出日期:  2017-06-20

毛竹PheMADS15基因的克隆及功能分析

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.006
    基金项目:

    国家高技术研究发展计划(“863”计划)项目 2013AA102607-4

    国家自然科学基金资助项目 31570673

    作者简介:

    程占超, 博士, 从事林木遗传育种研究。E-mail:chengzhan_chao@126.com

    通信作者: 高健, 研究员, 博士, 博士生导师, 从事林木遗传育种研究。E-mail:gaojian@icbr.ac.cn
  • 中图分类号: S722.3

摘要: 以毛竹Phyllostachys edulis花为材料,通过聚合酶链式反应(PCR)克隆技术从毛竹中分离得到1个含完整编码区的cDNA,长603 bp,编码200个氨基酸。命名为PheMADS15(GenBank登记号:KU721916)。对PheMADS15进行分析表明,该基因具有典型的MADS-box基因结构域,与拟南芥Arabidopsis thaliana的A类基因AP1编码蛋白的同源性为58.65%。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)克隆技术检测了PheMADS15在毛竹花芽、苞片、颖片、稃片、浆片、雄蕊、雌蕊和幼胚中的相对表达量。分析表明:PheMADS15基因在毛竹花发育的初期表达量最高,主要在花芽中表达,可能参与毛竹成花转变过程。

English Abstract

程占超, 马艳军, 侯丹, 刘俊, 高健. 毛竹PheMADS15基因的克隆及功能分析[J]. 浙江农林大学学报, 2017, 34(3): 421-426. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.006
引用本文: 程占超, 马艳军, 侯丹, 刘俊, 高健. 毛竹PheMADS15基因的克隆及功能分析[J]. 浙江农林大学学报, 2017, 34(3): 421-426. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.006
CHENG Zhanchao, MA Yanjun, HOU Dan, LIU Jun, GAO Jian. Isolation and functional analysis of the PheMADS15 gene in Phyllostachys edulis[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2017, 34(3): 421-426. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.006
Citation: CHENG Zhanchao, MA Yanjun, HOU Dan, LIU Jun, GAO Jian. Isolation and functional analysis of the PheMADS15 gene in Phyllostachys edulis[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2017, 34(3): 421-426. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.006
  • 毛竹Phyllostachys edulis作为经济竹种,经济价值高,生产潜力大,在中国工农业生产和国民经济中占有重要的地位。毛竹营养生长周期长,开花时期不确定,并且开花后集体死亡,导致竹林面积减少,对经济发展和生态环境造成重大损失和破坏。近几年竹子频繁的开花,科研人员不断尝试各种试验手段来探究竹子开花的机制,竹子开花生物学和生殖生物学研究又成为人们关注的重点。近年来,花器官发育研究的快速发展为竹类的花发育研究提供了借鉴和基础,尤其是模式植物拟南芥Arabidopsis thaliana,金鱼草Antirrhinum majus,矮牵牛Petunia hybrida等开花调控基因及其功能的研究。通过对拟南芥和金鱼草中同源异型突变体进行系统的遗传学分析[2-4],提出了花器官ABC模型的假说。在植物中,A类基因能够控制花萼形成,A类和B类基因能够共同控制花瓣的形成,B类和C类基因共同决定雄蕊的发生和发育,而C类基因则控制植物心皮的行成。反向遗传学研究显示,D类基因和E类基因的同源基因同样在调控花形态建成方面起重要作用,D类基因调控胚珠的形成和发育[5-7],而E类基因在所有花器官的形成中起着调控作用[8-10]。在花发育调控中大部分基因属于MADS-box基因家族,该家族基因拥有典型的MADS-box保守结构域,是一类重要的转录因子,主要在植物花器官的发育及开花时间的调控上起作用。目前,从麻竹Dendrocalamus latiflorus和绿竹Bambusa oldhamii中已经分离了与竹子花发育密切相关的MADS-box基因,并对其功能进行初步了分析[11-12],但是对于毛竹MADS-box基因的相关报道比较少,研究人员曾对毛竹的E类基因PeMADS1进行了初步的鉴定与分析[13]。本研究以毛竹花样品为研究材料,首次克隆了1个A类的MADS-box基因PheMADS15,并对该基因与麻竹、拟南芥和水稻Oryza sativa等不同物种同源基因亲缘关系进行了分析,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)研究它在毛竹不同组织上的表达差异,初步鉴定了PheMADS15的功能,为竹子开花和育种奠定了基础。

    • PheMADS15基因克隆的材料为毛竹的花穗,毛竹开花实验地位于广西壮族自治区桂林市,位于南岭山系的西南部。该毛竹林属于自然生长状态。以毛竹花器官分离出的花芽、苞片、颖片、稃片、浆片、雄蕊、雌蕊和幼胚为模板,共计8个样品,用于克隆和组织特异性表达分析。

