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抗生素因其广谱的抗菌特性和促进生长作用广泛应用于医疗卫生、畜牧及水产养殖等领域[1]。然而，进入机体的抗生素仅有小部分发挥作用，剩下约30%~90%会随着代谢排出体外[2-4]，并且以原药的形式输入周边环境[5]。一些化学性质稳定的抗生素会在环境中长期残留，不仅对周边植物[6]、鱼类[7]造成不利影响，其产生的选择压力还能够诱导耐药菌群的出现和抗性基因的传播[8]。鉴于其巨大的风险和威胁，抗生素以及抗性基因已经被世界卫生组织列为21世纪最重要的污染源之一。残留抗生素的去除和抗生素污染环境的修复成为保障生态安全和生命健康的重要举措。残留抗生素的去除主要有理化处理和生物降解2种途径，其中生物降解因为价格低廉、操作简便且不会造成二次污染而备受青睐[9]。当前关于利用微生物进行抗生素生物降解的研究日益增多，并已积累不少优良的菌种资源[10-11]。但抗生素被降解并不能确保转化产物的安全性，一些原药被代谢后可能会产生毒性更高的中间产物[12]。因此对降解菌株代谢产物的生物毒性评估和生态安全性评价是菌株能够实际应用的必要保证。土霉素(oxytetracycline，OTC)是当今应用范围最广、用量最多的抗生素之一[13]，由于性状稳定已在陆地、水体等多种环境中被高频次检出[14-15]。本研究前期分离获得1株OTC高效降解菌Arthrobacter nicotianae ZAF-05，该菌株环境适应性好，能在液体体系、粪肥和土壤中发挥积极的降解作用[16]。本研究以该菌株为实验对象，利用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(HPLC-Q-TOF-MS)初步解析菌株作用下OTC的降解产物，并以对OTC敏感的大肠埃希菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和水生生物斜生栅藻Scenedesmus obliquus作为指示生物，评估OTC降解产物的生物毒性，以期为菌株的安全使用提供初步理论依据。
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OTC高效降解菌A. nicotianae ZAF-05于2019年分离自制药厂活性污泥。OTC敏感菌革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌No 1.821、革兰氏阴性菌大肠埃希菌No 1.12882均来自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，OTC敏感斜生栅藻购自上海光宇生物技术有限公司。
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OTC购于Solarbio公司，纯度＞99%。LB培养基用于细菌的培养，主要配方为胰蛋白胨10 g·L−1；酵母提取物5 g·L−1；氯化钠5 g·L−1，pH 7.2。BG11合成培养基用于供试斜生栅藻的培养，购自上海光宇生物技术有限公司并按说明书指导方法使用。质谱所用甲醇和乙腈等相关试剂均购自Merck公司(Kenilworth, 美国)。
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制备不同密度降解菌菌悬液，绘制细胞数量与悬液600 nm波长下吸光度[D(600)]的标准曲线，根据标准曲线得到合适密度的细菌悬液。在OTC终质量浓度为100 mg·L−1的LB培养基中接入终密度为1.5×105 CFU·mL−1的降解菌。培养2 d后，取样菌悬液经过滤除菌、过柱萃取后利用HPLC-Q-TOF-MS技术检测OTC降解产物。质谱数据由Agilent 6545 Q-TOF质谱仪获得，使用电喷雾电离源，以正离子和负离子模式工作。具体工作条件：离子化压力3 500 V，裂解电压75 V，碰撞能30 eV，质荷比50~1 200。筛选获得可能的转化产物以TPs表示。以添加OTC但不接种降解菌的处理为阳性对照，以不添加OTC但接种降解菌的处理为阴性对照，所有处理均设置3个平行。
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降解产物毒性测定设置4个处理。对照A(ckA)：添加300 mg·L−1 OTC的LB液体培养基。T1处理：添加300 mg·L−1 OTC的LB培养基，接种降解菌；培养4 d后20 000 r·min−1高速离心2 min，取过滤除菌后的上清备用。T2处理：添加300 mg·L−1OTC的LB液体培养基，自然降解4 d。对照B(ckB)：LB液体培养基。①OTC降解产物对细菌的生物毒性。取2组各4支试管，按1∶1(v/v)加入LB培养液和上述4个处理样品，定容至体积5 mL。分别依次接入1.5×105 CFU·mL−1的枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌新鲜菌悬液，菌液密度确定方法同1.3.1。37 ℃下震荡培养，每隔24 h取样测定菌液吸光度[D(600)]，用以表征细菌数量。②OTC降解产物对供试藻的生物毒性。取1组4个三角瓶，依次加入16 mL BG11培养基和2 mL上述4个处理样品，混匀后接种终密度为1.2×103个·mL−1新鲜藻种。于25 ℃、12 h (光照) /12 h (黑暗)光周期条件下静置培养，每天定时摇晃4~5次，每隔24 h取样测定吸光度[D(680)]。培养4 d后取样藻液，参考武鹏鹏等[17]的方法测定藻液叶绿素质量浓度，参考邹宁等[18]的方法观察藻细胞结构。
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各处理均3个平行，所得数据利用SPSS 16.0进行方差分析，在0.01水平下确认差异显著性。
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OTC降解产物的生物毒性既取决于残留的OTC，也取决于降解过程中产生的中间代谢产物。培养2 d后，对各处理悬液产物进行HPLC-Q-TOF-MS分析发现：降解菌组和阳性对照中均检出了TP447和TP461，阴性对照中则未检出；推测TP447和TP461可能为OTC降解相关中间产物。图1 A和图1 B可见：在7.279 min时TP447出现了明显的特征峰，其图谱特征以及出峰时间与QI等[19]发现的脱甲基OTC一致；由图1 C和图1 D可见：TP447在正、负离子作用下均出现了脱甲基OTC特有的离子碎片图谱，推测TP447可能是OTC水解产物——脱甲基OTC。TP461在4~7 min区段内出现了多个特征峰(图2 A)，参考文献[20]可知：OTC出峰时间在5.434 min时，差向异构OTC(epioxytetracycline，EOTC)出峰时间在4.893 min时，同分异构OTC(isomeric oxytetracyline，ISO-OTC)出峰时间在6.550 min时；此3个化合物出峰时间、质荷比和分子离子峰图谱与TP461相同，推测TP461可能为OTC(图2 B)、EOTC (图2 C)和ISO-OTC (图2 D)的混合物。由表1可知：降解菌培养体系中OTC、EOTC和脱甲基OTC相对丰度极显著低于阳性对照(P＜0.01)，表明菌株ZAF-05在加速OTC分解的同时，还可能抑制了OTC向脱甲基OTC和EOTC的转化，使得体系中EOTC和脱甲基OTC丰度降低。
