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柳杉Cryptomeria fortunei为杉科Taxodiaceae柳杉属Cryptomeria常绿高大乔木，是中国特有的用材与绿化树种。天然种群集中分布于东南部的武夷山和天目山山脉，长江以南省区多有栽培[1]。柳杉生长快，生长期持久，树干通直，材质优良，可广泛应用于建筑、桥梁、家具等，且树姿雄伟，树形优美，是优良的园林绿化树种。同时，柳杉叶片对空气颗粒物有着较强吸附能力，是重要环保树种[2]。目前柳杉研究主要集中在育苗[3-6]、良种选育[7]、病虫害[8-9]与生理生态[10-11]等方面。此外，学者进行了简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)分子标记引物筛选[12]与材性相关基因的筛选[13]等分子生物学方面的初步探索。此前柳杉种苗繁育仍采用播种[3-4]、扦插[5]与嫁接[6]等常规扩繁方法，但即便是良种选育，也存在优良材料繁殖系数低、繁育周期长等问题，有性繁育子代分离难以保持优良性状。植物组织培养是目前植物快速繁殖的重要手段，具有繁殖系数高、生产速度快、受外界环境影响小、可实现工厂化育苗、全年生产等优点，在良种繁育上已具有诸多成功案例[14]。如张翠萍等[15]以柳杉种胚为实验材料，通过柳杉试管苗繁殖技术研究，建立了种子试管苗组培快繁体系；但该体系仅能应用于分离世代的种子材料，受种胚采集时间和环境限制，繁殖效率偏低。祝晨辰等[16]以柳杉优良无性系的茎段为外植体，建立了柳杉优良无性系繁育技术体系，但不定芽增殖效率较低(1.23~5.00)。为提高柳杉的不定芽增殖效率，本研究以柳杉优良无性系的茎段为外植体，以高效分段培养的方式进行组织快繁，以期建立高效无性繁殖技术体系，为柳杉良种生产性规模化快繁提供参考。
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以浙江省文成县石垟林场20年生柳杉无性系测定林中3个植株健壮、性状优良的无性系作为外植体，取当年生幼嫩枝条，用洗涤剂浸泡30 min后轻刷枝条表面，并将其剪成独立的带顶芽茎段，流水冲洗2 h。无菌条件下用质量浓度75.0%的乙醇浸泡20 s，再用质量浓度0.1%的升汞消毒8 min，无菌蒸馏水冲洗4~5次，每次1~2 min。
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为探索基本培养基、水解酪蛋白(CH)对不定芽诱导与增殖的影响，采用MS、DCR和WPM等3个基本培养基，分别添加蔗糖30 g·L−1，琼脂粉7 g·L−1，pH值调至5.8；设置6-苄氨基腺嘌呤(6-BA，0.10、0.50和1.00 mg·L−1)、吲哚丁酸(IBA，0、0.10和0.30 mg·L−1)、水解酪蛋白(CH，0、0.50和1.00 g·L−1)各3个水平，使用L9(34)正交实验(表1)。每瓶接种2~3个茎段，每个处理10瓶，重复3次，40 d后统计数据，计算不定芽诱导率与增殖系数。
表 1 不同培养基对不定芽诱导与增殖
Table 1. Effects of different mediums on the induction and proliferation of adventitious buds
处理 培养基 ρ6-BA/
(mg·L−1)ρIBA/
(mg·L−1)ρCH/
(g·L−1)诱导率/
%增殖
系数A1 MS 0.10 0 0 50.00 4.00 A2 DCR 0.10 0.10 0.50 66.67 4.50 A3 WPM 0.10 0.30 1.00 55.56 4.20 A4 WPM 0.50 0 0.50 87.50 4.00 A5 MS 0.50 0.10 1.00 75.00 3.50 A6 DCR 0.50 0.30 0 90.91 3.00 A7 DCR 1.00 0 1.00 100.00 8.00 A8 WPM 1.00 0.10 0 100.00 9.13 A9 MS 1.00 0.30 0.50 94.12 7.25 -
前期实验发现，组织培养过程中＜1 cm的不定芽操作效率偏低，微扦插生根效果不佳。本实验将芽长≥1 cm的不定芽定义为有效芽。为解决上一步实验中不定芽萌发多但有效芽少的问题，调整培养基植物生长调节剂质量浓度，设计B1(WPM+1.00 mg·L−1 6-BA+0.10 mg·L−1 IBA)、B2(WPM+0.20 mg·L−1 6-BA+0.02 mg·L−1 IBA)和B3(不添加植物生长调节剂的WPM培养基)等3个培养基组合，每瓶接种3~5个茎段，每个处理10瓶，重复3次。40 d后观察芽伸长情况，统计数据。
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剪取不定芽长≥1 cm的有效芽进行生根培养。在DCR和WPM培养基中添加0.10 mg·L−1 IBA和不同质量浓度(0、0.01、0.10 mg·L−1)萘乙酸(NAA)，每瓶接种3个有效芽，每个处理10瓶，重复3次。30 d后观察并统计数据。
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生根培养约40 d后，将株高≥5 cm且根系发达的柳杉无菌苗移至V(泥炭)∶V(蛭石)=1∶1的混合基质常规管理。30 d后调查移栽存活率。
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以上培养条件均为光照时间16 h·d−1，光强2 000 lx，培养温度(23±2) ℃。
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根据实验获得数据，分别计算以下指标。
