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中国作为农业大国之一，具有丰富的秸秆资源。据统计，中国秸秆年生产量达8.65 亿t，但每年有1 亿t秸秆废置，造成资源浪费和环境污染[1]。秸秆主要成分为木质纤维素，其特殊的“纤维素-半纤维素-木质素”三维网络结构在自然状态下难以降解，严重限制了秸秆资源利用[2]。随着技术不断发展，目前已开发出多种秸秆处理方法，如高温热解、蒸汽爆破、酸碱处理等[3]。微生物降解法以成本低、耗能小、环境友好等优点受到广泛关注[4]。相较于细菌和放线菌，真菌能产生更多种类的酶，如纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、过氧化物酶、糖苷酶等来协同降解木质纤维素[5−7]，成为当前研究热点。目前，已开发的秸秆降解真菌主要有黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium、黑曲霉Aspergillus niger、草酸青霉Penicillium oxalicu、糙皮侧耳Pleurotus ostreatus等[8−11]，但部分真菌仍存在降解周期长、生长条件严格、降解不稳定等缺点[12]，难以实现产业化，因此，仍需进一步挖掘高效稳定的木质纤维素降解真菌。
白蚁是自然界中高效的木质纤维素分解者，其特殊的白蚁-共生菌降解系统可消化植物中74%~99%的纤维素和65%~87%的半纤维素[13]，降解效率为瘤胃动物的3倍以上[14]。有研究表明：白蚁的共生真菌具有较强的木质纤维素降解能力，如王成盼等[15]研究发现：黑翅土白蚁Odontotermes formosanus菌圃共生真菌蚁巢伞Termitomyces在固体发酵条件下可降解木质食料中20.98%的纤维素、31.89%的半纤维素和11.68%的木质素。SIJINAMANOJ等[16]从胖身土白蚁O. obesus菌圃和肠道中分离得到红绶曲霉A. nomius和哈茨木霉Trichoderma harzianum，分别使不同农业废弃物纤维素降低10.83%~15.53%和8.50%~36.30%。
为进一步挖掘白蚁共生真菌在秸秆资源利用上的应用潜力，本研究从黑翅土白蚁肠道中分离筛选木质纤维素降解真菌，挖掘高效降解水稻Oryza sativa秸秆的真菌菌种资源，为秸秆生物降解产业化提供理论基础。
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供试黑翅土白蚁蚁巢采自福建省三明市大田县，26 ℃避光饲养。供试水稻秸秆收集自江苏省连云港市，烘干粉碎后过100目筛，常温保存。
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羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基：CMC-Na 1.000 g、硝酸钠 0.200 g、氯化铵 0.200 g、磷酸二氢钾 0.100 g、磷酸氢二钾 0.100 g、蛋白胨 0.100 g、七水硫酸镁 0.050 g、氨苄青霉素 0.005 g、卡那霉素 0.005 g、琼脂 4.000 g、蒸馏水 100 mL，pH 7。
水稻秸秆培养基：水稻秸秆粉(100目) 2.000 g、硝酸钠 0.200 g、氯化铵 0.200 g、蛋白胨 0.200 g、磷酸二氢钾 0.100 g、磷酸氢二钾 0.100 g、七水硫酸镁 0.050 g、蒸馏水 100 mL，pH 7。
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肠道匀浆制备：取黑翅土白蚁成熟工蚁25只，在无菌超净台中用体积分数为75%的乙醇浸泡消毒5 min，无菌水清洗3次后用解剖针压住腹部末端，拉出白蚁肠道，于5 mL质量分数为0.9%的无菌生理盐水中研磨成匀浆。
分离：肠道匀浆液稀释100倍后，取100 µL均匀涂布于CMC-Na平板上，37 ℃避光培养至单菌落，长成后划线分离，重复3次后获纯培养菌株。
筛选：将直径5 mm菌饼接种于CMC-Na平板，37 ℃避光培养5 d后加入20 mL 1 g·L−1的刚果红溶液，染色1 h弃去染色液，加入1 mol·L−1的氯化钠溶液20 mL脱色30 min，观察菌株是否产生透明圈。
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将纯化后菌株送至浙江尚亚生物技术有限公司，提取分离真菌DNA后，选取通用引物ITS1与ITS4扩增真菌ITS序列，将扩增产物连接至pTOPO-T载体并转入感受态细胞，使用M13F/13R引物扩增载体序列，测序后通过BLAST在线比对菌种，同时于GenBank登记序列号。
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取直径5 mm菌饼接种于100 mL CMC-Na液体培养基(配方同CMC-Na培养基，不加琼脂)，于27 ℃、180 r·min−1的摇床内避光培养9 d后，取2 mL液体培养基，4 ℃ 8 000 r·min−1条件下离心5 min，上清液即为粗酶液。
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取200 μL粗酶液(对照组取无菌CMC-Na液体培养基)，加入800 μL 质量分数为1% CMC-Na溶液，50 ℃反应60 min后加入1 mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液，沸水浴反应10 min，冷却后稀释至5 mL，于540 nm波长下测定吸光度值，计算酶活性。
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取200 μL粗酶液(对照组取无菌CMC-Na液体培养基)，加入800 μL 质量分数为1%微晶纤维素溶液，50 ℃反应60 min后加入1 mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液，沸水浴反应10 min，冷却后稀释至5 mL，于540 nm波长下测定吸光度值，计算酶活性。
