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近年来,随着生猪养殖业的飞速发展,规模猪场普遍采用生化处理模式[1-2]对养殖污水处理后进行排放,但由于受处理工艺稳定性及其他因素的影响,大量排放的污水达标与否成为突出问题[3-4]。因此,提出合理、快速的水质评价方法用于污水实时监管十分必要。现有的水质评价研究主要是针对地下水及河流湖泊等地表水[5-7]。在单因子评价法的研究中,超标最严重的指标往往被简单地视作整体水质的决定性因素,而其他指标所产生的综合影响则被忽视,导致评价结果不准确。模糊综合评价法常用于地下水的评价,方运海等[8]引入相对隶属度概念建立起模糊综合优化模型评价地下水水质,并证明了模型的可靠性,但该方法仍存在隶属函数判定区间不精确、水质评价结果表达方式单一等问题。BP人工神经网络法在自学习以及自适应功能方面优势显著,有利于将各水质指标与水质整体等级更好地拟合,被广泛应用于水质评价[9-10],孔刚等[11]通过BP神经网络法对浅层地下水水质进行综合评级,在减小了人为影响因素的同时,得到更加贴近客观实际的水质评价结果,但因其对样本依赖性过强而具有局限性。与以上方法相比,水质指数(water quality index,WQI)方法能够结合多个环境参数并将其有效地转换为反映水质状况的单个值,被广泛用于地下水和地表水的水质评价[12-13],在水资源管理中起着越来越重要的作用。KAMRAN等[14]对河流水采用主成分分析法提取主要指标后,再结合WQI方法对河流水质进行准确评价。目前,规模猪场针对生化处理后的养殖污水水质评价仅以GB 18596—2001《畜禽养殖业污染物排放标准》中的各指标限值作为依据,评价结果具有一定的单一性和片面性。本研究以一家采用SFAO4(step-feed four-stage micro aeration units)微氧曝气工艺的规模猪场处理后的养殖污水为研究对象,在分析其水质特征的基础上,构建了基于关键水质指标和WQI的生猪养殖污水水质评价模型,以期为生化处理后的生猪养殖污水提供准确和快速的评价方法。
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本研究自2018年秋至2020年秋对浙北一家规模猪场处理后的养殖污水进行随机采样,累计样本81组,其中春、夏、秋、冬分别采样20、19、24和18组。
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以GB 18596—2001《畜禽养殖业污染物排放标准》中规定的指标和现有规模猪场中常规监测的水质指标为依据,本研究选取了氨氮(NH3-N)、总磷(TP)、总氮(TN)、化学需氧量(COD)、酸碱度(pH)和电导率(EC)共6个指标对生猪养殖污水水质进行评价。
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为避免水质评价的片面性和单一性,初始水质指数(WQI)的计算选取了评价生猪养殖污水水质常用的NH3-N、COD、TN、TP、pH共5个指标,计算方法如式(1)所示。根据每个指标对水质的影响程度及相对重要性,为其分配权重[15-17],同时对其进行标准化以消除变量的不同量纲和不同数量级对评价结果的影响(表1)。
表 1 各指标权重和标准化值
Table 1. Weights and standardized values of water quality indexes
标准化值 pH TN/
(mg·L−1)NH3-N/
(mg·L−1)TP/
(mg·L−1)COD/
(mg·L−1)100 6~9 <50 <4 <0.5 <20 90 50~70 4~6 0.5~1.0 20~40 80 70~90 6~8 1.0~2.0 40~60 70 90~110 8~20 2.0~3.0 60~100 60 110~130 20~40 3.0~6.0 100~200 50 130~150 40~80 6.0~9.0 200~400 40 150~170 80~120 9.0~12.0 400~600 30 170~190 120~160 12.0~15.0 600~800 20 190~210 160~200 15.0~18.0 800~1 000 10 210~230 200~240 18.0~21.0 1 000~1 200 0 <6、>9 >230 >240 >21.0 >1 200 权重 1 3 3 1 4 $$I_{{\rm{WQ}}} = \frac{{\displaystyle\sum\limits_{i = 1}^{n} {({C_i} {P_i})} }}{{\displaystyle\sum\limits_{i = 1}^{n} {{P_i}} }}{\text{。}}$$ (1) 式(1)中:n为指标总数,Ci和Pi分别为指标i的标准化值与权重。IWQ为水质指数,取值范围为[0, 100],根据水质指数把水质等级划分为:很好(90, 100]、好(70, 90]、一般(50, 70]、差(30, 50]、很差[0, 30]。在保证水质评价合理的同时,为了缩减评价指标以提高评价速度,本研究采用逐步回归分析法筛选影响生猪养殖污水水质的关键指标,并引入了加权和非加权最小水质指数模型[18],分别表示为WQImin-w和WQImin-nw。