芽诱导率=出芽外植体数/总接外植体数×100%。芽增殖系数=诱导出的不定芽总数/外植体总数。有效枝条增长率=诱导出的有效枝条总数/原有效枝条总数×100%。不定根的诱导率=生根的枝条数/接种枝条总数×100%。平均不定根数=生根的总数/诱导出不定根的枝条数。平均根长=不定根的总长度/诱导出不定根的枝条数。移栽存活率=移栽存活的苗数/移栽的总苗数×100%。繁殖潜能(株·株−1·a−1)=繁殖系数3.75×生根率×移栽存活率。
采用SPSS 17.0和Excel先对百分率数据进行反正弦转换，再进行方差分析和LSD多重比较。
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由表1知：各无性系在所有培养基中均能形成不定芽，但不同处理间芽的诱导率与增殖系数存在差异。综合来看，A8处理优于其他组合，不定芽诱导率和增殖系数达到最高，分别为100%和9.13。外植体在培养基中7 d左右开始萌动，针叶基部的芽点膨大，随后逐渐伸长，萌发出芽(图1A)。从芽的生长状况来看，A8芽萌发较多，叶色翠绿，生长健壮(图1B)；A1芽萌发少，叶色较黄，芽苗瘦弱，生长状况较差(图1C)。
图 1 柳杉茎段的不定芽诱导和植株再生
Figure 1. Adventitious buds induction and plant regeneration of C. fortunei sterile seedlings
根据正交实验结果进行极差分析，结果见表2。从诱导率来看，6-BA对柳杉茎段不定芽诱导率的影响占主导地位，极差(R)达40.63，其次是IBA(15.07)和基本培养基(12.82)，最后是CH(5.91)。其中最佳水平6-BA为1.00 mg·L−1，IBA为0.10 mg·L−1，CH为0.50 g·L−1，最佳基本培养基为DCR。因此，柳杉芽诱导与增殖的最佳基本培养方案为WPM+1.00 mg·L−1 6-BA+0.10 mg·L−1 IBA。
表 2 不定芽诱导与增殖实验结果极差分析
Table 2. Range analysis on the induction and proliferation of adventitious buds
指标 水平 6-BA IBA CH 基本培养基 诱导率/% K1 57.41 65.49 80.30 73.04 K2 84.47 80.56 82.76 85.86 K3 98.04 80.20 76.85 81.02 R 40.63 15.07 5.91 12.82 增殖系数 K1 4.23 3.73 5.38 4.92 K2 3.50 5.71 5.25 5.17 K3 8.13 4.82 5.23 5.78 R 4.63 1.98 0.14 0.86 说明：K1、K2、K3为各因素的3个水平对应的各次试验结 果之和的平均值 方差分析发现(表3)：6-BA对柳杉茎段不定芽的诱导率及增殖系数均有极显著影响(P＜0.01)，基本培养基与IBA质量浓度对柳杉茎段不定芽的增殖系数有显著影响(P＜0.05)。
表 3 不同因素对茎段不定芽诱导与增殖影响的方差分析
Table 3. Variance analysis on the induction and proliferation of adventitious buds
因变量 变异来源 平方和 自由度 均方 F P 诱导率 6-BA 1 945.413 2 972.706 139.685 0.007** 基本培养基 16.068 2 8.034 1.154 0.464 CH 234.396 2 117.198 16.830 0.056 误差 13.927 2 6.964 总计 42 965.601 9 增殖系数 6-BA 37.102 2 18.551 1 006.38 0.001** IBA 1.207 2 0.603 32.736 0.030* 基本培养基 1.174 2 0.587 31.85 0.030* 误差 0.037 2 0.018 总计 291.059 9 说明：*表示在P=0.05水平上差异显著，**表示在P=0.01水平上差异显著 -
在继代培养过程中，将幼芽接入最佳诱导增殖培养基后，各无性系不定芽增殖系数显著提升。培养40 d后，接入不定芽伸长培养基。结果表明(表4)：相较于添加高质量浓度植物生长调节剂的培养基，低质量浓度或不添加植物生长调节剂的培养基对柳杉不定芽的伸长有显著促进作用。其中B3处理下柳杉芽伸长效果最好，有效枝条多，长势良好，有效枝条增长率达到456.87%；B1处理下柳杉芽基本没有伸长，短芽多，植株发黄，甚至死亡。由图1D(培养1 d)、图1E(培养7 d)、图1F(培养40 d)可知：B3处理下柳杉芽伸长良好。
表 4 不同质量浓度植物生长调节剂对不定芽伸长的影响
Table 4. Effects of different concentrations of plant growth regulators on elongation of adventitious buds
培养基 ρ6-BA/(mg·L−1) ρIBA/(mg·L−1) 有效枝条增长率/% B1 1.00 0.10 66.36±116.78 b B2 0.20 0.02 286.84±148.46 a B3 0 0 465.87±268.46 a 说明：不同小写字母表示在P=0.05 水平上差异显著 -
待枝条生长到2~3 cm时剪下，插入生根培养基进行生根培养。结果表明(表5)：幼苗在2种基本培养基中生根情况无显著差异。当培养基中添加0.10 mg·L−1 IBA时，枝条的生根率达到100%，生根速度较快，根多且健壮。平均生根数随着NAA质量浓度的升高而增加，但平均根长减小(图1G )。当培养基中添加少量NAA时，幼苗基部先分化出少量愈伤组织，随后从愈伤组织中分化出根，根条细弱，根数较多，根长度较短。随着NAA质量浓度升高，生根率逐渐降低，愈伤组织增多；至0.10 mg·L−1 时，幼苗基部分化出大量愈伤组织，生根受到抑制，茎段发黄，最终整株死亡。C1处理下柳杉幼苗生根率较高，根长度大，与其他处理差异显著。因此，DCR+0.10 mg·L−1 IBA为生根的最适培养基。幼苗在最佳不定根诱导培养基中生长，7 d左右长出白色的根尖，之后根迅速伸长，30 d后形成良好根系。由图1G可知：无性系在C1培养基中生根情况最好。
