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常绿阔叶林是亚热带地区的地带性植被，在调节气候、涵养水源和保持水土等发挥重要作用[1]。树木对太阳辐射和降水的利用受限于林冠的结构和空间分布特征[2]。林冠结构受生物环境和非生物环境的综合影响[3]。林冠层是次生常绿阔叶林与外界联系最直接与最活跃的界面[4]。林冠结构、物种组成、立地条件、季节变化[5]以及间伐[6]等都会改变林下光环境。林冠通过对光照的吸收、反射和散射改变林下光照条件[7]，进而影响林下植被的种子萌发[8]、林下更新[9]、物种组成和分布[10-11]、种群特征[12]以及多样性[13]等。研究者根据森林群落类型[13]、林冠开度[14]、光照总立地因子[15]等单一因子划分森林群落类群。综合采用林冠结构多个指标，通过聚类分析划分类群开展次生常绿阔叶林林冠结构与林下植被的关系还相对缺乏研究。珠江三角洲城市如广州、东莞、佛山等9市已建成国家森林城市，粤港澳大湾区为国家森林城市群的建设和发展带来新的发展机遇。本研究以珠江三角洲城郊次生常绿阔叶林为研究对象，试图回答以下问题：林冠结构、林下光环境以及林下植被的数量特征沿林冠梯度变化是否一致？不同林冠结构及林下光环境对林下植被物种分布的影响是否有差异？通过对以上问题的探讨，为珠江三角洲国家森林城市群群落构建及林下植被物种选择提供科学依据。
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试验监测样地位于广州市和东莞市城郊。该区域位于广东省东南部珠江三角洲核心地带。地理位置22°51′29″~23°38′21″N，113°27′36″~113°56′59″E，属南亚热带季风气候区，气候温和，雨量充沛，年平均气温20.5~22.5 ℃，年平均降水量1 100.0~2 200.0 mm，年平均相对湿度71%~79%。地带性土壤为赤红壤，主要土壤类型还有山地赤红壤、山地黄壤和耕作土等。地带性植被为常绿阔叶林，但该区南亚热带原生常绿阔叶林消失殆尽，城郊仅存少量次生常绿阔叶林，人工林较常见。
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在线路踏查的基础上，选取广州帽峰山森林公园、广州石门国家森林公园和东莞大岭山森林公园典型次生常绿阔叶林，作为珠江三角洲城郊次生常绿阔叶林群落调查样地。3个样地的土壤、地形等因素尽量保持一致。每个样地分别设置10个20 m × 20 m的样方开展植被调查，调查面积共计1.2 hm2。对每个样方进行每木调查，测定胸径(DBH)≥ 3 cm的所有立木的种名、胸径、树高和冠幅。在每个样方内按顺时针方向选取4个面积为5 m × 5 m的小样方，记录灌木的种名、高度与盖度；在每个样方的四角和对角线中心各设置1个面积为1 m × 1 m的小样方，记录草本植物的种名、高度与盖度。
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选择阴天或晴好天气的日出或日落时刻，将Nikon CoolPix D750数码相机外接Nikkor AF-S 8-15/3.5-4.5 E鱼眼镜头转换器用三脚架水平放置于离地面1.65 m处，用指南针确定方向使记录的照片顶部与磁北方向重合，在每个20 m × 20 m样方四角和对角线四分位处镜头朝上拍摄半球面林冠影像，共计拍摄150张半球面林冠影像。采用Gap Light Analyzer 2.0(GLA)图像处理软件分析林冠影像，输出林冠开度(canopy openness)，叶面积指数(leaf area index)，林下直射光(transmitted direct light)，林下散射光(transmitted diffused light)和林下总光照(transmitted total light)。
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综合采用次生常绿阔叶林群落样方立木多度、胸径、树高、林冠开度和叶面积指数矩阵信息，采用Euclidean距离系数和组平均聚类法进行林冠梯度聚类分析。当信息保留70%左右时，组平均聚类分析将次生常绿阔叶林30个样方分为3个林冠梯度(图 1)。林冠梯度1的12个样方主要分布在广州帽峰山森林公园，林冠梯度2的10个样方主要分布在广州石门国家森林公园，林冠梯度3的8个样方主要分布在东莞大岭山森林公园。
图 1 次生常绿阔叶林群落组平均聚类图
Figure 1. Group average clustering diagram of secondary evergreen broadleaved forest communities
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对次生常绿阔叶林群落林冠结构与林下植被数量特征分别进行Kruskal-Wallis test(非参数检验)，并对差异显著的结果进一步做多重比较。
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针对次生常绿阔叶林群落的林冠结构、林下光环境与林下植被盖度的关系开展指示种分析，将P＜0.05的物种作为该林冠结构和林下光环境参数的指示种。
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利用林下植被样方物种盖度与林冠结构矩阵进行非度量的多维标定法，分析次生常绿阔叶林群落林下物种与林冠结构的关系。
以上数据分析方法在软件PC-ORD(6.0)，Statistica(8.0)和Canoco(4.5)中完成。
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基于1.2 hm2调查面积，南亚热带城郊次生常绿阔叶林群落林冠层立木共有立木3 198株，胸径10 cm左右，树高约7 m。