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从表2可以看出:部分样本的TN质量浓度偏高,最大质量浓度为183.00 mg·L−1;NH3-N、COD和TP的平均质量浓度分别为6.36、40.79和2.40 mg·L−1,均远低于限值,且标准差相对较小;pH均在正常范围内。
表 2 水质指标的统计特征
Table 2. Statistical characteristics of water quality indexes
项目 pH EC/(μS·cm−1) TN/(mg·L−1) NH3-N/(mg·L−1) TP/(mg·L−1) COD/(mg·L−1) 限值 6.00~9.00 ≤140.00 ≤80.00 ≤8.00 ≤400.00 最大值 7.85 400.00 183.00 10.70 3.24 62.76 最小值 6.16 51.80 26.10 0.88 0.81 20.78 平均值±标准差 7.21±0.39 200.31±85.90 102.32±35.83 6.36±2.77 2.40±0.50 40.79±10.09 对不同季节的水质指标进行统计分析(图1)可以看出:秋、冬季TN和NH3-N的质量浓度及EC相比春、夏季较高;TP的质量浓度春季较小;COD四季变化规律不明显;pH在春季相对较高。
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将采样数据代入水质指数公式的计算结果表明:81组样本中有64组等级为好,占比为79.0%,等级为一般和很好的样本分别占8.6%和12.4%。从图2可以看出:不同季节中水质指数差异较大,秋、冬季的污水水质指数相对较低,平均为60~80,而春、夏季的水质指数显著增大,平均为75~95,尤其在夏季较为突出,这表明总体上春、夏季的水质较好。
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从81组样本中根据不同季节共随机抽取45组用于建模,其余36组用于模型检验。如表3所示:在构建最小水质指数模型(WQImin)之前,利用逐步多元线性回归法确定了对水质指数影响最大的指标为TN(模型1,R2=0.859,P<0.001),依次增加NH3-N、COD后,模型的决定系数(R2)逐渐增加(模型2、模型3)。从R2变化可以看出:NH3-N、COD对模型精度有较为明显的提升;但加入TP后,R2仅提升了0.005(模型4)。因此,TN、NH3-N和COD对水质指数的影响较大。
表 3 基于实测值和计算值的水质指数逐步多元回归结果
Table 3. Water quality indexes stepwise multiple regression results based on measured values
模型编号 模型表达式 数据来源 R2 P 1 y=12.745+48.381 lg(x1+1) 实测值 0.859 <0.001 2 y=−87.461+37.294 lg(x1+1)+39.662 lg(x2+1) 实测值 0.927 <0.001 3 y=−232.459+31.739 lg(x1+1)+45.921 lg(x2+1)+55.114 lg(x3+1) 实测值 0.981 <0.001 4 y=−237.045+35.884 lg(x1+1)+59.762 lg(x2+1)+70.416 lg(x3+1)+21.264 lg(x4+1) 实测值 0.986 <0.001 5 y=−22.539+51.28 lg(x1+1) 计算值 0.842 <0.001 6 y=−135.074+37.179 lg(x1+1)+57.368 lg(x2+1) 计算值 0.925 <0.001 7 y=−213.361+35.154 lg(x1+1) +78.005 lg(x2+1)+67.733 lg(x3+1) 计算值 0.994 <0.001 说明:y表示WQI;x1、x2、x3和x4分别表示TN、NH3-N、COD和TP的标准化值 周昊等[19]发现生猪污水中NH3-N、TN和EC具有强相关性,其中NH3-N、TN的标准化值可分别通过替代模型由EC推导的NH3-N(记做NH3-Nd)、TN(记做TNd)标准化值代替。本研究将NH3-N、TN分别与EC和WQI进行相关性分析表明:①NH3-N、TN与EC的强相关性依然存在,相关系数分别为0.738和0.914。②NH3-N、TN与WQI的相关系数分别为0.898和0.938;NH3-Nd、TNd与WQI的相关系数分别为0.768和0.812。因此NH3-N和TN的推导值与实测值均与WQI显著相关。
