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中国作为农业大国之一，具有丰富的秸秆资源。据统计，中国秸秆年生产量达8.65 亿t，但每年有1 亿t秸秆废置，造成资源浪费和环境污染[1]。秸秆主要成分为木质纤维素，其特殊的“纤维素-半纤维素-木质素”三维网络结构在自然状态下难以降解，严重限制了秸秆资源利用[2]。随着技术不断发展，目前已开发出多种秸秆处理方法，如高温热解、蒸汽爆破、酸碱处理等[3]。微生物降解法以成本低、耗能小、环境友好等优点受到广泛关注[4]。相较于细菌和放线菌，真菌能产生更多种类的酶，如纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、过氧化物酶、糖苷酶等来协同降解木质纤维素[5−7]，成为当前研究热点。目前，已开发的秸秆降解真菌主要有黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium、黑曲霉Aspergillus niger、草酸青霉Penicillium oxalicu、糙皮侧耳Pleurotus ostreatus等[8−11]，但部分真菌仍存在降解周期长、生长条件严格、降解不稳定等缺点[12]，难以实现产业化，因此，仍需进一步挖掘高效稳定的木质纤维素降解真菌。
白蚁是自然界中高效的木质纤维素分解者，其特殊的白蚁-共生菌降解系统可消化植物中74%~99%的纤维素和65%~87%的半纤维素[13]，降解效率为瘤胃动物的3倍以上[14]。有研究表明：白蚁的共生真菌具有较强的木质纤维素降解能力，如王成盼等[15]研究发现：黑翅土白蚁Odontotermes formosanus菌圃共生真菌蚁巢伞Termitomyces在固体发酵条件下可降解木质食料中20.98%的纤维素、31.89%的半纤维素和11.68%的木质素。SIJINAMANOJ等[16]从胖身土白蚁O. obesus菌圃和肠道中分离得到红绶曲霉A. nomius和哈茨木霉Trichoderma harzianum，分别使不同农业废弃物纤维素降低10.83%~15.53%和8.50%~36.30%。
为进一步挖掘白蚁共生真菌在秸秆资源利用上的应用潜力，本研究从黑翅土白蚁肠道中分离筛选木质纤维素降解真菌，挖掘高效降解水稻Oryza sativa秸秆的真菌菌种资源，为秸秆生物降解产业化提供理论基础。
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供试黑翅土白蚁蚁巢采自福建省三明市大田县，26 ℃避光饲养。供试水稻秸秆收集自江苏省连云港市，烘干粉碎后过100目筛，常温保存。
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羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基：CMC-Na 1.000 g、硝酸钠 0.200 g、氯化铵 0.200 g、磷酸二氢钾 0.100 g、磷酸氢二钾 0.100 g、蛋白胨 0.100 g、七水硫酸镁 0.050 g、氨苄青霉素 0.005 g、卡那霉素 0.005 g、琼脂 4.000 g、蒸馏水 100 mL，pH 7。
水稻秸秆培养基：水稻秸秆粉(100目) 2.000 g、硝酸钠 0.200 g、氯化铵 0.200 g、蛋白胨 0.200 g、磷酸二氢钾 0.100 g、磷酸氢二钾 0.100 g、七水硫酸镁 0.050 g、蒸馏水 100 mL，pH 7。
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肠道匀浆制备：取黑翅土白蚁成熟工蚁25只，在无菌超净台中用体积分数为75%的乙醇浸泡消毒5 min，无菌水清洗3次后用解剖针压住腹部末端，拉出白蚁肠道，于5 mL质量分数为0.9%的无菌生理盐水中研磨成匀浆。
分离：肠道匀浆液稀释100倍后，取100 µL均匀涂布于CMC-Na平板上，37 ℃避光培养至单菌落，长成后划线分离，重复3次后获纯培养菌株。
筛选：将直径5 mm菌饼接种于CMC-Na平板，37 ℃避光培养5 d后加入20 mL 1 g·L−1的刚果红溶液，染色1 h弃去染色液，加入1 mol·L−1的氯化钠溶液20 mL脱色30 min，观察菌株是否产生透明圈。
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将纯化后菌株送至浙江尚亚生物技术有限公司，提取分离真菌DNA后，选取通用引物ITS1与ITS4扩增真菌ITS序列，将扩增产物连接至pTOPO-T载体并转入感受态细胞，使用M13F/13R引物扩增载体序列，测序后通过BLAST在线比对菌种，同时于GenBank登记序列号。
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取直径5 mm菌饼接种于100 mL CMC-Na液体培养基(配方同CMC-Na培养基，不加琼脂)，于27 ℃、180 r·min−1的摇床内避光培养9 d后，取2 mL液体培养基，4 ℃ 8 000 r·min−1条件下离心5 min，上清液即为粗酶液。
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取200 μL粗酶液(对照组取无菌CMC-Na液体培养基)，加入800 μL 质量分数为1% CMC-Na溶液，50 ℃反应60 min后加入1 mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液，沸水浴反应10 min，冷却后稀释至5 mL，于540 nm波长下测定吸光度值，计算酶活性。
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取200 μL粗酶液(对照组取无菌CMC-Na液体培养基)，加入800 μL 质量分数为1%微晶纤维素溶液，50 ℃反应60 min后加入1 mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液，沸水浴反应10 min，冷却后稀释至5 mL，于540 nm波长下测定吸光度值，计算酶活性。
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取100 μL粗酶液(对照组取无菌CMC-Na液体培养基)，加入200 μL 10 mmol·L−1 对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖(p-NPG)溶液，50 ℃反应30 min后加入2 mL 1 mol·L−1 碳酸钠溶液终止反应并显色，于400 nm波长下测定吸光度，计算酶活性。
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本研究酶活性单位定义：在50 ℃，pH 7条件下，1 L酶液在1 s内水解底物生成1 μmol还原产物所需的酶量为1个酶活性单位(μkat·L−1)。
