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抗生素因其广谱的抗菌特性和促进生长作用广泛应用于医疗卫生、畜牧及水产养殖等领域[1]。然而，进入机体的抗生素仅有小部分发挥作用，剩下约30%~90%会随着代谢排出体外[2-4]，并且以原药的形式输入周边环境[5]。一些化学性质稳定的抗生素会在环境中长期残留，不仅对周边植物[6]、鱼类[7]造成不利影响，其产生的选择压力还能够诱导耐药菌群的出现和抗性基因的传播[8]。鉴于其巨大的风险和威胁，抗生素以及抗性基因已经被世界卫生组织列为21世纪最重要的污染源之一。残留抗生素的去除和抗生素污染环境的修复成为保障生态安全和生命健康的重要举措。残留抗生素的去除主要有理化处理和生物降解2种途径，其中生物降解因为价格低廉、操作简便且不会造成二次污染而备受青睐[9]。当前关于利用微生物进行抗生素生物降解的研究日益增多，并已积累不少优良的菌种资源[10-11]。但抗生素被降解并不能确保转化产物的安全性，一些原药被代谢后可能会产生毒性更高的中间产物[12]。因此对降解菌株代谢产物的生物毒性评估和生态安全性评价是菌株能够实际应用的必要保证。土霉素(oxytetracycline，OTC)是当今应用范围最广、用量最多的抗生素之一[13]，由于性状稳定已在陆地、水体等多种环境中被高频次检出[14-15]。本研究前期分离获得1株OTC高效降解菌Arthrobacter nicotianae ZAF-05，该菌株环境适应性好，能在液体体系、粪肥和土壤中发挥积极的降解作用[16]。本研究以该菌株为实验对象，利用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(HPLC-Q-TOF-MS)初步解析菌株作用下OTC的降解产物，并以对OTC敏感的大肠埃希菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和水生生物斜生栅藻Scenedesmus obliquus作为指示生物，评估OTC降解产物的生物毒性，以期为菌株的安全使用提供初步理论依据。
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OTC高效降解菌A. nicotianae ZAF-05于2019年分离自制药厂活性污泥。OTC敏感菌革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌No 1.821、革兰氏阴性菌大肠埃希菌No 1.12882均来自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，OTC敏感斜生栅藻购自上海光宇生物技术有限公司。
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OTC购于Solarbio公司，纯度＞99%。LB培养基用于细菌的培养，主要配方为胰蛋白胨10 g·L−1；酵母提取物5 g·L−1；氯化钠5 g·L−1，pH 7.2。BG11合成培养基用于供试斜生栅藻的培养，购自上海光宇生物技术有限公司并按说明书指导方法使用。质谱所用甲醇和乙腈等相关试剂均购自Merck公司(Kenilworth, 美国)。
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制备不同密度降解菌菌悬液，绘制细胞数量与悬液600 nm波长下吸光度[D(600)]的标准曲线，根据标准曲线得到合适密度的细菌悬液。在OTC终质量浓度为100 mg·L−1的LB培养基中接入终密度为1.5×105 CFU·mL−1的降解菌。培养2 d后，取样菌悬液经过滤除菌、过柱萃取后利用HPLC-Q-TOF-MS技术检测OTC降解产物。质谱数据由Agilent 6545 Q-TOF质谱仪获得，使用电喷雾电离源，以正离子和负离子模式工作。具体工作条件：离子化压力3 500 V，裂解电压75 V，碰撞能30 eV，质荷比50~1 200。筛选获得可能的转化产物以TPs表示。以添加OTC但不接种降解菌的处理为阳性对照，以不添加OTC但接种降解菌的处理为阴性对照，所有处理均设置3个平行。
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降解产物毒性测定设置4个处理。对照A(ckA)：添加300 mg·L−1 OTC的LB液体培养基。T1处理：添加300 mg·L−1 OTC的LB培养基，接种降解菌；培养4 d后20 000 r·min−1高速离心2 min，取过滤除菌后的上清备用。T2处理：添加300 mg·L−1OTC的LB液体培养基，自然降解4 d。对照B(ckB)：LB液体培养基。①OTC降解产物对细菌的生物毒性。取2组各4支试管，按1∶1(v/v)加入LB培养液和上述4个处理样品，定容至体积5 mL。分别依次接入1.5×105 CFU·mL−1的枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌新鲜菌悬液，菌液密度确定方法同1.3.1。37 ℃下震荡培养，每隔24 h取样测定菌液吸光度[D(600)]，用以表征细菌数量。②OTC降解产物对供试藻的生物毒性。取1组4个三角瓶，依次加入16 mL BG11培养基和2 mL上述4个处理样品，混匀后接种终密度为1.2×103个·mL−1新鲜藻种。于25 ℃、12 h (光照) /12 h (黑暗)光周期条件下静置培养，每天定时摇晃4~5次，每隔24 h取样测定吸光度[D(680)]。培养4 d后取样藻液，参考武鹏鹏等[17]的方法测定藻液叶绿素质量浓度，参考邹宁等[18]的方法观察藻细胞结构。
