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温室气体排放加剧全球气候变暖[1]，导致系列环境问题频发，如水资源短缺[2]、区域干旱化加剧[3]等。氧化亚氮(N2O)是主要的温室气体之一，在百年尺度上，N2O造成全球变暖的潜力是二氧化碳(CO2)的265倍[4]。土壤是N2O的一个重要排放源[5]，据估计，大气中80%~90%的N2O来源于土壤[6]。土壤中由微生物介导的硝化和反硝化过程是N2O主要产生途径，其中，施肥土壤是N2O排放量最高的土壤。有研究表明：氮(N)、磷(P)肥的大量施用会增加土壤气态氮、氧化氮(NO)、N2O等的排放[7-9]。因此，合理施肥对缓解全球气候变化显得极为重要。土壤N2O的排放不仅仅与施N、P肥相关，还受土壤含水量的影响，土壤含水量是影响N2O的排放的一种潜在因素[10]。有研究表明：土壤含水量的增加会降低土壤N2O的排放[11-12]，也有研究表明：土壤含水量的增加会促进土壤N2O的排放[13-15]。聚丙烯酰胺是用强吸水性树脂制成的超高吸水保水能力的高分子聚合物。它可以吸收大量的水，然后形成水凝胶，且可以反复吸水。当土壤处于干旱时，它会缓慢的将水分释放，供土壤和植物利用[16-18]，大幅度提高了用水效率。而且聚丙烯酰胺还具有改善土壤结构、低成本、使用方便等诸多优点，对农林产品的生产经营具有一定的实际意义。油茶Camellia oleifera是中国南方最重要的食用油料树种，主要分布于秦岭淮河以南至华南北部，以江西和湖南为主产区。江西省油茶产区属于典型的红壤地区，受亚热带季风气候的影响，夏季水热不同期。在这一时期内，油茶树进行产果，氮磷的缺乏会影响油茶的油脂转化，缺水会导致油茶落果，这将会限制油茶林的高产[19]。因此，保水剂聚丙烯酰胺的施用对油茶林的产果量有着很大意义。近年来，已有不少研究表明施氮、磷肥可以促进温室气体排放[7-9]，聚丙烯酰胺可以增加土壤含水量，进而影响土壤N2O排放，那聚丙烯酰胺和氮、磷肥共同施用会如何影响油茶林土壤N2O排放？本研究通过添加不同肥料和不同用量聚丙烯酰胺，来探究聚丙烯酰胺和施肥对油茶土壤N2O排放的影响，为发展高效节水林业和缓解全球气候变化提供理论依据。
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样地位于江西农业大学科技园(28°45′53″N，115°50′10″E)，属于亚热带湿润季风气候。年日照时间为1 723~1 820 h，日照率为40%，7−8月最高，2−3月最低；年平均气温约18 ℃，年降水量为1 600~1 700 mm，降水日主要集中在4−6月。土壤为典型红壤。
所用油茶苗是1年生实生苗，土壤采自未施肥油茶林。所施用的氮肥为硝酸铵(NH4NO3，分析纯)，磷肥为磷酸氢二钠(Na2HPO4，分析纯)。保水剂聚丙烯酰胺(分析纯)为阴离子型，平均分子量不小于1 000万。土壤基本理化性质：有机碳13.01 g·kg−1、全氮1.46 g·kg−1、速效磷1.07 mg·kg−1、铵态氮1.87 mg·kg−1、硝态氮1.68 mg·kg−1、pH 5.76。
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盆栽试验于2018年4月17日至9月26日进行，盆栽容器为高18 cm，宽16 cm的圆形花盆，每盆土质量为1 500 g。试验共设置12个处理：C0+ck、C0+P、C0+N、C0+N+P、C1+ck、C1+P、C1+N、C1+N+P、C2+ck、C2+P、C2+N、C2+N+P。其中，C0、C1、C2分别为施用保水剂聚丙烯酰胺0、1.0、2.0 g·kg−1。每个处理3个重复，聚丙烯酰胺与土壤混施，氮磷肥加水混合均匀喷施。共施肥3次，分别为6月1日(0.050 g·kg−1 N，0.025 g·kg−1 P)、6月24日(0.040 g·kg−1 N，0.020 g·kg−1 P)和7月18日(0.040 g·kg−1 N，0.020 g·kg−1 P)，共施氮肥0.130 g·kg−1，磷肥0.065 g·kg−1。
