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香豆素对入侵植物节节麦种子萌发及幼苗生长的影响

王宁 昌孝涛 袁美丽 陈浩

魏亚楠, 龚明贵, 白娜, 等. 梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性分析[J]. 浙江农林大学学报, 2024, 41(4): 696-705. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230498
引用本文: 王宁, 昌孝涛, 袁美丽, 等. 香豆素对入侵植物节节麦种子萌发及幼苗生长的影响[J]. 浙江农林大学学报, 2019, 36(4): 835-840. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.04.025
WEI Ya’nan, GONG Minggui, BAI Na, et al. Analysis of codon preference in chloroplast genome of Dendrocalamus farinosus[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2024, 41(4): 696-705. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230498
Citation: WANG Ning, CHANG Xiaotao, YUAN Meili, et al. Seed germination and seedling growth of invasive Aegilops tauschii with application of coumarin[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2019, 36(4): 835-840. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.04.025

香豆素对入侵植物节节麦种子萌发及幼苗生长的影响

DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.04.025
基金项目: 

河南省自然科学基金资助项目 182300410092

河南省教育厅高等学校重点科研项目 16A22001

详细信息
    作者简介: 王宁, 讲师, 博士, 从事外来植物入侵机理研究。E-mail:475662628@qq.com
  • 中图分类号: S765.1;Q946

Seed germination and seedling growth of invasive Aegilops tauschii with application of coumarin

  • 摘要: 为探讨利用化感物质香豆素对入侵植物节节麦Aegilops tauschii进行生物防控的可行性,采用培养皿生物检测法,研究了50,100,150 mg·L-1等3种质量浓度香豆素溶液对其种子萌发及幼苗生长和生理生化指标的影响。结果表明:随质量浓度的增加,香豆素溶液显著降低了节节麦种子发芽率、发芽指数,以及幼苗苗高和根长的生长。从抑制率(RI)可知,香豆素溶液对节节麦种子萌发及幼苗生长存在质量浓度效应的抑制作用。此外,不同质量浓度香豆素溶液处理对根长的RI值均明显大于苗高,表明香豆素对节节麦幼苗根长生长的抑制作用大于苗高。幼苗生长试验中,仅50 mg·L-1溶液处理中,至第10天时相对电导率及丙二醛质量摩尔浓度较第5天时增加未达到显著水平,这可能是节节麦通过自身调节机制对香豆素造成的损伤进行积极修复的结果。而150 mg·L-1溶液处理中,至第15天时脯氨酸质量分数较第10天时增加不显著,而超氧化物歧化酶活性则呈下降趋势。表明香豆素150 mg·L-1溶液处理第15天已超出节节麦的适应承受范围。以上结果显示:150 mg·L-1香豆素溶液对节节麦种子萌发具有较强的化感抑制作用,并通过影响植株抗氧化酶系统、细胞膜透性及膜脂过氧化作用等途径调节节节麦的生长。
  • 密码子是识别和传递生物体遗传信息、联系蛋白质与DNA之间的重要桥梁,在生物体遗传和变异中起着至关重要的作用[1]。编码同一氨基酸的不同密码子被称为同义密码子。由于基因突变和自然选择的影响,某些同义密码子在蛋白质翻译过程中往往被高频使用,被称为密码子的使用偏好性[23]。物种的生物学功能与密码子偏好性密切相关,密码子偏好性不仅可以影响生物编码基因的蛋白质合成速率和翻译速率[4],还会影响蛋白质结构、折叠程度和mRNA的合成[5]。研究表明:同一物种或亲缘关系相近的物种,具有相似的密码子偏好使用模式[6],通过分析物种的密码子偏好性可以衡量物种之间的基因表达量,进而探究物种之间亲属关系[7]。通过密码子偏好性的研究,能够更好地阐明物种进化过程中基因的表达规律[8],为利用基因工程技术改良物种目标基因提供参考依据[9]

    梁山慈竹Dendrocalamus farinosus属竹亚科Bambusoideae牡竹属Dendrocalamus,又名大叶竹和瓦灰竹,是中国西南地区重要的经济竹种[10],生长速度快,适应性强,竹笋效益高,属于优良的笋竹两用竹种,与硬头黄竹Bambusa rigida都属于竹编和制浆造纸的优质原料[11]。针对梁山慈竹叶绿体基因组密码子使用偏好性的研究鲜见报道。为了更好地挖掘和利用梁山慈竹的潜在经济价值,本研究以梁山慈竹叶绿体基因组序列为研究对象,分析其密码子偏好性使用模式,探究并总结其相关表达基因的密码子偏好性,以期分析影响梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性的主要因素,并筛选出最优密码子,为后续梁山慈竹叶绿体基因工程改造等研究提供理论基础。

    根据GenBank登录号MZ681865.156在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中搜索并下载梁山慈竹叶绿体基因组序列,共有85条编码序列(CDS)。序列重复或小于300 bp会对密码子偏好性指标的测定产生影响[12]。对基因序列进行筛选,剔除序列长度小于300 bp且重复的序列,获取起始密码子为ATG,终止密码子为TAG、TGA和TAA的序列,最终获得51条CDS序列作为后续分析的样本序列。

    运用CodonW1.4.2 (http://sourceforge.net/projects/codonw)和EMBOSS (http://imed.med.ucm.es/EMBOSS/)计算有效密码子数(ENC)、适应指数(CAI)、密码子偏性指数(CBI)、最优密码子频率(FOP)以及密码子第3位核苷酸A、T、C、G的含量(分别记为A3、T3、C3、G3)。利用ENC判断密码子偏好性程度,ENC>35说明密码子偏好性比较弱;反之,说明偏好性强[13]。通过CUSP软件分析并获得密码子鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)所占的比率(GC比率)及GC平均比率(GCall),使用SPSS 25.0软件对梁山慈竹密码子各位置的GC比率与ENC进行相关分析。

    运用CodonW 1.4.2对同义密码子相对使用度(RSCU)进行分析,即该密码子的实际使用频率与其理论使用频率的比值[14]。当RSCU大于1时,同义密码子中偏好使用该密码子,被称为高频密码子;当RSCU等于1时,密码子无偏好性;当RSCU小于1时,密码子使用偏好性较弱[15]