      TA克隆T-esay Vector,Taq酶购自TaKaRa公司,柱式DNA胶回收试剂盒购自QIAGEN公司。转化用的感受态来自天根公司DH5α大肠埃希菌Escherichia coli。Trizol试剂购自Life公司,反转录试剂盒购自Promega公司。SYBR Green I Master试剂盒购自Roche公司。根据毛竹的TIP41作为内参,用于qRT-PCR分析。聚合酶链式反应(PCR)引物均由金唯智生物科技有限公司合成。

    • 选取生长良好的毛竹花穗,通过Trizol法提取花样品的总RNA,用于PheMADS15基因的克隆。

    • 根据毛竹基因组数据库的PheMADS15 cDNA序列设计PCR引物,PheMADS15-F:5′-AGTTGAACTGAAGAGGATTGAG-3′;PheMADS15-R:5′-CTAAAGAACCCAACCAAGCATG-3′,引物由金唯智生物科技有限公司合成。以毛竹花cDNA为模板,进行PCR。反应体系50.0 μL:5.0 μL 10.0×长和精确聚合酶链式反应(LA PCR)缓冲液(加镁离子优化),8.0 μL三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)(2.5 mmol·L-1),5.0 μL PheMADS15-F(5.0 mmol·L-1),5.0 μL PheMADS15-R(5.0 mmol·L-1),2.0 μL模板,24.5 μL双蒸水和0.5 μL长和精确脱氧核糖核酸(LA DNA)聚合酶。反应程序为94 ℃预变性5 min;然后按下列循环参数进行扩增反应:94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,经过30个循环后,72 ℃ 10 min,16 ℃保温。PCR扩增产物进行电泳检验,回收目的DNA片段,与T-easy克隆载体连接,将PCR连接产物热激转化到DH5α感受态细胞,最后涂含Amp的Luria-Bertani(LB)培养基平板,过夜37 ℃培养,然后挑取单克隆进行菌落PCR反应。取1.0 μL菌液,通过引物PheMADS15-F和PheMADS15-R验证,PCR反应程序同上。将检测正确的阳性克隆菌液测序并保菌。

    • 根据Trizol试剂提取毛竹花样品的总RNA。通过NanoDrop Spectrophotometer ND-100测定提取的总核糖核酸(RNA)的浓度,然后进行电泳检测。根据Promega胶回收试剂盒说明书,取1.0 μg RNA于0.2 mL离心管(EP)中,70 ℃孵育10 min,短暂离心后,置于冰上;准备一个20.0 μL的反应体系:4.0 μL 25 mmol·L-1氯化镁,2.0 μL 10×反转录缓冲液,2.0 μL脱氧核糖核苷三磷酸混合液,0.5 μL RNA酶抑制剂,15.0×16.67 nkat鸟类成髓细胞性白细胞病毒(avian myeloblastosis virus,AMV)反转录酶,0.5 μg多聚胸腺嘧啶T重复寡核苷酸[Oligo(dT)]15引物,1.0 μg RNA,最后添加不含核酸酶的水到20.0 μL。混匀后进行反转录反应。使用Oligo(dT)15引物时,42 ℃孵育15 min,95 ℃,5 min,然后转入0~5 ℃放置5 min。得到的cDNA用于下一步的qRT-PCR反应的模板。其反应体系为20.0 μL体系,包括2.0 μL的反转录的cDNA,10.0 μL的2×SYBR Green I Mastermix,各0.4 μL的上下游引物,加双蒸水至反应总体积为20.0 μL,重复3次·处理-1。反应条件:95 ℃预变性30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40个循环。qRT-PCR使用仪器的是Roche LightCycler® 480。

    • PheMADS15基因的开放读码框(ORF)由美国生物技术信息中心(NCBI)ORF-finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)来鉴定;通过DNAMAN和MAGE 6.0软件来分析该基因的同源性;用ExPASY(http://web.expasy.org/compute_pi/)分析氨基酸的相对分子质量和等电点等理化性质。

    • 用Trizol试剂提取毛竹总核糖核酸(RNA),测得RNA样品的光密度为1 103.0 ng·L-1。将提取到的RNA作为模板,于-20 ℃冰箱保存,用于后续PCR扩增。

    • 以毛竹花cDNA为模板,以PheMADS15-F和PheMADS15-R为引物,PCR扩增PheMADS15的全长,PCR产物经过电泳检测,在603 bp处有一条明亮的条带(图 1),与基因组数据的片段大小保持一致,初步判定为目的基因片段。测序的结果表明,该目的基因与毛竹基因组数据库中的cDNA序列完全一致。命名为PheMADS15(GenBank登记号:KU721916)。