非参数检验(Kruskal-Wallis test)揭示，次生常绿阔叶林林冠结构和林下光环境各参数沿林冠梯度变化表现不一。平均树高、林冠开度和叶面积指数沿林冠梯度差异不显著(P＞0.05)，立木密度和平均胸径沿林冠梯度差异极显著(P＜0.001)，林下直射光、林下散射光和林下总光照沿林冠梯度差异显著(P＜0.05)。多重比较进一步表明，3个林冠梯度的立木密度差异显著。平均胸径、林下直射光、林下散射光和林下总光照在林冠梯度1和林冠梯度2间差异显著，但在林冠梯度2和林冠梯度3之间差异不显著(表 1)。
表 1 次生常绿阔叶林林冠结构和林下光环境特征
Table 1. Canopy structure andunderstory light conditions of secondary evergreen broadleaved forest communities
林冠梯度 立木密度/（株·hm－2） 平均胸径/cm 平均树高/m 林冠开度 叶面积指数 林下直射光/% 林下散射光/% 林下总光照/% 1 1 615 ± 122 c 12.7 ± 1.1 a 7.6 ± 0.4 a 12.16 ± 0.43 a 2.37 ± 0.04 a 15.88 ± 0.77 b 13.84 ± 0.37 b 14.86 ± 0.53 b 2 2 683 ± 111 b 9.7 ± 0.4 b 7.4 ± 0.3 a 12.98 ± 0.75 a 2.24 ± 0.07 a 18.99 ± 0.81 a 15.82 ± 0.60 a 17.40 ± 0.67 a 3 3 950 ± 62 a 7.5 ± 0.3 b 6.6 ± 0.3 a 11.57 ± 0.28 a 2.30 ± 0.04 a 17.26 ± 0.66 ab 14.87 ± 0.44 ab 16.07 ± 0.51 ab -
次生常绿阔叶林林下植被物种丰富，物种数、平均树高和总盖度沿林冠梯度差异显著(P＜0.05)。基于1.2 hm2样地，群落整体共有林下植被224种，分属于140属82科，群落平均高度85 cm左右。林冠梯度2的林下植被物种最多。但群落平均高度和总盖度皆以林冠梯度3最大，其次为林冠梯度2，最小的是林冠梯度3。非参数检验(Kruskal-Wallis test)揭示，林下植被数量特征沿林冠梯度差异显著(P＜0.05)。多重比较进一步揭示，林冠梯度3的物种数和平均树高与林冠梯度1及林冠梯度2有显著差异，但林冠梯度3的总盖度只与林冠梯度2有差异，与林冠梯度1差异不显著(图 2)。芒萁Dicranopteris dichotoma，粗叶榕Ficus hirta和九节Psychotria rubra等是林冠梯度1的优势种，鸭公树Neolitsea chuii，大叶鼠刺Itea macrophylla和扇叶铁线蕨Adiantum flabellulatum等是林冠梯度2的优势种，华山姜Alpinia oblongifolia，密花树Rapanea neriifolia和九节等是林冠梯度3的优势种。
图 2 林下植被数量特征沿林冠梯度的分布
Figure 2. Quantitative features of understory vegetation along the canopy gradient
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次生常绿阔叶林群落林下植被对不同林冠结构参数及林下光环境的响应不一。立木多度、胸径、林冠开度和叶面积指数的林下植被指示种分析P皆大于0.05，未能筛选出指示种。而立木平均高度、林下直射光、林下散射光和林下总光照分别有2~5种指示种(表 2)。
表 2 次生常绿阔叶林林冠结构及林下光照的指示种
Table 2. Indicator species of canopy structure and transmitted lightof secondary evergreen broadleaved forest communities
林冠结构 指示种 总盖度/% 出现样方数 生长型 指示值 P 立木平均高度 黄杞Engelhardtia roxburghiana 26 6 乔木 75.0 0.012 8 竹叶木姜子Litsea pseudoelongata 6 1 乔木 46.2 0.044 6 林下直射光 水锦树Wendlandia uvariifolia 25 2 乔木 66.7 0.024 4 绿冬青Ilex viridis 42 5 灌木 57.6 0.035 8 异形南五味子Kadsura heteroclite 11 3 藤本 58.8 0.041 6 林下散射光 冬青Ilex chinensis 48 4 灌木 62.6 0.011 0 虎舌红Ardisia mamillata 4 2 灌木 50 0.029 4 谷木Memecylon ligustrifolium 2 2 灌木 50 0.029 4 友水龙骨Polypodiodes amoena 10 2 蕨类 50 0.029 4 林下总光照 绿冬青Ilex viridis 42 5 灌木 94.1 0.005 6 水锦树Wendlandia uvariifolia 25 2 乔木 100 0.009 6 华南紫萁Osmunda vachellii 13 3 蕨类 82.8 0.014 0 金樱子Rosa laevigata 14 3 乔木 71.4 0.024 8 土沉香Aquilaria sinensis 21 4 乔木 59.3 0.048 6 立木平均高度的指示种为黄杞(乔木)和竹叶木姜子(乔木)。其中，黄杞出现的样方数较多，指示性较强。林下直射光的指示种为水锦树(乔木)、绿冬青(灌木)和异形南五味子(木质藤本)。林下散射光的指示种为灌木类的冬青、虎舌红和谷木，还有蕨类植物友水龙骨。林下总光照的指示种较多，除了同为林下直射光指示种的水锦树和绿冬青外，还有华南紫萁(蕨类)、金樱子(乔木)和土沉香(乔木)。其中，水锦树的指示性最强。