基于这一结论,本研究利用NH3-Nd和TNd计算WQI (记做WQId),并将其与初始WQI值进行对比,结果表明:①WQId与初始WQI之间存在较强的相关性,其R2为0.721,P<0.001;②WQId与WQI的差值平均值仅为1.13,标准差为3.8,差值小于等于5的组数占总组数的88.73%。因此,WQId与WQI差距较小,采用NH3-Nd和TNd替代NH3-N和TN实测值计算WQI值是可行的。综上,在利用逐步多元线性回归方法剔除TP并确定NH3-N、TN和COD等3个关键指标后,利用NH3-Nd和TNd可再次精简计算WQI所需指标,仅需要使用EC和COD计算WQI即可。在45组建模样本中,将原NH3-N和TN分别用NH3-Nd和TNd替换,得出模型5~7共3个WQI模型(表3),这3个模型的R2逐步递增,分别为0.842、0.925和0.994。因此,本研究选择精度最高的模型7作为WQImin模型。
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以模型7为验证对象,将加权最小水质指数模型WQImin-w和非加权最小水质指数模型WQImin-nw进行对比验证。首先基于决定系数(R2)、残差平方和(RSS)以及显著性(P)来判断模型本身的拟合优度和精度,再将基于WQImin-w、WQImin-nw计算得到的WQI值,与通过初始5个指标计算得到的WQI值的线性拟合效果判断模型的适用性。以EC和COD作为关键指标,将36组检验数据分别代入2个模型,进行精度检验。模型WQImin-w和WQImin-nw的P<0.001,其中模型WQImin-w的决定系数(0.994)略高于模型WQImin-nw(0.971),且模型WQImin-w的残差平方和(RSS)为1.327,小于模型WQImin-nw(6.580)。因此,模型WQImin-w的拟合优度和精度略高于模型WQImin-nw。为进一步判断模型的适用性,将检验样本数据分别代入2个模型,得到WQI值,与初始WQI值进行线性拟合分析。从图3可知:由模型WQImin-w得到的WQI值与初始WQI值具有更密切的相关性,其拟合直线决定系数为0.855,略高于模型WQImin-nw(0.854);模型WQImin-nw对应的样点与1∶1参考线的距离普遍较大,且偏离程度大于WQImin-w中拟合直线与1∶1参考直线的偏离程度。图4为分别通过2个模型以及初始WQI公式计算得到的36组水质指数,可以直观地看出:模型WQImin-w的WQI值与初始WQI值较为接近,而模型WQImin-nw的误差相对较大。可见,模型WQImin-w的水质评价结果与初始WQI水质评价结果一致程度更高(91.7%),而模型WQImin-nw的水质评价结果误差相对较大,一致程度仅为83.3%。综合以上对比结果,模型WQImin-w更适用于生猪养殖污水水质的评价。
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本研究结果表明:相对于TP、pH和COD这3个污水水质主要指标,TN和NH3-N这2个关键指标的大小受季节变化影响较为明显,这可能与不同季节的气温有关。仇天雷[20]研究发现:在适当的温度范围内,温度的升高有利于养殖废水中NH3-N的消除。何佳敏等[21]研究了温度对升流式微氧活性污泥反应器(UMSR)处理高NH3-N、低碳氮比养猪废水效能的影响,结果表明当温度下降时,TN和NH3-N的去除率均有大幅度下降,而其他指标的去除率变化不明显。诸多关于城市生活污水处理工艺或水质影响因素的研究中也有同一发现[22-24],即不同处理工艺的污水处理效果均与温度密切相关。因春夏季平均气温高于秋冬季,故本研究处理后的污水水质为春夏季优于秋冬季,且以夏季最优。此外,污水曝气情况、静置时间、阳光照射等因素也可能对各指标的值产生影响[25]。曝气是否充分是影响污水指标质量浓度的重要因素,如曝气不足将导致溶解氧供应不充分,直接影响微生物的代谢,从而降低COD、NH3-N和TP的去除率[26];曝气过量也同样会影响污水处理效率,可能导致COD等指标质量浓度超标[27]。
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污水样本检测的精度、水质指标的标准化方法、权重分配是影响水质评价模型精度的主要因素。本研究以地表水水质指标的标准化方法为参考,结合生猪养殖污水的特点,基于GB 18596—2001《畜禽养殖业污染物排放标准》对污水中相应指标进行了标准化,标准化值共分为11个等级,而等级数和等级划分的细致程度会对水质指数的大小产生直接影响。在权重分配环节,是以地下水及河流湖泊等地表水水质研究中的权重分配方式为参考,对生猪养殖污水中的TN、NH3-N、COD、TP和pH进行权重分配。在地下水及河流湖泊等地表水水质研究中,TN的权重取2。而针对生猪养殖污水的有关研究表明[28]:TN是畜禽养殖污水中重要的指标,也是极易超标的指标之一,因此本研究适当地对TN的权重进行了调整,COD、TN和NH3-N的权重分别为4、3、3,其他指标为1。
除上述分析外,污水处理工艺的稳定性也是需要考虑的因素,不稳定的工艺必然导致出水水质异常,若将异常数据作为水质评价模型构建的基础,即使数量很少,也会对模型精度产生不容忽视的影响。