表 5 不同培养基对生根的影响
Table 5. Effects of different mediums on the percentage of rooting
培养基 基本培养基 ρIBA/(mg·L−1) ρNAA /(mg·L−1) 生根率/% 平均根数/条 平均根长/cm C1 WPM 0.10 0 100.00±0.00 a 10.00±5.00 b 3.87±1.17 a C2 0.01 69.44±4.81 b 8.67±1.15 b 2.71±0.36 bc C3 0.10 55.56±19.25 b 24.00±2.00 a 1.29±0.39 c C4 DCR 0.10 0 100.00±0.00 a 10.50±0.71 b 3.82±1.17 a C5 0.01 80.56±17.34 ab 15.67±5.86 ab 3.15±0.59 ab C6 0.10 77.78±19.79 ab 17.33±9.24 ab 1.86±0.60 bc 说明：不同小写字母表示在P=0.05 水平上差异显著 -
组培苗经炼苗移栽，约15 d后发出新芽。检查根部有新根长出即移栽成活，移栽成活率达96.70%，成活植株长势较好且一致。图1H可知：无菌苗移栽1、15和40 d后生长良好。
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将诱导与继代增殖的不定芽进行分段培养。首先，将经消毒的外植体接入诱导与增殖培养基进行不定芽的诱导与增殖；接着，将诱导与增殖的不定芽接入伸长培养基进行伸长培养；然后，将经过伸长培养的枝条剪下，一部分接入生根或增殖不定芽，进行分段循环培养；最后，将生根完成的无菌苗移栽炼苗，投入常规容器苗培育。经分段培养的组培苗，各无性系不定芽得到有效利用，有效枝条比例显著提升，单个外殖体的繁殖潜能高达3 865株·株−1·a−1。
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植物组织培养中，基本培养基的区别主要在于无机盐的种类和含量的不同[17]。MS培养基中无机盐和离子浓度较高，具有较稳定的离子平衡，养分的数量和比例合适，因而适用范围比较广，是多数植物组织培养快速繁殖的基本培养基。相较于MS培养基，DCR与WPM培养基均是低盐培养基。本实验结果表明：DCR与WPM培养基的诱导效果均优于常用的MS基本培养基；不定芽诱导中DCR培养基效果最佳，不定芽增殖中WPM效果最佳。这与低盐培养基更适合于外植体生长和增殖的报道相符[18]。
植物生长调节剂尤其生长素和细胞分裂素在调控离体器官发生中起关键作用[19]。本研究中选用6-BA和IBA作为植物生长调节剂，选用CH作为营养物质，研究不同组合在柳杉芽诱导过程中的作用。结果表明：6-BA最佳质量浓度为1.00 mg·L−1，同时添加少量的IBA(0.10 mg·L−1)诱导率可达100%，增殖系数达到9.0以上。有研究[20]表明：CH对猕猴桃Actinidia chinensis芽苗的生长有一定促进作用；本研究中，添加CH的处理组合其诱导与增殖效果均无明显差异，可见CH不适用于柳杉不定芽的诱导与增殖。
有研究认为：繁殖系数过高，不定芽过度增殖会引起组培苗弱化，生长势变差[21]。崔佩荣[22]在对紫萼Hosta ventricosa 继代增殖培养时发现：有效芽增殖系数随着植物生长调节剂质量浓度增加呈先上升后再下降规律，影响有效芽增殖。本研究采用高质量浓度植物生长调节剂培养基与低质量浓度植物生长调节剂培养基交替继代，对柳杉组培苗进行分段培养，可有效解决上述问题，显著加快柳杉组织培养进程，为工厂化育苗提供了有效途径。
大量研究[23]表明：培养基的无机盐质量浓度降至一半，可有效提高大多数植物的生根能力；WPM和DCR培养基是低盐培养基，因此常和不同质量浓度植物生长调节剂配合诱导组培苗生根。本实验利用WPM和DCR培养基配合低质量浓度的IBA诱导生根，柳杉幼苗生根率高达100%，同时生根较快，根系健壮。生根的无菌苗移栽至V(泥炭)∶V(蛭石)=1∶1的基质中，浇透水，保持相对湿度90%~100%，30 d后存活率达96.70%。
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本研究建立的柳杉外植体分段培养再生体系，主要包括丛生芽诱导、伸长、生根及移栽等。不定芽诱导与增殖阶段，无性系在WPM+1.00 mg·L−1 6-BA+0.10 mg·L−1 IBA中培养，不定芽诱导率(100%)和增殖系数(9.13)显著高于其它处理；不定芽伸长阶段采用高-低质量浓度植物生长调节剂培养基交替分段培养，柳杉无性系继代增殖效果良好，有效枝条增长率可达到456.87%；生根培养阶段，无性系离体生根的最适宜培养基为DCR+0.10 mg·L−1 IBA，且3个无性系生根率最高可达100%；炼苗移栽阶段，生根的无菌苗移栽至V(泥炭)∶V(蛭石)=1∶1的混合基质，经过15~20 d炼苗，成活率高达96.70%。从不定芽的诱导到生根仅需4~5个月，繁殖潜能高达3 865株·株−1·a−1。综上所述，柳杉分段培养的组培模式可有效解决柳杉外植体丛芽分化能力强而芽伸长不足的问题。
Study on rapid propagation system of superior clones in Cryptomeria fortunei