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采用典范对应分析对林下植被盖度与林冠结构及林下光环境的关系进行分析(表 3)，4个排序轴的特征值分别为0.434，0.214，0.055和0.041。前3个排序轴的累积贡献率达88.5%，特别是第1排序轴已经解释了林下植被物种与环境之间关系的54.6%，可以比较好地分析出林冠结构中物种分布起主要作用的指标。同时，蒙特卡罗检验结果P＜0.05，说明排序结果可信。
表 3 各排序轴的加权相关矩阵
Table 3. Weighted correlation matrix of CCA ordination axles
参数 特征值 物种-环境关系 物种数据变量累积百分比 物种-环境关系变量累积百分比 所有特征值之和 所有典范特征值之和 第一典范轴P值 排序轴1 0.434 0.904 24.0 54.6 1.804 0.794 0.001 排序轴2 0.214 0.702 35.9 81.5 排序轴3 0.055 0.738 38.9 88.5 排序轴4 0.041 0.689 41.2 93.6 分析结果表明：林冠结构各项指标与物种轴和环境轴的第一、二排序轴均表现出较大相关性，其中立木多度的相关性最大，其次是平均树高和平均胸径，林下光环境各参数与轴1的相关性也较强。不同林冠梯度的样方集中分布在不同象限(图 3)。林冠梯度1的样方与林下光环境和林冠开度关系较密切，林冠梯度2的样方与平均树高和平均胸径相关性较强，林冠梯度3的样方与立木多度相关性较强。扇叶铁线蕨Adiantum flabellulatum，乌毛蕨Blechnum orientale，芒萁Dicranopteris dichotoma，狗脊Woodwardia japonica等蕨类植物均分布在林下光环境较弱的区域，油茶Camellia oleifera和锡叶藤Tetracera sarmentosa等喜阳植物则分布在林下光环境较强的区域，而木荷Schima superba和腺点紫金牛Ardisia lindleyana等中性植物受林冠层立木的高度和胸径的影响更大。
图 3 林下植被与林冠结构各参数的典范对应分析
Figure 3. Canonical correspondence analysis of under story vegetation and canopy structure parameters
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不同季节林下光环境差异明显[16]，林冠不同建群种对林下草本植物多样性影响不同[17]，中、下层林冠对林下更新植物多样性的作用更明显[9]。不同人工林林分的冠层结构和林下光照指标间差异显著[18]。从落叶阔叶林到常绿落叶阔叶混交林再到常绿阔叶林，不同森林群落类型的林冠结构发生了显著变化，林冠开度降低，叶面积指数增加，平均叶倾角变小，林冠对光的截获能力和消光能力增强，林下光照强度降低[12]。本研究组平均聚类分析将次生常绿阔叶林30个样方分为3个林冠梯度，分别分布在不同的3个地点。究其原因，可能是由于珠江三角洲城郊这3个地点的次生常绿阔叶林立木密度和平均胸径差异极显著(P＜0.001)，林下光环境差异也显著(P＜0.05)，因而可明确划分出不同的林冠梯度。这还表明，除了林冠开度和叶面积指数，立木密度和平均胸径也是较好的林冠结构指标。
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林冠结构影响林下草本层的结构和多样性，混交林的冠层斑块对于保护林下植被的自然分布格局很重要[13]，常绿林冠和落叶林冠对林下灌木的影响不一致[11]。本研究也表明：次生常绿阔叶林群落不同林冠结构参数对林下植被的指示作用不同。林下植被物种分布与立木多度、平均树高和平均胸径相关性较强，不同林冠梯度林下植被物种组成和分布都有明显差异。无论是资源数量还是环境异质性都不能单独影响物种多样性，但它们通过森林生态系统林分发展和干扰影响林下植被多样性[19]。冠层结构所形成的光环境强烈影响着林下植被的分布。林冠开度和林下总光照对木本植物的影响最大[20]。草本植物覆盖度与漫射光和基质显著相关[21]。本研究对次生常绿阔叶林林冠结构的指示种分析也揭示，14个指示种中有5种灌木、6种乔木、2种蕨类和1种藤本。不同林冠梯度下的林下植被物种组成因林下光照强弱而不同。林冠结构以及林下光环境共同影响林下植被的物种分布，但对次生常绿阔叶林木本植物影响最大的林下光环境指标是林下总光照和林下散射光。
Influence of canopy structure on understory vegetation of secondary evergreen broadleaf forest communities
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摘要: 采用经典群落学调查方法和半球面影像技术，以珠江三角洲城郊次生常绿阔叶林群落为研究对象，运用聚类分析、非参数检验（Kruskal-Wallis test），指示种分析（ISA）和典范对应分析（CCA）等方法，定量研究次生常绿阔叶林群落林冠结构对林下植被的影响。主要结果如下：①次生常绿阔叶林林冠结构和林下光环境各参数沿林冠梯度变化表现不一。立木密度和平均胸径沿林冠梯度差异极显著（P < 0.001），林下直射光、林下散射光和林下总光照沿林冠梯度差异显著（P < 0.05）。②林下植被物种丰富，物种数、平均树高和总盖度沿林冠梯度差异显著（P < 0.05）。林冠梯度2的林下植被物种最多，但群落平均高度和总盖度皆以林冠梯度3最大。③林下植物对不同林冠结构和林下光照参数的响应不一。水锦树Wendlandia uvariifolia和绿冬青Ilex viridis同为林下直射光和林下总光照的指示种。④典范对应分析（CCA）揭示，林冠结构以及林下光环境共同影响林下植被的物种分布，扇叶铁线蕨Adiantum flabellulatum，乌毛蕨Blechnum orientale，芒萁Dicranopteris dichotoma和狗脊Woodwardia japonica等蕨类植物均分布在林下光环境较弱的区域，油茶Camellia oleifera和锡叶藤Tetracera sarmentosa等喜阳植物则分布在林下光环境较强的区域，而木荷Schima superba和腺点紫金牛Ardisia lindleyana等中性植物受林冠层立木的高度和胸径的影响更大。