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各处理均3个平行，所得数据利用SPSS 16.0进行方差分析，在0.01水平下确认差异显著性。
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OTC降解产物的生物毒性既取决于残留的OTC，也取决于降解过程中产生的中间代谢产物。培养2 d后，对各处理悬液产物进行HPLC-Q-TOF-MS分析发现：降解菌组和阳性对照中均检出了TP447和TP461，阴性对照中则未检出；推测TP447和TP461可能为OTC降解相关中间产物。图1 A和图1 B可见：在7.279 min时TP447出现了明显的特征峰，其图谱特征以及出峰时间与QI等[19]发现的脱甲基OTC一致；由图1 C和图1 D可见：TP447在正、负离子作用下均出现了脱甲基OTC特有的离子碎片图谱，推测TP447可能是OTC水解产物——脱甲基OTC。TP461在4~7 min区段内出现了多个特征峰(图2 A)，参考文献[20]可知：OTC出峰时间在5.434 min时，差向异构OTC(epioxytetracycline，EOTC)出峰时间在4.893 min时，同分异构OTC(isomeric oxytetracyline，ISO-OTC)出峰时间在6.550 min时；此3个化合物出峰时间、质荷比和分子离子峰图谱与TP461相同，推测TP461可能为OTC(图2 B)、EOTC (图2 C)和ISO-OTC (图2 D)的混合物。由表1可知：降解菌培养体系中OTC、EOTC和脱甲基OTC相对丰度极显著低于阳性对照(P＜0.01)，表明菌株ZAF-05在加速OTC分解的同时，还可能抑制了OTC向脱甲基OTC和EOTC的转化，使得体系中EOTC和脱甲基OTC丰度降低。
图 1 TP447的色谱和质谱图
Figure 1. Extracted ion chromatograms and mass spectrum of TP447
图 2 TP461的色谱和质谱图
Figure 2. Extracted ion chromatograms and mass spectrum of TP461
表 1 OTC及其推定代谢产物的相对丰度
Table 1. Relative abundance of OTC and the putative degradation products
可能的化合物 保留时间/min 分子式 相对丰度 阳性对照 降解菌处理 OTC 5.434 C22H24N2O9 13.872 7.254 EOTC 4.893 C22H24N2O9 20.931 5.231 ISO-OTC 6.550 C22H24N2O9 2.727 3.157 脱甲基OTC 7.279 C21H22N2O9 37.278 4.142 -
图3显示：72 h的培养期内，枯草芽孢杆菌在各处理中均有不同程度的生长，随时间推移细胞数量逐渐增加。具体来看，ckB处理下枯草芽孢杆菌生长良好，不同培养时间下细胞的吸光度[D(600)]始终最大，培养72 h时达2.563。相比之下，ckA处理72 h时D(600)仅0.334，表明受试细菌的生长受到明显抑制，极显著低于T1处理[D(600)=2.336]和ckB(P＜0.01)。同时T2处理下吸光度一直处于较低水平[D(600)=0.424，72 h]，与T1差异极显著(P＜0.01)。提示OTC的自然水解过程并不能明显降低液体中OTC及其水解产物的毒性，降解菌ZAF-05能有效分解OTC，降低OTC及中间代谢产物的毒性；T1处理下细菌细胞数量与ckB最为接近，说明降解菌减轻了OTC及中间代谢产物对枯草芽孢杆菌生长的不利影响。
图 3 不同处理对枯草芽孢杆菌生长的影响
Figure 3. Effects of different treatments on growth of B. subtilis
OTC的降解产物对大肠埃希菌生长的影响呈现出与枯草芽孢杆菌一致的态势(图4)。T2处理下，大肠埃希菌生长受阻，72 h培养期内，与ckA处理差异均不显著，说明OTC自然水解的解毒作用甚微。T1处理下，整个培养期内大肠埃希菌细胞数量始终处于较高水平，仅次于ckB，培养后期(48~72 h)甚至超过后者，推测可能是经ZAF-05降解后，OTC中间代谢产物为细菌生长提供了额外的碳源。
图 4 不同处理对大肠埃希菌生长的影响
Figure 4. Effects of different treatments on growth of E. coli
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从图5可以看出：斜生栅藻在4个不同处理中的长势不同，ckB处理下供试藻生长良好[D(680)＝1.064，96 h]，而ckA中培养96 h后斜生栅藻吸光度[D(680)]仅0.028，表明OTC抑制斜生栅藻生长，生理毒性较强。T1处理下，斜生栅藻细胞数量与ckB无显著差异，远高于T2和ckA，说明降解菌株ZAF-05有效缓解了OTC对斜生栅藻的生物毒害。培养0~48 h，T2处理的吸光度与ckA比较差异不明显，尽管48 h后有所增加但远不及T1，说明OTC能发生自然水解，但解毒作用有限。
图 5 不同处理对斜生栅藻生长的影响
Figure 5. Effects of different treatments on growth of S. obliquus
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从图6可以看出：ckB处理下斜生栅藻叶绿素质量浓度为2.126 mg·L−1，ckA为0.193 mg·L−1。可见，OTC的存在大大降低了藻的叶绿素质量浓度。与ckA相比，T1处理一定程度上缓解了叶绿素的减少(0.555 mg·L−1)，但仍极显著低于ckB (P＜0.01)。结合图5认为：尽管T1与ckB的藻类细胞数量相差不大，但其叶绿素质量浓度却显著降低，说明尽管降解菌ZAF-05能高效降解OTC，但短期(96 h)内，仍不能完全转化毒性物质，培养体系中残留的毒性可能会影响斜生栅藻的叶绿素合成。