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摘要:
目的 柳杉Cryptomeria fortunei外植体丛芽分化能力强而芽伸长不足。为探索分段培养过程中的柳杉不定芽诱导与增殖、伸长培养及生根诱导的最佳培养基，建立柳杉分段培养的高效组培快繁体系。 方法 以20年生柳杉优良无性系的当年生带芽茎段为外植体，采用正交试验设计分段培养的组培体系。柳杉外植体分段培养再生体系主要包括丛生芽诱导、伸长、生根及移栽等步骤。 结果 ①在3种基本培养基(MS、DCR和WPM)中分别添加不同质量浓度6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)及水解酪蛋白(CH)，3个柳杉无性系均能诱导出不定芽，但诱导率存在显著差异，以WPM+1.00 mg·L−1 6-BA+0.10 mg·L−1 IBA中不定芽诱导率(100%)和增殖系数(9.13)最高。②高质量浓度激素培养基与低质量浓度激素培养基交替分段培养方式对柳杉无性系进行继代增殖培养，效果良好，有效枝条增长率可达到456.87%。③柳杉无性系离体生根的最适宜培养基为DCR+0.10 mg·L−1 IBA，且3个无性系生根率最高可达100%。④生根的无菌苗移栽至V(泥炭)∶V(蛭石)=1∶1的混合基质，经过15~20 d炼苗，成活率高达96.70%，繁殖潜能达3 865株·母株−1·a−1。 结论 柳杉分段培养的组培模式极大提高了柳杉组培再生效率，有助于柳杉优良品种的工业化育苗。图1表5参23 Abstract:Objective The induced clustered buds of Cryptomeria fortunei have strong differentiative capacity but insufficient elongation ability. In order to obtain the optimum medium of adventitious bud induction, proliferation, elongation culture and rooting induction, the rapid propagation system of C. fortunei was established. Method The annual shoot from 20-year-old C. fortunei were used as explants; the orthogonal test design was used to select the optimum medium. The propagation system of C. fortunei includes induction, proliferation, elongation, rooting and transplant. Result (1) Adventitious buds from three clones could be induced on MS, DCR and WPM basic medium supplemented with different combinations of 6-BA, IBA and CH. But the proliferation ability of buds varied significantly among different mediums. When clones were cultured in WPM medium with 1.0 mg·L−1 6-BA and 0.1 mg·L−1 IBA, the induction rate and proliferation coefficient was the highest, which was 100% and 9.13, respectively. (2) When three clones of C. fortunei were subcultured alternately with high concentration hormone and low concentration hormone, the effective shoot growth rate reached 456.87%. (3) The most suitable medium for the C. fortunei rooting was DCR medium with 0.1 mg·L−1 IBA, under which the rooting rate ratio was 100%. (4) The rooted seedlings were transplanted to a mixed matrix with equal vermiculite and peat, after 15−20 days of seedling hardening, and the survival rate was 96.70%. Therefore, the potential propagation ability is 3 865 seedlings per maternal plant per year. Conclusion Thus, an efficient propagation technology for C. fortunei was established, which laid a technical foundation for industrialization of improved varieties. [Ch, 1 fig. 5 tab. 23 ref.] -
Key words:
- cilviculture /
- buds elongation /
- segmental culture /
- rapid propagation /