不同林冠梯度下的林下植被物种组成因林下光照强弱而不同，对次生常绿阔叶林木本植物影响最大的林下光环境指标是林下总光照和林下散射光。Abstract: Understory vegetation, representing the main component of biodiversity in a forest community and playing a key role in forest functioning and canopy structure, are important characteristics of a forest community. To evaluate the effects of different gradients of canopy structure on understory vegetation, secondary evergreen broadleaf forest communities in the suburbs of the Pearl River Delta were studied. The effect on understory plants was tested using classical community survey methods and hemispherical photography. Analysis included use of Cluster Analysis, Non-parametric Test (Kruskal-Wallis test), Indicator Species Analysis (ISA), and Canonical Correspondence Analysis (CCA). Results showed that (1) Canopy structure and understory light conditions varied along the canopy gradient. The standing density and average diameter at breast height (DBH) showed a highly significant difference (P < 0.001); whereas, the transmitted direct light, transmitted diffused light, and transmitted total light significantly differed along the canopy gradient (P < 0.05). (2) The understory vegetation was rich; and the abundance and average height as well as total coverage, significantly differed with canopy gradient (P < 0.05). Species were richest in canopy gradient 2, but the average height and total coverage were both highest in canopy gradient 3. (3) The responses of understory vegetation to canopy structure and transmitted light varied. Wendlandia uvariifolia and Ilex viridis were both indicator species of transmitted direct light and transmitted total light. (4) The CCA showed that canopy structure and understory light conditions affected the distribution of understory vegetation. Ferns such as Adiantum flabellulatum, Blechnum orientale, Dicranopteris dichotoma, and Woodwardia japonica resided in areas of weak sunlight, but heliophytes like Camellia oleifera and Tetracera sarmentosa inhabited places where they received better light. Moreover, distribution of neutral plants like Schima superba and Ardisia lindleyana were more affected by the height and DBH of standing trees. This study demonstrated that understory vegetation varied according to understory light conditions along the canopy gradient with transmitted total light and transmitted diffused light being the main factors influencing the understory light environment of the secondary evergreen broadleaf forest.