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生化处理模式下,规模猪场处理后的养殖污水水质呈现季节性变化特征,具体表现为春、夏季水质总体优于秋、冬季,尤其是夏季水质最好。基于EC和COD构建的最小水质指数评价模型决定系数为0.994,通过该模型得到的水质等级与基于NH3-N、COD、TN、TP和pH共5个指标评价的等级一致程度可达90%以上。因此,利用该模型能够较为准确、合理地评价处理后的生猪养殖污水水质。
Characteristics analysis and water quality assessment of swine breeding wastewater under biochemical treatment mode
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摘要:
目的 研究生化处理模式下的生猪养殖污水特征,找到一种合理、快速的水质评价方法,为猪场及相关监管部门了解污水处理情况提供理论依据。 方法 以浙北一家规模猪场为采样点,于2018年秋至2020年秋对处理后的养殖污水进行随机采样。先采用SPSS软件对样本进行统计特征分析,然后利用逐步多元回归分析方法确定影响污水水质的关键指标,再结合水质指标之间的相关性建立生猪污水最小水质指数评价模型。 结果 ①水质呈现季节性变化特征,春、夏季节水质优于秋、冬季节,尤其是夏季水质最好;②基于电导率和化学需氧量2个关键指标建立的最小水质指数评价模型的决定系数为0.994,该模型的验证结果表明:通过其评价的水质结果与基于氨氮、化学需氧量、总氮、总磷和酸碱度共5个指标的评价结果一致程度可达90%以上。 结论 基于关键指标构建的最小水质指数模型具有准确性和合理性,可用于生化处理模式下生猪养殖污水水质的快速评价。图4表3参28 Abstract:Objective This objective is to analyze the characteristics of swine breeding wastewater under biochemical treatment mode, and put forward a reasonable and rapid water quality assessment method, so as to provide a theoretical basis for swine farms and related regulatory authorities to understand the wastewater treatment situation. Method A large-scale swine farm in northern Zhejiang was taken as the sampling location, and the treated breeding wastewater was randomly sampled from fall 2018 to fall 2020. Firstly, SPSS software was used to analyze the statistical characteristics of the samples, and then the stepwise multiple regression analysis method was used to determine the key indexes affecting the wastewater quality. Thirdly, combined with the correlation among the water quality indexes, the assessment model of the minimum water quality index for swine wastewater was established. Result (1) The water quality will change in different seasons, it was better in spring and summer than that in fall and winter, and the water quality in summer was the best. (2) Based on the electrical conductivity and chemical oxygen demand, the assessment model of the minimum water quality index was established, its determination coefficient was 0.994. The verification results showed that the consistency of evaluation grades of water quality based on the minimum model