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采用静态暗箱法测定土壤N2O通量。静态箱体由箱体和底座2个部分组成，箱体是由有机玻璃制成的内径为18 cm，高为80 cm的圆柱体。箱体上侧的中心位置有1个小孔，用于放置温度计，用于记录箱体温度。箱体外部用锡箔纸进行包裹，保证在采气过程中内部是黑暗状态。底座由水进行密封，保证在抽气过程中箱内空间密闭。采样时把每盆油茶苗搬到底座上，再扣上箱体，用50 mL的医用注射器进行气体采集。采气过程中，注射器需反复抽拉10次，保证所采气体是混合均匀的[20]。气体采集时间自5月23日开始，7 d采集1次，每次施肥后的第1、3、6天进行气体采集，后逐渐延长采气时间。每次的气体采集时间为9:00−11:00，盖上箱体后的0、5、10、15 min分别抽取40 mL气体注入真空气袋。在气体采集过程中，用W.E.T Sensor Kit测定盆栽内土壤的温度和湿度。
N2O排放通量的测定：用气相色谱仪(安捷伦7890B)测定N2O质量浓度，并根据方程式计算N2O排放通量(L)：
$L=P\times V\times \dfrac{\Delta c}{\Delta t}\times \dfrac{1}{R\times T}\times M\times \dfrac{1}{S}$ 。其中：P代表标准大气压力(Pa)，V指箱内空间的体积(m3)，Δc/Δt代表单位时间内N2O质量浓度的变化量(μg·L−1)，R代表通用气体常数(m3·mol−1·K−1)，T代表采气时箱内温度(K)，M代表N2O的分子质量(g·mol−1)，S代表箱体的底面积(m2)。N2O累积排放量根据以下公式计算：
$$ E=\sum _{i=1}^{n}\frac{\left({L}_{i}+{L}_{i+1}\right)}{2}\times \left({t}_{i+1}-{t}_{i}\right)\times 24{\text{。}}$$ 其中：L代表N2O排放通量(μg·m−2·h−1)，i表示第i次进行气体采集，ti+1−ti代表2次采样的间隔天数，n代表气体采集的次数。
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用Excel 2010对数据进行统计和处理，利用JMP 9.0软件进行单因素方差分析，利用Origin 2017软件绘图。
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由图1和图2可见：随着时间的变化，不同处理土壤温度和N2O排放通量无明显差异。聚丙烯酰胺处理土壤含水量高于未添加聚丙烯酰胺，说明聚丙烯酰胺对土壤有很好的保水作用。
图 1 南昌市平均降水量、平均气温图和试验土壤含水量、土壤温度动态图
Figure 1. Dynamic diagram of mean rainfall and medial temperature in Nanchang, and dynamic diagram of soil water content and soil temperature
图 2 土壤N2O排放通量动态图
Figure 2. Dynamic diagram of soil N2O emission flux
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由表1和图3可见：未施肥条件下，C1和C2处理土壤含水量较之C0，分别增加37.5%、53.2%(P＜0.05)；单施N条件下，土壤含水量从大到小依次为C2、C1、C0，与C0对比，C1和C2分别增加38.3%、61.4%(P＜0.05)；单施P条件下，C1和C2处理土壤含水量较之C0，分别增加51.4%、71.6%(P＜0.05)；施N+P条件下，C1和C2处理土壤含水量较之C0，分别增加65.4%、57.6%(P＜0.05)。总体上，C1、C2处理土壤含水量均显著高于C0，说明聚丙烯酰胺可以有效提高土壤保水性能。
表 1 不同处理对土壤N2O排放通量、土壤含水量和N2O累积排放量的影响