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将CMC-Na平板分为2个半圆区域，分别在2个半圆区域内接种直径为0.5 cm的不同真菌菌饼，37 ℃黑暗条件下对峙培养7~15 d，观察真菌间拮抗反应。
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将直径0.5 cm真菌菌饼(双菌组合各1/2，加入直径为0.5 cm菌饼)接入灭菌后水稻秸秆培养基(秸秆干质量记为m)，37 ℃避光培养20 d，使用20目筛分离真菌菌丝和秸秆，秸秆80 ℃烘干12 h后称干质量(记为md)，计算干物质降解率(Rdm)：Rdm= (m−md)/m×100%。
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木质纤维素组分质量分数测定参考美国国家可再生能源实验室(NREL)方法[17]，并有所简化：取0.2 g干燥植物材料(记为m0)，加入3 mL体积分数为72%的硫酸，摇匀，30 ℃水浴1 h。稀释酸体积分数至4%(体积记为v)，转移至聚四氟乙烯耐压瓶中，于烘箱中121 ℃酸解2 h。使用砂芯漏斗抽滤，滤纸采用已烘干并称量的无灰定量滤纸(记为m1)。滤渣连同滤纸转移至陶瓷坩埚，80 ℃过夜烘干后称量(记为m2)，随后于马弗炉中550 ℃煅烧4 h，冷却后称量(记为m3)。滤液以质量分数为4%的氢氧化钠中和至中性后(稀释倍数记为k)，用葡萄糖试剂盒测定葡萄糖质量分数(记为Cglu)，用DNS法测定还原糖质量分数(记为Crs)，计算纤维素、半纤维素和木质素质量分数(分别记为Ccel、Chem和Clig)，最后根据降解前组分质量分数(记为C)和降解后组分质量分数(记为Cd)计算组分降解率(记为Rlc)。计算公式如下：Ccel = Cglu×v×k×0.90/m0×100%；Chem = (Crs−Cglu)×v×k×0.88/m0×100%；Clig = (m2−m1−m3)/m0×100%；Rlc = [1−(m×C)/(md×Cd)]×100%。其中：0.90为纤维素单糖转化系数，0.88为半纤维素单糖转化系数。
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取降解前后水稻秸秆样品，烘干后研磨成粉末，使用傅立叶红外光谱仪(Thermo Scientific NICOLET iS50FT-IR)分析。分辨率4 cm−1，扫描次数32次，扫描波长500~4 000 cm−1。
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取降解前后水稻秸秆样品，烘干后研磨成粉末，使用X射线衍射仪(Bruker D8 Advance)分析。扫描范围5°~90°，扫描速度5°·min−1，计算纤维素结晶度(D) = (I002−Iam)/I002×100%。其中：I002表示2θ = 22.5°衍射峰最大值；Iam表示2θ = 18.0°衍射峰最小值。
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取降解前后水稻秸秆样品，烘干后研磨成粉末后用扫描电镜(Hitachi SU8010)观察。加速电压：3.0 kV；放大倍数：1 000倍。
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使用SPSS 29对不同真菌的纤维素酶活性和水稻秸秆降解率进行方差齐性检验与显著性分析。
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本研究共从黑翅土白蚁肠道中分离出6株真菌，分别记为FU-1~FU-6。经刚果红染色后筛选出FU-1、FU-2、FU-4和FU-6共4株产生明显透明圈的真菌，其菌落形态与透明圈形态如图1所示，其中产生透明圈初步表明其能将纤维素降解为多聚糖类物质，具有潜在的木质纤维素降解活性[18]。
图 1 4株真菌菌落形态及透明圈形态
Figure 1. Morphologies of colony and transparent zone of four fungal strains
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对4株具备木质纤维素降解活性的真菌进行分子生物学鉴定，其中FU-1、FU-2属于篮状菌属Talaromyces，分别鉴定为安拉阿巴德篮状菌T. allahabadensis和刺孢篮状菌T. aculeatus。FU-4属于曲霉属Aspergillus，鉴定为黑曲霉A. niger。FU-6属于多年卧孔菌属Perenniporia，鉴定为灰孔多年卧孔菌P. tephropora(表1)。
表 1 4株真菌鉴定结果
Table 1. Identification results of four fungal strains
菌株编号 GenBank
登记号相似菌种
(GenBank登记号)相似度/
%FU-1 OQ804643 Talaromyces allahabadensis
(MH727608)100.00 FU-2 OQ804660 T. aculeatus (HQ392496) 100.00 FU-4 OQ804669 Aspergillus niger
(MG228418)100.00 FU-6 OQ804677 Perenniporia tephropora
(MW077095)99.84 -
图2结果表明：黑曲霉的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶活性显著高于其他真菌(P＜0.05)，分别达4.361和1.893 μkat·L−1，表明其具有较强的纤维素链切割和末端水解能力。安拉阿巴德篮状菌的β-葡萄糖苷酶活性显著高于其他真菌(P＜0.05)，达11.133 μkat·L−1，说明具有较强的纤维二糖水解能力。
图 2 4种真菌不同纤维素酶活性
Figure 2. Different cellulase activities of four fungal species
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将筛选得到的4株真菌两两组合对峙，发现安拉阿巴德篮状菌与刺孢篮状菌(图3A)、刺孢篮状菌与黑曲霉(图3B)和刺孢篮状菌与灰孔多年卧孔菌(图3C)菌落之间产生抑菌圈，表现出相互拮抗。而安拉阿巴德篮状菌与黑曲霉(图3D)、安拉阿巴德篮状菌与灰孔多年卧孔菌(图3E)和黑曲霉与灰孔多年卧孔菌(图3F)菌落之间可接触生长，具备共生协作降解木质纤维素的潜能。
图 3 不同真菌组合对峙培养结果
Figure 3. Antagonistic culture results of different fungal combinations