and five indexes include ammonia nitrogen, chemical oxygen demand, total nitrogen, total phosphorus and pH can be more than 90%. Conclusion The minimum water quality index model based on key indexes can be used for rapid evaluation of swine breeding wastewater quality under biochemical treatment mode, meanwhile its accuracy and rationality can be ensured. [Ch, 4 fig. 3 tab. 28 ref.] -
Key words:
- swine /
- wastewater /
- water quality assessment /
- water quality index
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山核桃Carya cathayensis隶属于胡桃科Juglandaceae中的山核桃属Carya,是一种著名的干果树种,因其干果富含营养和经济价值较高而得到了广泛栽培[1]。山核桃干腐病是山核桃生产上一种重要病害,不但影响山核桃的产量,而且会削弱树势,严重时则导致树木过早死亡,并造成重大经济损失[2]。2011年首次报道山核桃干腐病病原菌为Botryosphaeria dothidea(Moug. ex Fr.) Ces. & De Not,属于子囊菌门葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae的葡萄座腔菌属Botryosphaeria[3]。葡萄座腔菌科真菌是农业和林业上重要病原菌、内生真菌或潜在的致病菌,主要引起树木溃疡病。葡萄座腔菌属真菌广泛分布于世界各地,而且寄主范围广泛,是森林生态系统中的重要真菌类群[4]。该菌存在有性型和无性形阶段,其主要形态分类特征为子座、子囊、子囊孢子以及分生孢子的形状、纹饰、颜色、分隔、长宽比、大小及壁厚度等[5-6]。另外,培养菌落颜色、气生菌丝生长情况及子囊孢子表面超微结构(纹饰)也可用于葡萄座腔菌科真菌的分类和鉴定[7]。随着分子生物学的快速发展,越来越多的基因序列分析方法应用于葡萄座腔菌科真菌的分类鉴定及系统发育分析,如核糖体小亚基基因(SSU),核糖体大亚基基因(LSU),延长因子α基因(EF1-a),核糖体DNA内转录间隔区(rDNA-ITS),几丁质合酶基因,β微管蛋白(β-tubulin),A-肌动蛋白(A-actin)基因,钙调蛋白(calmodulin)基因等基因[8]。尤其rDNA-ITS序列是应用最普遍的基因序列,已广泛地应用于很多真菌目、科、属、种等的分类鉴定及系统发育分析。本研究采用形态学特征与与rDNA ITS相结合的方法对分离自中国山核桃的干腐病菌进行了鉴定研究。
1. 材料与方法
1.1 样品采集和病菌分离
分别从浙江省临安市的昌化镇和横路镇,淳安县,桐庐县和安徽省宁国市等山核桃产区采集干腐病标本(枝条和树干)带回实验室,然后在实验室进行病原菌分离与纯化培养。具体分离方法:首先选取发病枝条和树干,用乙醇对病健交接处的组织进行表面消毒30 s,然后剪成约5.0 mm × 5.0 mm大小的组织块,在体积分数为75.0%的乙醇中浸泡5 s,用无菌水浸洗3次,再用质量分数为1.0%的次氯酸钠浸泡1 min,最后用无菌水清洗3次。用灭菌的滤纸吸干水分,将组织块置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上,在25 ℃恒温培养箱中进行培养,2 d后挑取菌落边缘的菌丝进行转接培养、纯化,并进行编号和转管保存。
1.2 致病性测定及病原菌确定
将供试菌株在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上活化培养3~4 d后,用经灭菌的直径为7.0 mm的打孔器打取菌饼。室外选取健康的山核桃,采用丁字型接种方法,将菌饼正面朝向伤口,用已浸湿无菌水脱脂棉保湿。设置重复15个·菌株-1,并设置空白PDA作为对照。接种15 d后观察发病情况,记录不同菌株的病斑数和发病级别,并计算不同菌株的感病指数。将病斑分为3级,15 d后病斑大小在10.0 mm以上的代表数值为“3”,10.0 mm以下5.0 mm以上代表数值的为“2”,5.0 mm以下的代表数值为“1”,不发病的代表数值为“0”。感病指数等于各病级的总代表数值(病斑分级的代表数值与该级标准株数之积)相加,再除以最高一级的代表数值与总株数之积,再乘以100。感病指数越高表示该菌株的致病性越强。对发病病斑进行组织分离,分离得到与接种菌株培养特征一致的菌株确定为该病的病原菌。
1.3 病原菌形态特征观察
