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化肥过量施用导致农业面源污染与环境恶化是中国生态治理面临的严重问题之一[1-3]。据统计，2017年中国农用化肥施用总量为5 859.4万t，施用强度为352 kg·hm−2，超过国际警戒强度。近年来，中国政府先后出台了一系列政策文件，推动化肥减量化，测土配方施肥技术是促进化肥减量化的重要途经[4-5]。家庭农场是中国未来现代农业发展进程中最为合意和最具生命力的经营主体[6]，家庭农场的生产决策行为直接关乎化肥减量化这一目标能否实现。中国目前测土配方施肥技术采用率不足1/3[7]。因此，以中国家庭农场等新型经营主体为对象，探究影响家庭农场采纳环境友好型技术的因素及影响强度，对促进中国农业绿色转型发展具有重要的现实意义。已有研究表明：创新意识、经营规模、外出务工等是影响家庭农场采纳测土配方施肥技术的重要因素[8-10]，但从契约农业参与的视角来理论和实证分析其采纳测土配方技术的内在机制与效应还未见报道；同时，已有研究大多基于区域调查数据展开，鲜有基于全国大样本调查数据的实证检验，其结论的普适性有待进一步验证。鉴于此，本研究以2018年全国家庭农场监测数据为基础，分析作用机制，构建Probit-倾向得分匹配(PSM)模型，估计契约农业对家庭农场采纳测土配方施肥技术的实际影响，以期为政府制定相关政策提供依据。
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一般具备较强能力与资本实力的家庭农场会偏向于采用能提高农产品产量与质量、促进农场增收的技术[9]。测土配方施肥技术作为一种典型的环境友好型生产技术，可增产6%~10%，节约成本450元·hm−2以上[11]。从理论上看，经营主体是否采纳某项技术取决于对该技术的认知程度，以及该技术能否带来大于技术采纳成本的净收益[12]。经营主体参与契约农业对测土配方技术采纳的作用机制，主要体现在3个方面。
一是通过签订具有法律效应的产品销售与农资供应合约，提前锁定预期收益与生产成本，保证家庭农场的未来投资能够获得稳定的预期回报，从而为采纳测土配方施肥技术等长期投资行为提供正面激励；二是建立契约农业，与上下游主体形成“风险共担、利益共享”共同体，降低交易成本，规避、分散风险，提高其采用测土配方施肥技术的信心[13]；三是通过契约农业为家庭农场争取合作单位技术培训等支持，降低家庭农场采纳新技术的搜寻学习成本及新技术应用的风险，增强其采用技术的可能性。此外，家庭农场自身特征、农场主特征、农场经营特征等也会对技术采纳产生影响。基于以上分析，给出研究假定：相对于未参与契约农业的家庭农场，参与契约农业的家庭农场采纳测土配方施肥技术的概率更高。
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数据来自于2018年全国家庭农场监测项目调查报告[14]。受农业农村部委托，中国社会科学院农村发展研究所对全国近3 000个家庭农场开展长期固定监测工作，在全国各省(区、市)按经济水平高低选择2~4个代表县，每个县选择30~50个生产经营情况比较稳定的家庭农场，调查生产经营各个方面。选择监测数据中1 706个涉及小麦、玉米、水稻和蔬菜瓜果种植为主的家庭农场数据，作为本研究分析样本。
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家庭农场测土配方施肥技术采纳与否，所涉及到的被解释变量为二分类变量，即采纳测土配方施肥技术为1，反之为0。因此可采用Probit模型进行实证分析。同时，家庭农场选择是否参与契约农业还要结合自身需求和资源禀赋，即自选择会导致估计偏误。因此本研究利用基础模型分析，采用PSM构建“反事实推断模型”。
Probit模型如下：
$${Y_i} = {\beta _0} + {\beta _1}{X_1} + \sum\limits_{i = 2}^n {{\beta _i}} {X_i} + \varepsilon \text{。}$$ (1) 式(1)中：Yi表示家庭农场i是否采纳测土配方施肥技术，采纳取值为1，未采纳取值为0；X1表示是否参与契约农业，参与取值为1，不参与取值为0；Xi表示影响家庭农场测土配方施肥技术采纳行为的特征变量，β1和βi分别为其估计系数；β0表示常数项，ε表示随机扰动项。
PSM匹配模型如下：
$$ P({Z}_{i})={P}_{r}({D}_{i}=1|{Z}_{i})=\frac{{\rm{exp}}(\beta {Z}_{i})}{1+{\rm{exp}}(\beta {Z}_{i})}\text{。}$$ (2) 式(2)中：P(Zi)为倾向匹配得分值，表示家庭农场参与契约农业的倾向匹配得分值；Di为二值虚拟变量，即家庭农场i参与契约农业时取值为1，不参与取值为0；Zi为一系列的匹配变量，包括农场特征、农场主特征、经营特征等；β表示相应匹配变量的确定性系数。