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单独降解时，4株真菌均表现出一定降解能力(表2)，其中刺孢篮状菌和黑曲霉具有显著较高的纤维素降解率，分别达38.49%和40.72%，灰孔多年卧孔菌具有极高的半纤维素降解率，达59.77%，同时这3种真菌的木质素降解率也达到最高水平。组合降解时，部分真菌组合表现出更强的降解能力，其中当黑曲霉与灰孔多年卧孔菌“强强联合”后，其干物质降解率和纤维素降解率进一步提高，达38.27%和62.59%，同时半纤维素降解率仍保持较高水平，达51.75%。尽管其木质素降解率有所降低，但综合来看，该真菌组合表现出最强的水稻秸秆降解能力，具有潜在的开发价值。
表 2 水稻秸秆干物质与木质纤维素组分的降解率
Table 2. Dry matter and lignocellulose components degradation rates of rice straw
处理组 干物质降解率/% 纤维素降解率/% 半纤维素降解率/% 木质素降解率/% 安拉阿巴德篮状菌 26.38±0.33 e 27.86±0.49 e 19.44±2.05 d 13.06±2.56 c 刺孢篮状菌 33.79±1.16 bc 38.49±0.93 c 21.75±2.20 d 28.96±2.79 a 黑曲霉 32.18±0.13 cd 40.72±1.71 bc 30.45±1.40 c 26.87±2.13 a 灰孔多年卧孔菌 36.61±1.02 ab 33.96±0.67 d 59.77±0.90 a 29.66±1.91 a 安拉阿巴德篮状菌 + 黑曲霉 33.66±1.07 bc 39.91±2.99 bc 33.68±2.34 c 24.38±1.36 ab 安拉阿巴德篮状菌 + 灰孔多年卧孔菌 29.21±1.57 de 45.60±2.98 b 50.41±1.94 b 14.69±2.33 c 黑曲霉 + 灰孔多年卧孔菌 38.27±1.32 a 62.59±0.70 a 51.75±2.56 b 17.39±0.36 bc 说明：数值为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同处理组的降解率之间差异显著(P＜0.05)。 -
经黑曲霉与灰孔多年卧孔菌组合降解后，水稻秸秆部分红外吸收峰明显下降(图4)，其中3 400 cm−1附近吸收峰与—OH伸缩振动相关[19]，说明秸秆部分氢键被破坏，分子间作用力减弱；1 460 cm−1附近吸收峰与半纤维素中亚甲基(CH2)弯曲振动相关[19]，表明真菌组合能有效破坏半纤维素结构；1 370和1 315 cm−1附近吸收峰分别与纤维素中CH2摇摆振动和C—H弯曲振动相关[20]，证明真菌组合具有一定的纤维素分解能力；1 235 cm−1附近吸收峰与半纤维素-木质素复合物中O=C—C伸缩振动相关[19]，说明部分复合结构被瓦解，半纤维素与木质素发生分离；1 160 cm−1附近吸收峰与碳链中C—O—C伸缩振动相关[19]，表明在酶作用下，秸秆中部分碳链结构被破坏，分子聚合度下降。
图 4 黑曲霉与灰孔多年卧孔菌组合降解前后水稻秸秆傅立叶红外光谱
Figure 4. FTIR spectra of rice straw before and after A. niger and P. tephropora combined degradation
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经黑曲霉与灰孔多年卧孔菌组合降解后，水稻秸秆纤维素非结晶区衍射峰(2θ = 18.0°)明显下降，纤维素结晶区衍射峰(2θ = 22.5°)无明显变化，水稻秸秆纤维素结晶度由22.44%上升至32.53%(图5)。说明相较于纤维素结晶区，真菌组合分泌的纤维素酶能够更容易分解纤维素非结晶区。但随着纤维素结晶度不断升高，纤维素整体晶体结构变为更加紧凑，推测对于进一步降解利用纤维素产生一定阻碍作用[20]。
图 5 黑曲霉与灰孔多年卧孔菌组合降解前后水稻秸秆X射线衍射图谱
Figure 5. XRD patterns of rice straw before and after A. niger and P. tephropora combined degradation
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通过扫描电镜观察(图6)，发现黑曲霉与灰孔多年卧孔菌组合降解后水稻秸秆表面由紧密光滑变为粗糙隆起，纤维结构崩解断裂，结构蓬松化，并产生大量孔隙和碎片，推测真菌菌丝可能通过孔隙深入秸秆内部，在内外双重降解下加速破坏秸秆结构。
图 6 黑曲霉与灰孔多年卧孔菌降解前后水稻秸秆扫描电镜图像(×1 000倍)
Figure 6. SEM images of rice straw before and after A. niger and P. tephropora combined degradation (×1 000 times)
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随着分子生物学与环境生物学技术不断成熟，近年来利用真菌绿色降解水稻秸秆已取得了一定进展。MUSTAFA等[21]研究发现：糙皮侧耳和里氏木霉T. reesei对水稻秸秆纤维素、半纤维素和木质素降解率可分别达13.1%、23.7%、35.3%和20.1%、23.3%、23.6%。尹蕾等[22]从土壤中分离出的枝孢菌Cladosporium sp. BD-19可降解水稻秸秆中26.42%的纤维素、16.64%的半纤维素和11.43%的木质素。SHENG等[23]利用逆型金钱菌Gymnopus contrarius降解水稻秸秆后，去除了22.9%的纤维素、22.7%的半纤维素和41.9%的木质素。与上述研究相比，本研究从黑翅土白蚁肠道分离筛选的部分真菌具有更强的降解能力，其中刺孢篮状菌和黑曲霉具有更强的纤维素降解能力，降解率分别达38.49%和40.72%，灰孔多年卧孔菌具有更强的半纤维素降解能力，降解率达59.77%，推测这些共生真菌在白蚁消化木质食料过程中发挥一定协同降解作用。
在自然状态下，秸秆腐解往往是多种微生物共同参与的结果，将具有酶系互补作用的真菌组合培养不仅弥补部分菌种酶系不完整或个别酶活低的缺陷，同时还能减缓反馈抑制，从而提高降解效果[24]。江高飞等[25]研究发现：将草酸青霉等5种真菌复配后，复合菌系的秸秆降解能力和纤维素酶活性随着菌株种类增多而逐步升高。KOLASA等[26]将里氏木霉分别与黑曲霉等3种曲霉混合培养后，小麦Triticum aestivum秸秆降解率效果相较于单独降解均提升80%左右。本研究发现：当黑曲霉与灰孔多年卧孔菌“强强联合”后，水稻秸秆干物质降解率和纤维素降解率进一步提高，分别达38.27%和62.59%，同时半纤维素降解率仍保持较高水平，达51.75%，表现出极强的降解能力。进一步研究发现：两者组合能有效破坏水稻秸秆中半纤维素-木质素复合物内部化学键并减弱分子间作用力，推测在降解过程中纤维素、半纤维素和木质素三者间失去“黏性”，纤维素向外暴露，释放更多酶切位点供以降解[27−28]。本研究也证实：真菌组合更偏好分解纤维素非结晶区，推测是由于非结晶区吸水性更强，更容易与酶结合[29]。秸秆化学结构被破坏的同时，其物理结构也显著改变，降解后的秸秆表面崩解碎裂，结构蓬松化，产生大量碎片和孔隙，不仅有利于酶的渗透和吸附，真菌菌丝也更易探入内部“破坏”[30]。