图 1 TP447的色谱和质谱图
Figure 1. Extracted ion chromatograms and mass spectrum of TP447
图 2 TP461的色谱和质谱图
Figure 2. Extracted ion chromatograms and mass spectrum of TP461
表 1 OTC及其推定代谢产物的相对丰度
Table 1. Relative abundance of OTC and the putative degradation products
可能的化合物 保留时间/min 分子式 相对丰度 阳性对照 降解菌处理 OTC 5.434 C22H24N2O9 13.872 7.254 EOTC 4.893 C22H24N2O9 20.931 5.231 ISO-OTC 6.550 C22H24N2O9 2.727 3.157 脱甲基OTC 7.279 C21H22N2O9 37.278 4.142 -
图3显示：72 h的培养期内，枯草芽孢杆菌在各处理中均有不同程度的生长，随时间推移细胞数量逐渐增加。具体来看，ckB处理下枯草芽孢杆菌生长良好，不同培养时间下细胞的吸光度[D(600)]始终最大，培养72 h时达2.563。相比之下，ckA处理72 h时D(600)仅0.334，表明受试细菌的生长受到明显抑制，极显著低于T1处理[D(600)=2.336]和ckB(P＜0.01)。同时T2处理下吸光度一直处于较低水平[D(600)=0.424，72 h]，与T1差异极显著(P＜0.01)。提示OTC的自然水解过程并不能明显降低液体中OTC及其水解产物的毒性，降解菌ZAF-05能有效分解OTC，降低OTC及中间代谢产物的毒性；T1处理下细菌细胞数量与ckB最为接近，说明降解菌减轻了OTC及中间代谢产物对枯草芽孢杆菌生长的不利影响。
图 3 不同处理对枯草芽孢杆菌生长的影响
Figure 3. Effects of different treatments on growth of B. subtilis
OTC的降解产物对大肠埃希菌生长的影响呈现出与枯草芽孢杆菌一致的态势(图4)。T2处理下，大肠埃希菌生长受阻，72 h培养期内，与ckA处理差异均不显著，说明OTC自然水解的解毒作用甚微。T1处理下，整个培养期内大肠埃希菌细胞数量始终处于较高水平，仅次于ckB，培养后期(48~72 h)甚至超过后者，推测可能是经ZAF-05降解后，OTC中间代谢产物为细菌生长提供了额外的碳源。
图 4 不同处理对大肠埃希菌生长的影响
Figure 4. Effects of different treatments on growth of E. coli
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从图5可以看出：斜生栅藻在4个不同处理中的长势不同，ckB处理下供试藻生长良好[D(680)＝1.064，96 h]，而ckA中培养96 h后斜生栅藻吸光度[D(680)]仅0.028，表明OTC抑制斜生栅藻生长，生理毒性较强。T1处理下，斜生栅藻细胞数量与ckB无显著差异，远高于T2和ckA，说明降解菌株ZAF-05有效缓解了OTC对斜生栅藻的生物毒害。培养0~48 h，T2处理的吸光度与ckA比较差异不明显，尽管48 h后有所增加但远不及T1，说明OTC能发生自然水解，但解毒作用有限。
图 5 不同处理对斜生栅藻生长的影响
Figure 5. Effects of different treatments on growth of S. obliquus
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从图6可以看出：ckB处理下斜生栅藻叶绿素质量浓度为2.126 mg·L−1，ckA为0.193 mg·L−1。可见，OTC的存在大大降低了藻的叶绿素质量浓度。与ckA相比，T1处理一定程度上缓解了叶绿素的减少(0.555 mg·L−1)，但仍极显著低于ckB (P＜0.01)。结合图5认为：尽管T1与ckB的藻类细胞数量相差不大，但其叶绿素质量浓度却显著降低，说明尽管降解菌ZAF-05能高效降解OTC，但短期(96 h)内，仍不能完全转化毒性物质，培养体系中残留的毒性可能会影响斜生栅藻的叶绿素合成。
图 6 不同处理对斜生栅藻叶绿素的影响
Figure 6. Effects of different treatments on chlorophyll content of S. obliquus
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将斜生栅藻置于电镜下放大12 000倍观察细胞超微结构，由图7可见：ckB处理下斜生栅藻细胞截面为典型的椭圆形，细胞壁边缘整齐，细胞器界限清晰，叶绿体数量多，几乎布满整个细胞，平行排列的类囊体整齐地堆叠在叶绿体内。在叶绿体片层间的基质中可见电子密度较大的淀粉粒，淀粉粒数目较多(图7A)。相比之下ckA(图7B)和T2处理(图C)中的细胞壁边缘不整齐，略有缺刻，叶绿体数量少，且结构松散甚至破裂变形。叶绿体中基粒类囊体片层结构减少，形态模糊不清，且排列无序无方向。T1处理下(图7D)，斜生栅藻细胞叶绿体少于ckB，但结构仍然完整，整齐地分布在细胞壁周围，类囊体的片层结构清晰可见且平行排列整齐，细胞结构完整无明显损伤。以上结果证明：与T2和ckA相比，T1处理对斜生栅藻的亚细胞结构影响更小，再次证明降解菌ZAF-05能够有效降解并降低OTC的生物毒性。
图 7 不同处理下斜生栅藻的亚细胞形态
Figure 7. Effects of different treatments on chlorophyll content of S. obliquus
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A. nicotianae ZAF-05是实验室前期分离获得的1株OTC高效降解菌，该菌株不仅能良好降解OTC，还对四环素和金霉素具有一定的去除能力，具有广泛的应用潜力。有些环境残留抗生素在消解时可能会被转化成毒性更高的中间代谢产物。如LI等[21]发现：经臭氧处理5~30 min后OTC大量分解，但产生的代谢产物比OTC的生物毒性更高，其生态危害也更大。因此明确降解菌株的代谢产物生物毒性是菌株能实际发挥作用的前提和保障。本研究采用HPLC-Q-TOF-MS技术解析了OTC的降解产物，最终获得脱甲基OTC、EOTC和ISO-OTC 3种代谢中间产物，其中脱甲基OTC和EOTC为自然水解产物，在降解菌体系和对照中均有出现，但对照中相对丰度远高于降解菌处理体系。研究[22-23]表明：四环素类抗生素的差向异构体，往往具有比母体化合物更高的毒性，而OTC水解形成的ISO-OTC毒性却较OTC及其衍生物(如EOTC)要小得多[23]。本研究中，对照中EOTC相对丰度为降解菌体系的4倍，而ISO-OTC在降解菌体系的相对丰度略高于对照，因此推测A. nicotianae ZAF-05促进了OTC及其高毒代谢产物EOTC向低毒物质(如ISO-OTC)的转化，降低了体系生物毒性。