图 6 不同处理对斜生栅藻叶绿素的影响
Figure 6. Effects of different treatments on chlorophyll content of S. obliquus
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将斜生栅藻置于电镜下放大12 000倍观察细胞超微结构，由图7可见：ckB处理下斜生栅藻细胞截面为典型的椭圆形，细胞壁边缘整齐，细胞器界限清晰，叶绿体数量多，几乎布满整个细胞，平行排列的类囊体整齐地堆叠在叶绿体内。在叶绿体片层间的基质中可见电子密度较大的淀粉粒，淀粉粒数目较多(图7A)。相比之下ckA(图7B)和T2处理(图C)中的细胞壁边缘不整齐，略有缺刻，叶绿体数量少，且结构松散甚至破裂变形。叶绿体中基粒类囊体片层结构减少，形态模糊不清，且排列无序无方向。T1处理下(图7D)，斜生栅藻细胞叶绿体少于ckB，但结构仍然完整，整齐地分布在细胞壁周围，类囊体的片层结构清晰可见且平行排列整齐，细胞结构完整无明显损伤。以上结果证明：与T2和ckA相比，T1处理对斜生栅藻的亚细胞结构影响更小，再次证明降解菌ZAF-05能够有效降解并降低OTC的生物毒性。
图 7 不同处理下斜生栅藻的亚细胞形态
Figure 7. Effects of different treatments on chlorophyll content of S. obliquus
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A. nicotianae ZAF-05是实验室前期分离获得的1株OTC高效降解菌，该菌株不仅能良好降解OTC，还对四环素和金霉素具有一定的去除能力，具有广泛的应用潜力。有些环境残留抗生素在消解时可能会被转化成毒性更高的中间代谢产物。如LI等[21]发现：经臭氧处理5~30 min后OTC大量分解，但产生的代谢产物比OTC的生物毒性更高，其生态危害也更大。因此明确降解菌株的代谢产物生物毒性是菌株能实际发挥作用的前提和保障。本研究采用HPLC-Q-TOF-MS技术解析了OTC的降解产物，最终获得脱甲基OTC、EOTC和ISO-OTC 3种代谢中间产物，其中脱甲基OTC和EOTC为自然水解产物，在降解菌体系和对照中均有出现，但对照中相对丰度远高于降解菌处理体系。研究[22-23]表明：四环素类抗生素的差向异构体，往往具有比母体化合物更高的毒性，而OTC水解形成的ISO-OTC毒性却较OTC及其衍生物(如EOTC)要小得多[23]。本研究中，对照中EOTC相对丰度为降解菌体系的4倍，而ISO-OTC在降解菌体系的相对丰度略高于对照，因此推测A. nicotianae ZAF-05促进了OTC及其高毒代谢产物EOTC向低毒物质(如ISO-OTC)的转化，降低了体系生物毒性。
本研究以大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和模式藻斜生栅藻为靶标生物，考察了OTC及其降解产物对供试细菌和藻类的影响。结果表明：OTC不仅抑制细菌和供试藻增殖，还导致藻细胞变形，引起叶绿体片层结构破裂，与同属四环素族的金霉素的细胞毒性表现一致[24]。OTC被降解后，细菌和藻细胞生长的抑制作用减轻，藻叶绿素合成和叶绿体超微结构的伤害作用缓解。说明降解菌ZAF-05促进体系中OTC及其高毒代谢产物EOTC向低毒物质转化，从而降低了生物毒性。
叶绿体是藻进行光合作用的重要细胞器，内部密布排列整齐的基粒内囊体，基粒内囊体既是叶绿素也是光合系统存在的场所，光合作用过程中的光反应在此进行[25-26]，因此基粒类囊体结构的完整性和有序性是叶绿体进行正常、高效的光能转换的首要前提，对于保障光合作用的顺利进行具有重要意义。本研究中OTC的存在破坏了藻细胞叶绿体中基粒内囊体片层结构的完整，影响了光合作用。这可能是OTC导致藻细胞数量减少的一个重要原因。而添加菌株ZAF-05后，藻内叶绿体仍整齐地分布在细胞壁周围，类囊体片层结构清晰可见且平行排列整齐，细胞结构完整无明显损伤，再一次证实，ZAF-05的降解作用能降低OTC的生物毒性，提高其生态安全性。
Reduction of toxicity of oxytetracycline by highly efficient degrading bacterium Arthrobacter nicotianae ZAF-05
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摘要:
目的 明确1株土霉素(oxytetracycline, OTC)高效降解菌降低OTC生物毒性的效应，为菌株的实际应用提供初步理论依据。 方法 以前期获得的OTC高效降解菌Arthrobacter nicotianae ZAF-05为对象，利用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(HPLC-Q-TOF-MS)分析了OTC的降解产物。以对OTC敏感的大肠埃希菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和斜生栅藻Scenedesmus obliquus作为指示生物，评估OTC降解产物的生物毒性。 结果 HPLC-Q-TOF-MS分析发现：经菌株ZAF-05作用后，体系中的高毒性OTC以及其自然水解产物差向异构土霉素(EOTC)含量显著降低，而低毒性的同分异构土霉素(ISO-OTC)含量略有上升。