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本研究从黑翅土白蚁肠道分离筛选得到的安拉阿巴德篮状菌、刺孢篮状菌、黑曲霉和灰孔多年卧孔菌均具有水稻秸秆降解活性，其中黑曲霉和灰孔多年卧孔菌在组合降解水稻秸秆时表现出极强的降解能力，20 d内可降解水稻秸秆中38.27%的干物质、62.59%的纤维素和51.75%的半纤维素，并显著破坏秸秆理化结构，在秸秆生物降解产业化上具有潜在的开发价值。
Biodegradation of rice straw by symbiotic fungi of Odontotermes formosanus
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摘要:
目的 挖掘黑翅土白蚁Odontotermes formosanus共生真菌在秸秆资源利用上的应用潜力，为实现秸秆生物降解产业化补充菌种资源并提供理论依据。 方法 以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)平板为分离培养基，采用刚果红染色法筛选，从黑翅土白蚁肠道中分离筛选具有木质纤维素降解活性的真菌，并测定纤维素酶活性。在液态发酵条件下，评估不同真菌以及真菌组合对水稻Oryza sativa秸秆的降解效果，利用傅立叶红外光谱、X射线晶体衍射和扫描电镜分析降解前后水稻秸秆的理化性质。 结果 从黑翅土白蚁肠道中共分离到4种具有木质纤维素降解活性的真菌，经鉴定分别为安拉阿巴德篮状菌Talaromyces allahabadensis、刺孢篮状菌T. aculeatus、黑曲霉Aspergillus niger和灰孔多年卧孔菌Perenniporia tephropora。纤维素酶活结果显示：黑曲霉的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶活性最高，安拉阿巴德篮状菌的β-葡萄糖苷酶活性最高。水稻秸秆降解试验表明：黑曲霉与灰孔多年卧孔菌双菌组合具有最强的秸秆降解能力，20 d内可降解秸秆中38.27%的干物质、62.59%的纤维素和51.75%的半纤维素。降解后水稻秸秆内部化学键和分子间作用力被破坏，结晶度由22.44%上升至32.53%，秸秆表面崩解碎裂，结构蓬松化。 结论 从黑翅土白蚁肠道分离得到的黑曲霉和灰孔多年卧孔菌在组合降解水稻秸秆时表现出极强的降解能力，在秸秆生物降解产业化上具有潜在的开发价值。图6表2参30 Abstract:Objective This study aims to explore the application potential of symbiotic fungi of Odontotermes formosanus in the utilization of straw resources, so as to provide a theoretical basis for the industrialization of straw biodegradation and supplement strain resources. Method Using CMC-Na plate as isolation medium and Congo red staining method for screening, the fungi with lignocellulose degrading activity were isolated and screened from the gut of O. formosanus and cellulase activities were measured. The degradation effect of different fungi and fungal combinations on Oryza sativa (rice) straw was evaluated under liquid fermentation. The physicochemical properties of rice straw before and after degradation were analyzed using FTIR, XRD and SEM. Result 4 fungi with lignocellulose degrading activity were isolated from the gut of O. formosanus, identified as Talaromyces allahabadensis, T. aculeatus, Aspergillus niger and Perenniporia tephropora. Cellulase activity results showed that A. niger had the highest activity of endoglucanase and exoglucanase, while T. allahabadensis had the highest activity of β-glucosidase. The rice straw degradation test showed that the combination of A. niger and P. tephropora had the strongest straw degradation ability. Within 20 days, 38.27% of dry matter, 62.59% of cellulose and 51.75% of hemicellulose in rice straw could be degraded. After degradation, the internal chemical bonds and intermolecular forces in rice straw were destroyed, and crystallinity increased from 22.44% to 32.52%. The straw surface disintegrated and smashed, and the structure became fluffy. Conclusion A. niger and P. tephropora isolated from the gut of O. formosanus show strong degradation ability in the combined degradation of rice straw, and have potential development value in the industrialization of straw biodegradation. [Ch, 6 fig. 2 tab. 30 ref.] -