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取100 μL粗酶液(对照组取无菌CMC-Na液体培养基)，加入200 μL 10 mmol·L−1 对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖(p-NPG)溶液，50 ℃反应30 min后加入2 mL 1 mol·L−1 碳酸钠溶液终止反应并显色，于400 nm波长下测定吸光度，计算酶活性。
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本研究酶活性单位定义：在50 ℃，pH 7条件下，1 L酶液在1 s内水解底物生成1 μmol还原产物所需的酶量为1个酶活性单位(μkat·L−1)。
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将CMC-Na平板分为2个半圆区域，分别在2个半圆区域内接种直径为0.5 cm的不同真菌菌饼，37 ℃黑暗条件下对峙培养7~15 d，观察真菌间拮抗反应。
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将直径0.5 cm真菌菌饼(双菌组合各1/2，加入直径为0.5 cm菌饼)接入灭菌后水稻秸秆培养基(秸秆干质量记为m)，37 ℃避光培养20 d，使用20目筛分离真菌菌丝和秸秆，秸秆80 ℃烘干12 h后称干质量(记为md)，计算干物质降解率(Rdm)：Rdm= (m−md)/m×100%。
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木质纤维素组分质量分数测定参考美国国家可再生能源实验室(NREL)方法[17]，并有所简化：取0.2 g干燥植物材料(记为m0)，加入3 mL体积分数为72%的硫酸，摇匀，30 ℃水浴1 h。稀释酸体积分数至4%(体积记为v)，转移至聚四氟乙烯耐压瓶中，于烘箱中121 ℃酸解2 h。使用砂芯漏斗抽滤，滤纸采用已烘干并称量的无灰定量滤纸(记为m1)。滤渣连同滤纸转移至陶瓷坩埚，80 ℃过夜烘干后称量(记为m2)，随后于马弗炉中550 ℃煅烧4 h，冷却后称量(记为m3)。滤液以质量分数为4%的氢氧化钠中和至中性后(稀释倍数记为k)，用葡萄糖试剂盒测定葡萄糖质量分数(记为Cglu)，用DNS法测定还原糖质量分数(记为Crs)，计算纤维素、半纤维素和木质素质量分数(分别记为Ccel、Chem和Clig)，最后根据降解前组分质量分数(记为C)和降解后组分质量分数(记为Cd)计算组分降解率(记为Rlc)。计算公式如下：Ccel = Cglu×v×k×0.90/m0×100%；Chem = (Crs−Cglu)×v×k×0.88/m0×100%；Clig = (m2−m1−m3)/m0×100%；Rlc = [1−(m×C)/(md×Cd)]×100%。其中：0.90为纤维素单糖转化系数，0.88为半纤维素单糖转化系数。
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取降解前后水稻秸秆样品，烘干后研磨成粉末，使用傅立叶红外光谱仪(Thermo Scientific NICOLET iS50FT-IR)分析。分辨率4 cm−1，扫描次数32次，扫描波长500~4 000 cm−1。
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取降解前后水稻秸秆样品，烘干后研磨成粉末，使用X射线衍射仪(Bruker D8 Advance)分析。扫描范围5°~90°，扫描速度5°·min−1，计算纤维素结晶度(D) = (I002−Iam)/I002×100%。其中：I002表示2θ = 22.5°衍射峰最大值；Iam表示2θ = 18.0°衍射峰最小值。
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取降解前后水稻秸秆样品，烘干后研磨成粉末后用扫描电镜(Hitachi SU8010)观察。加速电压：3.0 kV；放大倍数：1 000倍。
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使用SPSS 29对不同真菌的纤维素酶活性和水稻秸秆降解率进行方差齐性检验与显著性分析。
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本研究共从黑翅土白蚁肠道中分离出6株真菌，分别记为FU-1~FU-6。经刚果红染色后筛选出FU-1、FU-2、FU-4和FU-6共4株产生明显透明圈的真菌，其菌落形态与透明圈形态如图1所示，其中产生透明圈初步表明其能将纤维素降解为多聚糖类物质，具有潜在的木质纤维素降解活性[18]。
图 1 4株真菌菌落形态及透明圈形态
Figure 1. Morphologies of colony and transparent zone of four fungal strains
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对4株具备木质纤维素降解活性的真菌进行分子生物学鉴定，其中FU-1、FU-2属于篮状菌属Talaromyces，分别鉴定为安拉阿巴德篮状菌T. allahabadensis和刺孢篮状菌T. aculeatus。FU-4属于曲霉属Aspergillus，鉴定为黑曲霉A. niger。FU-6属于多年卧孔菌属Perenniporia，鉴定为灰孔多年卧孔菌P. tephropora(表1)。
表 1 4株真菌鉴定结果
Table 1. Identification results of four fungal strains
菌株编号 GenBank
登记号相似菌种
(GenBank登记号)相似度/
%FU-1 OQ804643 Talaromyces allahabadensis
(MH727608)100.00 FU-2 OQ804660 T. aculeatus (HQ392496) 100.00 FU-4 OQ804669 Aspergillus niger
(MG228418)100.00 FU-6 OQ804677 Perenniporia tephropora