    中性绘图分析是对影响密码子使用偏好性的关键因素进行分析,X轴为GC3,Y轴为GC1和GC2的平均值,绘制二维散点图对GC3和GC12 (各基因 GC1和GC2的平均值)的相关性进行分析(GC1、GC2、GC3分别代表第1、2、3位密码子的GC比例)。若回归系数接近1,代表GC3和GC12显著相关,碱基组成没有差异,说明突变是决定密码子偏好性的主要因素;若回归系数接近0,则代表自然选择是主要因素。

    ENC-plot绘图分析表现密码子的使用偏好性受到突变和自然选择的影响程度。使用Python 3.7进行ENC-plot绘图分析,构建散点图,横纵坐标分别为GC3、ENC,并绘制ENC的标准曲线。基因位点靠近或在标准曲线上,表明突变是决定密码子偏好性的主要因素,若基因位点和标准曲线距离很大,则说明偏好性主要由自然选择决定。

    PR2-plot分析表明基因中密码子的第3位碱基的构成情况。计算密码子碱基中第3位上4种碱基A、T、C、G比例,G3/(G3+C3)为X轴,A3/(A3+T3)为Y轴,绘制PR2-plot散点图,中心点为碱基比例A=T、C=G时的值,代表处于此区域的密码子并无使用偏好性[16]

    将51条基因升序排列后的ENC前后两端10%的基因建立高、低表达基因库。通过CodonW软件计算2个表达库中密码子的RSCU和ΔRSCU,同时满足高频密码子(RSCU>1)和高表达密码子(ΔRSCU≥0.08)的为最优密码子[17]

    在Codon Usage Database (http://www.kazusa.or.jp/codon/)下载异源表达宿主和植物代表类群,包括巨龙竹D. farinosus、粉麻竹D. sinicus、小叶龙竹D. pulverulentus、硬头黄竹、大肠埃希菌Escherichia coli、烟草Nicotiana tabacum、拟南芥Arabidopsis thaliana和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae等物种基因组密码子的使用频率,与梁山慈竹基因组密码子使用频率比值进行比较分析,当梁山慈竹密码子使用频率比其他生物的比值≥2.0或≤0.5时,说明该物种与梁山慈竹的同义密码子的使用偏好性差异较大,当比值不在上述范围内时,表明这2个物种对该密码子的偏好性较接近。

    将叶绿体基因如表1所示进行功能分类,使用CodinW软件,选择对应分析计算样本中各个基因的RSCU,将分析结果分布在59维向量空间中,分析指标间的对应性。

    表 1  梁山慈竹叶绿体基因结构分析
    Table 1  Structural analysis of the choroplast genome of D. farinosus
    基因分类基因分组基因名称
    光合系统基因光系统Ⅰ基因psaApsaBpsbApsbCpsbDpsbB
    光系统Ⅱ基因petApetBpetD
    细胞色素b/f复合体基因atpAatpBatpEatpFatpI
    三磷酸腺苷合成酶基因ndhAndhBndhCndhDndhEndhFndhGndhHndhIndhJndhK
    遗传系统基因烟酰胺腺票吟二核甘酸氧化还原酶基因rbcL
    二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因rpoArpoBrpoC1、rpoC2
    RNA聚合酶亚基基因rps2、rps3、rps4、rps7、rps8、rps11、rps12、rps14、rps18
    核糖体蛋白小亚基基因rpl2、rpl14、rpl16、rpl20、rpl22
    其他基因成熟酶K基因matK
    膜蛋白基因cemA
    细胞色素合成基因ccsA
    酪蛋白分解蛋白酶基因clpP
    未知功能基因假定叶绿体阅读框ycf2、ycf3、infA
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    分析梁山慈竹叶绿体基因组CDS序列的碱基组成:梁山慈竹的4种碱基所对应的同义密码子的第3位碱基比例 (T3s、A3s、C3s、G3s)分别为45.28%、42.07%、18.13%、17.96%,T3s和A3s远高于G3s和C3s,表明梁山慈竹叶绿体基因组密码子的第3位碱基以A/U结尾为主。梁山慈竹的ENC为50.40,CAI为16.6%,第3位同义密码子的GC比率 (GC3S)为28.1%,表明其叶绿体基因组密码子偏好性较弱。

    梁山慈竹叶绿体基因组密码子的GC平均比率为39.48%,且GC1 (47.69%)>GC2 (39.70%)>GC3 (31.05%)。ENC为 39.04~61.00,均值为49.51,GC比率在基因密码子上并没有均匀分布(表2)。ENC和密码子3个位置GC比率的相关分析(表3)结果发现:ENC与GC3比率显著相关,与GC1、GC2不显著相关,说明密码子使用偏好性形成过程中GC3的影响作用大于GC1、GC2。