将分离获得的病原菌菌株在PDA平板上培养5 d后,观察菌落培养特性,将菌株接种到由树皮煎汁或松针等制成的培养基上诱导孢子产生。制作徒手切片后,在光学显微镜下观察和测量病原菌分生孢子器、分生孢子梗及分生孢子等特征。根据形态特征进行病原菌种类鉴定。
1.4 病原菌rDNA-ITS序列扩增与分析
1.4.1 基因组DNA提取
将病原菌转接到PDA平板上,于25 ℃培养3 d后,刮取约200.0 mg气生菌丝于灭菌后的1.5 mL的离心管中,-20 ℃冰冻过夜,经带研磨杵的电钻研磨破壁后,采用基因组DNA提取试剂盒(北京宝锐通生物科技有限公司)提取真菌基因组DNA。
1.4.2 rDNA-ITS
PCR扩增和纯化 采用真菌rDNA-ITS区域通用引物ITS1(5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′)和ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′)进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。PCR反应体系总体积为25.0 μL,包括12.5 μL PCR脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP),9.5 μL 双蒸水(ddH2O),引物ITS1/ITS4各1.0 μL,模板DNA 1.0 μL。反应程序:94.0 ℃预变性2 min;94.0 ℃变性30 s;57.3 ℃退火30 s;72.0℃延伸40 s,30个循环;72.0 ℃延伸10 min。经质量浓度为15.0 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,将条带清晰的PCR扩增产物送交北京宝锐通生物科技有限公司进行双向测序。
1.4.3 系统发育分析
将测序结果在美国生物技术信息中心(NCBI) GenBank (http://www.ncbi.nlm.gov)中进行同源性比对,下载参比序列,采用clustalX和Mega 5.0软件进行分析比对,采用PAUP 4.0和Mrbayes 3.0软件构建最大简约法(MP)和贝叶斯法(BI)系统发育树。
2. 结果分析
2.1 病原菌分离和确定
本研究分离得到129株菌株,选取7株作为实验菌株,室外接种健康山核桃枝条,保湿培养15 d后,所有实验菌株均具有致病性,枝条上出现黑色病斑,对病斑进行组织分离得到了相应的病原菌。根据不同菌株枝条发病数及其感病级数,计算得到各病原菌的感病指数。其中CXY1565,CXY1566,CXY1567致病性相近,其病情指数为77.8,其致病性最强(图 1F),其次为CXY1568和CXY1569,病情指数为15.6(图 2F),CXY1570和CXY1571菌株致病性最差,其病情指数为6.7(图 3F)。
2.2 病原菌形态学鉴定
以上7株病原菌形态学鉴定后共分为3种,一种是Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. & De Not,以CXY1567为代表菌株,分离频率为71.4%;另一种是B. fabicercianum sp. Nov.,以CXY1568为代表菌株,分离频率为14.3 %;第3种是B. obtusa De Not.,以CXY1570为代表菌株,分离频率为14.3%。
Botryosphaeria dothidea:在PDA上25 ℃菌落生长速率较快,3~4 d几乎布满平板(直径90.0 mm);初期菌落白色或无色,气生菌丝棉絮毛状,较稀疏;培养1~2 d后,有白色或黄色小点沿菌丝分布,菌落中间有墨绿色色素;随着色素的沉积,黄色色素逐渐被掩盖,最后整个菌落变为灰褐色;后期菌落边缘气生菌丝倒伏紧贴培养基,菌落背面黄绿色色素呈点状不均匀分布;随着色素沉积,整个培养皿背面逐渐变为墨绿色或黑色。分生孢子器沿菌落边缘生长,表生,球形或不规则形;多腔室,分生孢子梗着生于腔室内壁细胞上,无色,杆状。分生孢子无色,无隔,锤形,顶部钝圆,基部比顶部稍尖。大分生孢子18.0~22.2 μm × 4.6~6.9 μm,平均为21.5 μm × 5.6 μm。长/宽比为3.0~4.0,小分生孢子直径为4.0~6.0 μm(图 1)。
Botryosphaeria fabicercianum:在PDA上菌落生长迅速,5 d可长满培养皿(直径90.0 mm)。菌落初呈白色,菌丝绒毛状或棉絮状,4~6 d菌落中央呈烟灰色,边缘菌丝紧贴培养基;12~16 d气生菌丝由灰绿色变为橄榄绿色,最后变为墨绿色。分生孢子器表生,散生或聚生,深褐色,球状,表面有菌丝覆盖。分生孢子器壁分3层,外层厚,深褐色或浅棕色,角质状;中层细胞薄壁,浅棕色;内层细胞薄壁,无色。分生孢子梗缺。产孢细胞圆柱形或烧瓶形,无色,光滑,薄壁,顶端产生单个分生孢子。侧丝无。分生孢子薄壁,光滑,无色,单胞,纺锤形,中间至中上1/3处最宽,顶端尖锐,基部平截,边缘具一个细小褶皱。分生孢子萌发前形成1~2个隔膜。大分生孢子17.3~24.3 μm × 4.5~7.5 μm,平均为22.7 μm × 6.1 μm,长/宽比为3.5~4.5,小分生孢子直径为3.8~6.3 μm[9](图 2)。