基于匹配结果测算家庭农场参与契约农业对测土配方施肥技术采纳行为的平均处理效应(average treatment effect of the treated, EATT)，计算公式如下：
$${E_{{\rm{ATT}}}} = E({y_{1i}}\left| {{X_1} = 1} \right.) - E({y_{0i}}\left| {{X_1} = 1} \right.) = E({y_{1i}} - {y_{0i}}\left| {{X_1} = 1} \right.)\text{。}$$ (3) 式(3)中：y1i为参与契约农业的家庭农场采纳测土配方施肥技术的概率，y0i为匹配后得到的假如处理组未参与契约农业时家庭农场采纳测土配方施肥技术的概率。X1=1表示家庭农场参与契约农业。
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基于上述机制分析，给出模型变量及测度。①被解释变量。被解释变量为家庭农场测土配方施肥技术采纳行为，是指家庭农场在全年的生产经营过程中是否采纳测土配方施肥技术。②关键解释变量。关键解释变量为家庭农场是否参与契约农业，是指家庭农场是否和合作社或农业企业签订了农产品销售合同。③其他控制变量。参考文献[9-10]和[15-16]，选取其他可能影响家庭农场采纳测土配方施肥技术的变量，如农场主个人特征(性别、年龄、受教育程度、是否参加农业技术培训、从事农业规模经营年限、是否为外村户籍和从业经历)、农场特征(是否在工商部门登记注册、是否为农业部门认定的示范农场、农场土地经营总面积、农场经营的全部土地共有几块和家庭成员中在农场工作的人数)、经营特征(是否有日常收支记录、农场未来扩张意愿、是否有生产经营性借款、是否购买过农业保险)等。变量说明及描述性统计结果见表1。
表 1 变量赋值与说明
Table 1. variable assignment and description
类别 变量名 具体含义与赋值 均值 标准差 最小值 最大值 因变量 是否测土配方施肥技术 否为0；是为1 0.61 0.49 0 1 自变量 是否参与契约农业 否为0；是为1 0.32 0.46 0 1 农场主特征 性别 女为0；男为1 0.89 0.32 0 1 年龄 岁 46.14 8.52 18 73 受教育程度 未上过学为1；小学为2；初中为3；高中为4；中专为5；
职高为6；大专为7；本科为8；研究生及以上为93.89 1.38 1 9 是否接受过土肥培育技术培训 否为0；是为1 0.54 0.50 0 1 从事农业规模经营年限 a 7.75 4.81 0 36 是否为外村户籍 否为0；是为1 0.82 0.39 0 1 主要从业经历 非普通农民为0；普通农民为1 0.37 0.48 0 1 农场特征 是否在工商部门登记注册 否为0；是为1 0.80 0.40 0 1 是否为农业部门认定的示范农场 否为0；是为1 0.55 0.50 0 1 土地经营总面积 hm2 23.88 32.63 2.00 475.30 全部经营土地块数 块 13.30 28.32 1 385 家庭成员中在农场工作的人数 人 2.88 1.17 1 15 日常收支记录 否为0；是为1 0.76 0.43 0 1 土地未来扩张意愿 否为0；是为1 0.41 0.49 0 1 是否有生产经营性借款 否为0；是为1 0.60 0.49 0 1 是否购买农业保险 否为0；是为1 0.62 0.48 0 1 -
由表2可知：模型整体拟合程度较好，参数估计符合预期。从关键解释变量来看，家庭农场参与契约农业对其采纳测土配方施肥技术的影响系数为正，且P＜0.01。表明相比未参与契约农业的家庭农场，参与契约农业的家庭农场采纳测土配方施肥技术的可能性更大。
表 2 Probit模型估计结果
Table 2. Probit model estimation results
类别 变量 测土配方施肥技术采纳行为 系数 标准误 是否参与契约农业 0.621*** 0.083 农场主特征 性别 −0.013 0.108 年龄 0.006 0.004 受教育程度 0.005 0.027 是否参加土肥培育技术培训 0.516*** 0.069 从事农业规模经营年限 0.018** 0.007 是否为外村户籍 −0.144 0.091 主要从业经历 −0.425*** 0.076 农场特征 是否在工商部门登记注册 −0.091 0.093 是否为农业部门认定的示范农场 −0.123 0.075 土地经营总面积 0.000 0.000 全部经营土地块数 0.000 0.001 家庭成员中在农场工作的人数 0.007 0.029 是否有日常收支记录 0.613*** 0.087 土地未来扩张意愿 0.205*** 0.072 是否有生产经营性借款 −0.031 0.073 是否购买农业保险 0.196*** 0.074 常数项 −0.880*** 0.302 样本量 1 706 拟合优度 0.184 χ2 420.10 说明：