(MW077095)99.84 -
图2结果表明：黑曲霉的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶活性显著高于其他真菌(P＜0.05)，分别达4.361和1.893 μkat·L−1，表明其具有较强的纤维素链切割和末端水解能力。安拉阿巴德篮状菌的β-葡萄糖苷酶活性显著高于其他真菌(P＜0.05)，达11.133 μkat·L−1，说明具有较强的纤维二糖水解能力。
图 2 4种真菌不同纤维素酶活性
Figure 2. Different cellulase activities of four fungal species
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将筛选得到的4株真菌两两组合对峙，发现安拉阿巴德篮状菌与刺孢篮状菌(图3A)、刺孢篮状菌与黑曲霉(图3B)和刺孢篮状菌与灰孔多年卧孔菌(图3C)菌落之间产生抑菌圈，表现出相互拮抗。而安拉阿巴德篮状菌与黑曲霉(图3D)、安拉阿巴德篮状菌与灰孔多年卧孔菌(图3E)和黑曲霉与灰孔多年卧孔菌(图3F)菌落之间可接触生长，具备共生协作降解木质纤维素的潜能。
图 3 不同真菌组合对峙培养结果
Figure 3. Antagonistic culture results of different fungal combinations
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单独降解时，4株真菌均表现出一定降解能力(表2)，其中刺孢篮状菌和黑曲霉具有显著较高的纤维素降解率，分别达38.49%和40.72%，灰孔多年卧孔菌具有极高的半纤维素降解率，达59.77%，同时这3种真菌的木质素降解率也达到最高水平。组合降解时，部分真菌组合表现出更强的降解能力，其中当黑曲霉与灰孔多年卧孔菌“强强联合”后，其干物质降解率和纤维素降解率进一步提高，达38.27%和62.59%，同时半纤维素降解率仍保持较高水平，达51.75%。尽管其木质素降解率有所降低，但综合来看，该真菌组合表现出最强的水稻秸秆降解能力，具有潜在的开发价值。
表 2 水稻秸秆干物质与木质纤维素组分的降解率
Table 2. Dry matter and lignocellulose components degradation rates of rice straw
处理组 干物质降解率/% 纤维素降解率/% 半纤维素降解率/% 木质素降解率/% 安拉阿巴德篮状菌 26.38±0.33 e 27.86±0.49 e 19.44±2.05 d 13.06±2.56 c 刺孢篮状菌 33.79±1.16 bc 38.49±0.93 c 21.75±2.20 d 28.96±2.79 a 黑曲霉 32.18±0.13 cd 40.72±1.71 bc 30.45±1.40 c 26.87±2.13 a 灰孔多年卧孔菌 36.61±1.02 ab 33.96±0.67 d 59.77±0.90 a 29.66±1.91 a 安拉阿巴德篮状菌 + 黑曲霉 33.66±1.07 bc 39.91±2.99 bc 33.68±2.34 c 24.38±1.36 ab 安拉阿巴德篮状菌 + 灰孔多年卧孔菌 29.21±1.57 de 45.60±2.98 b 50.41±1.94 b 14.69±2.33 c 黑曲霉 + 灰孔多年卧孔菌 38.27±1.32 a 62.59±0.70 a 51.75±2.56 b 17.39±0.36 bc 说明：数值为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同处理组的降解率之间差异显著(P＜0.05)。 -
经黑曲霉与灰孔多年卧孔菌组合降解后，水稻秸秆部分红外吸收峰明显下降(图4)，其中3 400 cm−1附近吸收峰与—OH伸缩振动相关[19]，说明秸秆部分氢键被破坏，分子间作用力减弱；1 460 cm−1附近吸收峰与半纤维素中亚甲基(CH2)弯曲振动相关[19]，表明真菌组合能有效破坏半纤维素结构；1 370和1 315 cm−1附近吸收峰分别与纤维素中CH2摇摆振动和C—H弯曲振动相关[20]，证明真菌组合具有一定的纤维素分解能力；1 235 cm−1附近吸收峰与半纤维素-木质素复合物中O=C—C伸缩振动相关[19]，说明部分复合结构被瓦解，半纤维素与木质素发生分离；1 160 cm−1附近吸收峰与碳链中C—O—C伸缩振动相关[19]，表明在酶作用下，秸秆中部分碳链结构被破坏，分子聚合度下降。
图 4 黑曲霉与灰孔多年卧孔菌组合降解前后水稻秸秆傅立叶红外光谱
Figure 4. FTIR spectra of rice straw before and after A. niger and P. tephropora combined degradation
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经黑曲霉与灰孔多年卧孔菌组合降解后，水稻秸秆纤维素非结晶区衍射峰(2θ = 18.0°)明显下降，纤维素结晶区衍射峰(2θ = 22.5°)无明显变化，水稻秸秆纤维素结晶度由22.44%上升至32.53%(图5)。说明相较于纤维素结晶区，真菌组合分泌的纤维素酶能够更容易分解纤维素非结晶区。但随着纤维素结晶度不断升高，纤维素整体晶体结构变为更加紧凑，推测对于进一步降解利用纤维素产生一定阻碍作用[20]。
图 5 黑曲霉与灰孔多年卧孔菌组合降解前后水稻秸秆X射线衍射图谱
Figure 5. XRD patterns of rice straw before and after A. niger and P. tephropora combined degradation
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通过扫描电镜观察(图6)，发现黑曲霉与灰孔多年卧孔菌组合降解后水稻秸秆表面由紧密光滑变为粗糙隆起，纤维结构崩解断裂，结构蓬松化，并产生大量孔隙和碎片，推测真菌菌丝可能通过孔隙深入秸秆内部，在内外双重降解下加速破坏秸秆结构。
图 6 黑曲霉与灰孔多年卧孔菌降解前后水稻秸秆扫描电镜图像(×1 000倍)