供试细菌和藻类在添加ZAF-05菌株的OTC体系中的生长情况明显好于OTC自然水解的处理和未添加降解菌的阴性对照，且差异极显著(P＜0.01)。与原药和自然水解物相比，经过ZAF-05菌株降解的OTC代谢产物生物毒性大大降低。菌株的降解作用缓解了OTC对斜生栅藻细胞超微结构的伤害，细胞叶绿体及细胞壁受损减轻。 结论 降解菌ZAF-05能降低OTC残留的环境生物毒性，而毒性的降低可能与体系中高毒性物质被转化成无毒或低毒的代谢产物有关。图7表1参26 Abstract:Objective The objective is to determine the effect of a degrading bacterium which can effectively reduce the bio-toxicity of oxytetracycline (OTC) metabolites, so as to provide a preliminary theoretical basis for practical application of the strain. Method Taking Arthrobacter nicotianae ZAF-05, an efficient OTC-degrading bacterium obtained in the previous studies, as the object, the degradation products of OTC were analyzed by high-performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (HPLC-Q-TOF-MS). OTC sensitive Escherichia coli, Bacillus subtilis, and Scenedesmus obliquus were used as indicators to evaluate the bio-toxicity of degradation products. Result HPLC-Q-TOF-MS analysis showed that the content of highly toxic OTC and its natural hydrolysate epioxytetracycline(EOTC) decreased significantly after treatment with strain ZAF-05, while the content of low toxic isomeric oxytetracyline(ISO-OTC) increased slightly. The growth of tested bacteria and alga in OTC system treated by strain ZAF-05 was significantly better than that in OTC natural hydrolysis treatment and negative control without degrading bacteria, and the difference was significant (P＜0.01). The results indicated that the bio-toxicity of OTC metabolites degraded by strain ZAF-05 was greatly reduced compared with the active drug and its natural hydrolysates. Besides, the degradation effect of the strain alleviated the damage of OTC to the ultrastructure of algal cells, as well as the damage to chloroplasts and cell walls. Conclusion Degrading bacterium ZAF-05 can reduce bio-toxicity of OTC residues, which may be related to the conversion of highly toxic substances into non-toxic or low-toxic metabolites in the system. [Ch, 7 fig. 1 tab. 26 ref.] -
Key words:
- oxytetracycline /
- degrading bacterium /
- degradation products /
- algae /
- bio-toxicity
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近年来，国内绿道建设发展迅猛。目前，已有广东、浙江、河北、江苏、四川、福建、安徽、新疆等省(自治区)的众多城市开展了绿道网规划和建设工作。绿道网的规划建设行动源于对日趋严峻的城乡环境问题和对传统生态绿色空间保护政策实效的主动反思和应对，然而，在部分地区绿道建设的快速推进中也出现了绿道生态性不足，存在功能单一、基础设施缺乏、绿道特色欠缺等问题[1]。当前，亟需对已建成的绿道价值进行评价与分析，以便清晰地呈现绿道建设的综合效益，为科学规划和建设绿道提供参考和依据。国内对于绿道评价体系的研究已有一定积累，但多为对绿道某一方面的性质或功能评价，对于绿道服务价值全面系统的评价较少。