**、***分别代表在5%、1%的统计水平下显著就农场主特征来看，农场主参加土肥培育技术培训对家庭农场采纳测土配方施肥技术具有正向影响，影响系数为0.516，且P＜0.01。说明参与土肥培育技术培训的家庭农场更愿意采纳测土配方施肥技术。农场主从事农业规模年限对家庭农场采纳测土配方施肥技术具有正向影响，影响系数为0.018，且P＜0.05。说明农场主农业规模年限越长，越倾向于采纳测土配方施肥技术。另外，农场主的从业经历对家庭农场采纳测土配方施肥技术也有显著影响。
就农场特征来看，农场具有完整日常收支记录对家庭农场采纳测土配方施肥技术具有正向影响，影响系数为0.613，且P＜0.01。说明具有完整日常收支记录的家庭农场更愿意采纳测土配方施肥技术；可能的原因是，家庭农场有完整日常收支记录会极大地提高其成为示范典型的可能性[17]，从而提升农场主采纳测土配方施肥技术的意愿和动机。农场土地未来扩张意愿对家庭农场采纳测土配方施肥技术具有正向影响，影响系数为0.205，且P＜0.01。说明具有土地未来扩张意愿的家庭农场采纳测土配方施肥技术的可能性更大；可能的原因是家庭农场具有未来继续扩张土地的意愿一定程度能反映出家庭农场土地经营的稳定性，较高的地权稳定性是促进家庭农场可持续发展的重要指标[18]，对家庭农场采纳测土配方施肥技术意愿有利。
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家庭农场是否参与契约是自主选择的结果，Probit模型回归结果可能存在选择性偏误。因此需要采用倾向得分匹配(PSM)来处理可能存在的自选择问题。PSM模型需要满足2个基本假定，即共同支撑假设和匹配变量的平衡性假定。
共同支撑假设要求对照组与实验组的倾向得分值重叠区间要足够大，否则将导致样本缺失。结果显示：1 706个家庭农场样本数据中，共有1 647个样本数据满足共同支撑假设，可进行匹配。由图1和图2可以看出：样本匹配前，对照组和实验组概率密度曲线重叠较少，吻合度不高，说明存在显著性差异；样本匹配后，概率密度曲线重叠增多，吻合度较高，说明2组样本无显著差异，各个维度特征基本趋于相似，满足共同支撑假设。
图 1 匹配前概率密度分布图
Figure 1. Probability density distribution map before matching
图 2 匹配后概率密度分布图
Figure 2. Probability density distribution map after matching
PSM的平衡性检验主要是考察协变量在控制组与实验组之间是否存在显著性差异。最近邻匹配下的平衡性检验假设结果显示：匹配后各个协变量的标准偏差均大幅度减少，除农场主年龄(8.5%)和农场家庭劳动力(22.9%)的标准偏差下降幅较小，其他协变量标准偏差下降幅度均超过60%，并且所有协变量的标准偏差均小于10%。2组样本均值非常接近，无显著性差异，即通过了平衡性检验。
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本研究PSM模型分别采用最近邻匹配(K=1)、最近邻匹配(K=4)、半径匹配(R=0.01)和核匹配4种方法对样本进行匹配。由表3可知：4种匹配结果均通过了1%的显著性检验，且处理效应系数差异不大。一方面表明PSM模型估计结果较为稳健，另一方面说明家庭农场参与契约农业对其采纳测土配方施肥技术有显著的促进作用。
表 3 契约农业参与的平均处理效应
Table 3. Average processing effect of contract farming participation
匹配方法 处理组/对照组(样本数) EATT 匹配方法 处理组/对照组(样本数) EATT 最近邻匹配(K=1) 538/1 168 0.195***(0.040) 半径匹配(R=0.01) 529/1 091 0.196***(0.029) 最近邻匹配(K=4) 533/1 114 0.183***(0.034) 核匹配 533/1 114 0.190***(0.026) 说明：括号内为标准误；***表示在1%的统计水平下差异显著 -