- Cryptomeria fortunei
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GRF(general regulatory factor)蛋白质最先由MOORE等[1]在牛脑中发现，并根据淀粉凝胶电泳上的迁移特性命名。GRF蛋白质是一类高度保守的同源或异源的二聚体蛋白质，具有多种功能，广泛存在于真核生物中，如酵母Pichia guilliermondii、拟南芥Arabidopsis thaliana、水稻Oryza sativa、花生Arachis hypogaea等。已有研究[2]表明：GRF蛋白质家族通过与磷酸化的靶蛋白质相互作用参与植物信号传导、细胞定位、转录调控和应激反应等多种重要生命活动过程，在植物代谢调控和生物合成反应中发挥着重要作用，如拟南芥GRF蛋白质可以与感光系统中的蛋白质相互作用调节根系生长发育[3]；葡萄Vitis vinifera GRF蛋白质参与冷热应激反应[4]；木薯Manihot esculenta GRF蛋白质主要分布在细胞质中，作用于淀粉合成酶Ⅲ靶蛋白质，对淀粉的合成起到负调控作用[2]；菊花Dendranthema morifolium GRF蛋白质参与开花和周期调控，盐、冷等胁迫响应过程[5]；动物细胞中GRF蛋白质还可通过调节细胞周期，影响细胞凋亡，参与多种信号通路等方式来调控肿瘤进程[6]。GRF活化后可以使G2/M期阻滞从而起到负调控细胞周期，发挥抑制癌基因的作用[7]。在动物中GRF蛋白质的过表达可能转化为一种致癌因子，促进肿瘤的发生[8]，还可能与肿瘤细胞耐药性有关[9]。毛竹Phyllostachys edulis用途广泛，笋和叶具有食用、药用价值；竹材多用于建筑制造、工艺品制作。毛竹林是一种重要的经济林，具有重要生态价值，其固碳作用机制在不同的生长阶段有所差异[10]。毛竹基因组草图已公布，且大量转录组数据也可以从公共数据库中获取[11]。目前根据毛竹全基因组数据进行基因家族分析已取得了一定的成果，如ZF-HD基因家族[12]、B3基因家族[13]、APX基因家族[14]等，也分析了毛竹快速生长期的基因表达[15-16]。但对于毛竹GRF基因家族的全基因组数据分析尚未有相关报道。本研究通过毛竹公开的相关测序结果，利用生物信息学的方法，从基因组及转录组数据入手，对毛竹GRF基因进行全基因组的鉴定与表达分析，拟为进一步明确GRF基因家族在毛竹重要生长发育过程中的功能解析提供依据。
1. 材料与方法
1.1 基因家族来源、鉴定及理化性质分析
毛竹基因组序列、编码序列(CDS)、蛋白质序列和基因组GFF注释文件均从以下站点ftp://parrot.genomics.cn/gigadb/pub/10.5524/100001_101000/100498/[12]下载。从Pfam数据库[17]中下载隐马可夫模型(HMM) PF00244.17的结构域数据，并以此结构域数据为种子模型，用HMMER[18]检索本地毛竹蛋白质数据库。在Excel 2018中，将E-value设置为≤1E−20，对检索结果排序整理，去除重复，获得候选基因。进一步从毛竹全基因组数据库中提取得到GRF家族成员的基因、CDS、蛋白质序列以及基因结构和位置信息；利用在线工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)、ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)[19]以及SignalP 4.1[20]在线分析GRF家族各成员理化性质等。
1.2 家族进化分析
依据毛竹、拟南芥、水稻GRF家族成员蛋白质序列，分别通过ClustalW多重比对，用MEGA 7.0软件邻位连接(neighbor-Joining, NJ)法构建种内和种间系统进化树，自检值取1 000次抽样[21]。
1.3 基因结构、基序和保守结构域预测
根据毛竹全基因组的GFF注释文件基因位置信息，分析毛竹GRF家族的基因结构并绘制基因结构图；利用在线网站NCBI Conserve Domain(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和MEME(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)对GRF家族成员的保守结构域(domain)和基序(motif)进行预测[22]，并通过TBtools[23]将结果可视化。
1.4 启动子分析
提取毛竹GRF基因上游1 500 bp序列作为启动子序列信息，通过在线预测软件PlantCare[24]预测毛竹GRF基因的顺式作用元件，并整理预测结果，富集顺式作用元件，利用TBtools上的Simple Biosequence viewer功能进行可视化分析。
1.5 染色体定位及共线性分析
利用MCScanX[25]获取GRF家族种内、种间共线性关系，并用TBtools软件Amazing Super Circos[26]和Multipe Synteny Plot分别对种内和种间的结果可视化。
1.6 基因表达分析
选取NCBI SRA数据库中毛竹不同组织器官：根(登录号为ERR105075、ERR105076)，花序(登录号为ERR105069、ERR105070、ERR105071)，叶(登录号为ERR105067、ERR105068、ERR105075)，鞭(登录号为ERR105073、ERR105074)和笋不同生长高度：0.2 m(登录号为SRR6131114、SRR131113、SRR6131115)，0.5 m(登录号为SRR131117、SRR6131118、SRR5710699)和1.0 m(登录号为SRR5710701、SRR5710702、SRR5710697)的转录组数据，分别计算毛竹GRF基因的TPM(transcripts per million reads)值表示基因的表达丰度。为方便统计，对每个表达数值取以2为底的对数(log2)，使用TBtools Amazing Heatmap绘制基因表达热图，用对数转换预处理数据，再用正态标准化的方法处理数据。