Figure 6. SEM images of rice straw before and after A. niger and P. tephropora combined degradation (×1 000 times)
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随着分子生物学与环境生物学技术不断成熟，近年来利用真菌绿色降解水稻秸秆已取得了一定进展。MUSTAFA等[21]研究发现：糙皮侧耳和里氏木霉T. reesei对水稻秸秆纤维素、半纤维素和木质素降解率可分别达13.1%、23.7%、35.3%和20.1%、23.3%、23.6%。尹蕾等[22]从土壤中分离出的枝孢菌Cladosporium sp. BD-19可降解水稻秸秆中26.42%的纤维素、16.64%的半纤维素和11.43%的木质素。SHENG等[23]利用逆型金钱菌Gymnopus contrarius降解水稻秸秆后，去除了22.9%的纤维素、22.7%的半纤维素和41.9%的木质素。与上述研究相比，本研究从黑翅土白蚁肠道分离筛选的部分真菌具有更强的降解能力，其中刺孢篮状菌和黑曲霉具有更强的纤维素降解能力，降解率分别达38.49%和40.72%，灰孔多年卧孔菌具有更强的半纤维素降解能力，降解率达59.77%，推测这些共生真菌在白蚁消化木质食料过程中发挥一定协同降解作用。
在自然状态下，秸秆腐解往往是多种微生物共同参与的结果，将具有酶系互补作用的真菌组合培养不仅弥补部分菌种酶系不完整或个别酶活低的缺陷，同时还能减缓反馈抑制，从而提高降解效果[24]。江高飞等[25]研究发现：将草酸青霉等5种真菌复配后，复合菌系的秸秆降解能力和纤维素酶活性随着菌株种类增多而逐步升高。KOLASA等[26]将里氏木霉分别与黑曲霉等3种曲霉混合培养后，小麦Triticum aestivum秸秆降解率效果相较于单独降解均提升80%左右。本研究发现：当黑曲霉与灰孔多年卧孔菌“强强联合”后，水稻秸秆干物质降解率和纤维素降解率进一步提高，分别达38.27%和62.59%，同时半纤维素降解率仍保持较高水平，达51.75%，表现出极强的降解能力。进一步研究发现：两者组合能有效破坏水稻秸秆中半纤维素-木质素复合物内部化学键并减弱分子间作用力，推测在降解过程中纤维素、半纤维素和木质素三者间失去“黏性”，纤维素向外暴露，释放更多酶切位点供以降解[27−28]。本研究也证实：真菌组合更偏好分解纤维素非结晶区，推测是由于非结晶区吸水性更强，更容易与酶结合[29]。秸秆化学结构被破坏的同时，其物理结构也显著改变，降解后的秸秆表面崩解碎裂，结构蓬松化，产生大量碎片和孔隙，不仅有利于酶的渗透和吸附，真菌菌丝也更易探入内部“破坏”[30]。
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本研究从黑翅土白蚁肠道分离筛选得到的安拉阿巴德篮状菌、刺孢篮状菌、黑曲霉和灰孔多年卧孔菌均具有水稻秸秆降解活性，其中黑曲霉和灰孔多年卧孔菌在组合降解水稻秸秆时表现出极强的降解能力，20 d内可降解水稻秸秆中38.27%的干物质、62.59%的纤维素和51.75%的半纤维素，并显著破坏秸秆理化结构，在秸秆生物降解产业化上具有潜在的开发价值。
Biodegradation of rice straw by symbiotic fungi of Odontotermes formosanus
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摘要:
目的 挖掘黑翅土白蚁Odontotermes formosanus共生真菌在秸秆资源利用上的应用潜力，为实现秸秆生物降解产业化补充菌种资源并提供理论依据。 方法 以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)平板为分离培养基，采用刚果红染色法筛选，从黑翅土白蚁肠道中分离筛选具有木质纤维素降解活性的真菌，并测定纤维素酶活性。在液态发酵条件下，评估不同真菌以及真菌组合对水稻Oryza sativa秸秆的降解效果，利用傅立叶红外光谱、X射线晶体衍射和扫描电镜分析降解前后水稻秸秆的理化性质。 结果 从黑翅土白蚁肠道中共分离到4种具有木质纤维素降解活性的真菌，经鉴定分别为安拉阿巴德篮状菌Talaromyces allahabadensis、刺孢篮状菌T. aculeatus、黑曲霉Aspergillus niger和灰孔多年卧孔菌Perenniporia tephropora。纤维素酶活结果显示：黑曲霉的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶活性最高，安拉阿巴德篮状菌的β-葡萄糖苷酶活性最高。水稻秸秆降解试验表明：黑曲霉与灰孔多年卧孔菌双菌组合具有最强的秸秆降解能力，20 d内可降解秸秆中38.27%的干物质、62.59%的纤维素和51.75%的半纤维素。降解后水稻秸秆内部化学键和分子间作用力被破坏，结晶度由22.44%上升至32.53%，秸秆表面崩解碎裂，结构蓬松化。 结论 从黑翅土白蚁肠道分离得到的黑曲霉和灰孔多年卧孔菌在组合降解水稻秸秆时表现出极强的降解能力，在秸秆生物降解产业化上具有潜在的开发价值。图6表2参30 Abstract:Objective This study aims to explore the application potential of symbiotic fungi of Odontotermes formosanus in the utilization of straw resources, so as to provide a theoretical basis for the industrialization of straw biodegradation and supplement strain resources. Method Using CMC-Na plate as isolation medium and Congo red staining method for screening, the fungi with lignocellulose degrading activity were isolated and screened from the gut of O. formosanus