本研究以大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和模式藻斜生栅藻为靶标生物，考察了OTC及其降解产物对供试细菌和藻类的影响。结果表明：OTC不仅抑制细菌和供试藻增殖，还导致藻细胞变形，引起叶绿体片层结构破裂，与同属四环素族的金霉素的细胞毒性表现一致[24]。OTC被降解后，细菌和藻细胞生长的抑制作用减轻，藻叶绿素合成和叶绿体超微结构的伤害作用缓解。说明降解菌ZAF-05促进体系中OTC及其高毒代谢产物EOTC向低毒物质转化，从而降低了生物毒性。
叶绿体是藻进行光合作用的重要细胞器，内部密布排列整齐的基粒内囊体，基粒内囊体既是叶绿素也是光合系统存在的场所，光合作用过程中的光反应在此进行[25-26]，因此基粒类囊体结构的完整性和有序性是叶绿体进行正常、高效的光能转换的首要前提，对于保障光合作用的顺利进行具有重要意义。本研究中OTC的存在破坏了藻细胞叶绿体中基粒内囊体片层结构的完整，影响了光合作用。这可能是OTC导致藻细胞数量减少的一个重要原因。而添加菌株ZAF-05后，藻内叶绿体仍整齐地分布在细胞壁周围，类囊体片层结构清晰可见且平行排列整齐，细胞结构完整无明显损伤，再一次证实，ZAF-05的降解作用能降低OTC的生物毒性，提高其生态安全性。
Reduction of toxicity of oxytetracycline by highly efficient degrading bacterium Arthrobacter nicotianae ZAF-05
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摘要:
目的 明确1株土霉素(oxytetracycline, OTC)高效降解菌降低OTC生物毒性的效应，为菌株的实际应用提供初步理论依据。 方法 以前期获得的OTC高效降解菌Arthrobacter nicotianae ZAF-05为对象，利用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(HPLC-Q-TOF-MS)分析了OTC的降解产物。以对OTC敏感的大肠埃希菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和斜生栅藻Scenedesmus obliquus作为指示生物，评估OTC降解产物的生物毒性。 结果 HPLC-Q-TOF-MS分析发现：经菌株ZAF-05作用后，体系中的高毒性OTC以及其自然水解产物差向异构土霉素(EOTC)含量显著降低，而低毒性的同分异构土霉素(ISO-OTC)含量略有上升。供试细菌和藻类在添加ZAF-05菌株的OTC体系中的生长情况明显好于OTC自然水解的处理和未添加降解菌的阴性对照，且差异极显著(P＜0.01)。与原药和自然水解物相比，经过ZAF-05菌株降解的OTC代谢产物生物毒性大大降低。菌株的降解作用缓解了OTC对斜生栅藻细胞超微结构的伤害，细胞叶绿体及细胞壁受损减轻。 结论 降解菌ZAF-05能降低OTC残留的环境生物毒性，而毒性的降低可能与体系中高毒性物质被转化成无毒或低毒的代谢产物有关。图7表1参26 Abstract:Objective The objective is to determine the effect of a degrading bacterium which can effectively reduce the bio-toxicity of oxytetracycline (OTC) metabolites, so as to provide a preliminary theoretical basis for practical application of the strain. Method Taking Arthrobacter nicotianae ZAF-05, an efficient OTC-degrading bacterium obtained in the previous studies, as the object, the degradation products of OTC were analyzed by high-performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (HPLC-Q-TOF-MS). OTC sensitive Escherichia coli, Bacillus subtilis, and Scenedesmus obliquus were used as indicators to evaluate the bio-toxicity of degradation products. Result HPLC-Q-TOF-MS analysis showed that the content of highly toxic OTC and its natural hydrolysate epioxytetracycline(EOTC) decreased significantly after treatment with strain ZAF-05, while the content of low toxic isomeric oxytetracyline(ISO-OTC) increased slightly. The growth of tested bacteria and alga in OTC system treated by strain ZAF-05 was significantly better than that in OTC natural hydrolysis treatment and negative control without degrading bacteria, and the difference was significant (P＜0.01). The results indicated that the bio-toxicity of OTC metabolites degraded by strain ZAF-05 was greatly reduced compared with the active drug and its natural hydrolysates. Besides, the degradation effect of the strain alleviated the damage of OTC to the ultrastructure of algal cells, as well as the damage to chloroplasts and cell walls. Conclusion Degrading bacterium ZAF-05 can reduce bio-toxicity of OTC residues, which may be related to the conversion of highly toxic substances into non-toxic or low-toxic metabolites in the system. [Ch, 7 fig. 1 tab. 26 ref.] -