本研究以2018年全国家庭农场监测项目中采集的1 706个种植业家庭农场信息为基础，构建Probit-PSM模型实证分析了家庭农场参与契约农业对其采纳测土配方施肥技术的影响，研究发现：①家庭农场是否参与契约农业是影响其采纳测土配方施肥技术的重要因素，家庭农场参与契约农业对其采纳测土配方施肥技术具有显著的正向影响，参与契约农业的家庭农场采纳测土配方施肥技术的可能性更大。②农场主参加土肥培育技术培训、农场主从事农业规模经营年限、农场主的从业经历、农场具有完整的日常收支记录和农场具有土地未来扩张意愿等都会显著正向影响家庭农场采纳测土配方施肥技术。
由此认为：第一，政府或相关农业部门单位应该进一步建立健全契约农业参与机制，规范契约双方农业生产协议，充分发挥好契约农业的福利提供和约束作用，鼓励家庭农场积极参与契约农业，促使家庭农场积极采纳测土配方施肥技术；第二，当地政府应该积极开展土肥培育技术等农业技术培训，鼓励家庭农场建立日常收支记录，规范化经营，以更大程度提升家庭农场资源禀赋水平，提高农业生态化经营的发展水平。
On the impact of contract farming on family farms’ adoption of environmentally friendly technologies
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摘要:
目的 为测土配方施肥技术的推广提供决策依据。 方法 基于全国1 706个种植业家庭农场调查数据，借助Probit模型和倾向得分匹配(PSM)方法实证检验契约农业对家庭农场采纳测土配方施肥技术的影响。 结果 Probit模型结果表明：家庭农场参与契约农业对其采纳测土配方施肥技术具有显著的正向影响，影响系数为0.621；PSM模型结果表明：与未参与契约农业的家庭农场相比，参与契约农业的家庭农场平均处理效应为0.19，技术培训、农场主从事农业规模经营年限、农场主的从业经历、家庭农场具有规范的日常收支记录以及未来扩张意愿对技术采纳也有影响。 结论 契约农业是影响家庭农场采纳测土配方施肥技术的重要因素，政府应进一步加快建立健全契约农业参与机制，支持家庭农场提升资源禀赋水平。图2表3参18 Abstract:Object It is expected to provide decision-making basis for the promotion of soil testing and formula fertilization technology. Method With 1706 family plantations selected as the subjects, this paper, after an investigation of the influence of contract farming on the adoption of soil testing and formula fertilization technology on family farms by means of Probit and propensity score matching (PSM), is aimed to provide decision-making basis for the promotion of such environmentally friendly technologies. Result The participation of family farms in contract farming has a prominent and effective influence on the adoption of soil testing and formula fertilization technology with an influence coefficient of 0.621. The average treatment effect is about 0.19 and the adoption of such environmentally friendly technologies is also significantly subject to elements like farmers’ participation in soil and fertilizer cultivation technology training, the duration of large-scale agricultural operations, farmers’ experience, farms’ daily records of income and expenditure and farms’ intention for future land expansion. Conclusion Contract farming is a vital factor affecting the adoption of soil testing and formula fertilization technology by family farms, therefore, efforts are called from the government to further accelerate the establishment of a sound participation mechanism of contract farming and support family farms in the promotion of their resource endowment. [Ch, 2 fig. 3 tab. 18 ref.] -