    表 2  梁山慈竹叶绿体基因组各基因密码子相关参数统计
    Table 2  Statistics of codon related parameters of various genes in the chloroplast genome of D. farinosus
    基因GC比率/%ENCCAIFOP基因GC比率/%ENCCAIFOP
    GCGC1GC2GC3GCGC1GC2GC3
    rps1241.8752.0047.2026.4044.850.1400.341rps1833.5334.5039.7726.3239.040.1470.333
    psbA42.5649.7242.9435.0341.330.3130.532rpl2036.1138.3340.8329.1750.970.1120.298
    matK34.4440.8232.4230.0849.490.1660.329clpP43.0152.5338.2538.2552.370.1750.337
    psbD44.4453.3943.5036.4448.990.2420.456psbB44.0154.4245.9731.6350.730.1900.380
    psbC44.6653.5944.7335.6348.910.1830.386petB41.0648.9341.2033.0547.310.1910.333
    rpoB39.1949.8138.0129.7449.690.1530.353petD40.3750.9339.1331.0649.460.1610.305
    rpoC139.8749.9338.0731.6352.770.1560.347rpoA37.0646.1835.5929.4149.940.1510.311
    rpoC238.9549.0136.6431.1852.290.1540.333rps1143.5250.6956.2523.6144.330.1740.396
    rps238.4040.5140.9333.7652.550.1680.338infA40.3543.8635.9641.2361.000.1810.409
    atpI38.8447.5836.2932.6650.550.1630.353rps836.5041.6141.6126.2846.620.1220.374
    atpF38.2747.6235.4531.7553.170.1470.353rpl1438.7154.8437.1024.1951.900.1810.392
    atpA42.0656.0139.9630.1249.960.1820.385rpl1644.7652.1453.5728.5739.410.1150.354
    rps1439.4239.4246.1532.6941.730.1350.384rps333.4743.7531.6725.0048.030.1930.402
    psaB41.8148.7143.1333.6149.340.1720.350rpl2237.5641.3336.6734.6747.480.1880.415
    psaA43.6851.8043.2835.9552.070.1980.373rpl244.5651.7748.5833.3353.330.1430.361
    ycf339.6947.4038.1533.5355.450.1560.343ndhB38.1642.0739.3333.0746.710.1560.348
    rps437.1347.5237.1326.7349.590.1690.386rps739.4949.6845.2223.5748.310.1640.373
    ndhJ39.3849.3836.8831.8851.480.1760.356ndhF34.1937.8438.9225.8146.190.1440.321
    ndhK38.6041.7043.7230.3651.910.1590.329ccsA33.6433.7441.1026.0745.600.1520.307
    ndhC39.6750.4136.3632.3348.750.1770.345ndhD36.1940.7236.9330.9448.980.1330.314
    atpE42.5152.1739.1336.2359.510.1670.405ndhE33.3341.1832.3526.4759.060.1440.316
    atpB42.6253.9141.6832.2647.430.1920.381ndhG34.4644.0732.7726.5545.770.1250.250
    rbcL44.1457.1143.9331.3850.190.2710.454ndhI34.9937.5738.6728.7352.090.1710.345
    ycf441.2248.3939.7835.4847.140.1620.385ndhA33.9842.4236.3623.1444.350.1400.321
    cemA33.6241.9927.7131.1755.910.1760.342ndhH37.8250.7634.7727.9249.950.1550.322
    petA40.2953.5835.232.0951.120.1550.331
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    表 3  梁山慈竹叶绿体基因组中各基因参数的相关性分析
    Table 3  Correlation analysis of various gene parameters in the chloroplast genome of D. farinosus
    参数GC1GC2GC3ENCCAICBIFOPGC3sGC
    GC11
    GC20.300*1
    GC30.265−0.0091
    ENC0.142−0.425**0.389**1
    CAI0.409**0.0760.370**0.0121
    CBI0.438**0.2720.322*−0.0920.774**1
    FOP0.402**0.312*0.341*−0.0640.797**0.965**1
    GC3s0.271−0.0290.946**0.445**0.330*0.330*0.370**1
    GC0.814**0.673**0.525**0.0100.407**0.512**0.518**0.499**1
      说明: *表示显著相关 (P<0.05);**表示极显著相关 (P<0.01)。
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    梁山慈竹叶绿体基因组中共包含18110个密码子(表4),总计编码20个氨基酸,密码子数为12~705个,其中密码子UGA共有12个,密码子含量最多的是编码谷氨酸的GAA,共有705个。梁山慈竹叶绿体基因组蛋白编码序列RSCU分析表明:氨基酸含量较高的有亮氨酸(Leu)和精氨酸(Arg),均为6个密码子编码,编码精氨酸的是UUA、UUG、CUU、CUC、CUA和CUG;编码亮氨酸的有AGA、AGG、CGU、CGC、CGA和CGG;除此之外,蛋氨酸(Met)和色氨酸(Trp)均只有1个密码子编码,分别是AUG和UGG,其余氨基酸密码子编码个数分别为2~4个。

    表 4  梁山慈竹叶绿体基因组蛋白编码序列RSCU分析
    Table 4  RSCU of protein coding region in the chloroplast of D. farinosus
    氨基酸
    密码子数量RSCU氨基酸密码子数量RSCU氨基酸
    密码子数量RSCU氨基酸密码子数量RSCU
    PheUUU*6441.29TyrUAU*5321.59SerUCU*3431.58CysUGU*1511.53
    PheUUC3510.71TyrUAC1370.41SerUCC*2601.19CysUGC470.47
    LeuUUA*6341.94TERUAA*281.56SerUCA*2221.02ArgAGA*3221.75
    LeuUUG*3621.11TERUAG140.78SerUCG1190.55ArgAGG1190.64
    LeuCUU*4201.29TERUGA120.67SerAGU*2731.25ArgCGU*2611.41
    LeuCUC1380.42TrpUGG*3281.00SerAGC890.41ArgCGC950.51
    LeuCUA2950.90GlnCAA*4771.53ThrACU*4031.68ArgCGA*2341.27
    LeuCUG1070.33GlnCAG1480.47ThrACC1810.75ArgCGG760.41
    IleAUU*7401.48GluGAA*7051.46ThrACA*2591.08GlyGGU*4211.24
    IleAUC2950.59GluGAG2630.54ThrACG1160.48GlyGGC1450.43
    IleAUA4610.92LysAAA*6471.44AlaGCU*4931.73GlyGGA*5381.58
    MetAUG*4161.00LysAAG2530.56AlaGCC1720.60GlyGGG2590.76
    ValGUU*3821.47AspGAU*5221.54AlaGCA*3431.20ProCCU*2861.48
    ValGUC1260.49AspGAC1550.46AlaGCG1350.47ProCCC*1961.01
    ValGUA*3901.50HisCAU*3111.47AsnAAU*5281.48ProCCA*2091.08
    ValGUG1390.54HisCAC1120.53AsnAAC1870.52ProCCG840.43
      说明:*表示RSCU大于1的高频密码子。
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    梁山慈竹叶绿体基因组RSCU大于1的密码子数目为34个(分别为UUU、UUA、UUG、CUU、AUU、AUG、GUU、GUA、UCU、UCC、UCA、AGU、ACU、ACA、GCU、GCA、AAU、UAU、UAA、UGG、CAA、GAA、AAA、GAU、CAU、UGU、AGA、CGU、CGA、GGU、GGA、CCU、CCC和CCA),即筛选出了34个高频密码子,其中以A、U、C、G结尾的密码子分别有13、16、2和1个,这说明密码子偏好以A和U结尾,RSCU较高的3个密码子分别为UUU (1.94)、CUA (1.73)和UCU (1.75)。