Key words:
- oxytetracycline /
- degrading bacterium /
- degradation products /
- algae /
- bio-toxicity
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核桃Juglans regia 为胡桃科Juglandaceae胡桃属Juglans植物[1]，其种仁含油量高，有“木本油料之王”的称号[2]。同时，核桃木材坚实，是良好的硬木材料。作为重要的经济林树种，核桃大多种植于土壤贫瘠的山坡沟坎，不与粮争地[3]。然而，核桃树体高大，与其他果树相比对矿质营养元素需求量较高，大量元素与核桃产量和品质形成紧密相关[4]，因此，提高核桃树体对矿质元素的吸收能力对于提高核桃产量和品质至关重要[5]。研究表明：在核桃树各器官中种仁的氮素质量分数最高，核桃树吸收累积的矿质营养元素中氮素被商品核桃(种仁、硬壳)携走的比例也最高，叶片次之[6]。可见，氮素可能是提高核桃产量和品质的关键营养元素。然而，过量施用氮肥会导致严重的环境问题，因此，提高氮素利用效率是提高核桃产量与品质的重中之重[7]。
土壤中氮素主要分为无机氮和有机氮两大类，植物根系能够吸收利用的主要是无机氮，主要以硝态氮和铵态氮形式存在[8−9]。植物根系对无机氮转运调节途径可分为2种，即高亲和力(HATs)和低亲和力(LATs)的氮转运系统[10]，HATs 在外部铵态氮( ${\rm{NH}}_4^ +$)、硝态氮(${\rm{NO}}^ -_3 $)浓度低于 0.5 mmol·L−1时介导吸收大部分的无机氮，而 LATs 则是在 ${\rm{NH}}_4^ + $、${\rm{NO}}_3^ - $浓度高于 0.5或 1.0 mmol·L−1时介导吸收无机氮[10]。植物对铵态氮和硝态氮的吸收主要由铵转运蛋白和硝酸转运蛋白介导。土壤中同时含有植物可吸收利用的硝态氮和铵态氮时，由于植物吸收硝态氮需要先将其还原成铵态氮后才能进行同化利用，消耗的能量更多，所以植物对铵态氮表现出明显的偏好性，而且当植物受盐胁迫及活性氧的伤害时，铵态氮具有缓解作用，因此，介导植物对铵态氮吸收的铵转运蛋白在植物氮同化中起着重要作用[11]。铵转运蛋白基因主要有两大类族，分为AMT1和AMT2。在已知的铵转运蛋白中大部分 AMT1 家族的转运蛋白属于高亲和转运体[12]，如拟南芥Arabidopsis thaliana中有6个编码铵转运蛋白被鉴定，包括5个AMT1家族基因，1个AMT2家族基因。AMT1家族基因中，AtAMT1.1和AtAMT1.3对拟南芥根系铵态氮吸收的贡献率最高，为30%，AtAMT1.2、AtAMT1.5对拟南芥根系高亲和铵态氮吸收的贡献率略低于AtAMT1.1和AtAMT1.3[13]，AtAMT1.4在花粉中特异性表达[14]，在水稻Oryza sativa铵转运蛋白基因家族中AMT1家族有基因3个，其中OsAMT1.1和OsAMT1.2为高亲和力转运体[15]；而 AMT2 家族以低亲和为主，在拟南芥AMT2家族基因中AtAMT2.1 在低亲和范围内适度促进拟南芥根系对铵态氮吸收，主要在铵从根部到地上部运输中发挥作用[16]。AMT2 型蛋白通常在植物的不同组织中包括根、芽和叶中都有表达，如AtAMT2.1基因在拟南芥各器官中均有表达，主要表达在拟南芥的维管束及上皮层[17]，在拟南芥中AtAMT2.1与AtAMT1s之间还存在协同作用。此外，毛果杨Populus trichocarpa PtAMT2.1主要在叶片中，PtAMT2.2在叶柄中高表达。除此之外，玉米Zea mays[18]、番茄Lycopersicon esculentum [19]、欧洲油菜Brassica napus [20]等高等作物均鉴别出了AMT基因，但到目前为止，研究大多集中于高亲和的铵转运蛋白AMT1基因家族，对低亲和的铵转运蛋白AMT2基因家族的研究较少。因此，阐明AMT2的生物学功能和调控机制，对于提高核桃自身的氮效率和提高肥料利用效率都具有重要意义。
本研究以核桃JrAMT2过表达株系为供试材料，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及生理检测的方法鉴定JrAMT2基因在核桃植株体内的表达模式，进一步对核桃JrAMT2基因进行生物学功能分析，为核桃优良品种选育提供理论依据。
1. 材料和方法
1.1 植物材料
实验材料来自浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室保存的核桃野生型(WT)以及课题组2019年获得的核桃JrAMT2过表达阳性植株 [21]，其中JrAMT2基因构建于PCMBIA1300植物表达载体，载体抗性为卡那霉素(kanmycin，Kan)，利用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3103菌株介导将构建好的35S::JrAMT2::GFP过表达载体转化到核桃野生型体细胞胚中，植物筛选标记为潮霉素(hygromycin，Hyg)。本研究所用核桃组培苗为野生型体胚和JrAMT2过表达阳性体胚经脱水萌发获得，温室苗则由上述组培苗经生根、炼苗、驯化获得。
1.2 实验方法
1.2.1 生物信息分析运用
SOPMA(
https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html )网站在线分析JrAMT2蛋白质二级结构，运用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ )在线软件对JrAMT2 蛋白进行跨膜结构域的预测，通过 GSDS(http://gsds.gao-lab.org/ )软件在线分析JrAMT2基因结构。1.2.2 植株的培养
同一JrAMT2过表达阳性体胚萌出的植株为1个株系，选取3个核桃JrAMT2阳性株系，命名为JrAMT2-1、JrAMT2-2、JrAMT2-3，每个株系继代培养至50株以上，培养条件：温度为 25 ℃，湿度为 75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗，培养基为Driver&Kunivuki&McGranahan (DKW)培养基。
采用2步生根法获得核桃驯化植株，选取阳性体胚萌发后经4次继代培养的核桃组培苗作为实验材料。第1步进行根诱导，5~8 cm长的光生芽，转移到补充有10 mg·L−1吲哚丁酸钾(K-IBA)的DKW固体培养基，在黑暗中培养7 d，诱导根原基的发生；第2步，不定根诱导结束后将其转移到粗蛭石∶DKW培养基比例(体积比)为3∶2的固体培养基中，温度为25 ℃，湿度为75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗，培养时间为21~28 d，形成不定根，获得核桃不同株系生根植株[22]。