1.7 蛋白质三级结构同源模建
利用SWISSMODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)在线软件[27]预测GRF蛋白质的3D结构。模建结果使用SAVES v5.0(https://servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/)[19]进行评估。
2. 结果与分析
2.1 基因家族成员鉴定及理化特性分析
根据植物GRF隐马可夫模型(PF00244.17)搜索毛竹相关基因组数据，获得相关GRF家族成员，然后通过E-value(≤1E−20)筛选、保守结构域、基序特征分析，去除相同转录本重复，最终筛选得到13个GRF家族成员(表1)。将获得13个GRF家族成员按照其在scaffold的分布先后顺序命名为PeGRF01~PeGRF13。进一步对PeGRF作蛋白质特性分析，13个GRF蛋白质中长度最短的为PeGRF10(256个氨基酸)，最长的为PeGRF09(293个氨基酸)，平均长度266.8个氨基酸；各GRF蛋白质等电点最小的为4.70(PeGRF02)，最大的为5.29(PeGRF01)，平均等电点为4.82；各GRF蛋白质分子量最小的为PeGRF04(28.65 kD)，最大的为PeGRF09(32.41 kD)，平均分子量为29.79 kD。
表 1 毛竹GRF基因及其蛋白质理化特性Table 1 Characteristics of PeGRF family genes and their deduced proteins基因登录号 基因名称 等电点(pI) 平均分子量/kD 内含子数量/个 氨基酸数量/个 PH02Gene26029.t1 PeGRF01 5.29 32.20 5 286 PH02Gene21972.t1 PeGRF02 4.70 29.68 4 262 PH02Gene06378.t1 PeGRF03 4.79 29.14 4 263 PH02Gene19868.t1 PeGRF04 4.82 28.65 3 261 PH02Gene15394.t1 PeGRF05 4.76 31.08 4 274 PH02Gene31988.t1 PeGRF06 4.73 29.94 6 270 PH02Gene44376.t1 PeGRF07 4.79 29.15 4 263 PH02Gene09923.t1 PeGRF08 4.86 29.28 4 261 PH02Gene25395.t2 PeGRF09 4.72 32.41 5 293 PH02Gene13806.t1 PeGRF10 4.76 29.02 4 256 PH02Gene13908.t1 PeGRF11 4.82 29.15 4 260 PH02Gene26176.t1 PeGRF12 4.84 28.76 3 263 PH02Gene15240.t1 PeGRF13 4.75 28.77 4 256 2.2 GRF基因家族分类与进化树构建
利用MEGA 7.0对13个毛竹GRF、14个拟南芥GRF和8个水稻GRF的氨基酸序列比对后，采用NJ法进行系统聚类分析(图1)，绝大部分毛竹基因家族成员和水稻处于同一分支，表明毛竹与水稻的进化关系较近。
图 1 毛竹(Pe)、拟南芥(At)和水稻(Os)GRF家族系统进化树分析Figure 1 Phylogentic analysis of GRF gene family from Phyllostachys edulis (Pe), Arabidopsis thaliana (At) and Oryza sativa (Os)2.3 GRF家族基因结构、基序及保守结构域
对毛竹GRF基因结构分析发现：内含子数量存在差异，非ε组成员都包含4个外显子和3个内含子，它们在位置上高度保守。ε组成员都具有不同于非ε组的内含子-外显子结构，具有2个额外的N-末端内含子[21]。利用NCBI-CDD对毛竹GRF基因进行保守结构域分析，PeGRF蛋白质均包含14/3/3结构域，毛竹GRF基因家族14/3/3结构域存在一定的保守性，但该结构域的分布位置有一定分化。利用MEME在线工具对该基因家族的保守基序预测，基数设置为10，结果显示(图2)：Motif1~6在每个家族成员中均出现，属于高度保守结构，其余基序在家族成员中出现的频率及所在位置均存在一定的差异。
2.4 启动子特征
如图3所示：筛选出的部分典型的顺式调控元件，除核心启动子TATA-box(5个)和CAAT-box(16个)外，还有与激素相关的顺式调控元件，包括与赤霉素相关的GARE-motif(5个)、P-box(3个)，与生长素有关的AuxRR-core(3个)、TGA-element(6个)，与脱落酸有关的ABRE(42个)，与水杨酸有关的TCA-element(5个)；与外部条件有关的顺式调控元件，包括参与低温响应的LTR(2个)和光响应的G-box(48个)。推测毛竹GRF蛋白质家族可能参与激素和非生物胁迫响应，家族基因表达模式可能有所不同。
图 3 PeGRF基因家族启动子的上游顺式作用元件Figure 3 Upstream cis-acting elements of promotor from PeGRF gene family2.5 染色体分布及共线性分析
利用毛竹基因组GFF注释文件提取PeGRF在scaffold上的分布特征，结果显示：毛竹GRF基因在scaffold上分布不均匀，不同的scaffold基因分布密度不同，scaffold7、14、16、18和21仅包含1个PeGRF，scaffold3、13、15和22上分别包含2个。