Table 1. Effects of different treatments on soil N2O emission flux, soil moisture content and cumulative N2O emission
处理 df F N2O排放通量 土壤含水量 N2O累积排放量 N 1 5.41* 13.72** 1.35 P 1 6.27* 5.05* 5.41* N+P 1 2.23 4.19 0.49 C 2 0.66 200.89** 2.75 N+C 2 0.13 1.34 0.18 P+C 2 2.45 3.78* 2.24 N+P+C 2 3.13* 4.17* 1.71 说明：N表示施氮处理，P表示施磷处理，C表示施加聚丙烯 酰胺处理；*P＜0.05，**P＜0.01 
图 3 不同聚丙烯酰胺添加和施肥对土壤含水量的影响
Figure 3. Effects of different polyacrylamide addition and fertilization on soil moisture content
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由图4和图5可见：添加1.0 g·kg−1聚丙烯酰胺条件下，施N、P、N+P的土壤N2O排放通量较之未施肥土壤，分别增加56.0%、61.7%、40.7%(P＜0.05)；添加2.0 g·kg−1聚丙烯酰胺条件下，施P、N+P的土壤N2O排放通量较之未施肥土壤，分别增加38.7%、58.1%(P＜0.05)。C0+ck、C1+ck、C2+ck处理表明：添加聚丙烯酰胺的土壤N2O排放通量要低于未添加的，但不显著，可能是聚丙烯酰胺施用的量较小。相对于只添加聚丙烯酰胺的处理，施肥和添加聚丙烯酰胺的，土壤N2O排放通量增加，说明聚丙烯酰胺与N、P之间存在某种作用促进土壤N2O排放。施P显著提高土壤N2O累积排放量(P＜0.05)，相较于ck增加13.3%。
图 4 不同聚丙烯酰胺添加和施肥对土壤N2O排放通量的影响
Figure 4. Effects of different polyacrylamide addition and fertilization on soil N2O emission flux
图 5 施磷肥对N2O累积排放量的影响
Figure 5. Influence of phosphate fertilizer on N2O cumulative emission
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施用聚丙烯酰胺显著提高了油茶土壤的含水量，原因可能是聚丙烯酰胺影响了土壤的孔隙状况，降低土壤入渗率，增加了土壤的持水能力[21]，而且聚丙烯酰胺是一种含有大量亲水基和疏水基的高分子化合物，它可以加强土壤对水分子的吸着能力，从而有效抑制土壤水分的蒸发，增加土壤含水量[22]。而土壤含水量和施肥共同影响土壤N2O排放通量。不同施肥处理的土壤含水量从大到小依次为C2+N、C1+N、C0+N和C2+P、C1+P、C0+P和C1+N+P、C2+N+P、C0+N+P，不同施肥处理土壤N2O排放通量最高的分别是C1+N、C1+P、C2+N+P，总体表现为施肥处理下的土壤N2O排放通量随着土壤含水量的增加呈现先增后减的趋势。因为土壤含水量控制着氧气进入土壤以及土壤中NO、N2O和氮气(N2)的排放[23]，在干燥的土壤中，气体的扩散率很高，所以大部分NO在被消耗之前就可以从土壤中扩散出去[24]。在湿润的土壤中，气体的扩散率较低，透气性较差，大部分NO在逸出土壤之前就被减少了，更多的被还原，氧化物N2O是主要的最终产物。当土壤的含水量更高且土壤大多为厌氧状态时，大部分的N2O在逸出土壤之前被反硝化作用进一步还原为N2[25]。本研究中，在C0处理下，施N、N+P处理并没有显著增加土壤N2O排放通量，造成这样的原因可能是低土壤含水量影响了土壤微生物活性，减少了无机氮的产生，抑制了土壤的硝化和反硝化作用[24]；施P处理的土壤N2O排放通量略低于ck，可能是磷肥的施用促进植物对氮的吸收利用。通过比较C0+ck、C1+ck、C2+ck，较高的土壤含水量抑制了土壤N2O排放通量，这可能是因为土壤处于厌氧环境，反硝化最终的主要产物是N2，而且较高的土壤含水量有利于提升养分的运输速率，加快了植物对无机氮的吸收，从而减少了土壤N2O的排放[26]。