核桃苗不定根形成后取出用清水冲洗，多菌灵浸泡，移栽到泥炭∶蛭石∶珍珠岩比例(体积比)为2∶1∶1的混合土中，将移栽驯化成活后获得的核桃再生植株在温度为 25 ℃，湿度为 75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗的条件下培养[23]，获得核桃不同株系温室植株。
1.2.3 核桃JrAMT2基因阳性鉴定
选用阳性体胚萌发后经4次继代培养的核桃组培苗进行绿色荧光蛋白(GFP) 检测、PCR及RT-qPCR验证，引物见表1。从再生植株顶芽开始向下截取 1.5 cm，培养14 d 后观察植株表型，每个株系均5个生物学重复。选取植株顶芽、叶片、茎段混样提取DNA及RNA。 PCR 反应程序为：94 ℃预变性 2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火温度 30 s，68 ℃延伸 2 min，共 32 个循环；68 ℃延伸 7 min，PCR 反应产物进行质量分数为1.2%琼脂糖凝胶电泳。使用 The iQ5 Real-Time PCR Detection System 仪器进行RT-qPCR，测定转基因植株中JrAMT2的相对表达量。反应程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，40 个循环；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 15 s。通过 2−ΔΔCt方法计算定量结果[24]。
表 1 引物Table 1 Primers引物 序列(5′→3′) 用途 Actin-F GCCGAACGGGAAATTGTC 内参 Actin-R AGAGATGGCTGGAAGAGG 内参 QJrAMT2-F AGCAAATGGGGTTCCAGGTT 定量 QJrAMT2-R TGTCTCCCGCAGATAGAAGGTA 定量 GFP-F ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 鉴定 GFP-R TTACTTGTACAGCTCGTCCA 鉴定 JrAMT2-F CATGAATACCACACCGGCCTA 鉴定 取核桃野生型及核桃JrAMT2过表达株系组培苗的根、茎、小叶，根纵切、茎横切临时切片分别放置于体视荧光显微镜(Carl Zeiss Stereo D13covery V12，Axio Cam MRc system)在明场和蓝光(488 nm)激发条件下利用 ZEN lite 成像软件连续拍照[25-26]。
1.2.4 生长参数、铵态氮和硝态氮测定
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，从顶尖向下剪取1.5 cm茎段，含2~4片复叶，培养14 d，每个株系均5个生物学重复，测量株高及节间数。选取长势相同的核桃野生型及JrAMT2过表达植株采用2步生根法驯化，移栽后用直尺测量统计不同株系生长0、20、40 d的株高、节间长、叶片长度及叶片宽度。
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，培养14 d，采用2步生根法获得核桃生根植株，植株分为地上部分及地下部分2个部分，清洗植株，分别测定地上部分及地下部分鲜质量，于105 ℃下杀青，80 ℃烘干至恒量，称取干质量。使用苏州科铭生物技术有限公司的植物铵态氮(ZATD-1-G)和植物硝态氮(ZXTD-1-G)试剂盒测定地上部分及地下部分铵态氮和硝态氮质量分数，每个株系均5个生物学重复。
1.2.5 植株叶绿体观察、叶绿素质量分数及叶绿素荧光测定
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，取顶尖向下第2节间处复叶。将该叶片置于0.35 mol·L−1氯化钠中研磨破碎至絮状，取悬液于高倍光学显微镜下观察，找到视野中单个完整的叶肉细胞，观察细胞中的叶绿体, 使用image J软件计算叶绿体表面积与单层细胞表面积比率。每个株系均5个生物学重复。
采用丙酮浸取法测定叶绿素质量分数。分别取0.1 g核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗长势一致的叶片，剪碎，置于15 mL离心管中，加入10 mL体积分数 80%丙酮溶液，于室温黑暗处浸提，直至管内材料褪色变白，以80%丙酮溶液为对照，测定663和646 nm处吸光值，每个株系均5个生物学重复。wt=[(wa+8wb)×Vt×(mFW×1 000)−1]，叶绿素 a 质量分数(wa) =20.3×D(646)，叶绿素 b 质量分数(Cb)=8.04×D(663)。其中：wt为叶绿素质量分数(mg·g−1)，Vt为提取液总体积(mL)，mFW为叶片鲜质量(g)，D(646)和D(663)分别为646和663 nm处的吸光度。
叶绿素荧光测定使用M-PEA(multi-function plant efficiency analyser)多功能植物效率分析仪(英国Hansatech公司)测定。选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系温室苗由上向下第3片叶片暗处理30 min，在饱和脉冲光(5 000 μmol·m−2·s−1) 下进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线) 的测定和绘制。参照SCHANSKE等[27]的方法分析叶绿素荧光诱导动力学参数(JIP-test)。
1.2.6 数据分析
利用SPSS 26软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比较(邓肯法)，显著性水平为0.05。使用GraphPad Prism 7.0软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 核桃JrAMT2基因生物信息学分析
核桃 JrAMT2基因的全长为 1 464 bp，起始密码子为 ATG，终止密码子为 TGA。经过美国国家生物技术信息中心(NCBI)在线序列比对显示：该基因的序列编码的氨基酸序列属于 Ammonium Transporter Family，编码487个氨基酸(图1)，蛋白分子量为52.458 kD，预测分子式为C2433H3715N601O646S23，含有7 418个原子，理论等电点为7.11，不稳定指数为35.61，脂溶指数为101.56，亲水性平均值为0.472。该段蛋白质中包含20种常见氨基酸：亮氨酸质量分数最高，达到11.7%，其次分别为甘氨酸11.1%，丙氨酸10.9%，缬氨酸8.6%，半胱氨酸质量分数最低，仅为1.0%。JrAMT2蛋白中分别含有29个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和29个碱性氨基酸残基(Arg+Lys) (表2)。