利用TBtools工具，将毛竹GRF基因种内和种间的共线性关系进行了可视化分析。从图4A中可以看出：除PeGRF02、PeGRF03和PeGRF07不存在种内共线性关系外，其余家族基因成员间均有显著的共线性关系，说明GRF基因家族存在基因复制现象，推测在进化过程中GFR基因可能通过复制进行家族成员数量的扩张。但PeGRF不存在串联重复基因。物种间的共线性关系是反映不同物种来源于同一个祖先的现象。从图4B可以看出：毛竹与水稻的共线性关系要明显多于拟南芥，这可能与水稻和毛竹同属于禾本科Gramineae，进化关系较近有关。
图 4 毛竹PeGRF家族染色体分布(A)及共线性分析(B)Figure 4 Chromosomal distribution of PeGRF genes in Ph. edulis (A) and their collinear relationships (B)Sca表示scaffold；CHR和Chr表示染色体(chromosome)2.6 GRF家族基因表达模式
本研究基于毛竹RNA-Seq转录组数据，对毛竹不同组织(叶、花序、鞭及根)以及不同生长高度(0.2、0.5、1.0 m)的毛竹笋中的GRF表达量绘制热图。由图5可以看出：除PeGRF10，PeGRF09在不同组织和生长高度保持较低的表达量外，其他成员均有较高的表达量。在毛竹不同组织中，根和花序的表达量相对于叶和鞭要稍高；非ε组的GRF基因均有较高的表达。在竹笋的不同生长阶段，非ε组的GRF基因保持较高的表达水平；ε组不同的基因表达量有增有减，如PeGRF05在竹笋生长各个阶段均有较高的表达量，且随生长进程表达量不断增高；PeGRF06表达量随生长进程呈下降趋势。推测不同家族成员在参与组织器官发育的过程中发挥不同的作用，但其中的内在分子机制还值得进一步研究。
图 5 毛竹GRF基因家族表达水平热图分析Figure 5 Heatmaps of expression level of PeGRF family genes in Ph. edulis2.7 GRF家族蛋白质空间三级结构
由图6所示：毛竹GRF蛋白质由2个单体连接而成，每个单体由反向平行的9个α螺旋组成，每个单体都存在与配体(FSC3、FEC4)相互作用的结合位点，2个FSC配体均与壳梭孢素有关，单体间构成同源或异源二聚体，总体呈“W”型[28-29]。
图 6 毛竹GRF家族蛋白质SWISSMODEL同源模建的三维空间结构Figure 6 Predicted 3D protein structure of the GRF family from Ph. edulis by SWISSMODEL红色为α螺旋，黄色为配体(FSC3、FEC4)3. 讨论
物种基因组全序列的测定推动了生物信息学的迅速发展，在海量数据的基础上，利用生物信息学手段，对物种基因家族进行高效的统计分类和分析，预测基因家族的结构、功能及作用机制，将极大地推动相关功能基因的挖掘和农艺性状遗传的改良进程[30]。随着2018年第2版毛竹基因组数据的公布以及大量毛竹转录组数据的共享，毛竹GRF基因家族的生物信息学分析成为可能[11]。本研究通过全基因组数据分析发现：毛竹GRF家族成员共13个，数量多于水稻，可能的原因是毛竹染色体经过加倍，基因组数据远大于水稻；另外，共线性分析进一步证实：正是通过基因复制扩增，毛竹GRF在数量上有优势。毛竹GRF基因家族各成员间的理化性质存在一定的差异，但均含有14/3/3蛋白质结构域，其中有6种基序在每个成员中均出现。根据基因结构将PeGRF分为ε组和非ε组，其中ε组可能保留了祖先的蛋白质功能，这与PIOTROWSKI等[31]和WANG等[32]的研究结果相似。
大量研究表明GRF蛋白质参与激素信号的转导。如在拟南芥的研究中发现：GRF参与油菜素类激素(BR)调控细胞核发育的途径[33]；在烟草Nicotiana tabacum中，GRF参与赤霉素(GA)生物合成调控[34]；在水稻中，GRF表达同脱落酸(ABA)密切相关[35]。本研究发现：毛竹GRF顺式作用元件存在许多激素相关元件。由此可以推测毛竹GRF蛋白质可能介导激素信号的转导过程。但毛竹GRF同其他激素的相互关系还需进一步验证。
GRF蛋白质参与了植物的生长发育，特别是在花器官的发育中具有重要作用。PERTL等[36]证实随着百合Lilium brownii var. viridulum花粉管的生长，GRF蛋白质的表达量也明显增加。李兵娟[37]也证实雷竹Phyllostachys violascens GRF基因参与开花调控机制。本研究通过转录组数据分析发现：GRF蛋白质在花序组织中高表达，且表达量明显高于竹叶和竹鞭，这表明毛竹GRF基因可能参与花序的发育和调控。除此之外，在研究毛竹GRF顺式作用元件时还发现其启动子区域存在许多光响应元件，结合光周期对植物开花的作用机制以及在模式植物水稻上的研究[38]，GRF基因可能是通过光响应元件接受外界环境信号从而触发其高表达，最终影响毛竹花的发育。由于受毛竹花发育相关材料的限制，该假设将在后续实验验证。
毛竹GRF蛋白质是以一个螺旋结构为主的同源二聚体，二聚体界面内包着多个疏水残基和多个极性残基，外周则由盐桥连接，三级结构呈“W”型，每个单体分别含有2个凹槽，可能用于结合配体靶蛋白质。毛竹GRF蛋白质序列在进化谱系中高度保守，并且与配体结合的氨基酸残基极端保守，这同SEHNKE等[28]发现的结果相似。另外，虽然毛竹GRF蛋白质的N端和C端同源性较低，但可能通过碱性簇维持空间构象的稳定[28]。PAUL等[39]在研究拟南芥GRF蛋白质时发现，GRF蛋白质还可以通过结合磷酸化的蛋白质，参与重力反应等生理过程。GRF蛋白质在进化上高度保守，毛竹PeGRF可能也具有相似的分子作用机制。但毛竹GRF蛋白质生物学功能与上述空间结构之间的关系还需进一步的探索。