在遗传转化获得抗性植株时，转化体的抗性筛选是遗传转化能否取得成功的关键步骤。通常在选择培养基中加入合适种类和浓度的筛选剂，使其产生一定的筛选压起到抗性筛选的作用。转化体内选择标记基因的表达产物可对特定筛选剂产生抗性，使转化受体材料继续保持正常的生长发育[1]。目前的研究中，卡那霉素、潮霉素等抗生素被普遍作为筛选剂使用[2-3]。但是由于水稻Oryza sativa胚性愈伤组织对抗生素具有生理抗性，以抗生素为选择标记进行抗性筛选，不能起到很好的筛选效果，且经抗生素筛选后的转化体在分化和再生阶段易受抑制或产生白化苗[4-6]。以草甘膦作为筛选剂可以提高选择的灵敏度，消除转化体生理抗性对筛选结果的影响，克服了以往研究中抗生素筛选的局限性。可遗传的草甘膦抗性基因突变率低，并可在后代中稳定表达，因此进行抗草甘膦作物的培育是可行的[7]。籼稻Oryza sativa subsp. indica和粳稻Oryza sativa subsp. japonica是栽培稻的2个亚种，随着水稻遗传转化技术的发展，大部分粳稻品种已经建立了成熟的遗传转化体系，并成功引入抗虫、抗病、生长发育调控等诸多有利基因[8]。而大多数籼稻品种组培特性不佳，愈伤组织诱导率低，继代过程易褐化且分化再生频率低，导致籼稻的遗传转化效率低，有的品种甚至难以转化。尤其是对生产上广泛推广、农艺性状优良的重要品种而言，其改良与育种进程受到严重限制[9]。CHAN等[10]于1992年尝试利用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法转化籼稻幼根愈伤组织，对转化体进行Southern印记杂交，结果表明：目的基因片段已成功转入转化体细胞中。后经酶活性检测，目的基因可在转化体中稳定表达。1994年，HIEI等[11]为建立高效稳定的农杆菌遗传转化体系，采用了“双超元”载体，并通过在菌液添加乙酰丁香酮(As)活化Vir基因提高转化效率等方法，推进了遗传转化技术在籼稻中的研究应用。目前，虽然已有转抗草甘膦基因的籼稻遗传转化体系的报道，但是转化效率低，还未建立一个高效的转化体系[12]。基于此，本研究选取具有成功再生体系的籼稻‘中恢161’ Oryza sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’为材料，利用农杆菌介导法，转入草甘膦抗性基因(CP4)，探索适合的草甘膦质量浓度用于抗性筛选，并对农杆菌介导的转化过程进行了合理优化，建立‘中恢161’农杆菌介导的转化体系。
1. 材料与方法
1.1 材料
籼稻‘中恢161’成熟胚；农杆菌菌株EHA105；含CP4基因的表达载体p1300-HC。
1.2 方法
1.2.1 成熟胚胚性愈伤组织的诱导和增殖
将成熟种子去壳，进行消毒[13]，接种于诱导培养基R1[NB(N6+B5)+3.0 mg·L−12.4-D+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite]上，接种20 粒·皿−1。放入培养条件为28 ℃，光照16 h/黑暗8 h的组培室中诱导培养。5~7 d后，可观察到幼芽处有淡黄色愈伤组织，统计每皿的出愈数和出愈率。15 d后，剥下色泽鲜黄、结构紧密、生理状态良好的胚性愈伤组织，分散平铺于新鲜配制的胚性愈伤组织增殖培养基R1上进行增殖培养。继代2~4次后，增殖并产生大量的胚性愈伤组织，可用做后期转化的受体材料。
1.2.2 胚性愈伤组织的草甘膦敏感性测试
设置5组草甘膦质量浓度(100、200、300、400和500 mg·L−1)，重复3次，设空白对照，接种20块·皿−1。15 d后，观察胚性愈伤组织的色泽、是否增殖等外观形态，统计胚性愈伤组织褐化率，选出合适的草甘膦质量浓度范围作为筛选压。
1.2.3 胚性愈伤组织的遗传转化和抗性筛选