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沙棘Hippophae rhamnoides又名醋柳，是胡颓子科Elaeagnaceae沙棘属Hippophae的落叶性灌木[1]。作为药食同源植物的沙棘不仅在食疗、医药、农林牧渔等领域具有较大的经济价值，在水土保持、恢复生物链及防风固沙中也具有极大的生态价值[2-5]。生长过程中沙棘根部会遭受土壤中放线菌、细菌的侵染形成根瘤。部分菌种会在根瘤中高度富集发挥固氮、促生长、抵御逆境胁迫、防止有害病菌侵染等功能[6-8]。传统的微生物研究方法主要以培养基进行分离纯培养，再进而探究其培养特征、显微结构、生理特性等[9]。而自然界中90%以上的微生物为不可培养微生物，且现有培养基与培养技术不适应未知菌群的生长，或部分菌群生长缓慢、丰度较小等情况都会对菌群的多样性评估产生影响[10]。以二代高通量测序为基础的16S rDNA技术通过对编码原核核糖体小亚基rRNA的DNA序列进行测序，不仅克服了传统方法难以获得不可培养菌株的弊端，还能对样品中的物种相对丰度进行排序，并分析各群组样品中发挥重要作用的优势物种，解析样品中微生物之间的相互作用。该技术对研究沙棘根瘤内生菌微生物多样性与环境关系以及微生物资源的开发利用有重要的理论和现实意义[11-16]。
本研究通过16S rRNA测序技术对沙棘根瘤内生菌进行物种注释、分类学分析、α多样性分析、β多样性分析、组间差异显著性分析，比较高通量测序和纯培养方法的差异与优劣，为发掘具有应用价值的根瘤内生菌资源提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料采集
采样地为内蒙古自治区巴彦淖尔市磴口县中国林业科学研究院沙漠林业实验中心试验林场(40°29′34″N，106°74′06″E)。该研究区海拔为1 054 m，年平均气温为7.4 ℃。2020年7月，选取人为干扰因素较少的沙漠边缘地带采集沙棘根瘤样品。在每个样地10 m×10 m的区域内用网格法定9个点，运用梅花形采样法在边角及中心共5个点分别采集根瘤样品并进行混合，共设计6组重复样，分别命名为M1、M2、M3、M4、M5、M6。
1.2 沙棘根瘤内生菌的分离培养
1.2.1 沙棘根瘤内生菌的分离
依据文献[17-18]的方法进行修改，使其更加适宜沙棘根瘤内生菌的分离。详细步骤如下：选取新鲜饱满的根瘤，冲洗掉土粒泥沙，将根瘤团用解剖刀分割成带有单柄的瘤瓣，用纱布包裹，先用体积分数为95%的酒精溶液浸泡30 s，再用体积分数为10%的次氯酸钠溶液表面灭菌5 min，取出后用无菌水冲洗数次。在灭菌滤纸上，用无菌解剖刀先切取根瘤头部，再将其均分成2~3份薄片，置于固体培养基中28 ℃恒温暗处静置培养。根据相关研究，本研究选取BAP[19]、S[20]、JA[19]、高氏一号培养基[19]进行分离培养。
1.2.2 沙棘根瘤内生菌的鉴定
提取纯培养的沙棘根瘤内生菌DNA后，对16S rDNA全长进行PCR扩增。序列引物采用YU等[21]设计的细菌通用引物(引物序列27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR总反应体系为50 μL，包括10×缓冲液(KOD buffer) 5 μL、2 mmol·L−1三磷酸脱氧核糖核苷酸混合液(dNTPs) 5 μL、基因组DNA (genomic DNA) 1 μL、上游引物(forward primer) (10 μm) 1 μL、下游引物(reverse primer) (10 μm) 1 μL、DNA聚合酶(KOD DNA polymerase) 1 μL、超纯水(ddH2O) 36 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳，确定有特异扩增后，进行PCR产物回收和测序注释，并参考文献[22-25]进行比对校验。
1.3 沙棘根瘤内生菌的高通量测序分析
1.3.1 建库测序
提取沙棘根瘤总DNA后，根据16S rDNA保守区设计引物(引物序列335F：5′-CADACTCCTACGGGAGGC-3′，769R：5′-ATCCTGTTTGMTMCCCVCRC-3′)，在引物末端加上测序接头，便于建库时添加能区分样本的碱基序列的条码/索引(barcode/index)。再进行PCR扩增并对其产物进行紫外分光光度计定量及混样、过柱纯化和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序[26]。高通量测序得到的原始图像数据文件，经碱基识别分析转化为原始测序序列，结果以FASTQ (简称为fq)文件格式存储[27]。
1.3.2 测序数据处理
首先使用 Trimmomatic v.0.33软件[28]，对测序得到的原始测序序列进行过滤；其次使用cutadapt 1.9.1软件进行引物序列的识别与去除，得到不包含引物序列的高质量测序序列；然后使用FLASH v1.2.7软件[29]，按照最小重叠(overlap)长度为10 bp、重叠区允许的最大错配比率为0.2的要求，对每个样品高质量的一小段短的基因测序片段(reads)进行拼接，得到的拼接序列即原始序列质控后的高质量测序序列(clean reads)；最后使用UCHIME v4.2软件[30]，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据。使用Usearch软件对reads在97.0%的相似度水平下进行聚类，获得分类操作单元(OTU)[31]，以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTU[32]。以SILVA (