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图 1 柳杉茎段的不定芽诱导和植株再生
A. 不定芽的诱导；B. 长势较好的无性系；C. 长势较差的无性系；D~F. 无性系分段培养的芽伸长情况； G. 生根的幼苗；H. 移栽成活的无菌苗
Figure 1 Adventitious buds induction and plant regeneration of C. fortunei sterile seedlings
表 1 不同培养基对不定芽诱导与增殖
Table 1. Effects of different mediums on the induction and proliferation of adventitious buds
处理 培养基 ρ6-BA/
(mg·L−1)ρIBA/
(mg·L−1)ρCH/
(g·L−1)诱导率/
%增殖
系数A1 MS 0.10 0 0 50.00 4.00 A2 DCR 0.10 0.10 0.50 66.67 4.50 A3 WPM 0.10 0.30 1.00 55.56 4.20 A4 WPM 0.50 0 0.50 87.50 4.00 A5 MS 0.50 0.10 1.00 75.00 3.50 A6 DCR 0.50 0.30 0 90.91 3.00 A7 DCR 1.00 0 1.00 100.00 8.00 A8 WPM 1.00 0.10 0 100.00 9.13 A9 MS 1.00 0.30 0.50 94.12 7.25 
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表 2 不定芽诱导与增殖实验结果极差分析
Table 2. Range analysis on the induction and proliferation of adventitious buds
指标 水平 6-BA IBA CH 基本培养基 诱导率/% K1 57.41 65.49 80.30 73.04 K2 84.47 80.56 82.76 85.86 K3 98.04 80.20 76.85 81.02 R 40.63 15.07 5.91 12.82 增殖系数 K1 4.23 3.73 5.38 4.92 K2 3.50 5.71 5.25 5.17 K3 8.13 4.82 5.23 5.78 R 4.63 1.98 0.14 0.86 说明：K1、K2、K3为各因素的3个水平对应的各次试验结 果之和的平均值
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表 3 不同因素对茎段不定芽诱导与增殖影响的方差分析
Table 3. Variance analysis on the induction and proliferation of adventitious buds
因变量 变异来源 平方和 自由度 均方 F P 诱导率 6-BA 1 945.413 2 972.706 139.685 0.007** 基本培养基 16.068 2 8.034 1.154 0.464 CH 234.396 2 117.198 16.830 0.056 误差 13.927 2 6.964 总计 42 965.601 9 增殖系数 6-BA 37.102 2 18.551 1 006.38 0.001** IBA 1.207 2 0.603 32.736 0.030* 基本培养基 1.174 2 0.587 31.85 0.030* 误差 0.037 2 0.018 总计 291.059 9 说明：*表示在P=0.05水平上差异显著，**表示在P=0.01水平上差异显著
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表 4 不同质量浓度植物生长调节剂对不定芽伸长的影响
Table 4. Effects of different concentrations of plant growth regulators on elongation of adventitious buds
培养基 ρ6-BA/(mg·L−1) ρIBA/(mg·L−1) 有效枝条增长率/% B1 1.00 0.10 66.36±116.78 b B2 0.20 0.02 286.84±148.46 a B3 0 0 465.87±268.46 a 说明：不同小写字母表示在P=0.05 水平上差异显著
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表 5 不同培养基对生根的影响
Table 5. Effects of different mediums on the percentage of rooting
培养基 基本培养基 ρIBA/(mg·L−1) ρNAA /(mg·L−1) 生根率/% 平均根数/条 平均根长/cm C1 WPM 0.10 0 100.00±0.00 a 10.00±5.00 b 3.87±1.17 a C2 0.01 69.44±4.81 b 8.67±1.15 b 2.71±0.36 bc C3 0.10 55.56±19.25 b 24.00±2.00 a 1.29±0.39 c C4 DCR 0.10 0 100.00±0.00 a 10.50±0.71 b 3.82±1.17 a C5 0.01 80.56±17.34 ab 15.67±5.86 ab 3.15±0.59 ab C6 0.10 77.78±19.79 ab 17.33±9.24 ab 1.86±0.60 bc 说明：不同小写字母表示在P=0.05 水平上差异显著
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