    中性绘图分析量化自然选择和突变压力之间的关系,阐明3个密码子位置之间的联系。结果表明:横坐标GC3的数值为23.14%~41.23%,纵坐标GC12的数值为39.04%~61.00% (图1)。梁山慈竹的Pearson相关系数为0.17,呈正相关关系,数据拟合后的回归系数为0.1868,决定系数(R2)较小,为0.0282,GC12和GC3的相关性不显著,说明其叶绿体基因组密码子偏好性受自然选择影响较大。

    图 1  中性绘图分析
    Figure 1  Analysis of neutrality plot

    图2显示:ENC分布并不紧密,少量分布在标准曲线附近,还有个别分布在标准曲线上侧,位点的ENC均大于35,与预期ENC值有差距。说明梁山慈竹密码子偏好性较弱且自然选择和突变都对其偏好性有影响。由于落在标准曲线下方的基因点数量比较多,所以梁山慈竹基因组密码子使用偏好性主要受自然选择的影响。

    图 2  ENC-plot分析
    Figure 2  Analysis of ENC-plot

    图3显示:基因位点在平面图4个区域内分布并不均匀,在A3/(A3+T3)<0.5和G3/(G3+C3)>0.5区域范围内分布最多。表明第3位碱基使用频率为:T>A、G>C,梁山慈竹叶绿体基因组密码子的第3位碱基在选择上具有偏好性,同时说明其密码子使用偏好性主要受自然选择的影响。

    图 3  PR2-plot分析
    Figure 3  Analysis of PR2-plot

    对梁山慈竹的ENC进行升序排列,前10%为高表达基因,即rps18、rpl16、psbA、rps14、rps11,后10%为低表达基因,即 ycf3、cemA、ndhE、atpE、infA。梁山慈竹的RSCU和ΔRSCU表明(表5):梁山慈竹叶绿体基因组有32个高频密码子,筛选出GCA、GCU等25个高表达密码子,最终确定18个密码子作为梁山慈竹叶绿体基因组的最优密码子,分别为UAA、GCA、GCU、UUC、GGU、AAA、CUU、UUA、CCA、CCU、CAA、AGA、CGU、AGU、UCC、ACU、GUA、GUU。其中16个以A/U结尾,2个以C结尾。

    表 5  梁山慈竹叶绿体基因组各氨基酸的RSCU分析及最优密码子分析
    Table 5  RSCU analysis and optimal codon analysis of amino acids in chloroplast genome of D. farinosus
    氨基酸密码子基因组
    RSCU
    高表达
    RSCU
    低表达
    RSCU
    ΔRSCU氨基酸密码子基因组
    RSCU
    高表达
    RSCU
    低表达
    RSCU
    ΔRSCU
    TerUAA***1.560 01.800 01.200 00.600 0MetAUG1.000 01.000 01.000 00
    UAG0.780 00.600 01.200 0−0.600 0AsnAAC*0.520 00.893 60.625 00.268 6
    UGA0.670 00.600 00.600 00AAU1.480 01.106 41.375 0−0.268 6
    AlaGCA**1.200 01.200 00.734 70.465 3ProCCA**1.080 00.800 00.500 00.300 0
    GCC0.600 00.457 10.653 1−0.196 0CCC1.010 00.800 01.166 7−0.366 7
    GCG0.470 00.228 60.734 7−0.506 1CCG0.430 00.444 41.000 0−0.555 6
    GCU*1.730 02.114 31.877 60.236 7CCU***1.480 01.955 61.333 30.622 3
    CysUGC**0.470 00.400 000.400 0GlnCAA*1.530 01.500 01.368 40.131 6
    UGU1.530 01.600 02.000 0−0.400 0CAG0.470 00.500 00.631 6−0.131 6
    AspGAC*0.460 00.500 00.411 80.088 2ArgAGA*1.750 01.723 41.534 90.188 5
    GAU1.540 01.500 01.588 2-0.088 2AGG0.640 00.319 10.837 2−0.518 1
    GluGAA1.460 01.189 21.578 9−0.389 7CGA1.270 01.276 61.395 3−0.118 7
    GAG**0.540 00.810 80.421 10.389 7CGC0.510 00.319 10.837 2−0.518 1
    PheUUC**1.290 01.041 70.650 00.391 7CGG0.410 00.319 10.279 10.040 0
    UUU0.710 00.958 31.350 0−0.391 7CGU***1.410 02.042 61.116 30.926 3
    GlyGGA1.580 01.253 71.818 2−0.564 5SerAGC0.410 00.384 60.470 6−0.086 0
    GGC0.430 00.417 90.484 8−0.066 9AGU**1.250 01.846 21.411 80.434 4
    GGG0.760 00.119 40.363 6−0.244 2UCA1.020 00.615 41.058 8−0.443 4
    GGU***1.240 02.209 01.333 30.875 7UCC***1.190 01.769 20.941 20.828 0
    HisCAC**0.530 00.941 20.571 40.369 8UCG0.550 00.153 80.705 9−0.552 1
    CAU1.470 01.058 81.428 6−0.369 8UCU1.580 01.230 81.411 8−0.181 0
    Ile AUA0.920 00.850 70.949 4−0.098 7ThrACA1.080 01.181 81.176 50.005 3
    AUC*0.590 00.626 90.531 60.095 3ACC0.500 00.818 21.058 8−0.240 6
    AUU1.480 01.522 41.519 00.003 4ACG0.480 00.363 60.588 2−0.224 6
    LysAAA**1.440 01.471 71.155 60.316 1ACU**1.680 01.636 41.176 50.459 9
    AAG0.560 00.528 30.844 4−0.316 1ValGUA***1.500 01.767 41.257 10.510 3
    LeuCUA0.900 00.833 31.295 5−0.462 2GUC0.490 001.028 6−1.028 6
    CUC0.420 000.545 5−0.545 5GUG0.540 00.372 10.342 90.029 2
    CUG0.330 00.250 00.477 3−0.227 3GUU**1.470 01.860 51.371 40.489 1
    CUU*1.290 01.333 31.227 30.106 0TrpUGG1.000 01.000 01.000 00
    UUA***1.940 02.166 71.022 71.144 0TyrUAC**0.410 00.521 70.166 70.355 0
    UUG1.110 01.416 71.431 8−0.015 1UAU1.590 01.478 31.833 3−0.355 0
      说明: 高频密码子(RSCU>1.00)带下划线;*. ΔRSCU≥0.08;**. ΔRSCU≥0.3;***. ΔRSCU≥0.5; 加粗的密码子表示最优密码子。
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    将梁山慈竹基因组密码子使用频率与巨龙竹、粉麻竹、小叶龙竹、硬头黄竹、大肠埃希菌、烟草、拟南芥和酿酒酵母等物种的基因组密码子使用频率进行比较(图4)。结果显示:梁山慈竹与巨龙竹、粉麻竹、小叶龙竹和硬头黄竹的密码子使用频率为0.5~2.0,说明它们的密码子使用偏好性相似,推测具有亲缘关系的禾本科Gramineae牡竹属植物叶绿体基因组密码子偏好性相似;在大肠埃希菌、烟草、拟南芥和酿酒酵母的密码子使用比值中筛选≥2.0或≤0.5的密码子,分别有28和15、15、14个,表明梁山慈竹与这些物种在同义密码子的偏好性上有一定差异。