表 2 JrAMT2基因氨基酸组成Table 2 Composition of JrAMT2 amino acids氨基酸 数量/个 占比/% 氨基酸 数量/个 占比/% 氨基酸 数量/个 占比/% 丙氨酸 53 10.90 组氨酸 9 1.80 苏氨酸 27 5.50 精氨酸 11 2.30 异亮氨酸 25 5.10 色氨酸 18 3.70 天冬酰胺 16 3.30 亮氨酸 57 11.70 酪氨酸 17 3.50 天冬氨酸 15 3.10 赖氨酸 18 3.70 缬氨酸 42 8.60 半胱氨酸 5 1.00 甲硫氨酸 18 3.70 吡咯赖氨酸 0 0.00 谷氨酰胺 11 2.30 苯丙氨酸 24 4.90 晒半胱氨酸 0 0.00 谷氨酸 14 2.90 脯氨酸 24 4.90 甘氨酸 54 11.10 丝氨酸 29 6.00 对核桃JrAMT2蛋白跨膜区的预测结果表明：该蛋白N端在膜外，C端存在膜内，共含有11个跨膜螺旋，跨膜螺旋区段分别位于24~46、59~81、129~151、158~180、195~214、227~244、254~276、288~310、314~333、346~368和398~420，推测JrAMT2属于跨膜蛋白，并在N端存在信号肽(图2A)。
对JrAMT2 蛋白二级结构的预测结果显示：JrAMT2的氨基酸组成中有4种构象，其中 α- 螺旋有 201 个氨基酸，占比 43.12%；延伸链有 93个氨基酸，占比19.10%；β- 转角有 30个氨基酸，占比 6.16%；无规则卷曲有154个氨基酸，占比 31.62%。JrAMT2 铵转运蛋白主要由 α- 螺旋和无规则卷曲组成(图2B)。
对JrAMT2基因结构的分析显示：JrAMT2基因由4个外显子，3个内含子组成。与拟南芥AtAMT2基因相比，拟南芥基因结构多了1个外显子和1个内含子，与山核桃Carya cathayensis CcAMT2基因[28]、栓皮栎Quercus suber QsAMT2基因[29]相比，外显子和内含子数量相同，同源性较高(图2C)。
2.2 核桃JrAMT2过表达植株阳性验证
在成功构建35S::JrAMT2::GFP的过表达载体并通过农杆菌介导转化核桃体胚后，对同一无性系JrAMT2体胚经脱水萌发获得的再生植株进行阳性鉴定。利用PCR技术，以核桃JrAMT2过表达植株3个株系(JrAMT2-1、JrAMT2-2和JrAMT2-3) DNA为模板，进行外源GFP基因(729 bp)的PCR验证，检测到大小约为 750 bp的电泳条带，与GFP基因大小符合(图3A)；进行目的基因JrAMT2加外源GFP基因全长(2193 bp)的PCR验证，检测到大小为2000 bp的电泳条带，与目的基因大小符合(图3B)；以核桃JrAMT2过表达植株3个株系的cDNA为模板，利用实时定量PCR技术对JrAMT2基因表达量进行检测，结果显示：核桃JrAMT2过表达植株3个株系JrAMT2基因相对表达量分别为野生型的10.58、12.80和14.94倍，显著上调(图3C)，表明核桃JrAMT2过表达植株中JrAMT2基因稳定表达。
图 3 PCR 和RT-qPCR 对核桃组培苗的JrAMT2基因的检测Figure 3 Detection of JrAMT2 gene in J. regia tissue culture seedlings by PCR and qRT-PCR对获得的过表达株系进行GFP荧光阳性鉴定，分别将核桃过表达及野生型幼苗(图4A)的小叶、茎、根置于荧光体视显微镜下在波长为488 nm蓝光激发下拍摄。结果显示：过表达植株的小叶、茎、根表面呈现均匀的绿色荧光，其中腋芽处荧光更明亮(图4B1~6)，野生型核桃幼苗的小叶、茎、根在荧光下拍摄无绿色荧光激发(图4B7~12)，说明JrAMT2蛋白在腋芽处积累。为进一步研究JrAMT2基因在核桃幼苗中的表达，对过表达株系及野生型组培苗的茎段进行横切，根进行纵切后，进行GFP荧光检测，结果显示：核桃JrAMT2过表达植株茎段横切中呈现均匀的绿色荧光，其中在维管组织中荧光更明亮，野生型植株茎段横切面无绿色荧面光(图4B1~12)；核桃JrAMT2过表达植株根段纵切面中呈现均匀的绿色荧光，且在维管组织中荧光更明亮，野生型植株根段纵切面无绿色荧光(图4C1~8)。表明JrAMT2基因在核桃幼苗的根和茎中均可稳定表达，其中JrAMT2蛋白在根和茎的维管束组织中积累。
图 4 铵态氮转蛋白基因JrAMT2在核桃苗中稳定表达Figure 4 Stable expression of ammonium nitrogen transfer protein gene JrAMT2 in J. regia2.3 核桃JrAMT2基因的生物学功能分析
2.3.1 核桃JrAMT2过表达植株生长表型分析
为了进一步研究核桃JrAMT2基因的生物学功能，将3个JrAMT2过表达植株与野生型核桃植株培养14 d。结果表明：与野生型相比，核桃JrAMT2过表达植株均生长旺盛，株高显著增加，节间显著增长(P＜0.05，图5A)。3个JrAMT2过表达株系株高分别为3.87、4.23和4.12 cm，节间长分别为0.33、0.35和0.34 cm，野生型植株株高为3.30 cm，节间长为0.28 cm，与野生型相比，3个JrAMT2过表达株系株高分别增加了17.0%、28.0%和29.0% (图5B)，节间长分别增加了19.0%、25.0%和24.0% (图5C)。综上所述，JrAMT2过表达对核桃幼苗的生长有显著提高作用。
图 5 核桃JrAMT2过表达离体培养植株表型分析Figure 5 Phenotypic analysis of J. regia JrAMT2 overexpression plant in vitro culture对核桃JrAMT2过表达植株进一步驯化培养，成功获得核桃JrAMT2过表达温室苗。对其生长表型进行分析(图6A)，定植后培养40 d，核桃JrAMT2过表达温室苗的株高、节间长、叶片长度、叶片宽度增加显著高于野生型(P＜0.05)。培养至第20天时，与野生型相比，核桃JrAMT2过表达温室苗3个株系株高分别增加21.9%、26.0%和24.6% (图6B)，节间长分别增加41.2%、27.7%和26.3% (图6C)，叶片长度分别增加18.7%、16%和30.7% (图6D)，叶片宽度分别增加41.3%、48.2%和55.1% (图6E)；培养至第40天时，与野生型相比，JrAMT2过表达温室苗3个株系株高分别增加53.6%、68.2%和62.1%，节间长分别增加37.2%、50.3%和44.8%，叶片长度分别增加了27.8%、34.1%和49.3%，叶片宽度分别增加24.3%、19.5%和29.2%。综上所述，核桃JrAMT2过表达温室苗与野生型相比，株高、节间长、叶片大小均显著增加，进一步证明JrAMT2基因过表达加快了核桃的生长速度。
图 6 核桃JrAMT2过表达阳性温室苗性状分析Figure 6 Character analysis of J. regia JrAMT2 overexpression positive greenhouse seedlings2.3.2 核桃JrAMT2过表达植株对氮素吸收分析