and cellulase activities were measured. The degradation effect of different fungi and fungal combinations on Oryza sativa (rice) straw was evaluated under liquid fermentation. The physicochemical properties of rice straw before and after degradation were analyzed using FTIR, XRD and SEM. Result 4 fungi with lignocellulose degrading activity were isolated from the gut of O. formosanus, identified as Talaromyces allahabadensis, T. aculeatus, Aspergillus niger and Perenniporia tephropora. Cellulase activity results showed that A. niger had the highest activity of endoglucanase and exoglucanase, while T. allahabadensis had the highest activity of β-glucosidase. The rice straw degradation test showed that the combination of A. niger and P. tephropora had the strongest straw degradation ability. Within 20 days, 38.27% of dry matter, 62.59% of cellulose and 51.75% of hemicellulose in rice straw could be degraded. After degradation, the internal chemical bonds and intermolecular forces in rice straw were destroyed, and crystallinity increased from 22.44% to 32.52%. The straw surface disintegrated and smashed, and the structure became fluffy. Conclusion A. niger and P. tephropora isolated from the gut of O. formosanus show strong degradation ability in the combined degradation of rice straw, and have potential development value in the industrialization of straw biodegradation. [Ch, 6 fig. 2 tab. 30 ref.] -
Key words:
- Odontotermes formosanus /
- symbiotic fungus /
- cellulase /
- utilization of straw resources
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植物的蒸腾作用是其水分利用的主要方式，拉动水分在“土壤—植物—大气”连续体体系中不断循环迁移。蒸腾耗水与植物生命表征直接联系，决定着植物的水分盈缺和灌溉与否[1]。对活立木蒸腾耗水的准确测定，可以为低耗水树种选择、合理密度配置以及城市园林绿化等工作提供理论依据和参考[2]。树木蒸腾耗水产生的水势差会拉动水分通过木质部向上运输进而形成液流，因此树干液流可作为评估树木蒸腾耗水能力的一项重要指标[3-4]。目前，有多种方法可以评估树木蒸腾耗水能力，多数是通过测定树木液流速率来估算蒸腾耗水量和耗水能力。不同树干液流测定方法测量精度不同，在选择树干液流速率测量方法时需要考虑实验研究目的、活立木树种的生理条件和实验研究所处的自然环境等因素。目前液流速率的测量主要有同位素示踪法和热技术法[5] 2类。其中同位素示踪法通过将化学同位素作为示踪剂注射到树木木质部，从而检测树木液流速率；但该方法在野外应用不便，且测定精度较低，有待改进[6]。利用热技术法测定树干液流不受外界环境和树木自身结构影响，安装布置操作相对简易，并且对树木组织结构损伤较小，具有一定的应用优势[7]，因此被广泛应用于树干液流测定、液流速率与环境因子的关系研究中[8-10]。如王檬檬等[11]应用热技术法研究了晋西黄土区苹果Malus pumila树液流速率与太阳辐射、大气水份等的关系；温淑红等[12]应用热技术法分析了宁南黄土陵区山桃Amygdalus davidiana树树干液流速率与太阳辐射、温度、风速的关系；杨洁等[13]应用热技术法研究了树干液流时滞效应，并精确估算树木的蒸腾耗水；还有学者[14-15]应用热技术法探究树干木质部径向不同深度的液流速率和不同时间尺度下的液流速率特征等。目前常用的测量树干液流的热技术法主要有热脉冲法(Heat Pluse Velocity Method，HPVM)、热平衡法、热扩散法、热场变形法以及外热比法等，前3种方法在国内应用较多，后2种方法在国外有较为详细的应用描述，但在国内的研究有限。鉴于此，本研究综述了现有的树干液流无损检测方法，阐述这些方法的基本原理、装置布置、应用领域和最新研究案例，对不同热技术方法的测量精度、适用范围、潜在优势以及今后改进方向等方面进行讨论和比较，并对不同研究目标和实验条件下适用的测定方法给出建议，展望各自在液流研究方面的应用前景。
1. 基于热技术的液流检测方法
1.1 热脉冲法
热脉冲法最早由HUBER等[16]提出，首次用热作为液体流动的示踪剂，利用热脉冲测量植物液流速率。该装置由加热元件和2个热电偶组成探针块，通过测量加热器发出热脉冲随着液流上升到达热电偶处所需的时间，计算液流速率(图1A)。由于热传导和对流会使得测量结果偏高，MARSHALL[17]利用热流方程建立了热脉冲法的模型框架，为热脉冲法的进一步发展提供了理论基础。