    图 4  梁山慈竹与其他物种密码子偏好性比较
    Figure 4  Comparison of codon preference between D. farinosus and other species

    将梁山慈竹的51个叶绿体基因的基因功能分为光合系统基因、遗传系统基因、其他基因和未知功能基因四大类,在计算RSCU的基础上将各个基因分布到59维的向量空间。对应分析结果(图5)显示:前4个向量轴分别存在18.3%、16.8%、15.6%和15.4%的差异,前4向量轴累计差异为66.1%,4个轴对密码子均有不同程度的影响;第1轴的值大于其他轴,说明第1轴对梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性的影响较大。对第1轴与CAI、CBI、FOP、ENC和GC3s等指数进行进一步的相关分析发现:梁山慈竹基因在第1轴上的坐标值与CAI (r=−0.001 7,P<0.01)、CBI (r=0.099 0,P<0.01)、FOP (r=0.083 0,P<0.01)、ENC (r=0.112 0,P<0.01)、GC3s (r=−0.145 0,P<0.01)间具有极显著的相关关系,其中CAI和GC3s第1轴具有负相关关系,表明基因组密码子的偏好性不止受单一因素的影响,自然选择、基因突变均有可能影响梁山慈竹基因组密码子使用偏好性[18]

    图 5  梁山慈竹基因组密码子RSCU的对应性分析
    Figure 5  Correspondence Analysis on RSCU of D. farinosus

    本研究对梁山慈竹叶绿体基因组密码子进行使用偏好性分析,筛选出51条CDS序列,分析表明:GC1>GC2>GC3,密码子在3个位置上的分布并不均匀,密码子偏好使用以A或U结尾的碱基,且梁山慈竹叶绿体基因组的ENC均值为49.51,表明其叶绿体基因组密码子使用偏好性较弱。这与乳油木Vitellaria paradoxa[19]和二乔玉兰Magnolia soulangeana[20]等植物叶绿体基因组密码子偏好性相似。

    对梁山慈竹叶绿体基因组密码子进行中性绘图、ENC-plot分析、PR2-plot分析和对应分析。在中性绘图分析中,回归系数为0.412 8,说明密码子偏好性更多受到自然选择的影响;在ENC-plot分析中,多数基因离标准曲线距离较远,实际ENC和预期ENC有差距,表明该部分基因的密码子偏好性主要受自然选择的影响;在PR2-plot绘图分析中,大部分基因位于平面图的右下方,即T>A、G>C,表明其密码子的使用更多受自然选择的影响。综上所述,影响梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性的主要原因是自然选择。该研究结果与巨桉Eucalyptus grandi[21]、灰毛浆果楝Cipadessa cinerascens、酸枣Ziziphus jujuba var. spinosa[22]和云南油杉Keteleeria evelyniana[23]等叶绿体基因组密码子偏好性研究结果基本一致;但在对4种蔷薇科 Rosaceae果树[24]和银白杨Populus alba[25]的研究中发现:突变是影响密码子偏好性的主要因素。这说明密码子的使用偏好性受自然选择或基因突变因素影响。基于RSCU的对应分析表明:梁山慈竹的密码子使用变异原因除了突变和自然选择之外,还有其他的因素,这其中光合系统基因和遗传系统基因分布相对集中,各类基因密码子使用偏好性较为接近。该结论与木薯Manihot esculenta[26]和高山松Pinus densata[27]的研究结果一致。密码子使用频率比较结果显示:梁山慈竹与禾本科牡竹属的植物密码子偏好性相似,在基因选择外源系统表达时,可以选择密码子偏好性差异相对较小的酿酒酵母,在选择大肠埃希菌、烟草和拟南芥作为外源表达宿主时,需要根据密码子使用偏好性进行碱基优化,从而使基因在宿主体内更好地表达。

    最优密码子分析表明:梁山慈竹叶绿体基因组有GCU、GAU以及GGU等18个最优密码子,最优密码子大部分以A或U结尾。该结果与抽筒竹Gelidocalamus tessellatus[28]和毛竹Phyllostachys edulis[29]叶绿体基因组最优密码子分析结果一致,这可能与亲缘关系相近,但不同物种之间叶绿体基因组进化过程中的相对保守性有关系[21]。通过筛选获取梁山慈竹偏好使用密码子,可进一步对目标基因进行密码子优化,提高梁山慈竹的竹笋产量和造纸纤维含量,以及利用新一代精准基因编辑工具CRISPR/Cas9优化梁山慈竹密码子,从而改造梁山慈竹基因组编辑的Cas9基因,提高该基因在梁山慈竹中的表达水平[30]