研究主要集中在2个方面：一为景观资源评价，包括植物景观评价[2]和景观视觉评价等[3]；二是功能评价，包括生态效益评价[4-5]、休闲游憩功能评价[6]、生态系统服务功能评价[7]、使用后评价(POE)[8-9]和社会绩效评价[10]。此外，也有学者提出了以“使用者(人)—绿道(环境)”关系为中心的区域绿道网评价体系研究假设以及研究思路，但未进行实证研究[11]。“景观绩效”是“衡量景观解决方案在实现其预设目标的同时满足可持续性方面效率的指标”[12]，即基于可持续发展目标，从环境、经济、社会等3个方面对景观进行全面的绩效评价。其评价以生态系统服务为基础，补充适合景观研究内容的评价指标[13]，因此更具有针对性。美国景观设计基金会(Landscape Architecture Foundation，简称 LAF)于 2010 年提出“景观绩效系列”(Landscape Performance Series，简称 LPS)研究计划，针对已建成的景观项目，形成一套依托案例调查研究(case study investigation, CSI)的开放性评价体系。当前，景观绩效研究呈现迅速增长的发展态势[13]，其研究主要集中于评价指标的选取[14]、评价体系的构建[15-16]和评估方法的应用[17]等方面。国内景观绩效的研究多集中于较小尺度风景园林的建成项目[18-19]，或景观绩效中某些可持续特征的部分[13,20]，缺少对大尺度区域景观的研究，对建成项目从环境、经济、社会等3个方面进行全面评价的研究也较少。为此，笔者依托案例研究，尝试对浙江青山湖国家森林公园环湖绿道1期的景观绩效进行评价，以期全面评估绿道的综合价值，为绿道的设计与建设提供参考，并向社会传播绿道的综合价值。
1. 研究地概况与研究方法
1.1 研究地概况
浙江省杭州市临安区青山湖国家森林公园环湖绿道(简称“青山湖绿道”)1期，曾入选2017年“浙江省十大经典绿道”，并获2018年浙江建设工程“钱江杯”一等奖，2019年度中国风景园林学会科学技术奖一等奖。青山湖绿道位于杭州市临安区锦城镇东郊。青山湖为大型人工湖，水域开阔，湖山一体，环湖森林覆盖率79%，自然景色优美，生态环境优越。青山湖绿道沿湖而建，连接城、村、湖、山，全长42.195 km，分3期建设，于2019年7月全线贯通。本研究区段为青山湖绿道1期，长10 km，于2017年1月建成开放。
1.2 评价方法
根据中国住房与城乡建设部2016年9月编制的《绿道规划设计导则》(简称《导则》)，郊野型绿道的功能包括生态环保、休闲健身、社会与文化、旅游与经济[21]。其中，生态环保作为其核心价值，体现在绿道有助于固土保水、净化空气、缓解热岛等，并为生物提供栖息地及迁徙廊道。以上功能与LPS中游径(trail，包含绿道类项目)[22]、滨水景观再开发(waterfront redevelopment)[23]等相关案例中所采用的评价指标(表1)高度吻合。另外，LPS基于可持续的发展目标，其经济评价指标还加入了节约建设成本。基于以上分析，结合青山湖绿道的实际情况，确定了本研究采用的景观绩效指标体系，包含环境、经济、社会等3个方面的17项指标(表2)。收集分析以上绩效数据，结合统计学、生态学、经济学、使用后评价等方法，进行景观绩效评价。
表 1 郊野型绿道的功能与LPS相关案例评价指标的对照表Table 1 Comparison between the function of country greenways and the evaluation indexes of LPS-related cases《绿道规划设计导则》中的郊野绿道功能 LPS相关案例采用的评价指标 生态环保 固土保水、净化空气、缓解热岛、生物提供栖息地及
迁徙廊道环境 土壤保护、水岸线保护、涵养水源、固碳释氧、空
气质量、调节气温和城市热岛效应、栖息地改善/
保护/创建/恢复旅游与经济 整合旅游资源，促进相关产业发展，提升沿线土地价值 经济 地产价值、工作岗位、旅游业收入、节约建设成本 休闲健身 提供亲近自然、游憩健身的场所和途径，倡导健康的生
活方式社会 娱乐及社会价值、文化保护、健康、教育、可达
性、景观质量社会与文化 连接城乡居民点、公共空间以及历史文化节点，保护和
利用文化遗产，促进人际交往、社会和谐与文化传承表 2 郊野型滨水绿道景观绩效指标体系Table 2 Country waterfront greenway landscape performance indicators system环境绩效 经济绩效 社会绩效 土壤保护 房产价值 文化保护 水岸线保护 工作岗位 健康 涵养水源 旅游业收入 教育价值 固碳释氧 节约建设成本 可达性 调节气温 娱乐及社会价值 景观质量 净化空气 增加物种多样性、
提高生态完整性等1.2.1 环境绩效评价方法
在LPS的案例中，环境绩效的评价多通过相应的绩效评估工具集进行计算，但由于本研究场地尺度较大，利用工具集评估所需的部分数据获取较为困难，故本研究的环境绩效评价，主要参考了欧阳志云等[24]对中国陆地生态系统服务功能进行评估时所综合运用的生态学及经济学方法。吴隽宇[8]曾采用此方法对珠江三角洲区域绿道1号线进行评估。首先确定绿道线路、类型和控制范围，再对其相应的生态系统面积进行计算。研究采用的绿道图纸由绿道的设计单位提供。《浙江省绿道规划设计技术导则》[25]规定，根据绿道所处区域和功能要求，分为城镇型绿道、乡野型绿道、山地型绿道3种类型。其中，乡野型绿道是指城镇规划建设用地范围外，依托林地、园地、湿地、水体、农田，连接风景名胜区、旅游度假区、历史文化名镇名村、农业观光区、特色乡村、农家乐等的绿道。乡野型绿道的总宽度一般不小于100 m。青山湖绿道依托青山湖国家森林公园，一面临水，一面靠山，属于该导则中的乡野型绿道。本研究将100 m作为其控制范围的宽度。以青山湖绿道1期的总体平面图为基本研究范围，将卫星图片导入Auto CAD软件，依据其控制范围的宽度，描绘其具体范围。再根据卫星图片及实地踏勘，确定绿道沿线生态系统的类型，主要包括林地、耕地、草地、湿地、水域等5种类型。根据设计单位提供的信息，在Auto CAD软件中分层描绘，并统计新增及因绿道建设而被保护的各类型生态系统的面积。在此基础上，分别计算其保持土壤、涵养水源、固碳释氧、调节气温、净化空气等方面的环境绩效。