为探究JrAMT2基因在核桃中是否存在差异表达，将核桃野生型及核桃JrAMT2过表达植株进行2步生根，获得核桃JrAMT2过表达生根植株，将其分为地上部分与地下部分。与野生型相比，核桃JrAMT2过表达生根植株地下部分不定根生长旺盛(图7A)。对核桃JrAMT2过表达植株地上部分及地下部分差异分析，分别提取3个核桃JrAMT2过表达株系生根植株地上部分及地下部分RNA，利用实时定量PCR技术，分析地上部分及地下部分JrAMT2基因表达的差异。结果表明：3个JrAMT2过表达株系地上部分JrAMT2基因表达量分别是野生型的11.94、12.70和15.06倍，地下部分JrAMT2基因表达量分别是野生型的19.07、23.34和24.00倍(图7B)。对核桃野生型及3个JrAMT2过表达株系地上部分及地下部分进行干质量和鲜质量测定。结果表明：3个JrAMT2过表达株系地上部分鲜质量和干质量显著高于野生型(P＜0.05)，与野生型相比，鲜质量分别增加23.45%、33.67%和56.26%，干质量分别增加23.45%、43.89%和56.26%；3个JrAMT2过表达株系地下部分干质量和鲜质量显著高于野生型(P＜0.05)，与野生型相比，鲜质量分别增加222.65%、199.24%和344.38%，干质量分别增加222.65%、199.24%和354.33%(图7C)。
图 7 核桃JrAMT2过表达植株氮素吸收分析Figure 7 Character analysis of the regenerated plants with expression of JrAMT2 in J. regia基于核桃JrAMT2过表达植株表型变化，本研究进一步测定核桃JrAMT2过表达植株对硝态氮及铵态氮吸收。结果表明：与野生型相比，核桃3个JrAMT2过表达株系地上部分及地下部分铵态氮质量分数显著增加(P＜0.05)，地上部分分别增加59.1%、32.3%和55.1%，地下部分别增加68.1%、61.9%和114.1% (图7D)；核桃3个JrAMT2过表达株系地上部分硝态氮质量分数显著降低(P＜0.05)，地下部分硝态氮质量分数显著增加(P＜0.05)，地上部分分别降低10.1%、7.1%和13.6%，地下部分别增加63.5%、75.7%和70.3% (图7E)。综上所述，JrAMT2基因主要作用于核桃地下部分，且JrAMT2基因过表达促进植株地下部分对铵态氮和硝态氮的吸收，并介导了铵态氮从地下部到地上部的运输。
2.3.3 核桃JrAMT2过表达植株叶绿素质量分数及叶绿素荧光特性分析
对核桃JrAMT2过表达植株叶色与叶片细胞叶绿体进行观察。核桃JrAMT2过表达植株叶色与野生型相比颜色较深(图8A)，在显微镜下观察3个核桃JrAMT2过表达植株株系及野生型叶绿体特征发现，3个核桃JrAMT2过表达株系扩张的栅栏叶肉细胞中的叶绿体更致密(图8B)。进一步分析发现：对3个阳性株系进行总叶绿素质量分数测定，3个核桃JrAMT2过表达株系叶绿素质量分数显著高于野生型(P＜0.05)，野生型总叶绿素质量分数为3.53 mg·g−1，核桃JrAMT2过表达阳性植株3个株系总叶绿素质量分数分别为4.64、4.69和6.10 mg·g−1，与野生型相比分别增加了32.6%、34.0%和74.3% (图8C)；JrAMT2过表达株系叶绿体表面积在单层细胞表面积的占比显著高于野生型(P＜0.05)，野生型叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率为0.56，3个核桃JrAMT2过表达株系叶绿体表面积与单层细胞表面积的比值分别为0.67、0.68和0.69，与野生型相比分别增加了19.41%、21.18%和22.94% (图8D)。综上所述，JrAMT2基因过表达提高了叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率及核桃叶肉细胞内叶绿素的积累。
图 8 核桃JrAMT2过表达植株叶绿体及叶绿素质量分数分析Figure 8 Analysis of chloroplast and chlorophyll content in J. regia with JrAMT2 overexpression对3个核桃JrAMT2过表达株系进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线测定。结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系的O (Fo点)相、K相降低，J点、I点、P (Fm)及J~P点振幅均提高，OJIP曲线较陡，表明JrAMT2基因一定程度上提高了叶片的活性(图9A)。与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系暗适应后的最大荧光强度(Fm)、最大量子产额(Fv/Fm)均提高，Fm分别提高了47.1%、45.9%、50.2%，Fv/Fm分别提高了15.6%、13.4%、14.7%，表明JrAMT2基因一定程度上提高了光系统Ⅱ(PSⅡ)的光化学效率(图9B)。计算归一化处理的OJIP曲线(Vt)[Vt =(Ft−Fo /(Fm−Fo)，Ft为任意时刻t的荧光值]，并计算相对荧光差异ΔVt[ΔVt = Vt处理−Vt对照，用ΔK、ΔJ值分别显示在300 μs和20 ms处的ΔVt值，表示放氧复活体的活性(OEC)]。结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系ΔK、ΔJ值下降且＜0 (图9C)，表明JrAMT2基因一定程度上提升了核桃叶片PSⅡ供体侧及受体侧电子传递效率及放氧复活体的活性。
图 9 铵态氮转运蛋白JrAMT2基因表达对核桃叶绿素荧光的影响Figure 9 Effect of ammonium nitrogen transporter JrAMT2 gene on chlorophyll fluorescence of J. regia用JIP-test参数对OJIP曲线进行定量分析，结果显示：核桃3个JrAMT2过表达株系在t=0时的最大光化学效率(φPo)、反应中心捕获的光能用于${\rm{Q}}_{\rm{A}}^- $下游电子传递的量子产量(ΨEo)、吸收的能量用于电子传递的量子产量(φEo)上升，分别上升了14.62%、44.59%、65.80%；在J点的相对可变荧光强度(VJ)、最小荧光强度与最大荧光强度比值(Fo/Fm)、反应中心关闭净速率(dV/dto)下降，分别下降了31.03%、35.29%、49.34% (图9D)，表明JrAMT2基因一定程度上提高了PS反应中心的量子比率及产额；对单位PS反应中心比活性参数分析，结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系在t=0 时的单位反应中心捕获的用于电子传递的能量(ETo/RC)、在t=0 时的单位反应中心传递到电子链末端的能量(REo/RC)无明显变化，在t=0 时单位反应中心吸收的能量(ABS/RC)、在t=0 时单位反应中心耗散的能量(DIo/RC)、在 