    本研究通过分析梁山慈竹叶绿体基因组的CDS序列,对梁山慈竹的叶绿体基因组进行生物信息学分析,筛选出梁山慈竹叶绿体基因组有GCU、GAU以及GGU等18个最优密码子。研究结果表明:影响梁山慈竹密码子偏好性的主要因素是自然选择。研究结果为后续在分子层面上利用基因工程开发梁山慈竹优良资源提供参考。

  • 图  1  不同质量浓度香豆素对节节麦幼苗相对电导率及丙二醛质量摩尔浓度的影响

    Figure  1  Relative electric conductivity and MDA content of Aegilops tauschii seedling under different concentrations of coumarin solution

    图  2  不同质量浓度香豆素对节节麦幼苗脯氨酸质量分数及超氧化物歧化酶活性的影响

    Figure  2  Proline content and SOD activity of Aegilops tauschii seedling under different concentrations of coumarin solution

    表  1  香豆素溶液对节节麦种子萌发和幼苗生长过程中生长指标的影响

    Table  1.   Coumarin solution influence of Aegilops tauschii growth indexes on seed germination and growth of seedlings

    ρ/(mg·L-1发芽率/% 发芽率抑制率 发芽指数 发芽指数抑制率 苗高/cm 苗高抑制率 根长/cm 根长抑制率
    0(对照) 94.00 ± 0.11 a 0.00 33.73 ± 0.87 a 0.00 16.52 ± 0.58 a 0.00 13.62 ± 0.76 a 0.00
    50 71.60 ± 2.19 b 0.24 22.84 ± 1.10 b 0.32 14.05 ± 0.41 ab 0.14 9.87 ± 0.14 b 0.49
    100 45.60 ± 1.95 c 0.51 14.38 ± 1.42 c 0.57 10.15 ± 0.65 c 0.38 7.44 ± 0.31 c 0.60
    150 31.60 ± 0.99 d 0.66 7.59 ± 1.19 d 0.77 7.16 ± 0.16 d 0.57 4.81 ± 0.11 d0.65
    说明:同列不同小写字母表示不同处理间差异显著
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  • 期刊类型引用(1)

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出版历程
  • 收稿日期:  2018-07-27
  • 修回日期:  2018-09-29
  • 刊出日期:  2019-08-20

香豆素对入侵植物节节麦种子萌发及幼苗生长的影响

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.04.025
    基金项目:

    河南省自然科学基金资助项目 182300410092

    河南省教育厅高等学校重点科研项目 16A22001

    作者简介:

    王宁, 讲师, 博士, 从事外来植物入侵机理研究。E-mail:475662628@qq.com

  • 中图分类号: S765.1;Q946

摘要: 为探讨利用化感物质香豆素对入侵植物节节麦Aegilops tauschii进行生物防控的可行性,采用培养皿生物检测法,研究了50,100,150 mg·L-1等3种质量浓度香豆素溶液对其种子萌发及幼苗生长和生理生化指标的影响。结果表明:随质量浓度的增加,香豆素溶液显著降低了节节麦种子发芽率、发芽指数,以及幼苗苗高和根长的生长。从抑制率(RI)可知,香豆素溶液对节节麦种子萌发及幼苗生长存在质量浓度效应的抑制作用。此外,不同质量浓度香豆素溶液处理对根长的RI值均明显大于苗高,表明香豆素对节节麦幼苗根长生长的抑制作用大于苗高。幼苗生长试验中,仅50 mg·L-1溶液处理中,至第10天时相对电导率及丙二醛质量摩尔浓度较第5天时增加未达到显著水平,这可能是节节麦通过自身调节机制对香豆素造成的损伤进行积极修复的结果。而150 mg·L-1溶液处理中,至第15天时脯氨酸质量分数较第10天时增加不显著,而超氧化物歧化酶活性则呈下降趋势。表明香豆素150 mg·L-1溶液处理第15天已超出节节麦的适应承受范围。以上结果显示:150 mg·L-1香豆素溶液对节节麦种子萌发具有较强的化感抑制作用,并通过影响植株抗氧化酶系统、细胞膜透性及膜脂过氧化作用等途径调节节节麦的生长。

English Abstract

魏亚楠, 龚明贵, 白娜, 等. 梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性分析[J]. 浙江农林大学学报, 2024, 41(4): 696-705. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230498
引用本文: 王宁, 昌孝涛, 袁美丽, 等. 香豆素对入侵植物节节麦种子萌发及幼苗生长的影响[J]. 浙江农林大学学报, 2019, 36(4): 835-840. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.04.025
WEI Ya’nan, GONG Minggui, BAI Na, et al. Analysis of codon preference in chloroplast genome of Dendrocalamus farinosus[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2024, 41(4): 696-705. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230498
Citation: WANG Ning, CHANG Xiaotao, YUAN Meili, et al. Seed germination and seedling growth of invasive Aegilops tauschii with application of coumarin[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2019, 36(4): 835-840. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.04.025
  • 化学除草剂的危害愈来愈受到人们重视,利用植物化感作用对田间杂草进行生态防控被认为是环境友好,促进农业可持续发展的新技术,并已被列入当代农业生态学研究的重要研究方向[1-2]。香豆素(C9H6O2)是香豆素类物质中形式最简单的化合物。邬彩霞等[3]采用色谱分离等技术,发现黄花草木樨Melilotus officinalis中化感物质含量最高的是香豆素。黄花草木樨对藜Chenopodium album[4],稗草Echinochloa crusgalli[5],苏丹草Sorghum sudanense[6]和多花黑麦草Lolium multiflorum[7]等多种杂草均存在较强的抑制作用。此外,覃逸明等[8]研究发现:在凤丹Paeonia ostii根际土壤中存在的5种化感物质中,香豆素抑制作用最强。CHON等[9]研究发现:与肉桂酸、香草酸等其他酚酸类化感物质相比,香豆素对苜蓿Medicago sativa的化感抑制作用最强。RAZAVI等[10]研究发现:当香豆素质量浓度达100 mg·L-1时,可完全阻碍生菜Lactuca sativa种子萌发及其幼苗根、茎生长。上述研究均表明:香豆素有作为新型除草剂的开发利用潜力,而有关香豆素对入侵植物的化感作用研究尚未见报道。节节麦Aegilops tauschii为禾本科Gramineae山羊草属Aegilops植物,最早起源于西亚及东欧等地,现已成为世界恶性杂草[11]。1955年,节节麦在中国河南省新乡地区首次被发现,如今已广泛入侵至渭河流域陕西、甘肃,黄河流域河北、河南、山东以及内蒙古等地,并成为中国麦田中最难防除的恶性杂草之一[12-13]。据报道,仅2003年河北南部地区由于节节麦危害导致的小麦损失就达10%~25%[14]。因严重威胁粮食的生产与安全,早在2007年节节麦已被列入中国首次发布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》[15]。生产上仅有甲基二磺隆和异丙隆对节节麦具有一定防除效果,但由于不同小麦品种及节节麦种群对上述2种除草剂的敏感性存在差异[16-17],导致它们在实际生产中的推广应用受到一定限制。这也是节节麦入侵范围愈来愈广泛的重要原因之一。为此,本研究以入侵植物节节麦为试材,探讨香豆素对其种子萌发及幼苗生长的影响,以期为节节麦的生物防控提供参考。