http://www.arb-silva.de/ )为参考数据库使用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学注释，可得到每个特征对应的物种分类信息，进而在各水平(门、纲、目、科、属、种)统计样品群落组成，利用QIIME软件生成不同分类水平上的物种丰度表，再利用R语言工具绘制样品分类学水平下的群落结构图[33]。使用QIIME软件对样品α多样性进行评估和t检验(显著性水平为0.01)。利用Mothur v1.30软件和R语言工具包绘制稀释曲线。基于独立OTU，采用加权分析方法和Bray-Curtis算法，使用QIIME软件进行非加权组平均法(UPGMA)分析，比较各组样品间的物种差异。2. 结果与分析
2.1 分类操作单元(OTU)聚类分析
使用Usearch软件对clean reads在97.0%的相似度水平下进行聚类，共计获得651个OTU。各样品OTU个数分布较为均匀，样品M1~M6分别为551、583、579、518、593、589个。如图1所示：6组样品中共有的OTU数为417个。M3、M5、M6中分别有4、2、9个特有的OTU，为样品特有OTU，非单个样品特有或所有样品间共有的OTU在图1未做展示。从整体来看，不同地点的各样品间的OTU差异性远小于共性，说明采样方法设计合理。
图 1 沙棘(M1~M6)根瘤样品分类操作单元(OTU)花瓣图Figure 1 Petal image of operational taxonomic unit (OTU) of H. rhamnoides root nodule sample (M1－M6)2.2 测序深度分析与α多样性指数分析
对6组样品测序共获得 810 039对reads，双端reads质控、拼接后共产生617 188条clean reads。其中质量≥20的碱基占总碱基数的比例(Q20)为98.7%，质量≥30的碱基占总碱基数的比例(Q30)为95.4%，表明测序质量较好。从图2可见：各样品稀释性曲线趋向平缓，表明在持续抽样下新物种出现的速率逐渐趋于平缓，此环境中物种数量不会随测序数量的增加而显著增多[34]，说明取样合理，能较好体现6组样品中根瘤内生菌的多样性，可以进行数据分析。M5的Shannon和Simpson指数最大(表1)，说明物种多样性最高。同理，M4的物种多样性最低。物种丰度方面M5与M6差别不大，均有较高水平。M4根瘤样品的物种丰度最低。样点的Shannon指数平均为4.24，Simpson指数平均为0.70，Ace指数平均为585.79，Chao1指数平均为595.47，样本文库平均覆盖率为99.95%。说明采样地的沙棘根瘤内生菌的物种丰富且多样性较大，各物种分配相对均匀，其微生物物种信息得到了充分体现。
表 1 各组样品的α多样性指数Table 1 Alpha diversity index for each group of samples样品 Shannon
指数Simpson
指数Ace
指数Chao1
指数覆盖
率/%M1 2.53 0.47 568.45 598.57 99.95 M2 4.73 0.79 595.09 600.60 99.95 M3 4.28 0.75 600.58 607.45 99.95 M4 2.52 0.44 542.32 543.52 99.94 M5 6.58 0.95 605.66 610.71 99.94 M6 4.82 0.77 602.63 611.97 99.94 平均 4.24 0.70 585.79 595.47 99.95 2.3 传统纯培养与高通量测序分析沙棘根瘤内生菌的群落结构及其差异
通过传统分离方法从BAP、JA、S、高氏一号培养基中得到纯培养菌株96株。所有菌株均可传代培养，但菌株之间培养周期差异较大，培养周期在1~30 d呈离散型分布。对各菌株进行分子鉴定，共有4门8纲8目13科19属。在门的分类水平分别为变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、厚壁菌门Firmicutes和柔膜菌门Tenericutes。在属的分类水平上，96株菌分属于支原体属Mycoptasma 1株、慢生根瘤菌属Bradyrhizobim 6株、土壤杆菌属Agrobacterium 7株、肠杆菌属Enterobacter 6株、小坂菌属Kosakonia 8株、柠檬酸杆菌属Citrobacter 1株、约克氏菌属Yokenella 1株、欧文氏菌属Erwinia 1株、克罗诺杆菌属Cronobacter 2株、泛菌属Pantoea 1株、莫拉菌属Moraxella 1株、贪噬菌属Variovorax 1株、草螺菌属Herbaspirillum 1株、假单胞菌属Pseudomonas 5株、链霉菌属Streptomyces 14株、小单孢菌属Micromonospora 1株、短杆菌属Brevibacterium 6株、葡萄球菌属Straphylococcus 1株和芽孢杆菌属Bacillus 32株。其中，优势门为变形菌门和厚壁菌门，优势属为芽孢杆菌属和链霉菌属。
高通量测序分析发现：6组样品共有14门34纲89目148科314属。将相对丰度大于0.1%的门与相对丰度前10的属进行汇总(图3、表2、表3)发现：在门的分类水平上，6组样品中相对丰度较高的主要为放线菌门和变形菌门，两者相对丰度之和为87.5%~97.1%。其次为拟杆菌门Bacteroidetes、杆菌门Patescibacteria、厚壁菌门、酸杆菌门Acidobacteria。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属Frankia占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。其次为根瘤菌属Rhizobium、类固醇杆菌属Steroidobacter、糖单孢菌属Saccharimonadales、肠杆菌属、泛菌属、欧文氏菌属、假黄色单胞菌属Pseudoxanthomonas、鞘脂单胞菌属Sphingomonas、假单胞菌属、固氮弓菌属Azoarcus、伯克氏菌属Burkholderia、芽单胞菌属Blastomonas、聚集杆菌属Congregibacter、拉恩氏菌属Rahnella、鞘氨醇菌属Chitinophaga、独岛杆菌属Dokdonella、普雷沃氏菌属Prevotella、链霉菌属、Microtrichales属。