t=0 时单位反应中心捕获的用于还原QA的能量(TRo/RC)显著下降，分别为36.43%、58.67%、27.22%，表明JrAMT2基因一定程度提高了核桃叶片反应中心活性和用于电子传递的能量份额，增强了电子传递能力(图9E)；对单位受光截面比活性参数分析，结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系在 t=tFM(暗适应后达到最大荧光强度时间点)时的单位受光截面耗散的能量(DIo/CSm)无明显变化，在 t=tFM时单位受光截面吸收的能量(ABS/CSm)、在t=tFM时单位受光截面捕获的用于还原QA的能量(TRo/CSm)、在 t=tFM时单位受光截面捕获的用于电子传递的能量(ETo/CSm)、在t=tFM时单位受光截面传递到电子链末端的能量(REo/CSm)上升，分别上升了 47.79%、69.39%、145.10%、303.62%(图9F)，表明JrAMT2基因一定程度提高核桃叶片单位受光截面的电子传递的份额及电子传递效率。综上所述，JrAMT2基因过表达促进核桃的光合作用。
3. 讨论
氮素作为植物生长发育必不可少的营养元素，是核酸、蛋白质、酶、叶绿素、植物激素等的重要组成部分[30]。自然界中可供利用的氮素资源有限，作物高产就需要化肥的投入。中国的化肥投入总量逐渐升高，但化肥利用率很低，给自然环境带来极大的负担 [31−32]，因此合理使用化肥，提高作物对氮素的吸收效率是促进农业生态化发展的重要途径。铵转运蛋白基因AMTs是广泛存在于动物、植物、微生物中用于运输${\rm{NH}}_4^+ $的载体蛋白，从分子层面提高植物对氮素的利用具有重要意义。前人研究发现：在拟南芥中，氮饥饿能诱导AtAMT1.1、AtAMT2.1基因上调表达，并且AtAMT2基因的表达水平随着氮饥饿时间的延长而增加[33-34]。在充足或高氮条件下，观察到拟南芥中AtAMT2.1及水稻根中OsAMT1.2基因表达水平仍上调 [35-36]，其中氮素形态对AMT基因转录水平的调控也取决于AMT基因个体和植物物种。
本研究对核桃JrAMT2过表达植株进行初步的功能验证，对JrAMT2基因进行生物信息学分析表明：JrAMT2蛋白中含有29个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和29个碱性氨基酸残基(Arg+Lys)。该蛋白N端在膜外，C端存在膜内，共含有11个跨膜螺旋结构域，与李畅[36]预测的OsAMT2.1蛋白结构域特点相同，且与夏金泽等[37]研究的木薯Manihot esculenta MeAMT2.6基因的蛋白结构相似。AMT2 型蛋白通常在植物的各种组织中表达，包括根、芽和叶。前人研究发现：杜梨 Pyrus betulifolia PbAMT2基因在所有器官中均有表达，但在根部表达最高[38]。在拟南芥中发现：AtAMT2.1基因主要在维管组织中表达，在芽中的表达高于根[15]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株进行绿色荧光观察发现：JrAMT2蛋白在核桃苗整株均有表达，且在芽及根茎的维管束中荧光更明亮，说明与拟南芥相同，核桃JrAMT2蛋白在所有器官中表达，且主要在维管组织中表达。
在植物生长发育重要阶段充足的氮素营养供给可以促进其生长发育，增加产量，对植物外施氮素能增加植株株高及叶面积[39]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株生长性状分析发现：JrAMT2基因在核桃中过表达对植株生长发育有调控作用，主要表现在过表达植株株高、节间长显著增加。对过表达植株生根驯化结果显示：过表达植株生物量显著增加，根系发达。对核桃JrAMT2过表达植株移栽驯化，定植后植株生长速率显著高于野生型，主要表现在节间伸长快，叶面积增加。AMT2是具有铵吸收功能的铵转运蛋白，且在维管组织表达，暗示着该基因可能参与铵向木质部的装载，介导铵在植物中的长距离运输。研究发现：拟南芥AtAMT2.1除了对根吸收氮素有一定贡献外，主要作用于${\rm{NH}}_4^+ $从根部到茎部的运输[40]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株地上部分和地下部分基因表达测定发现：植株地下部分JrAMT2基因表达量显著高于地上部分，且植株地下部分生物量的增加显著高于地下部分，说明核桃JrAMT2基因主要在地下部分表达。对核桃JrAMT2过表达植株对铵态氮和硝态氮吸收测定结果表明：核桃JrAMT2过表达植株地上部分仅对铵态氮的吸收显著上调，地下部分对铵态氮与硝态氮的吸收均显著上调，说明JrAMT2基因促进植株对铵态氮和硝态氮的吸收，并介导了铵态氮从地下部分到地上部分的运输。氮素营养还会通过影响叶绿素合成和叶绿素荧光参数的变化来参与光能的利用和调控[41]。有研究表明：水稻OsAMT2.1基因敲除株系的光合特性与野生型相比出现下降趋势，同样说明了AMT2基因对植物光合作用有调控作用[36]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株叶绿素质量分数及叶绿素荧光参数变化的测定结果显示：JrAMT2基因显著提高了核桃的叶绿体表面积与单层细胞表面积比率、叶绿素质量分数及叶绿素荧光参数中叶片放氧复活体活性、量子产额、电子传递效率。
4. 结论
JrAMT2作为铵态氮转运基因，促进核桃对铵态氮和硝态氮的吸收，且介导铵态氮从根部到茎部的运输，对核桃生长发育、光合作用等有积极作用，对研究核桃高效利用氮素及良种的筛选有重要意义。
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图 3 不同处理对枯草芽孢杆菌生长的影响
Figure 3 Effects of different treatments on growth of B. subtilis
图 6 不同处理对斜生栅藻叶绿素的影响
Figure 6 Effects of different treatments on chlorophyll content of S. obliquus
图 7 不同处理下斜生栅藻的亚细胞形态
Figure 7 Effects of different treatments on chlorophyll content of S. obliquus
表 1 OTC及其推定代谢产物的相对丰度
Table 1. Relative abundance of OTC and the putative degradation products
可能的化合物 保留时间/min 分子式 相对丰度 阳性对照 降解菌处理 OTC 5.434 C22H24N2O9 13.872 7.254 EOTC 4.893 C22H24N2O9 20.931 5.231 ISO-OTC 6.550 C22H24N2O9 2.727 3.157 脱甲基OTC 7.279 C21H22N2O9 37.278 4.142 
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