    • 2017年5月,节节麦种子来源于河南省新乡市农业科学院试验田(35°18′N,113°52′E)。研究在河南科技大学开元校区林学院园林植物实验室进行。固体香豆素来源于上海试剂厂。

    • 香豆素溶液配置:准确称取(万分之一天平)75 mg香豆素,蒸馏水定容至500 mL,充分溶解后得150 mg·L-1香豆素溶液,分别稀释得到50,100 mg·L-1的溶液,置4 ℃冰箱保存。使用时提前取出,室内放置3~5 h,避免低温溶液对种子萌发造成影响。

      种子萌发试验:采用培养皿沙培法[18]。选取籽粒饱满、大小基本一致的节节麦种子,先用体积分数为1%的次氯酸钠溶液浸泡10 min,之后蒸馏水反复冲洗,室内自然晾干备用。将种子置于铺有经高温消毒处理石英砂的培养皿(直径12 cm)内,加入10 mL(经预试验确定)处理液,50粒·皿-1,利用透明保鲜膜覆盖包裹培养皿(保证培养皿口保鲜膜平展)以减少试验过程中水分的散失,并称量记录每皿的质量(试验期间根据石英砂颜色,加入适量处理液保持每皿质量不变)。各处理5次重复,各重复3皿。以加等量蒸馏水的处理为对照(ck)。置于昼夜25 ℃/15 ℃,光暗各12 h的光照培养箱内培养。每天观察统计1次种子萌发情况(以胚根长度大于等于种子长度为萌发标准),培养10 d后各处理随机选取10株幼苗分别测量根长及苗高。其中,发芽率RG=(10 d内供试种子发芽数/供试种子数)×100%,发芽指数IG= ∑(Gt/Dt),其中:Dt为相应发芽天数,Gt为逐日发芽种子数。抑制率[4, 19]RI=(T0-T1)/T0。其中:T1为处理值,T0为对照值。RI<0为促进作用,RI>0,为抑制作用,RI绝对值大小代表抑制的强弱。

      幼苗生长试验:首先对节节麦种子进行催芽处理(水浸泡24 h,25 ℃培养箱内),选出露白基本一致的种子播种于装有适量石英砂的塑料杯(开口直径10 cm,高15 cm)内,10粒·杯-1,随后加入15 mL(经预备实验确定)不同质量浓度的处理液,以加等量蒸馏水的为对照(ck),各处理5次重复,各重复3杯。置于昼夜25 ℃/15 ℃,光暗各12 h的光照培养箱内培养。并分别在处理的5,10和15 d采样,取全株进行各项生理指标的测定。电导法测定相对电导率(REC)[20];酸性茚三酮法测定脯氨酸质量分数,氮蓝四唑光还原法测超氧化物歧化酶活性,硫代巴比妥酸法测定丙二醛质量摩尔浓度[21]

    • 用Excel对数据进行初步处理,利用SPSS 18.0进行单因素方差分析,数据为平均值±标准差。

    • 随香豆素溶液质量浓度的增加,节节麦种子发芽率、发芽指数均明显下降(表 1)。不同质量浓度处理的发芽率、发芽指数与对照差异均达到显著水平(P<0.05)。150 mg·L-1处理中,发芽率仅有31.60%,较对照下降66.38%。此外,从抑制率可看出,发芽率及发芽指数的抑制率均大于0,且呈质量浓度效应的变化。由此表明,香豆素溶液对节节麦种子萌发存在较强的抑制作用。

      表 1  香豆素溶液对节节麦种子萌发和幼苗生长过程中生长指标的影响

      Table 1.  Coumarin solution influence of Aegilops tauschii growth indexes on seed germination and growth of seedlings

      ρ/(mg·L-1发芽率/% 发芽率抑制率 发芽指数 发芽指数抑制率 苗高/cm 苗高抑制率 根长/cm 根长抑制率
      0(对照) 94.00 ± 0.11 a 0.00 33.73 ± 0.87 a 0.00 16.52 ± 0.58 a 0.00 13.62 ± 0.76 a 0.00
      50 71.60 ± 2.19 b 0.24 22.84 ± 1.10 b 0.32 14.05 ± 0.41 ab 0.14 9.87 ± 0.14 b 0.49
      100 45.60 ± 1.95 c 0.51 14.38 ± 1.42 c 0.57 10.15 ± 0.65 c 0.38 7.44 ± 0.31 c 0.60
      150 31.60 ± 0.99 d 0.66 7.59 ± 1.19 d 0.77 7.16 ± 0.16 d 0.57 4.81 ± 0.11 d0.65
      说明:同列不同小写字母表示不同处理间差异显著

      随香豆素质量浓度的增加,节节麦幼苗的苗高及根长同样呈明显的减少趋势。其中,100和150 mg·L-1的处理苗高均显著低于对照(P<0.05)。此外,不同质量浓度处理的根长均显著低于对照(P<0.05)。香豆素对苗高及根长的抑制率均大于0,且也随溶液质量浓度的增加而增大。由此表明,香豆素溶液对节节麦幼苗的生长也存在明显抑制作用。