1.2.2 经济绩效评价方法
经济绩效的评估采用市场价值法。工作岗位数据源自现场调研，旅游业收入的数据来自于对绿道周边乡村村委会的调研，节约建设成本的数据由绿道设计单位提供。
1.2.3 社会绩效评价方法
社会绩效的评估主要采用使用后评价、问卷调查等方法。在2017年3−5月、11月、2018年4月，本研究对583位场地使用者进行了现场问卷调查，其中有效问卷531份，问卷有效率91%。问卷内容根据社会绩效的相应指标设置，包括受访者对绿道的娱乐价值、文化保护、教育价值、景观质量评价，以及绿道对受访者健康的影响。
2. 结果与分析
2.1 环境绩效评价
根据彭建等[26]的经验，生态系统面积为有效林地、草地、湿地沼泽和水域面积的和，其中有效林地面积=林地面积+耕地面积×0.2(表3)。
表 3 青山湖绿道1期生态系统面积Table 3 Ecosystem area of Qingshan Lake Greenway Phase I有效林地/hm2 草地/hm2 湿地沼泽/hm2 水域/hm2 生态系统面积/hm2 针叶林 阔叶林 耕地(按0.2系数折算成林地) 1.670 13.692 0.896 7.198 17.250 0.134 40.840 2.1.1 保持土壤效益
保持土壤带来的经济价值，以林地、草地每年减少土壤侵蚀的总量为基础，计算林地、草地对表土损失、肥力损失和减轻泥沙淤积灾害3个方面的价值。(1)林地、草地每年减少的土壤侵蚀总量。潜在土壤侵蚀量是指无任何植被覆盖的情况下，土壤的最大侵蚀量。而不同植被覆盖下的土壤侵蚀量有很大差别。林地、草地减少的土壤侵蚀量=潜在土壤侵蚀量−林地、草地覆盖区土壤侵蚀量。本研究参考欧阳志云等[24]统计的侵蚀模数进行计算(表4~6)。(2)效益估算。①每年减少的土地损失面积及间接价值。根据土壤侵蚀量和土壤耕作层的平均厚度来推算土地损失面积。每年减少的土壤损失量按表5的平均值计，土壤密度以1.3 g·cm−3计，先算出每年减少的土壤损失量对应的体积。将中国耕作土壤的平均厚度0.5 m作为林地、草地的土层厚度[16]，进而算出每年林地、草地减少的土地损失面积分别为0.798、0.353 hm2·a−1。单位面积的生产收益根据2014年浙江省林业、牧业生产的平均收益2 224.8和1 489.7元·hm−2·a−1计算，则每年减少的林地、草地损失的经济价值分别为1 094、2 620元·a−1。②减少土壤肥力损失的间接效益。土壤侵蚀带走了大量的土壤营养物质，主要是土壤有机质、氮、磷、钾。根据实地调查，绿道所在区域土壤主要为红黄泥土，按照临安农林信息网[27]中红黄泥土的有机质、氮、磷、钾质量分数为标准，结合每年林地、草地分别减少的土壤损失平均值，估算林地、草地每年减少的有机质、氮、磷、钾元素的损失量分别为195.10 t·a−1、9.21 t·a−1、51.51 kg·a−1、1 075.05 kg·a−1。根据浙江价格网的公示，2018年第3季度浙江省化肥市场价格的平均值约2.52元·kg−1，据此可以估算林地、草地每年减少的土壤氮、磷、钾损失的经济价值为26 044元·a−1。③减少泥沙淤积的经济效益。根据中国主要流域的泥沙运动规律，一般土壤侵蚀流失的泥沙有24%淤积于水库、江河、湖泊，另有33%滞留，37%入海[28]。本研究仅考虑淤积于水库、江河、湖泊的24%，这部分泥沙直接造成蓄水量的下降。按林地、草地每年减少的土壤损失量平均值计算蓄水损失量，再根据蓄水成本计算其价值。按水库建设需投入成本5.714元·m−3计[29]，减少泥沙淤积的经济价值为7 897元·a−1。
表 4 每年林地草地的潜在土壤侵蚀量Table 4 Annual potential soil erosion of woodland and grassland侵蚀模数/(t·hm−2·a−1) 林地 草地 总潜在侵蚀量/(t·a−1) 面积/hm2 潜在侵蚀量/
(t·a−1)面积/hm2 潜在侵蚀量/
(t·hm−2·a−1)最低值 192.0 16.258 3 121.536 7.198 1 382.016 4 503.552 最高值 447.7 7 278.707 3 222.545 10 501.251 平均值 319.8 5 199.308 2 301.920 7 501.229 表 5 每年林地草地覆盖区的土壤侵蚀量Table 5 Annual soil erosion of woodland and grassland林地 草地 总侵蚀量/(t·a−1) 侵蚀模数/(t·hm−2·a−1) 面积/hm2 侵蚀量/(t·a−1) 侵蚀模数/(t·hm−2·a−1) 面积/hm2 侵蚀量/(t·a−1) 0.630 16.258 10.243 0.500 7.198 4.535 14.777 表 6 每年林地草地减少的土壤损失量Table 6 Annual reduction in soil loss of woodland and grassland林地减少的土壤损失量/(t·a−1) 草地减少的土壤损失量/(t·a−1) 总减少土壤损失量/(t·a−1) 最低值 3 111.293 最低值 1 377.481 4 488.775 最高值 7 268.464 最高值 3 218.010 10 486.474 平均值 5 189.066 平均值 2 297.386 7 486.452 综合以上，青山湖绿道1期每年保持土壤的总经济价值包括减少土壤损失面积的经济价值3 714元·a−1，减少土壤氮磷钾损失的经济价值26 044元·a−1，减少泥沙淤积的经济价值为7 897元·a−1，合计37 655元·a−1。