基于脉冲加热的方法包括补偿热脉冲法、最大温差法(T-max法)以及热比率法。其中补偿热脉冲法(Compensation Heat Pulse Method，CHPM)通过测量2个对称放置在线性加热器两侧的温度传感器达到相同温度时的时间来计算液流密度，该装置安装探针时会对周围木材组织造成损伤而导致液流速率失真，因此需要根据不同探针间距设置校正参数[18]，从而使液流速率的测量值更接近真实值。T-max法[19]的装置由加热器和1个温度探针组成，通过记录从发出热脉冲至温度探针到达最大温度时的时间，再根据MARSHALL的基础理论计算液流速率。该方法设备简单，仅需确定被测树干边材的导热系数，即可计算树干液流密度。热比率法(Heat Ratio Method，HRM)基于补偿热脉冲法提出[20]，测量范围可以达到零值甚至延伸至负值，其装置由1个加热器和2个安装在加热器上下游的温度探针组成，通过测定2个探针的增温比即可计算液流速率。
1.2 热平衡法
热平衡法(Heat Balance Method，HBM)的原理是当树干内通过一定量液流时，加热元件作为热源会向树干提供已知的热量，直至树干温度趋于稳定。若不考虑热传导以及隔热层损失热量，热源提供的热量应与被液流带走的热量相等，可根据这种热平衡关系计算液流速率。热平衡法可分为茎热平衡法和树干热平衡法[21]。
1.2.1 茎热平衡法
茎热平衡法(Stem Heat Balance，SHB)[22]以环形加热元件作为热源，提供稳定的热量，热量散失途径包括树干液流带走、热传导向树干上下方散失和对流散失。装置(图1B)设计为包裹式，利用包裹式隔热层(通常为聚苯乙烯泡沫)防止热辐射造成的热量散失(树干周围的热辐射忽略不计)。加热元件上下方安装2对热电偶，用来测定液流通过后的温差，依据热量平衡关系计算液流。SHB法适用于测定胸径较小的树干，其优点是检测时不需要标定，不需要将热电偶插入树干中，对树木无直接损伤。
1.2.2 树干热平衡法
树干热平衡法(Trunk Heat Balance，THB)[23]的原理与茎热平衡法类似，均通过热量平衡关系计算液流，不同点是THB法测量装置(图1C)由插入树干的加热片和1对热电偶组成，2个热电偶分别安装在紧挨加热片上端(温度场最大值)和加热片下端(不受温度场影响)位置，通过记录液流通过前后树干温度差来计算液流。THB法同样不需要标定，并且可测定胸径较大的树干。但THB法设备较多，安装相对复杂，易对树干造成微损伤。目前热平衡法的应用较为广泛，通常用来研究环境因子与液流速率的关系以及耗水特性。
1.3 热扩散法
热扩散法(Thermal Dissipation Method，TDM)[24]又称Granier法，是目前应用最广泛的液流测定方法。该装置(图1D)包含2个传感器探针，沿液流方向插入树干中。下游(上部)探针包括加热元件(长约20 mm)，并缠绕在装有热电偶的钢针上，热电偶尖端正对加热元件的中间；下游(上部)探针不加热，用作参考探头，以测量木质部的环境温度。工作时下游探针以恒定功率(0.2 W)连续加热，受液流的散热影响，2个探头间存在温度差异，因此可通过温差与液流速率间的关系计算液流速率。
TDM法常用来研究树干液流与环境因子的关系。万艳芳等[25]应用热扩散技术测定并分析了青海云杉Picea crassifolia树干液流密度与环境因子的关系，确定液流密度的主要环境影响因子是太阳辐射。朱敏捷等[26]利用热扩散法测定了尾叶桉Eucalyptus urophylla树干液流，研究了树干液流的方位差异以及与环境因子的关系。姚增旺等[27]应用热扩散探针测定梭梭Haloxylon ammodendron树干液流，研究了树干液流与环境因子之间的时滞效应。另外，通过测定单株树干液流还可以推算林分蒸腾量。王志超等[28] 研究了林分蒸腾耗水规律后发现：忽略夜间林分蒸腾耗水量会导致对林分蒸腾耗水量的估计不准确。
1.4 热场变形法
基于热脉冲法测量树木液流密度时，需要测量热脉冲前后温度，获得温度差，这就要求木材具有较高的热稳定性；热脉冲法两侧测量需要时间间隔，可以测得液流密度的最大值为45 cm3·cm−2·h−1，说明该方法具有一定的局限性。为解决以上问题，NADEZHDINA等[29]提出了热场变形法(Heat Field Deformation，HFD)，通过记录线性加热器周围的木质部中不同径向位置的热场变化，将热场变形与树干木质部的液流密度联系起来。热场变形法液流检测系统(图1E)包括3个探针和1个加热器，其中2个探针沿轴向对称安装在加热器的上游和下游，另1个探针沿切向平行于加热器水平安装在加热器侧边，轴向探针测量对称温差，切向探针测量不对称温差。通过测定加热器周围轴向和切向的温度差来表征由树液流动而产生的热场变化，进而确定液流密度。液流密度q (cm3·cm−2·h−1)的一般计算公式为：
$$ q=3\; 600D_{{\rm{st}}}(K＋T_{{\rm{s}}-{\rm{a}}})/T_{{\rm{as}}}Z_{{\rm{ax}}}Z_{{\rm{tg}}}L_{{\rm{sw}}}。 $$ 其中：Dst表示树干边材热扩散率(m2·s−1)；(K＋Ts-a)/Tas表示温差比率；ZaxZtg表示传感器探针间距离的校正因子；Lsw表示边材深度。K表示零液流下Ts-a的绝对值，其中Ts-a为Tsym与Tas的差。Tsym表示对称探针间的温差；Tas表示非对称探针间的温差；Zax表示轴向上游探针与加热器的距离；Ztg表示切向探针与加热器的距离。
HFD传感器也可以记录反向流量，即将Tsym改为负值。因此，计算公式转换为：
$$ q＝－3 \;600D_{{\rm{st}}}(－K+T_{{\rm{s}}-{\rm{a}}})/T_{{\rm{as}}}Z_{{\rm{ax}}}Z_{{\rm{tg}}}L_{{\rm{sw}}}。 $$ 用HFD法测量液流密度，非零液流下，利用线性外推法能准确测得零液流密度，相比其他热技术方法优势显著。同时HFD法结合了对称与非对称温差测量，利用对称温差测量低液流密度较为有效，而测得的高液流密度与实际蒸腾量线性关系不显著，因此高液流密度准确性不够[30]。而利用非对称温差测量是中高液流密度准确性较高。因此，HFD法对于低液流量和高液流量都可以准确测定。