      图  1  毛竹PheMADS15基因片段电泳图

      Figure 1.  Electrophoresis of the amplification fragment of PheMADS15 gene of Phyllostachys edulis

    • 用DNAMAN软件和NCBI的Blast在线软件分析测序结果,该基因开放阅读框(ORF)的核酸序列及推导出的氨基酸序列(图 2)。结果表明:毛竹PheMADS15基因序列含有1个603 bp的开放阅读框,编码200个氨基酸。用ExPASY(http://web.expasy.org/compute_pi/)分析该基因序列编码的蛋白。该蛋白氨基酸的相对分子量为23.48 kD,理论等电点为8.98。

      图  2  PheMADS15编码区核酸序列及其氨基酸序列

      Figure 2.  Nucleotide and predicted amino acid sequence of PheMADS15

    • 通过MAGE 6.0运用Neighboro-Joining方法构建毛竹与其他物种间的系统进化树。对PheMADS15基因编码的蛋白质进行系统进化分析(图 3),对比麻竹(AAR32118.1),水稻(AAF19047.1),二穗短柄草Brachypodium distachyon(NP_001288319.1),玉米Zea mays(ACG35179.1),小米Setaria italica(XP_004981740.1),高粱Sorghum bicolor(AAB50181.1),小麦Triticum aestivum(ABF57926.1),大麦Hordeum vulgare(AAW82994.1)和拟南芥(AT1G69120),毛竹与麻竹中的DlMADS1和水稻中OsMADS14比较近。这些MADS-box基因都与拟南芥的AP1同源。

      图  3  PheMADS15系统进化树分析

      Figure 3.  Phylogenetic tree analysis of PheMADS15

    • 提取的总RNA电泳检测结果表明,提取的毛竹花的总RNA结构完整,光密度为1 103.0 ng·L-1,可以用于定量PCR分析。用反转录的毛竹花组织cDNA模板进行qRT-PCR,以TIP41作为内参,PheMADS15在毛竹8个样品中进行表达量检测(图 4)。结果显示:PheMADS15的表达量在花蕾中最高,其次是苞片,接着是颖片,而表达量最低是雌蕊,其次是浆片,接着是幼胚。在毛竹花发育的过程中,PheMADS15主要在花初期表达量高,随着毛竹花的不断发育,表达量逐渐减少。

      图  4  PheMADS15在毛竹不同组织中特异性表达

      Figure 4.  Relative expression of PheMADS15 in different tissues of Phyllostachys edulis

    • 毛竹是中国重要的经济竹种,具有非常独特的性质,在中国具有广泛的栽植面积和非常高的经济价值。目前,竹子造林主要以无性繁殖为主,开花无规律,花粉活性极低,杂交育种进展缓慢,严重阻碍了毛竹新品种培育。现代分子生物学理论和实验技术的快速发展,为阐明竹子开花分子机制奠定了基础,有望突破常规育种的局限性,并加速育种进程。本研究对PheMADS15基因与其他物种的同源基因构建的进化树进行分析,结果表明:毛竹与麻竹的亲缘关系极为相近,其次和水稻的OsMADS14相近,而与玉米的亲缘关系较远,这与之前的报道大体一致。稻亚科Ehrhartoideae和竹亚科Bambusoideae有着比较近的基因序列结构和亲缘关系,在早期,水稻与竹类植物都同属竹亚科[14-15]

      毛竹PheMADS15基因编码的蛋白质与其他物种的MADS-box有着较高的同源性,尤其是与来自麻竹的DlMADS1[16]同源性更高,表明毛竹与麻竹在进化中可能处于比较相近的位置,进而也证明毛竹的MADS-box基因在进化上是相当保守的。PheMADS15基因编码蛋白序列与水稻和拟南芥A类基因同处于一个进化树分支中,推测该基因为A类的功能基因。

      A类功能基因在花发育过程中起着重要的调节作用。在拟南芥中,AP1主要在花分生组织的初期高量表达,过表达能提前使植物开花[17-19],在开花诱导中起着重要的作用。在水稻中,OsMADS14过表达导致水稻提前开花[20]。毛竹的PheMADS15与拟南芥的AP1以及水稻的OsMADS14在一个进化枝上。PheMADS15在毛竹花的初期表达量比较高,尤其是在花芽中。推测PheMADS15在毛竹开花诱导方面可能起着重要的作用,但PheMADS15在竹子中调控开花的机制仍是未知的。以上结果为竹子开花提供了有用的信息。

参考文献 (20)

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