Key words:
- Odontotermes formosanus /
- symbiotic fungus /
- cellulase /
- utilization of straw resources
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香榧Torreya grandis ‘Merrilii’是红豆杉科Taxaceae榧树属Torreya裸子植物榧树Torreya grandis经无性繁殖形成的优良栽培品种，也是中国南方特有的集果用、药用、材用、油用和观赏于一体的珍贵经济树种，具有极高的经济和生态价值[1]。香榧种实风味香酥，余味浓郁，营养丰富，具有很强的健康功效，深受消费者的喜爱，且丰产期产值在30万元·hm−2以上[2]。与其他坚果不同，香榧种实需经过一段后熟过程以积累糖分、不饱和脂肪酸和氨基酸等营养成分[3]，此过程对于香榧坚果采后品质的形成与提升极为关键[4]。
氨基酸是构建蛋白质的基本组成单元，不仅是人体生命活动的重要物质基础，也是决定食物风味与营养价值的关键成分[5−6]。在坚果中，游离氨基酸的含量及组成直接影响其营养品质和感官特性，尤其是呈味氨基酸的分布对坚果的风味特征具有重要贡献，如鲜味氨基酸赋予食物鲜味[7]，甜味氨基酸增强甜感[8]，而芳香味氨基酸则带来复杂味觉层次[9]。ZHANG等[10]研究表明：香榧种仁中含有17种游离氨基酸，其中，鲜味氨基酸占比最高，赋予其浓郁的鲜香风味，甜味和苦味氨基酸次之，形成独特的味觉平衡。长柄扁桃仁Amygdalus pedunculatus中，游离氨基酸质量分数较高，达21.74~32.35 mg·g−1，其必需氨基酸占总氨基酸比例为24.86%~28.22%，以鲜味氨基酸为主，甜味氨基酸次之[11]。鲜核桃Juglans regia中谷氨酸和天冬氨酸占比显著高于干核桃，其必需氨基酸占比高于扁桃仁，达30%~41%，营养价值更高[12]。花生Arachis hypogaea[13]和榛子Corylus heterophylla[14]等其他坚果，虽然氨基酸占比有差异，但游离氨基酸占比均少于扁桃仁。香榧受异花授粉、自然杂交、生态环境等方面因素影响，产生了许多变异，形成了不同品种(品系)。目前已研究发现：不同香榧品种的种实在形态和营养物质方面存在显著差异，如核形指数[15]、油脂[16]和蛋白质等[17]。氨基酸作为蛋白质的分解产物，它的组成和质量分数是衡量香榧品质优劣的重要指标[18]。
本研究选取当前主要栽培品种‘细榧’T. grandis‘Xi Fei’和主要推广品种‘象牙榧’T. grandis‘Xiangya Fei’，分析2个品种种实氨基酸积累的规律和差异，为香榧的品质评估和品种推广提供科学参考，以进一步提升香榧坚果的核心竞争力以及推动香榧产业的发展。
1. 材料与方法
1.1 材料
种实采集于浙江省湖州市安吉县上墅乡刘家塘村(30°38′N，119°41′E)，选取突破种鳞后525 d的‘细榧’ 和‘象牙榧’种实。样品采摘后于4 h内运回实验室，人工去除假种皮后清洗干净，放置一晚去除田间热。选取大小、颜色、形状一致的香榧种实，将其分为3个生物学重复，每个重复20 kg，置于温度25 ℃和湿度90%的室内进行后熟处理。每天进行1次翻堆，保证种实处于均匀的后熟环境。分别于后熟的第0、5、10、15和20天进行采样，人工去除香榧种壳，并将2个品种香榧种仁切碎分装于50 mL离心管，立即置于液氮中冷却速冻，放置于−80 ℃冰箱中保存，用于后续研究。
1.2 试剂与仪器
茚三酮、乙酸、乙酸钠、盐酸、氢氧化钠、乙醇等分析纯试剂购自国药集团化学试剂有限公司，柠檬酸、柠檬酸钠等优级纯试剂购自日本和光公司，氨基酸混标购自Sigma公司。L-8900全自动氨基酸分析仪购自日本日立公司，天平为波兰RADWAG-AS 220.R2专业分析天平。
1.3 方法
1.3.1 标准曲线绘制
准确吸取Type B、Type AN-Ⅱ氨基酸混标(日本和光)各0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于25 mL容量瓶中，用0.02 mol·L−1盐酸溶液定容，4 ℃冷藏保存。取配制好的17种氨基酸混标，进样20 µL，以氨基酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.2 氨基酸测定
取5 g液氮研磨好的香榧种实粉末鲜样，溶于10 mL去离子水，混匀成匀浆。再将该匀浆移至100 mL的容量瓶中，并添加60 mL的去离子水，摇匀后沸水浴1 h，期间每15 min涡旋1次。待冷却到室温后，定容到100 mL。从中取5 mL的定容液置于15 mL的离心管中，再加入等体积质量浓度为10%的磺酸水杨酸溶液混匀后，在4 ℃、10 000 r·min−1的条件下离心15 min。离心后用注射器吸取上清液，取上清液过0.22 μm水膜，待测。采用L-
8900 全自动氨基酸分析仪测定香榧种实游离氨基酸。1.3.3 色谱条件
色谱柱为Na+型阳离子交换柱；离子交换树脂2622，检测器为紫外可见光检测器；显色剂为茚三酮；缓冲液系统为柠檬酸钠缓冲液B1 (pH 3.2)，B2 (pH 3.0)，B3 (pH 4.0)，B4 (pH 4.9)；缓冲液流速为0.40 mL·min−1，茚三酮流速为0.35 mL·min−1；柱温为57 ℃，室温为135 ℃。进样体积为20 μL。用外标法测定样品溶液中的游离氨基酸，其中脯氨酸检测波长为440 nm，其他氨基酸检测波长为570 nm。
1.4 数据处理
数据通过Excel进行计算并绘图，方差分析采用SPSS 26.0。对数据进行标准化处理，进一步计算特征值和特征向量，基于累积方差贡献率进行主成分分析(PCA)；数据分析过程在Origin 2022平台完成，采用内置的PCA分析模块进行处理，并绘制相应的得分图(Score Plot)，以直观展示各类氨基酸在主成分空间中的分布特征及其相互关系。
2. 结果与分析
2.1 游离氨基酸的质量分数及组成分析
以17种游离氨基酸为对照，分别检测后熟过程中‘细榧’和‘象牙榧’种实的氨基酸组分。如图1所示：在‘细榧’和‘象牙榧’种实中氨基酸种类无差异，均检测到了包含天冬氨酸、苏氨酸等14种蛋白质氨基酸以及γ-氨基丁酸，但组氨酸和精氨酸未检出(表1和表2)。