HFD法广泛应用于液流指数(the sap flow index，SFI) 的测定。SFI是植物水分状况的敏感指标，用来决定植物是否需要灌溉。SFI值通过在加热器周围轴向等距安装差动热电偶测得，是液流速率测定的原始数据之一[31]。此外，HFD法可以直接监测木质部的水分运动[32]，通过沿着木质部半径的不同深度，用围绕普通线性加热器的传感器进行液流测定，具有快速响应和高度敏感的特性。NADEZHDINA[33]在对枫树Acer spp. 水运输路径的研究中，利用HFD法测定枫树木质部液流，证实了枫树的维管结构具有完整拓扑结构。
1.5 外热比法
外热比法(External Heat-Ratio，EHR)是在热比率法的基础上提出的，用外部加热元件代替插入式加热元件，其基本原理与激光脉冲法(laser heat-pulse gauge，LHPG)类似。不同点是后者用近红外激光源代替插入式加热元件，并通过红外摄像机从外部监控热量传播，热脉冲速度由温度数据确定，并与液流速率相关。HELFTER等[34]利用激光脉冲法对小茎木本植物的液流速率进行了测定，发现小茎木本植物韧皮部与木质部液流速率几乎一致。CLEARWATER等[35]首次提出了外热比法(图1F)，将1个微型外部加热器(电子芯片电阻)和温度传感器(精密热电偶)粘在软木块上，并压在茎干表面。释放热脉冲后，根据2个热电偶的增温比来计算液流密度。利用外热比法可以测定灌木液流速率[36]，研究植物水动力学，对直径较小的茎干具有良好的适用性。外热比法最小可测直径为5 mm，可测液流密度为0.36~50.00 cm3·cm−2·h−1，较少应用于直径较大的茎干。因此，下一步可改进EHR技术，用于测定较大茎段植物的液流密度。
2. 问题与建议
2.1 热技术方法的不足与改进
探针的使用会对树干边材造成一定的破坏，使得探针处树干边材的热均匀性改变，从而降低测量结果的准确性。GREEN等[37]用二维的“热-液流”模型确定不同伤口大小的校正因子，给出了补偿脉冲法和T-max法的校正因子表，并通过比较美洲黑杨Populus deltoides与白柳Salix alba的液流通量值与实际蒸腾速率值的关系证明了校正因子的有效性。TESTI等[38]在补偿热脉冲法的基础上提出了校准平均梯度法(calibrated average gradient，CAG)，有效测定了低速液流，使用也较为简易。
LANGENSIEPEN等[39] 发现：为更好地适应小麦Triticum aestivum茎的解剖结构和热物理特性，在应用茎热平衡法测量小麦液流速率时，通过引入降噪方程可有效提高液流计的测量精度。TRCALA等[40]利用热场变形法的温度场理论，通过改变传感器的几何形状(从垂直到水平)来改善热平衡法的传感性能，实现了零液流和反向液流的测定。这种方法也被称为线性热平衡法[41]，是从基础传导—对流传热方程解析得出的精确方程，不仅提高了液流测定的精度，而且基于热导率信息实现了水含量的估算。NAKANO等[42]发现：对金柑Fortunella crassifocia进行环剥处理后，可利用热平衡法测定其韧皮部和木质部的液流速率。
TDM法测定液流速率需要估算线性回归关系，确定零液流状态下的温差，而这个过程会产生一定误差[43]，许多情况下准确性受到质疑[44]。因此用热扩散法确定树木的蒸腾量时，有必要对测量树种液流量估计方程进行校准[45-47]。
外热比法也存在一些不足。首先，大多数加热传感器从加热芯片的中心到两侧感温元件有一定的窄间距。随着热量沿横截面向内传播和沿茎轴上下传播，热量到达木质部导管时变得非常分散，来自液流的热比率信号会减弱。其次，加热器和温度传感器被安置在1个矩形的不导电硅酮/软木块中，无法有效隔绝环境温度对检测温度的影响，增加了液流检测结果的误差。再次，矩形加热芯片横压在圆柱形树干上，载荷不均匀，加热器元件使用窄的矩形芯片电阻，比圆形芯片更容易断开。为此，王胜[48]开发了1种新设计的EHR加热传感器，增加了加热元件至温度传感器的间距，使之更适应直径较大的茎干。改良后的装置茎干直径检测范围扩大，可用于胸径较小的树木测量。
2.2 基于热技术液流速度测量的常用方法比较
目前，基于热技术的树干液流测定方法日趋完善，不同方法具有相对应的优势和劣势。由表1可知：不同热技术方法液流测定装置均包括为加热器提供能量的能量供应单元和用于收集检测数据的数据记录仪。具体来看，热脉冲法不受环境条件以及树冠结构及根系特性的影响，装置简洁，但存在一定的灵敏度和精度问题。热平衡法无需标定，测量精度有所提高，但仅适于测定高液流密度。热扩散法是目前研究蒸腾耗水特性应用最广泛的方法，测定结果较准确，仪器成本较低，安装简单，有较成熟的商业化产品，但测定结果容易被低估。热场变形法操作复杂，应用较少，但该方法能够准确测定零液流以及逆向液流，测定精度与范围也有很大的提升。外热比法与激光脉冲法均可实现精确的零破坏检测，但仅适用于胸径较小的树干，另外，激光脉冲法装置成本昂贵，未能普及。
表 1 树干液流的测定方法对比Table 1 Comparison of methods for sap flow measurement方法 装置 优点 缺点 热脉冲法 加热器，2个热电偶 不受环境条件，树冠结构及根系特性的影响，简洁准确， 经济可行[49] 存在测定精度问题[37−38] 热平衡法 探针，加热元件 无需标定，进一步提高了测量精度[22−23] 不适用于液流速率较高的 植物[50] 热扩散法 加热探针，参照探针 测定结果较准确，仪器成本较低，安装简单，有较成熟的 商品化产品[51] 液流可能被低估[43] 激光热脉冲法 近红外激光源，红外摄像机 无须将热源插入植物茎干内，避免对茎干内组织破坏而造 成误差[34] 成本较高 热场变形法 加热器，3根探针 能够准确地测定零液流量以及逆向液流[52] 测定过程较复杂[29] 外热比法 微型外部加热传感器 精确、无损地测定胸径较小的树干中的双向液流[53] 微型外部量规的配置尚存 在问题[35−36] 2.3 活立木液流测定方法选择建议
利用热技术方法测定液流速率，可以精确估算树木蒸腾耗水量[54]，但不同热技术方法的测量精度、测定范围以及适用性不尽相同，实际应用时应根据不同实验条件选择不同的热技术方法。选择热技术方法测定树干液流通常需要考虑树木胸径大小、热技术方法的误差范围、热技术方法的测定精度、热技术方法的可行性等因素。