2.1.2 涵养水源效益
本研究采用替代工程法评估涵养水源的价值。根据浙江省杭州市临安区气象局的数据，临安多年年均降水量为1 506.0 mm。参考陈波等[30]对杭州西湖风景区绿地储水保土研究，假设降水的蒸散量为65%，则青山湖绿道1期每年截留水量为1 506.0 mm×35%×23.45 hm2=123 636.58 m3。单位库容的水库工程费用仍以5.714元·m−3计，则每年涵养水源价值为70.65万元·a−1。
2.1.3 固碳释氧效益
参考孙燕飞[31]在临安的研究，杉木Cunninghamia Lanceolata林的固碳量为2.44 t·hm−2·a−1，释氧量为6.52 t·hm−2·a−1；针阔混交林的固碳量为2.16 t·hm−2·a−1，释氧量为5.76 t·hm−2·a−1。根据温家石[32]对城市建成区所做研究，考虑到绿道的草坪修剪次数远低于城市内部，假设绿道的草坪修剪次数是后者的1/4，得出绿道草地固碳量6.68 t·hm−2·a−1，草地释氧量为11.55 t·hm−2·a−1。对于生态系统二氧化碳吸收功能经济价值的评估多采用碳税法和造林成本法[33]，并取两者的平均值。国际上通常采用瑞典碳税，折合人民币1 010元·t−1，中国造林成本折合为255元·t−1[34]。对于释放氧气的价值采用工业制氧法进行评估，中国工业制氧的平均成本为400元·t−1。经计算可得青山湖绿道1期每年固碳价值为5.17万元·a−1元，释放氧气价值为6.92万元·a−1。
2.1.4 调节气温效益
根据已有研究测定[35]，夏季绿地可从环境中吸收81.8 MJ·hm−2·d−1的热量，相当于189台空调机全天工作的制冷效果。室内空调机耗电0.86 kWh·h−1·台−1，电费按浙江省电费价格0.538元·kWh−1计，则绿地节约电费为2 098.7元·hm−2·d−1。按每年使用空调60 d计，则青山湖绿道1期每年调节气温所创造的价值为295.29万元·a−1。
2.1.5 净化空气效益
(1)吸收二氧化硫的价值。阔叶林对二氧化硫的吸收能力为88.65 kg·hm−2·a−1，针叶林对二氧化硫的平均吸收能力值为215.60 kg·hm−2·a−1，两者对二氧化硫的平均吸收能力为152.13 kg·hm−2·a−1，二氧化硫的治理代价为3 000元·t−1，得到吸收二氧化硫价值为0.74万元·a−1。(2)吸收氮氧化物的价值。目前，汽车尾气脱氮治理的代价是1.6万元·t−1。林地可吸收氮氧化物380 kg·hm−2·a−1，得到吸收氮氧化物价值为9.88万元·a−1。(3)滞尘价值。针叶林的滞尘能力为33.20 t·hm−2·a−1，阔叶林的滞尘能力为10.11 t·hm−2·a−1，平均为21.67 t·hm−2·a−1。削减粉尘价格为170元·t−1，则其滞尘价值为5.99万元·a−1。因此，绿道净化空气的总价值为16.61万元·a−1。
2.2 经济绩效评估
2.2.1 房产价值
绿道的建设，极大地改善了周边居民的生活环境。根据安居客网站的数据，绿道建设前的2015年11月与竣工投入使用后的2018年12月相比，紧邻绿道的房产单价增幅约27.76%，可见绿道对于房产价值提升有积极影响。
2.2.2 工作岗位和旅游业收入
绿道建成后为管理维护提供了20个就业岗位，为带动旅游业发展而提供了37个就业岗位。绿道建成后对周边如泥山湾村等乡村的农家乐、民宿等有显著促进作用。据不完全统计，该区域旅游产值增幅超过20.00%。
2.2.3 节约建设成本
回收利用场地遗留的废旧材料，如红砖、青砖、石等，节约了废旧材料外运与处理费用，以及购买等量新材料的材料费和运输费用，节约成本为23.33万元(表7)。利用原有水利废弃设施等构筑物而产生的节约费用，包括拆除、清运、处理费用，及新建相应设施的费用，合计66.75万元(表8)。
表 7 利用废旧建材产生的节约建设成本Table 7 Construction costs savings from the use of waste building materials废旧材料 工程量/ m3 外运处理总价/元 新材料单价(含材料费、运费)/元 新材料总价/元 合计节约建设成本/元 砖 4.4 132 730 3 212 3 344 卵石 16.3 489 330 5 379 5 868 景观石 233.4 2 334 810 189 054 191 388 老石板 54.0 162 603 32 562 32 724 合计 233 324 表 8 利用原有构筑物产生的节约建设成本Table 8 Construction costs savings from the use of existing structures构筑物名称 工程量/ m3 拆除、清运、处理费用/元 新建栈道基础费用/元 合计节约建设成本/元 钓鱼台 63 15 750 31 500 47 250 观星台 675 168 750 337 500 506 250 “鱼头”小品 51 12 750 25 500 38 250 青风徐来亭 101 25 250 50 500 75 750 合计 667 500 2.3 社会绩效评价
根据问卷调查统计结果，青山湖绿道在1期自开放以来，已吸引大量长期使用者，首次来绿道的人群比例较低；绿道的使用者主要来自临安本地，尽管绿道距离杭州主城区有36 km，依然吸引了不少来自杭州的游人。表9记述了社会绩效调查的结果。多数使用者认为绿道建设提升了城市形象，绿道设计体现了临安的历史文化。82.7%的受访者对绿道的骑行或步行体验表示满意。多数受访者认为绿道提升了其户外活动的参与度，近半数使用者表示绿道改变了其生活方式。在可达性方面，公共交通的可达性较差，间接导致了选择私家车出行的游人增多，在节假日游客高峰时期，交通及停车问题较为突出。10.0%的受访者表示绿道当前最突出的问题即到达绿道的路线不畅通。增设绿道附近的公交站点，是增强其可达性及缓解交通与停车压力的有效方式。作为郊野型绿道，青山湖绿道吸引游客的主要因素是其自然环境优美，而绿道设计中对于乡土材料的应用也受到了使用者的关注，57.0%的受访者表示对于可持续设计有了更深的了解。