图 1 17种氨基酸混标(A)、‘细榧’(B)与‘象牙榧’(C)种实后熟第0天氨基酸色谱图Figure 1 17 amino acid mixed standards (A), amino acid chromatograms of ‘Xi Fei’ (B) and ‘Xiangya Fei’ (C) on day 0 during post-ripening process表 1 在后熟过程中‘细榧’和‘象牙榧’种实非必需氨基酸质量分数的变化Table 1 Non-essential amino acid content of ‘Xi Fei’ and ‘Xiangya Fei’ seeds during post-ripening process品种 时间/d 非必需氨基酸质量分数/(µg·g−1) 天冬氨酸 丝氨酸 谷氨酸 脯氨酸 甘氨酸 丙氨酸 酪氨酸 γ-氨基丁酸 总计 ‘细榧’ 0 40.90±1.15 c 46.37±2.56 b 72.80±5.89 de 44.01±7.91 a 9.43±0.65 b 29.90±1.43 cd 52.87±2.78 f 156.33±8.06 d 433.67±23.61 f 5 42.77±8.77 c 38.90±0.80 cd 89.63±2.79 bc 23.82±3.82 bc 30.20±6.22 a 28.87±2.21 d 114.67±4.99 d 320.00±24.91 a 665.03±36.97 cd 10 42.77±8.77 c 41.60±0.36 bcd 84.83±8.86 cde 14.03±4.24 c 32.73±5.89 a 35.13±0.69 bc 139.67±8.99 abc 331.67±21.70 a 731.30±28.72 abc 15 78.97±3.76 b 40.37±2.74 cd 72.47±5.42 de 15.23±0.97 c 32.07±5.53 a 34.93±3.46 bc 149.33±18.57 a 358.67±33.81 a 766.80±76.40 ab 20 79.27±6.31 b 36.57±1.03 d 81.20±2.97 cde 37.17±9.61 ab 33.47±4.18 a 30.80±0.59 cd 146.00±8.64 ab 353.67±14.50 a 798.13±19.70 a ‘象牙榧’ 0 106.23±8.32 a 51.53±1.67 a 71.97±5.15 e 40.77±8.34 a 12.63±1.24 b 40.53±1.10 a 72.30±5.46 ef 166.67±5.79 d 562.63±13.31 e 5 83.83±4.25 b 38.87±1.95 cd 87.70±13.71 bcd 42.77±7.89 a 26.40±0.45 a 34.60±2.32 bc 79.27±5.78 e 225.33±3.86 c 618.77±39.21 de 10 102.37±4.88 a 42.53±1.46 bc 92.63±5.24 bc 36.37±7.33 ab 29.43±1.00 a 33.27±1.09 cd 104.57±7.73 d 263.67±9.74 bc 704.83±27.31 bc 15 121.67±2.05 a 38.17±5.45 cd 100.20±2.29 b 42.47±7.98 a 26.33±4.22 a 39.03±4.71 ab 117.67±7.32 cd 270.33±16.74 b 755.86±21.37 abc 20 121.00±11.43 a 36.80±2.55 cd 119.33±6.13 a 22.40±12.01 bc 34.30±6.64 a 30.10±0.08 cd 124.67±19.62 bcd 255.67±30.71 bc 744.27±75.48 abc 说明：数值为平均值±标准差。不同小写字母表示‘细榧’和‘象牙榧’在同一物质不同后熟时间间差异显著(P＜0.05)。 表 2 在后熟过程中‘细榧’和‘象牙榧’种实必需氨基酸质量分数的变化Table 2 Essential amino acid content of ‘Xi Fei’ and ‘Xiangya Fei’ seeds during post-ripening process品种 时间/d 必需氨基酸质量分数/(µg·g−1) 苏氨酸 缬氨酸 蛋氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 苯丙氨酸 赖氨酸 总计 ‘细榧’ 0 23.37±1.34 b 28.63±2.43 c 10.07±1.11 cd 24.13±0.17 d 37.97±0.87 cd 57.80±2.38 d 38.53±3.82 b 220.50±14.06 c 5 35.63±2.47 a 44.23±4.76 ab 10.23±0.45 cd 31.70±2.49 abc 44.57±5.82 abcd 89.60±6.73 a 62.33±2.36 a 318.30±27.81 ab 10 38.83±2.25 a 48.60±2.29 a 11.97±0.88 bc 34.73±2.41 ab 48.87±5.57 ab 89.53±1.30 a 72.23±2.15 a 344.77±19.50 a 15 37.43±3.60 a 47.43±4.92 a 9.63±0.74 cd 34.60±3.60 ab 41.73±6.21 abcd 82.07±7.93 ab 67.43±7.71 a 320.33±40.59 ab 20 34.47±2.13 a 44.73±4.72 a 8.20±0.00 de 29.03±1.80 c 36.67±2.32 d 73.00±2.44 bc 63.07±5.31 a 289.17±18.78 b ‘象牙榧’ 0 33.93±0.85 a 37.13±1.90 b 16.00±0.67 a 29.97±0.54 bc 48.67±2.38 abc 87.93±5.41 a 65.50±2.09 a 319.13±8.33 ab 5 34.40±1.24 a 41.60±1.55 ab 11.37±2.38 bc 32.30±2.34 abc 45.63±2.00 abcd 77.33±10.14 abc 59.87±10.17 a 302.50±35.60 ab 10 37.17±1.23 a 47.63±1.28 a 12.70±1.39 b 36.30±2.48 a 51.63±3.41 a 80.73±3.80 ab 67.57±7.62 a 333.73±24.24 ab 15 38.30±1.44 a 48.00±1.14 a 10.30±0.49 cd 35.80±0.41 a 43.07±8.13 abcd 71.00±2.62 bc 66.60±2.87 a 313.07±16.31 ab 20 34.20±3.47 a 43.43±3.52 ab 7.03±0.40 e 32.67±3.18 abc 38.50±3.24 bcd 65.10±7.86 cd 65.17±7.85 a 286.10±33.01 b 说明：数值为平均值±标准差。不同小写字母表示‘细榧’和‘象牙榧’在同一物质不同后熟时间间差异显著(P＜0.05)。 根据标准曲线计算得到每种氨基酸的质量分数，结果显示：2个品种种实在后熟过程中的总游离氨基酸质量分数均显著(P＜0.05)增加，‘细榧’种实的总游离氨基酸质量分数为673.11~1 102.36 µg·g−1，‘象牙榧’种实为881.77~1 068.93 µg·g−1(图2)。后熟过程开始后，‘细榧’和‘象牙榧’种实总非必需氨基酸质量分数显均呈现上升趋势，‘细榧’在第20天积累达到最多，而‘象牙榧’种实则在第15天达时达到最大值后下降(表1)。‘细榧’种实总必需氨基酸质量分数显著高于‘象牙榧’(P＜0.05，表2)，然而，‘细榧’种实总必需氨基酸占比(26.59%~32.76%)却小于‘象牙榧’的占比(27.77%~36.19%)。在这2个品种中，γ-氨基丁酸质量分数最高，其次是谷氨酸和酪氨酸。γ-氨基丁酸在后熟过程中显著积累，且在第20天‘细榧’种实中γ-氨基丁酸质量分数为‘象牙榧’的1.38倍。