首先，不同胸径活立木应选用不同的热技术方法，外热比法和茎热平衡法适合测定胸径较小的树木，树干热平衡法适合测定胸径较大的树木。其次，不同热技术方法可测得的液流速率范围不同，补偿热脉冲法、T-max法以及热扩散法测定低速液流的误差较大，茎热平衡法测定高液流速率时误差较大，热比率法和热场变形法测定液流范围较广。热场变形法和外热比法可以测定逆向液流，热场变形法还可以准确测定零液流。热脉冲法、热平衡法和热扩散法较成熟[55]，应用较广泛，可行性较高。另外，将不同测定范围的热技术方法组合使用，可以有效提高测定精度。不同植物的液流速率不同。向日葵Helianthus annuus和玉米Zea mays等植物的液流速率相对较低，在利用T-max方法测定时，测量值总是略高于实际值[56]；换成热比率法测定也不够精确，而采用T-max法与热比率法组合测量则较为准确。
3. 热技术方法应用展望
利用热技术方法测定液流速率约80多年的研究，方法不断得到改进与创新，在校准度、测定范围和测定精度上均有所提高，同时，实验操作不断简化，数据实现自动化采集和存储，并逐步实现连续时间以及多层空间的同步测定[57]。其中，热脉冲法、热平衡法、热扩散法经一系列的发展与完善，极大程度上减小了测量误差[58]。热扩散法还形成了成熟的商业化产品，并得到了广泛的应用。虽然利用外热比法和热场变形法测定活立木液流速率的研究有限，但外热比法实现了精确的零破坏检测，热场变形法液流速率测定范围广，并可准确的测定零液流和逆向液流。在利用外热比法测定液流速率时，需要针对不同样本以及实验条件设计不同的量规，这是外热比法的不足之处。因此，外热比法和热场变形法亟待更为深入研究。
目前，热技术方法成为液流测量的首要选择。在未来，应用热技术测定树干液流仍需关注以下热点：在完善研究活立木蒸腾耗水特点的同时，结合土壤生物因子和气象因子与树干液流的关系，进一步深入研究活立木生理作用；从微观和宏观方面监控水分运动，研究水分利用与树木生长的关系；在生产实际方面，进一步完善活立木单株和森林林区的数据监控，为实现高效的林区治理提供有力依据。
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图 1 4株真菌菌落形态及透明圈形态
Figure 1 Morphologies of colony and transparent zone of four fungal strains
图 3 不同真菌组合对峙培养结果
Figure 3 Antagonistic culture results of different fungal combinations
图 4 黑曲霉与灰孔多年卧孔菌组合降解前后水稻秸秆傅立叶红外光谱
Figure 4 FTIR spectra of rice straw before and after A. niger and P. tephropora combined degradation
图 5 黑曲霉与灰孔多年卧孔菌组合降解前后水稻秸秆X射线衍射图谱
Figure 5 XRD patterns of rice straw before and after A. niger and P. tephropora combined degradation
图 6 黑曲霉与灰孔多年卧孔菌降解前后水稻秸秆扫描电镜图像(×1 000倍)
Figure 6 SEM images of rice straw before and after A. niger and P. tephropora combined degradation (×1 000 times)
表 1 4株真菌鉴定结果
Table 1. Identification results of four fungal strains
菌株编号 GenBank
登记号相似菌种
(GenBank登记号)相似度/
%FU-1 OQ804643 Talaromyces allahabadensis
(MH727608)100.00 FU-2 OQ804660 T. aculeatus (HQ392496) 100.00 FU-4 OQ804669 Aspergillus niger
(MG228418)100.00 FU-6 OQ804677 Perenniporia tephropora
(MW077095)99.84 
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表 2 水稻秸秆干物质与木质纤维素组分的降解率
Table 2. Dry matter and lignocellulose components degradation rates of rice straw
处理组 干物质降解率/% 纤维素降解率/% 半纤维素降解率/% 木质素降解率/% 安拉阿巴德篮状菌 26.38±0.33 e 27.86±0.49 e 19.44±2.05 d 13.06±2.56 c 刺孢篮状菌 33.79±1.16 bc 38.49±0.93 c 21.75±2.20 d 28.96±2.79 a 黑曲霉 32.18±0.13 cd 40.72±1.71 bc 30.45±1.40 c 26.87±2.13 a 灰孔多年卧孔菌 36.61±1.02 ab 33.96±0.67 d 59.77±0.90 a 29.66±1.91 a 安拉阿巴德篮状菌 + 黑曲霉 33.66±1.07 bc 39.91±2.99 bc 33.68±2.34 c 24.38±1.36 ab 安拉阿巴德篮状菌 + 灰孔多年卧孔菌 29.21±1.57 de 45.60±2.98 b 50.41±1.94 b 14.69±2.33 c 黑曲霉 + 灰孔多年卧孔菌 38.27±1.32 a 62.59±0.70 a 51.75±2.56 b 17.39±0.36 bc 说明：数值为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同处理组的降解率之间差异显著(P＜0.05)。
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20230140
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