表 2 沙棘微生物区系门水平的相对分布Table 2 Relative abundance of microbiota taxa at the level of phylum分类 6组样品在门水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 放线菌门 73.55 47.56 51.24 76.09 27.73 57.68 变形菌门 22.38 41.91 41.63 21.01 60.35 29.82 拟杆菌门 0.89 1.42 1.30 0.40 2.18 4.42 杆菌门 0.31 5.66 3.89 0.73 1.42 1.72 厚壁菌门 2.18 2.74 1.30 1.21 2.18 4.42 酸杆菌门 0.15 0.26 0.42 0.18 1.16 0.53 其他 0.54 0.45 0.22 0.38 0.75 0.60 表 3 沙棘微生物区系属水平的相对分布Table 3 Relative abundance of microbiota taxa at the level of genus分类 6组样品在属水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 弗兰克氏菌属 72.62 44.45 49.50 74.81 20.12 47.41 根瘤菌属 1.17 1.97 2.89 2.04 3.13 4.13 类固醇杆菌属 0.73 0.83 1.05 2.20 7.19 2.87 糖单孢菌属 0.28 5.61 3.85 0.71 1.41 1.68 肠杆菌属 6.93 2.19 1.05 0.08 0.22 0.40 泛菌属 0.63 5.19 4.69 0.01 0.05 0.11 欧文氏菌属 0.60 4.66 3.77 0.10 0.18 0.23 假黄色单胞菌属 0.85 1.98 1.67 0.75 3.56 0.68 鞘脂单胞菌属 0.39 1.06 2.10 1.55 2.10 1.64 假单胞菌属 0.51 1.27 5.60 0.03 0.21 0.09 其他 15.29 30.79 23.83 17.72 61.83 40.76 
图 3 6组根瘤样品的非加权组平均法(UPGMA)聚类树与物种分布柱状图Figure 3 UPGMA clustering tree and the species distribution histogram of the six groups of nodule samples are combined drawing在门、纲、目、科、属的各分类单元中，高通量测序的检测灵敏度(高通量测序/纯培养)依次是纯培养方法的3.50、4.25、11.20、11.38和16.53倍。在门水平上，纯培养菌株中占比较高的厚壁菌门在高通量测序中占比并不高。在属水平上，纯培养菌株中占比较高的芽孢杆菌属和链霉菌属皆在高通量测序中占比很低。该对比结果差异性较大，说明高通量测序在微生物多样性分析中占据优势地位，要优于纯培养方法。同时也说明，沙棘根瘤内共生细菌群落结构更为复杂，群落更为稳定。
3. 结论与讨论
3.1 结论
在运用传统方法分离纯培养微生物时，共分离纯培养菌株96株，分属于4门8纲8目13科19属，未获得弗兰克氏菌属的菌株，可能是培养基中弗兰克氏菌属的菌株生长缓慢，易被其他菌群取代，因此仍需探索新的培养基与培养方法以遏制根瘤中其他菌株的繁殖。在微生物多样性分析中，由于环境中的微生物复杂多样，各环境之间组成差异较大，通常采用非加权方法进行分析。该方法简单易操作，主要考虑物种的有无，但未考虑物种的丰度，所以采用非加权的方法难以区别各样品间的差异。
高通量测序分析共检测到14门34纲89目148科314属。在门、纲、目、科、属的各分类单元中，高通量测序的检测灵敏度(高通量测序/纯培养)依次是纯培养方法的3.50、4.25、11.20、11.38和16.53倍。与纯培养获得的菌株相比，高通量测序分析结果更加完整地揭示了沙棘根瘤内生菌的微生物多样性。高通量测序表明：在门的分类水平上，样品中相对丰度较高的主要为放线菌门和变形菌门，两者相对丰度之和为87.5%~97.1%。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。
3.2 讨论
张爱梅等[35]和刘志强等[36]分别对甘肃榆中、辽宁通辽、内蒙古赤峰等地沙棘根瘤内生菌微生物多样性做过类似研究，其高通量测序所得的微生物多样性高于本研究结果，说明沙棘根瘤内生菌微生物多样性受地理位置、土壤成分、气候条件、宿主种类及生长环境等多种因素的影响。本研究的沙棘取样于内蒙古乌兰察布沙漠边缘地带，采样地荒漠化土壤与干旱少雨气候对内生菌多样性有特别影响。