图 2 在后熟过程中‘细榧’和‘象牙榧’种实总游离氨基酸质量分数的变化Figure 2 Total free amino acid content of ‘Xi Fei’ and ‘Xiangya Fei’ seeds during post-ripening process2.2 呈味氨基酸的差异分析
2.2.1 总呈味氨基酸分析
甜味氨基酸包括脯氨酸、赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸；芳香味氨基酸包括酪氨酸和苯丙氨酸；鲜味氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；苦味氨基酸包括蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。在‘细榧’和‘象牙榧’种实中，总呈味氨基酸的质量分数从大到小排序为甜味氨基酸＞芳香族氨基酸＞鲜味氨基酸＞苦味氨基酸。鲜味氨基酸在‘象牙榧’种实中的占比高于‘细榧’，而芳香族氨基酸占比则相反，即在‘细榧’种实中的占比高于‘象牙榧’(图3A)。PCA结果(图3B)显示：鲜味、甜味、苦味和芳香族氨基酸在这2个品种中显示出明显的分离，且‘细榧’种实具有较高的芳香族氨基酸，而‘象牙榧’种实具有较高的鲜味氨基酸和甜味氨基酸。
图 3 后熟过程中‘细榧’和‘象牙榧’种实呈味氨基酸质量分数(A)与主成分分析(B)Figure 3 Flavor amino acid content (A) and PCA of flavor amino acids (B) in ‘Xi Fei’ and ‘Xiangya Fei’ seeds during post-ripening process2.2.2 甜味氨基酸分析
在后熟过程中，‘细榧’种实的总甜味氨基酸质量分数无显著变化，在第20天时最高，为235.53 µg·g−1；‘象牙榧’种实的总甜味氨基酸逐渐积累，在第15天时达到最大值，为250.89 µg·g−1(图4A)。在‘象牙榧’种实中，赖氨酸的质量分数最高，在‘细榧’中，赖氨酸逐渐积累且在第15天达到最高。PCA结果(图4B)显示：2个品种种实的甜味氨基酸在第0天差异明显，其中丝氨酸在‘象牙榧’中的贡献较大。随着后熟时间的推移，2个品种的甜味氨基酸质量分数差异不明显。
图 4 后熟过程中‘细榧’和‘象牙榧’种实甜味氨基酸质量分数(A)与主成分分析(B)Figure 4 Sweet amino acid content (A) and PCA of sweet amino acids (B) in ‘Xi Fei’ and ‘Xiangya Fei’ seeds during post-ripening process2.2.3 芳香族氨基酸分析
如图5A所示：后熟第0天时，‘细榧’种实的芳香族氨基酸质量分数低于‘象牙榧’。在后熟过程中，2个品种种实的芳香族氨基酸质量分数均呈上升趋势，但‘象牙榧’到第10天后趋于稳定，不再增加，而‘细榧’仍不断增加，在第15天达到最大值，且高于‘象牙榧’。‘细榧’种实的芳香族氨基酸质量分数介于110.67~231.40 µg·g−1，‘象牙榧’则介于156.60~189.77 µg·g−1。苯丙氨酸和酪氨酸是构成香榧芳香族氨基酸的重要成分，其中酪氨酸在后熟过程中质量分数增加更为显著，这2种氨基酸都对‘细榧’种实后熟过程中芳香味的形成有较大贡献(图5B)。
图 5 在后熟过程中‘细榧’和‘象牙榧’种实芳香族氨基酸质量分数(A)与主成分分析(B)Figure 5 Aromatic amino acid content (A) and PCA of aromatic amino acids (B) in ‘Xi Fei’ and ‘Xiangya Fei’ seeds during post-ripening process2.2.4 鲜味氨基酸分析
在后熟过程中，2个品种种实总鲜味氨基酸质量分数的变化趋势与芳香族氨基酸相似，均呈上升的趋势。然而，‘象牙榧’种实的鲜味氨基酸质量分数在整个后熟期间始终高于‘细榧’，特别是在后熟的第20天时，‘象牙榧’种实的鲜味氨基酸质量分数比‘细榧’高79.86 µg·g−1(图6A)。谷氨酸和天冬氨酸是构成香榧鲜味氨基酸的关键成分，均在后熟过程中逐渐积累。相比而言，‘细榧’种实的谷氨酸变化较小，这说明天冬氨酸可能是影响‘细榧’鲜味变化的主要因素。而在‘象牙榧’种实中，天冬氨酸和谷氨酸的质量分数则相对接近。PCA结果(图6B)进一步显示：谷氨酸和天冬氨酸均对‘象牙榧’种实在后熟过程中的鲜味有着较大的贡献。
图 6 在后熟过程中‘细榧’和‘象牙榧’鲜味氨基酸质量分数比较(A)与鲜味氨基酸主成分分析(B)Figure 6 Umami amino acid content (A) and PCA of umami amino acid (B) in ‘Xi Fei’ and ‘Xiangya Fei’ seeds during post-ripening process2.2.5 苦味氨基酸分析
如图7A所示：‘细榧’和‘象牙榧’的苦味氨基酸质量分数接近，在后熟过程中的变化趋势也相似，均在后熟第10天达到最高值，后逐渐降低。亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸占‘细榧’和‘象牙榧’苦味氨基酸的90%。2个品种在PCA分析(图7B)中呈现一定的分离，说明2个品种在后熟过程中苦味氨基酸组成的变化模式存在差异，其中亮氨酸和蛋氨酸对‘象牙榧’种实苦味贡献较大。
图 7 在后熟过程中‘细榧’和‘象牙榧’种实苦味氨基酸质量分数(A)与主成分分析(B)Figure 7 Bitter amino acid content (A) and PCA of bitter amino acids (B) in ‘Xi Fei’ and ‘Xiangya Fei’ seeds during post-ripening process3. 讨论
近年来，香榧坚果因其高营养价值和独特风味，深受消费者青睐[19]。本研究发现：香榧种实中总游离氨基酸质量分数为673.11~