Botryosphaeria obtusa:在PDA上25 ℃生长迅速,3 d布满平板(直径90.0 mm),菌落初为白色,气生菌丝稀疏不发达,较短,细绒毛状,边缘整齐;2 d后有墨绿色色素沉积。后期气生菌丝分布于菌落边缘,稀疏且长势较弱,中央无气生菌丝,或气生菌丝平铺。10 d后由于色素沉积,菌落变为墨黑色,有时具反光;菌落背面由灰黑色变为墨绿色或者黑色。分生孢子器散生,表生,多腔室,腔室圆形或近圆形,无褶皱,内壁上着生分生孢子梗。分生孢子初无色,单胞,后呈褐色,卵形;大分生孢子为17.3~22.5 μm × 8.8~11.3 μm,平均为21.9 μm ×10.2 μm,长/宽比为1.8~2.3,小分生孢子直径3.0~4.0 μm[10](图 3)。
2.3 rDNA-ITS序列分析
通过对供试7个菌株的rDNA-ITS序列测定和在GenBank中进行BLAST搜索和比对,结果表明:这些菌株均为葡萄座腔菌科真菌,分别为Botryosphaeria dothidea,B. fabicercianum和B. obtusa菌株(表 1)。
表 1 供试菌株rDNA-ITS序列与GenBank相关菌株的相似率Table 1. Similarity of rDNA-ITS sequences of the tested fungal strains with related strains blasted in GenBank菌株编号 菌株接收号 GenBank中相似的种类 相似率最高菌株 最高相似率/% 相似菌株接收号 CRY1567 TC527826 Botryosphaeria dothidea CBS 121484 99 EU650670 CRY1566 TC527822 B. dothidea CBS116743 99 AY786322 CRY1565 TC527825 B. dothidea CMW800 99 AY236949 CRY1568 TC527823 B. fabicercianum CMW24703 100 HQ332195 CRY1569 TC527824 B. fabicercianum CMW24703 99 HQ332195 CRY1570 TC527827 B. obtusa CBS119049 99 DQ458889 CRY1571 TC527828 B. obtusa CBS119049 99 DQ458889 2.4 系统发育分析
根据同源性比对的结果,从GenBank中下载33个与供试菌株关系相近的ITS序列和1个Guignardia philoprina(球痤菌属)序列作为外群,将所有序列整理后进行比对分析。用PAUP 4.0b10对比对结果进行最大简约法分析,将所有的614个特征视为无序且权重相同,其中120个恒量特征,和63个无效的变量特征Bootstrap法重复1 000次评估得到各节点支持率(BS)。利用最大简约法构建合议树步长(tree length)为327,一致性指数(consistency index,CI)0.8,保留指数(retention index,RI)0.9,趋同性指数(homoplasy index,HI)0.2,可调一致性指数(rescaled consistency index,RC)0.7;利用MrModeltese 3.7分析后,在AIC(Akaike Information Criterion)标准下,获得最佳模型TIM+G。贝叶斯方法采用马氏链蒙特卡罗(MCMC)算法,共运行500万代,所得9 902个树的合议树中各支的拓扑学结构与简约法基本一致,后验概率(PP)为节点支持率为PP。最后节点支持率为BS/PP(图 4)。
基于rDNA-ITS序列构建的系统发育树,结果将供试7个菌株与相关葡萄座腔菌科真菌分为2个大的类群,其中第1个类群包括分支Ⅰ,分支Ⅱ,分支Ⅲ,第2个类群包括分支Ⅳ和分支Ⅴ。
分支Ⅰ包括无性型为Spencermartinsia viticola等2个菌株,系加利福尼亚柑橘枝干溃疡病病菌[11]。供试菌株CXY1570和CXY1571位于分支Ⅱ中,其无性型为Diplodia。这2个菌株与B. obtusa菌株聚集在同一分支,与 CBS119049的菌株的最大相似率为99%。分支Ⅴ为无性型Fusicuccom类群的菌株,包括Botryosphaeria dothidea,B. fabicercianum和B. cortici。最大简约法和贝叶斯法的分析结果均表明,中国山核桃干腐病菌包括 Botryosphaeria dothidea,B. fabicercianum和B. obtusa。分子鉴定结果与形态学鉴定结果一致。
3. 结论与讨论
本研究从山核桃干腐病发病组织上分离得到了3种葡萄座腔菌属真菌,其中优势菌株为Botryosphaeria dothidea,而且致病性最强;而B. fabicercianum和B. obtusa分离频率较低,致病性较弱。