利用悬浮培养基R2(NB+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30 g·L−1蔗糖+100 μmol·L−1乙酰丁香酮)将培养好的含CP4基因表达载体的农杆菌菌株EHA105稀释至D(600)为0.5~0.8，用其侵染胚性愈伤组织[14]。将转化好的胚性愈伤组织用无菌滤纸吸干多余的菌液，适当干燥后，用灭菌镊子夹取愈伤组织分散地平铺在铺有1层无菌滤纸的共培养培养基R3(NB+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30.0 g·L−1蔗糖+100 μmol·L−1乙酰丁香酮+4.0 g·L−1Gelrite)上，20 块·皿−1。于25 ℃培养室中暗培养2~3 d。取出共培养后的愈伤组织，用含100 mg·L−1羧苄青霉素的无菌蒸馏水清洗3~4次，直至清洗液澄清透明。适度干燥后，用镊子夹取愈伤组织整齐均匀地平铺在筛选培养基R4(NB+3 mg·L−12.4-D+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+0.5 g·L−1谷氨酰胺+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite+0.5 g·L−1头孢霉素+不同质量浓度草甘膦)上。抗性筛选培养基中草甘膦质量浓度分别为300、350和400 mg·L−1。
1.2.4 分化、生根、移栽成活
将抗性愈伤组织系移至分化培养基R5(NB+0.5 mg·L−1 NAA+3.0 mg·L−16-BA+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+0.5 g·L−1谷氨酰胺+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite)上进行分化培养。约15~25 d，部分抗性愈伤组织长出绿点。待绿点进一步分化形成小苗，并长至2 cm左右时将其转移至生根培养基R6(1/2NB+20.0 g·L−1蔗糖+0.1 g·L−1肌醇+8.0 g·L−1琼脂)上生根培养。待幼苗生长出大量的茁壮根系，可将其从生根培养基中取出，小心洗净其根系附着的培养基，置于培养箱中炼苗，增强幼苗对环境的适应性，1周后将健壮的幼苗移至大棚成活。
1.2.5 转基因植株的分子检测和CP4基因试纸条检测蛋白表达
利用TPS法提取转基因植株叶片DNA。利用CP4基因引物(CP4-F: TTCCTTTAGGATTTCAGCATCAGTG, CP4-R: TCCTTCATGTTCGGCGGTCTC)进行CP4基因的PCR扩增，目的片段大小为400 bp。扩增后的产物经质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，统计阳性率。取阳性植株叶片，利用CP4基因表达检测试纸条进行再生植株抗性检测。
2. 结果和分析
2.1 草甘膦抗性筛选最适质量浓度
图1和图2所示：‘中恢161’的胚性愈伤组织在不含草甘膦的培养基中可正常生长且大量增殖，未发生褐化现象；在含100 mg·L−1草甘膦的培养基中，绝大多数胚性愈伤组织可正常生长增殖，褐化率低，仅为5.00%，未起到选择作用；在含200 mg·L−1草甘膦的培养基中褐化率为16.67%，选择效果不明显；在含300 mg·L−1草甘膦的培养基中，褐化率为41.67%，且与200 mg·L−1相比差异显著(P＜0.05)，选择效果好，适合作为筛选压；在含400 mg·L−1草甘膦的培养基中，大部分胚性愈伤组织发生褐化，少部分正常生长，褐化率为65.00%，选择效果明显；在含500 mg·L−1草甘膦的培养基中，胚性愈伤组织基本发生褐化，褐化率为91.67%，显著高于其他质量浓度下的褐化率(P＜0.05)，说明选择压过大。结果表明：草甘膦质量浓度为300~400 mg·L−1时，胚性愈伤组织褐化率约50%，具有很好的筛选效果。
图 1 籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织在不同质量浓度草甘膦培养基中培养20 d后的褐化率Figure 1 Browning rate of O.sativa subsp.indica ‘Zhonghui 161’ callus cultured in different concentrations of glyphosate for 20 days
图 2 籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织在不同质量浓度草甘膦培养基中培养20 d后的褐化情况Figure 2 Browning rate of O. sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’ callus cultured in different concentrations of glyphosate for 20 days2.2 抗性愈伤组织和转基因植株的分子检测