    • 图 1A可知:相同质量浓度处理中,节节麦幼苗的相对电导率随时间的延长呈快速上升的变化。其中,50 mg·L-1处理中,处理后第5天时,相对电导率略低于对照,之后则均高于对照,至第15天时较第5天时增加显著(P<0.05)。100和150 mg·L-1处理中,相对电导率均高于对照,至第10天时较第5天时增加均已达到显著水平(P<0.05)。

      图  1  不同质量浓度香豆素对节节麦幼苗相对电导率及丙二醛质量摩尔浓度的影响

      Figure 1.  Relative electric conductivity and MDA content of Aegilops tauschii seedling under different concentrations of coumarin solution

      相同质量浓度处理中,丙二醛质量摩尔浓度随时间的延长呈逐渐上升的变化(图 1B)。其中,50 mg·L-1处理中,至第15天时增加达到显著水平(P<0.05)。100和150 mg·L-1处理中,至第10天时丙二醛质量摩尔浓度较第5天时增加已达到显著水平(P<0.05)。同样,相同时间下,丙二醛质量摩尔浓度与香豆素质量浓度呈正相关。

      相同质量浓度处理中,节节麦幼苗的脯氨酸质量分数随时间延长呈逐渐增加的变化(图 2A)。其中,不同质量浓度香豆素溶液处理中,至处理后第10天时脯氨酸质量分数较第5天时增加均已达到显著水平(P<0.05)。150 mg·L-1处理中,至第15天时较第10天时增加未达到显著水平。且相同时间下,脯氨酸质量分数与香豆素质量浓度呈正相关。

      图  2  不同质量浓度香豆素对节节麦幼苗脯氨酸质量分数及超氧化物歧化酶活性的影响

      Figure 2.  Proline content and SOD activity of Aegilops tauschii seedling under different concentrations of coumarin solution

      50和100 mg·L-1处理中,超氧化物歧化酶活性随时间的延长呈持续增加的变化,而150 mg·L-1处理中,超过氧化物歧化酶活性呈先升后降的变化(图 2B)。其中,50及100 mg·L-1处理中,至处理后第10天时超氧化物歧化酶活性较第5天时增加已达到显著水平(P<0.05)。150 mg·L-1处理中,至第10天时超氧化物歧化酶活性较第5天时增加显著,至第15天时较第10天时略有下降,但差异不显著。且相同时间下,超氧化物歧化酶活性与香豆素质量浓度呈正相关。

    • 种子能否正常萌发决定了植物的繁衍及生存,对该物种的更新至关重要。而发芽率的增加及下降则会降低植物在群落中的竞争力及多度[22]。幼苗阶段在植物的生命周期中较为关键,影响着植物的形态建成,且是植物对外界环境较为敏感的时期[23]。本试验结果表明:香豆素溶液对节节麦种子萌发产生明显的抑制作用,且抑制作用随香豆素溶液质量浓度的增加而增大。在王婧怡等[6]对苏丹草,姚丹丹等[7]对多花黑麦草的研究中均发现:香豆素溶液对上述2种植物种子萌发存在一定的化感抑制作用。香豆素溶液处理造成节节麦种子发芽率下降的原因可能有:一是香豆素可能影响了种子萌发所需关键性酶等物质,造成萌发过程中萌发所需能量物质的缺乏,从而导致种子活力的下降;二是香豆素可能改变了节节麦种皮透性,进而影响种子的吸水作用,造成种子内部物质的外渗,而此类物质造成了真菌病原体的生长,导致种子腐烂而无法萌发。本研究的种子萌发后期,也确有种子腐烂现象的发生。此外,香豆素溶液处理对节节麦幼苗的苗高及根长生长也存在质量浓度效应的化感抑制作用。其中,不同质量浓度处理中根长的抑制率均明显大于苗高。由此也表明:香豆素对节节麦幼苗根长生长的化感抑制作用大于苗高,这可能与根系最先直接接触并吸收到处理物质有关,只有在根系被抑制达到一定程度后,幼苗的地上部分才会逐渐受到影响。这与宋亮等[24]利用酚酸类物质对苜蓿Medicago sativa的研究结论相符。

      相对电导率和丙二醛是植物质膜受伤害程度的重要反映指标。本研究中,相对电导率及丙二醛质量摩尔浓度均随处理时间的延长呈逐渐增加的变化。其中,相对电导率的增加表明香豆素对节节麦幼苗膜结构造成一定破坏,导致电解质外渗的增大;而丙二醛质量摩尔浓度的增加则表明膜脂过氧化作用的逐渐增大。此外,50 mg·L-1溶液处理中,至第10天时相对电导率及丙二醛质量摩尔浓度较第5天时增加均不显著。这可能是香豆素质量浓度低且处理时间短,节节麦通过自身的调节机制,对香豆素造成膜系统损伤进行了积极修复的结果。

      渗透调节物质含量的增加是植物对逆境胁迫的重要生理反映,而游离脯氨酸是植物体内重要的渗透调节物质之一。本研究中,随时间的延长,不同溶液处理中的脯氨酸质量分数均显著增加,这是节节麦通过脯氨酸质量分数增加以适应香豆素胁迫的结果,这也与香豆素处理苏丹草[6]、多花黑麦草[7]可溶性糖含量增加的结论相符。而150 mg·L-1处理中,至第15天时较第10天时增加不显著,这可能与香豆素溶液的过度胁迫所致。超氧化物歧化酶是植物体内重要的保护酶,其活性大小是植物抗逆性强弱的重要体现。本研究中,随时间的延长,超氧化物歧化酶活性呈持续增加的变化,表明节节麦启动抗氧化系统以应对香豆素处理造成的其体内活性氧自由基的逐渐增加,这也是节节麦为适应香豆素胁迫而产生的应激反应。150 mg·L-1处理中,至第15天时较第5天时增加显著,但较第10天时略有下降。这表明随着香豆素胁迫的进一步加剧,幼苗体内活性氧自由基的增加速率逐渐超过了超氧化物歧化酶的清除能力,造成自由基不断积累,最终导致超氧化物歧化酶活性的下降,这也与SCANDALIOS[25]及YE等[26]研究结论一致。

参考文献 (26)

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