表 9 青山湖绿道1期的景观绩效评价结果Table 9 Landscape performance evaluation results of Qingshan Lake Greenway Phase I类别 项目 指标 评价结果 环境
绩效土地 土壤保护 经济价值为3.8万元 水岸线保护 未进行评估 水 涵养水源 经济价值为70.65万元 碳及空
气质量固碳释氧 固碳价值为5.17万元，释氧价值为6.92万元 调节气温 经济价值为295.29万元 净化空气 经济价值为16.61万元 栖息地 增加物种多样性、提高
生态完整性等未进行评估 经济
绩效房产价值 绿道建设后，紧邻绿道的房产单价增幅约27.76% 工作岗位 绿道建成后管理维护提供了57个就业岗位 旅游业收入 绿道拉动了地方旅游业的发展，旅游产值增幅超过20.00% 节约建设成本 利用废旧建材节约23.33万元，利用原有构筑物设节约66.75万元 社会
绩效娱乐及社会价值 531名受访者中有82.7%对绿道骑行或步行的体验是满意的，67.0%的受访者认为绿道建设提升了城市形象，有组织的大型徒步、毅行、马拉松活动达到近1.5万余人次 文化保护 73.4%的受访者表示绿道设计体现了临安的历史文化 健康 65%的受访者表示绿道提升了其户外活动的参与度，68%的受访者来绿道活动的目的是散 步，25%选择了旅游观光，17%选择了骑行，10%选择聚会；43%的受访者表示绿道改变 了其生活方式，骑行、散步、聚会、摄影、钓鱼等活动对其生活产生了积极影响； 82%的受访者表示愿意居住在步行可达的范围内 教育价值 9%的受访者表示来此地是为了研究学习，57%的受访者表示对于可持续设计有了更深 的了解 可达性 38%的受访者开私家车到达绿道，其次为步行占30%，骑自行车或电动自行车前来的 占20%，采用公交交通者仅占11% 景观质量 82%的受访者表示由于绿道自然环境优美而选择来此 3. 结论
在环境绩效评价中，青山湖绿道1期的相应经济价值约398.44万元·a−1，其中调节气温价值为295.29万元·a−1，占总价值的74%，其次为涵养水源价值为70.65万元·a−1，占总价值的18%，净化空气价值为16.61万元·a−1，固碳释氧价值为12.09万元·a−1，保持土壤的经济价值较低，为3.80万元·a−1。
在经济绩效评价中，青山湖绿道1期充分利用废旧建材与原有构筑物，节约建设成本约90.08万元；绿道建成后提供了新的工作岗位，拉动了当地旅游业发展。
在社会绩效评价中，绿道的建设提升了城市形象，体现了临安的历史文化，提升了人们的户外活动参与度，在一定程度上改变了人们的生活方式，大多数人因自然环境优美而来到绿道，超半数受访者表示对可持续设计有了更深的了解。
本研究的郊野型滨水绿道景观绩效进行了较为全面的评价，客观、清晰地呈现了绿道建设的综合效益。青山湖绿道1期的建设投入约7 200万元，仅以环境绩效价值398.44万元·a−1计算，约18 a可获得与建设投入相当的经济价值，而其对于地区发展和市民健康的促进也将产生更大的价值。对于场地中废旧建材与原有构筑物进行充分利用，能够创造较大的经济价值。
景观绩效评价可以更全面地考察、直观地展现绿道建成的综合价值，但因绿道的规模尺度较大，沿线的自然、人文资源类型丰富，需要在绿道建设前，即结合评价指标体系进行全面的数据收集，且此过程需要延续至项目建成后的数年，才能够得到更客观且全面的评价结果。本研究也存在一定局限，其中水岸线保护、栖息地恢复等指标由于原始数据缺失而无法获取；经济绩效中，房产价值的增长未排除绿道之外的其他要素影响比例；针对健康等方面的评价可在对使用者进行问卷调查的基础上，采用更完善的研究方法，以获得更客观、准确的结果。
4. 致谢
浙江农林大学风景园林与建筑学院史琰副教授对本文写作提供帮助，谨致谢意。
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图 3 不同处理对枯草芽孢杆菌生长的影响
Figure 3 Effects of different treatments on growth of B. subtilis
图 6 不同处理对斜生栅藻叶绿素的影响
Figure 6 Effects of different treatments on chlorophyll content of S. obliquus
图 7 不同处理下斜生栅藻的亚细胞形态
Figure 7 Effects of different treatments on chlorophyll content of S. obliquus
表 1 OTC及其推定代谢产物的相对丰度
Table 1. Relative abundance of OTC and the putative degradation products
可能的化合物 保留时间/min 分子式 相对丰度 阳性对照 降解菌处理 OTC 5.434 C22H24N2O9 13.872 7.254 EOTC 4.893 C22H24N2O9 20.931 5.231 ISO-OTC 6.550 C22H24N2O9 2.727 3.157 脱甲基OTC 7.279 C21H22N2O9 37.278 4.142 
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