转化后的胚性愈伤组织在含有300、350和400 mg·L−1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选，分别获得200、113、和84块抗性愈伤组织，提取抗性愈伤组织DNA进行CP4基因的PCR检测，阳性愈伤组织的PCR扩增产物经电泳可获得长度为400 bp的条带，与预期相符，表明CP4基因已成功整合到转化体内。进行3个草甘膦质量浓度抗性筛选后愈伤组织阳性率分别为40.16%、61.72%和84.04%。共获得67株再生植株，提取再生植株叶片DNA进行CP4基因的PCR检测。其中阳性植株43株，再生植株阳性率为64.18%(图3)。
图 3 籼稻‘中恢161’再生植株CP4基因的PCR检测Figure 3 PCR result of CP4 gene from glyphosate-resistance plants2.3 CP4基因试纸条检测蛋白表达
抗性检测结果(图4)表明：检测的43株PCR阳性植株中，有25株表现为CP4基因表达，表达率为58.13%。
2.4 ‘中恢161’成熟胚遗传转化体系的建立
遗传转化再生过程如图5所示：对籼稻‘中恢161’成熟胚进行胚性愈伤组织诱导，约7 d可诱导出胚性愈伤组织(图5A)。胚性愈伤组织进行2~4次继代增殖(图5B)，约40 d后进行遗传转化。转化后的胚性愈伤组织在选择培养基上进行抗性筛选(图5C~D)，一段时间后，抗性愈伤组织系会出现增殖(图5E)。约50 d后，抗性愈伤组织于R5培养基上进行分化培养，约15~25 d，长出绿点(图5F)。1个月左右，长出小苗(图5G)。小心取出转移至R6培养基进行生根培养(图5H)。约15 d，幼苗长出大量的茁壮根系，将其从培养基中移出，小心洗净根部培养基。置于培养箱中炼苗，炼苗1周后可移至大棚成活。对再生植株进行CP4基因的PCR检测，保留阳性植株。从诱导胚性愈伤组织至获得抗草甘膦再生植株的整个过程需要4~6个月。
图 5 CP4基因转化籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织的各个阶段Figure 5 Various stages of transforming CP4 gene into embryogenic callus of O.sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’3. 结论与讨论
3.1 草甘膦抗性筛选及其优势
本研究建立了以草甘膦抗性基因CP4为选择标记的‘中恢161’遗传转化体系。非转化体的EPSPS酶活性较低，草甘膦可与S3P形成EPSPS-S3P-草甘膦复合体而竞争性抑制EPSPS酶活性，植物体内蛋白质合成受阻，生长受到抑制，不能正常生长分化[15]。而转化体抗草甘膦基因CP4的表达产物EPSPS酶具有高催化活性和低草甘膦亲和力不易与草甘膦结合，故能够进行正常的生长分化。因此，通过草甘膦筛选可获得转抗草甘膦基因CP4的再生植株。相较于以抗生素抗性基因为选择标记，草甘膦抗性基因不仅能作为筛选标记也能作为目的基因，使受体植物获得除草剂抗性，而且草甘膦比潮霉素等抗生素便宜[7]。不同植物细胞对草甘膦的抗性存在差异，选择合适的草甘膦质量浓度作为抗性筛选的筛选压是影响转化效率的关键因素。本研究将转化后的胚性愈伤组织分别在含有300、350和400 mg·L−1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选，进一步分化、成苗，共获得67株再生植株，进行CP4基因的PCR检测，其中阳性植株43株，再生植株阳性率为64.18%，达到很好的选择效果。
3.2 籼稻遗传转化体系的优化
3.2.1 受体材料的选择及胚性愈伤组织的代龄
能否成功进行遗传转化的重要前提是选择适合的植物材料作为转化受体。水稻幼胚分裂能力强，易形成大量优质胚性愈伤组织，但受季节的影响，水稻幼胚利用不便，且在组织培养过程中易受微生物污染，转化效率不高，因此作为转化体存在一定的困难[16]。成熟胚方便储存与利用，不受季节限制和胚性愈伤组织诱导率较高，通常被作为遗传转化和再生的良好的外源体材料。苏军[17]比较了不同代龄的胚性愈伤组织，发现第4、5代的胚性愈伤组织转化效率较高，并且分化能力也较强。早代愈伤组织不易接受外源遗传物质。但晚代愈伤组织容易出现质地软、水渍化等现象，影响遗传转化成功率。本研究选择胚性愈伤组织代龄为3~4代，可有效减少愈伤组织老化、色泽暗黄、结构松散和褐化率高等问题，有效提高了遗传转化效率。
3.2.2 转化过程的优化