属于非豆科Leguminosae植物的沙棘根瘤共生固氮体系是以弗兰克氏菌属为主导的[37]微生物—微生物—植物互作体系。高通量测序分析显示：弗兰克氏菌属所占比例较高，然而本次传统方法分离却未得到纯培养菌株，这可能是由于培养基中缺乏某种信号物质或与其他菌属竞争存在劣势导致的，建议添加制霉菌素、萘啶酮酸和放线菌酮抑制其他菌群的繁殖[18]。非豆科植物结瘤固氮过程，单一属的菌株难以完成此任务。有研究[38]表明：纯培养分离的贪噬菌属是复杂微生物组中维持根生长的核心菌属，并且具有产生和降解生长素的能力，是细菌—细菌—植物通讯网络的关键角色。小单孢菌是植物益生菌，在促进植物生长的同时还可以分泌细胞壁降解酶促进细胞壁的降解，进而便于弗兰克氏菌的侵染[39-40]，但是小单孢菌的快速繁殖也对弗兰克氏菌的生长起到抑制作用。沙棘作为胡颓子科植物，根部结瘤侵染方式为细胞间侵入。研究[41]表明：草螺旋菌属Spirillum、慢生根瘤菌属、肠杆菌属的相关细菌与弗兰克氏菌存在负相关性(即抑制关系)，以上3个菌属均在豆科、禾本科Poaceae植物中发挥固氮相关的重要作用，但在胡颓子科中此类细菌与弗兰克氏菌属相互作用的机制尚未明确。
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图 1 次生常绿阔叶林群落组平均聚类图
Figure 1 Group average clustering diagram of secondary evergreen broadleaved forest communities
图 2 林下植被数量特征沿林冠梯度的分布
Figure 2 Quantitative features of understory vegetation along the canopy gradient
图 3 林下植被与林冠结构各参数的典范对应分析
Figure 3 Canonical correspondence analysis of under story vegetation and canopy structure parameters
表 1 次生常绿阔叶林林冠结构和林下光环境特征
Table 1. Canopy structure andunderstory light conditions of secondary evergreen broadleaved forest communities
林冠梯度 立木密度/（株·hm－2） 平均胸径/cm 平均树高/m 林冠开度 叶面积指数 林下直射光/% 林下散射光/% 林下总光照/% 1 1 615 ± 122 c 12.7 ± 1.1 a 7.6 ± 0.4 a 12.16 ± 0.43 a 2.37 ± 0.04 a 15.88 ± 0.77 b 13.84 ± 0.37 b 14.86 ± 0.53 b 2 2 683 ± 111 b 9.7 ± 0.4 b 7.4 ± 0.3 a 12.98 ± 0.75 a 2.24 ± 0.07 a 18.99 ± 0.81 a 15.82 ± 0.60 a 17.40 ± 0.67 a 3 3 950 ± 62 a 7.5 ± 0.3 b 6.6 ± 0.3 a 11.57 ± 0.28 a 2.30 ± 0.04 a 17.26 ± 0.66 ab 14.87 ± 0.44 ab 16.07 ± 0.51 ab 
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表 2 次生常绿阔叶林林冠结构及林下光照的指示种
Table 2. Indicator species of canopy structure and transmitted lightof secondary evergreen broadleaved forest communities
林冠结构 指示种 总盖度/% 出现样方数 生长型 指示值 P 立木平均高度 黄杞Engelhardtia roxburghiana 26 6 乔木 75.0 0.012 8 竹叶木姜子Litsea pseudoelongata 6 1 乔木 46.2 0.044 6 林下直射光 水锦树Wendlandia uvariifolia 25 2 乔木 66.7 0.024 4 绿冬青Ilex viridis 42 5 灌木 57.6 0.035 8 异形南五味子Kadsura heteroclite 11 3 藤本 58.8 0.041 6 林下散射光 冬青Ilex chinensis 48 4 灌木 62.6 0.011 0 虎舌红Ardisia mamillata 4 2 灌木 50 0.029 4 谷木Memecylon ligustrifolium 2 2 灌木 50 0.029 4 友水龙骨Polypodiodes amoena 10 2 蕨类 50 0.029 4 林下总光照 绿冬青Ilex viridis 42 5 灌木 94.1 0.005 6 水锦树Wendlandia uvariifolia 25 2 乔木 100 0.009 6 华南紫萁Osmunda vachellii 13 3 蕨类 82.8 0.014 0 金樱子Rosa laevigata 14 3 乔木 71.4 0.024 8 土沉香Aquilaria sinensis 21 4 乔木 59.3 0.048 6
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表 3 各排序轴的加权相关矩阵
Table 3. Weighted correlation matrix of CCA ordination axles
参数 特征值 物种-环境关系 物种数据变量累积百分比 物种-环境关系变量累积百分比 所有特征值之和 所有典范特征值之和 第一典范轴P值 排序轴1 0.434 0.904 24.0 54.6 1.804 0.794 0.001 排序轴2 0.214 0.702 35.9 81.5 排序轴3 0.055 0.738 38.9 88.5 排序轴4 0.041 0.689 41.2 93.6
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