Botryosphaeria是重要的子囊菌,其无性型包括Diplodia,Dothiorella,Fusicoccum,Lasiodiplodia,Sphaeropsis等[12],是形态分类中最困难的真菌类群之一。关于山核桃干腐病的研究报道较少,而且关于病原菌种类不明确。杨淑贞等[13]提出该病病原真菌的有性态为B. fusisporae,无性态为Macrophoma caryae。也有研究认为山核桃溃疡病病原属于半知菌亚门腔胞纲球壳孢科小穴壳菌Dothiorella gregaria,并指出该病的病原与杨树溃疡病和桃树溃疡病的病原相同[14]。张传清等[15]认为山核桃干腐病菌为B. dothidea。田甜等[16]也认为山核桃干腐病病原菌是B. dothidea。本研究结果认为山核桃干腐病菌包括B. dothidea,B. fabicercianum及B. obtusa,但以B. dothidea为优势病菌。
Botryosphaeria是常见的林木干腐和枯梢病菌,尤其B. dothidea是发生最普遍和危害最重的病原菌[17]。Smith等[18]报道,B. dothidea在南非引起桉树溃疡病。另外,该菌是桉属Eucalyptus和松属Pinus植物上的内生真菌[19]。由于Botryosphaeria属真菌在自然条件以无性型最为常见,而且形态特征有限,所以,仅依靠形态特征难于进行种类鉴定。另外,该属真菌在人工培养条件下很难产生分生孢子器,而且耗时长。采用分子生物学技术不失为一种有效方法[20]。
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表 1 各指标权重和标准化值
Table 1. Weights and standardized values of water quality indexes
标准化值 pH TN/
(mg·L−1)NH3-N/
(mg·L−1)TP/
(mg·L−1)COD/
(mg·L−1)100 6~9 <50 <4 <0.5 <20 90 50~70 4~6 0.5~1.0 20~40 80 70~90 6~8 1.0~2.0 40~60 70 90~110 8~20 2.0~3.0 60~100 60 110~130 20~40 3.0~6.0 100~200 50 130~150 40~80 6.0~9.0 200~400 40 150~170 80~120 9.0~12.0 400~600 30 170~190 120~160 12.0~15.0 600~800 20 190~210 160~200 15.0~18.0 800~1 000 10 210~230 200~240 18.0~21.0 1 000~1 200 0 <6、>9 >230 >240 >21.0 >1 200 权重 1 3 3 1 4 表 2 水质指标的统计特征
Table 2. Statistical characteristics of water quality indexes
项目 pH EC/(μS·cm−1) TN/(mg·L−1) NH3-N/(mg·L−1) TP/(mg·L−1) COD/(mg·L−1) 限值 6.00~9.00 ≤140.00 ≤80.00 ≤8.00 ≤400.00 最大值 7.85 400.00 183.00 10.70 3.24 62.76 最小值 6.16 51.80 26.10 0.88 0.81 20.78 平均值±标准差 7.21±0.39 200.31±85.90 102.32±35.83 6.36±2.77 2.40±0.50 40.79±10.09 表 3 基于实测值和计算值的水质指数逐步多元回归结果
Table 3. Water quality indexes stepwise multiple regression results based on measured values
模型编号 模型表达式 数据来源 R2 P 1 y=12.745+48.381 lg(x1+1) 实测值 0.859 <0.001 2 y=−87.461+37.294 lg(x1+1)+39.662 lg(x2+1) 实测值 0.927 <0.001 3 y=−232.459+31.739 lg(x1+1)+45.921 lg(x2+1)+55.114 lg(x3+1) 实测值 0.981 <0.001 4 y=−237.045+35.884 lg(x1+1)+59.762 lg(x2+1)+70.416 lg(x3+1)+21.264 lg(x4+1) 实测值 0.986 <0.001 5 y=−22.539+51.28 lg(x1+1) 计算值 0.842 <0.001 6 y=−135.074+37.179 lg(x1+1)+57.368 lg(x2+1) 计算值 0.925 <0.001 7 y=−213.361+35.154 lg(x1+1) +78.005 lg(x2+1)+67.733 lg(x3+1) 计算值 0.994 <0.001 说明:y表示WQI;x1、x2、x3和x4分别表示TN、NH3-N、COD和TP的标准化值 -
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