为提高遗传转化效率，本研究采取一系列措施对转化过程进行合理优化。①转化阶段选用色泽鲜黄、外观形态良好、结构紧致的愈伤组织与农杆菌共培养，淘汰外观发白发软发褐的愈伤组织。②在共培养基R2和悬浮培养基R3中加入100 μmol·L−1乙酰丁香酮，可诱导农杆菌Vir基因的活化，从而促进外源基因的整合，极大提高转化效率[18]。③农杆菌菌液经悬浮培养液R3稀释后，D(600)为0.5~0.8。此时为最适菌液浓度，既不会使农杆菌在转化体表面过多繁殖影响其正常生长，又具一定的侵染能力，提高了转化效率。④黑暗条件下共培养2~3 d为适合的共培养时长。共培养时间过短，目的基因不能成功整合至转化体细胞内[19-20]。
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表 1 变量赋值与说明
Table 1. variable assignment and description
类别 变量名 具体含义与赋值 均值 标准差 最小值 最大值 因变量 是否测土配方施肥技术 否为0；是为1 0.61 0.49 0 1 自变量 是否参与契约农业 否为0；是为1 0.32 0.46 0 1 农场主特征 性别 女为0；男为1 0.89 0.32 0 1 年龄 岁 46.14 8.52 18 73 受教育程度 未上过学为1；小学为2；初中为3；高中为4；中专为5；
职高为6；大专为7；本科为8；研究生及以上为93.89 1.38 1 9 是否接受过土肥培育技术培训 否为0；是为1 0.54 0.50 0 1 从事农业规模经营年限 a 7.75 4.81 0 36 是否为外村户籍 否为0；是为1 0.82 0.39 0 1 主要从业经历 非普通农民为0；普通农民为1 0.37 0.48 0 1 农场特征 是否在工商部门登记注册 否为0；是为1 0.80 0.40 0 1 是否为农业部门认定的示范农场 否为0；是为1 0.55 0.50 0 1 土地经营总面积 hm2 23.88 32.63 2.00 475.30 全部经营土地块数 块 13.30 28.32 1 385 家庭成员中在农场工作的人数 人 2.88 1.17 1 15 日常收支记录 否为0；是为1 0.76 0.43 0 1 土地未来扩张意愿 否为0；是为1 0.41 0.49 0 1 是否有生产经营性借款 否为0；是为1 0.60 0.49 0 1 是否购买农业保险 否为0；是为1 0.62 0.48 0 1 
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表 2 Probit模型估计结果
Table 2. Probit model estimation results
类别 变量 测土配方施肥技术采纳行为 系数 标准误 是否参与契约农业 0.621*** 0.083 农场主特征 性别 −0.013 0.108 年龄 0.006 0.004 受教育程度 0.005 0.027 是否参加土肥培育技术培训 0.516*** 0.069 从事农业规模经营年限 0.018** 0.007 是否为外村户籍 −0.144 0.091 主要从业经历 −0.425*** 0.076 农场特征 是否在工商部门登记注册 −0.091 0.093 是否为农业部门认定的示范农场 −0.123 0.075 土地经营总面积 0.000 0.000 全部经营土地块数 0.000 0.001 家庭成员中在农场工作的人数 0.007 0.029 是否有日常收支记录 0.613*** 0.087 土地未来扩张意愿 0.205*** 0.072 是否有生产经营性借款 −0.031 0.073 是否购买农业保险 0.196*** 0.074 常数项 −0.880*** 0.302 样本量 1 706 拟合优度 0.184 χ2 420.10 说明：
**、***分别代表在5%、1%的统计水平下显著
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表 3 契约农业参与的平均处理效应
Table 3. Average processing effect of contract farming participation
匹配方法 处理组/对照组(样本数) EATT 匹配方法 处理组/对照组(样本数) EATT 最近邻匹配(K=1) 538/1 168 0.195***(0.040) 半径匹配(R=0.01) 529/1 091 0.196***(0.029) 最近邻匹配(K=4) 533/1 114 0.183***(0.034) 核匹配 533/1 114 0.190***(0.026) 说明：括号内为标准误；***表示在1%的统计水平下差异显著
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20200726
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