1102.36 µg·g−1，均值为991.06 µg·g−1，低于核桃，但高于山核桃Carya cathayensis和巴西松子Araucaria angustifolia [12]。香榧中的氨基酸组成与联合国粮食及农业组织/世界卫生组织(FAO/WHO)推荐的理想模式非常接近，易被人体吸收利用[2]。本研究检测到15种游离氨基酸，与ZHANG等[10]的研究相比，相差2种，可能是由于香榧品种及产地的不同，造成氨基酸组成成分和质量分数的差异。在后熟过程中，2个品种种实的游离氨基酸质量分数均显著提高，‘细榧’种实的整体游离氨基酸质量分数高于‘象牙榧’。其中，质量分数较高的氨基酸从高到低依次为γ-氨基丁酸、酪氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。这些氨基酸不仅对香榧的营养价值有重要贡献，还通过参与美拉德反应等化学反应，生成多种风味化合物[20]，能显著提升香榧的风味品质。已有研究表明：天冬氨酸能改善心肌收缩功能、促进能量代谢、保护线粒体功能以及降低缺血性心脏病风险[21−22]。谷氨酸作为中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质[23]，参与神经信号传递，调节学习和记忆功能[24]。酪氨酸作为芳香族氨基酸，与降低血压相关，尤其是在高血压患者中，其水平与心血管健康指标之间存在关联[25]。质量分数最高的γ-氨基丁酸能通过调节自主神经系统[26]，降低血压[27]。这说明后熟过程不仅能提升香榧的氨基酸质量分数，还能优化其营养成分。
氨基酸的多样性和组成差异是香榧独特口感的重要基础[28]。呈味氨基酸在食物的风味调节中发挥重要作用，它们赋予食品甜味、鲜味和苦味等多种风味特征，显著影响食品的整体风味和决定食品的可接受性[29]。在种实后熟过程中香榧的游离氨基酸，特别是鲜味和芳香族氨基酸的积累，显著提升了香榧的风味品质。本研究发现：香榧中各类呈味氨基酸的质量分数从高到低排序为：甜味＞芳香族＞鲜味＞苦味。‘细榧’种实中γ-氨基丁酸与酪氨酸质量分数较高，芳香风味更突出。有研究表明：在柑橘Citrus中，酪氨酸和苯丙氨酸也是重要的芳香味氨基酸，是柑橘风味多样性的重要来源[30]。酪氨酸和苯丙氨酸会通过参与挥发性化合物的合成，影响果实的香气特征[31]。‘象牙榧’种实因天冬氨酸与谷氨酸质量分数高，鲜味更足。谷氨酸具有明显的鲜味，是发酵食物和调味品中最丰富的氨基酸，也是其中最重要的风味成分物质[32]，间接影响蔬菜的风味形成[33]。番茄Solanum lycopersicum中的谷氨酸和天冬氨酸为它提供了特有的鲜味，其含量随着果实成熟逐渐增加，有助于番茄果实风味的形成[34]。综上，后熟过程使香榧种实具有了不同于其他坚果的独特呈味。
4. 结论
本研究结果显示：香榧不同品种种实的氨基酸组成和质量分数存在较大差异，在香榧种实的后熟过程中，游离氨基酸质量分数逐渐增加，‘细榧’和‘象牙榧’种实氨基酸差异主要体现在芳香族氨基酸和鲜味氨基酸上。未来可进一步优化检测方法，深入研究不同香榧品种种实游离氨基酸差异的形成机制，并结合转录组分析不同香榧品种后熟过程中氨基酸合成代谢机制。
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图 1 4株真菌菌落形态及透明圈形态
Figure 1 Morphologies of colony and transparent zone of four fungal strains
图 3 不同真菌组合对峙培养结果
Figure 3 Antagonistic culture results of different fungal combinations
图 4 黑曲霉与灰孔多年卧孔菌组合降解前后水稻秸秆傅立叶红外光谱
Figure 4 FTIR spectra of rice straw before and after A. niger and P. tephropora combined degradation
图 5 黑曲霉与灰孔多年卧孔菌组合降解前后水稻秸秆X射线衍射图谱
Figure 5 XRD patterns of rice straw before and after A. niger and P. tephropora combined degradation
图 6 黑曲霉与灰孔多年卧孔菌降解前后水稻秸秆扫描电镜图像(×1 000倍)
Figure 6 SEM images of rice straw before and after A. niger and P. tephropora combined degradation (×1 000 times)
表 1 4株真菌鉴定结果
Table 1. Identification results of four fungal strains
菌株编号 GenBank
登记号相似菌种
(GenBank登记号)相似度/
%FU-1 OQ804643 Talaromyces allahabadensis
(MH727608)100.00 FU-2 OQ804660 T. aculeatus (HQ392496) 100.00 FU-4 OQ804669 Aspergillus niger
(MG228418)100.00 FU-6 OQ804677 Perenniporia tephropora
(MW077095)99.84 
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表 2 水稻秸秆干物质与木质纤维素组分的降解率
Table 2. Dry matter and lignocellulose components degradation rates of rice straw
处理组 干物质降解率/% 纤维素降解率/% 半纤维素降解率/% 木质素降解率/% 安拉阿巴德篮状菌 26.38±0.33 e 27.86±0.49 e 19.44±2.05 d 13.06±2.56 c 刺孢篮状菌 33.79±1.16 bc 38.49±0.93 c 21.75±2.20 d 28.96±2.79 a 黑曲霉 32.18±0.13 cd 40.72±1.71 bc 30.45±1.40 c 26.87±2.13 a 灰孔多年卧孔菌 36.61±1.02 ab 33.96±0.67 d 59.77±0.90 a 29.66±1.91 a 安拉阿巴德篮状菌 + 黑曲霉 33.66±1.07 bc 39.91±2.99 bc 33.68±2.34 c 24.38±1.36 ab 安拉阿巴德篮状菌 + 灰孔多年卧孔菌 29.21±1.57 de 45.60±2.98 b 50.41±1.94 b 14.69±2.33 c 黑曲霉 + 灰孔多年卧孔菌 38.27±1.32 a 62.59±0.70 a 51.75±2.56 b 17.39±0.36 bc 说明：数值为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同处理组的降解率之间差异显著(P＜0.05)。
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