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磷是油茶品质和产量的关键限制因子，所以在经营油茶林的时候，磷肥的施用是不可少的。本研究发现施用磷肥促进了N2O累积排放量，这与以往的一些研究恰好相反。有研究[11, 27]发现：施用磷肥减少了N2O的排放，并认为这可能是土壤中的速效磷含量低，限制了植物对无机氮的吸收，而磷肥的施用增加了土壤速效磷含量，解除了植物的营养限制，减少了可用于生产N2O的无机氮含量，从而降低了土壤N2O的排放。但也有研究表明：施用磷肥促进了N2O的排放[28-30]，与本研究结果一致。一方面，因为土壤在缺磷的时候，微生物的活性受到抑制[31-33]，而施用磷肥解除了微生物的磷限制，从而微生物活性增强，由微生物介导的硝化和反硝化作用就会被加强，促进了土壤N2O的排放。另一方面，施用磷肥刺激了异养菌群的活性，增加了土壤中氧气的消耗，创造出一个厌氧环境，有利于反硝化作用[34]。而且施用磷肥也可能会通过诱导微生物对氮的需求来促进土壤有机质的分解，影响土壤总氮的矿化，增加硝化和反硝化作用的底物，从而促进土壤N2O的排放[35]。本研究所用土壤是典型红壤，存在较强的磷限制，这不仅限制了植物对养分的吸收，还限制了微生物的活性。施用磷肥解除了这些限制，促进了植物对无机氮的吸收，但也加强了微生物的硝化和反硝化作用。从本结果来看，可能是微生物介导气态氮释放过程的强度要大于植物对N的吸收强度，导致总体的土壤N2O排放的增加。
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施用聚丙烯酰胺会显著提高油茶林土壤含水量，并随施用聚丙烯酰胺施用量的增加土壤含水量也不断升高。施用聚丙烯酰胺不会促进土壤N2O排放通量，但氮、磷肥和聚丙烯酰胺存在交互作用，施聚丙烯酰胺条件下，施用氮、磷肥会显著增加土壤N2O排放量。施用磷肥促进了油茶林土壤N2O排放，因此，油茶林要合理施肥，在磷肥能满足树木生长所需的前提下，减少磷肥施用，有利于缓解温室效应。
Effects of water-retaining agent on soil nitrous oxide emission in Camellia oleifera forest under nitrogen and phosphorus addition
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摘要:
目的 化肥施用导致土壤氧化亚氮(N2O)排放增加，加剧了全球气候变化。在干旱和降水分配不均地区，土壤含水量是影响土壤N2O排放的关键因子，施用保水剂(如聚丙烯酰胺)可能影响土壤N2O排放。本研究目的是探究氮(N)与磷(P)肥添加下施用聚丙烯酰胺对土壤N2O排放的影响。 方法 以油茶Camellia oleifera林土壤为研究对象，设置不同处理，包括不同肥料添加[N、P、N+P、不施肥(ck)]，不同聚丙烯酰胺用量(C0：0 g·kg−1，C1：1.0 g·kg−1，C2：2.0 g·kg−1)以及两者交互处理，利用静态箱-气相色谱法测定油茶苗生长期内土壤N2O排放。 结果 ①施用聚丙烯酰胺显著提高了油茶林土壤含水量(P＜0.05)，且土壤含水量随保水剂施用量的增加而增加。与C0相比，C1和C2土壤的含水量分别增加47.1%和57.4%，但施用聚丙烯酰胺不会促进土壤N2O排放(F=2.75，P＞0.05)。②施磷肥显著提高土壤N2O累积排放量(P＜0.05)，相较于ck增加13.3%。③与只添加聚丙烯酰胺的土壤相比，1.0 g·kg−1聚丙烯酰胺分别与N、P、N+P肥混施处理的土壤N2O排放通量分别显著增加56.0%、61.7%、40.7% (P＜0.05)；2.0 g·kg−1聚丙烯酰胺与P、N+P肥混施处理的土壤N2O排放通量分别显著增加38.7%、58.1% (P＜0.05)。 结论 施用聚丙烯酰胺不仅能有效提高油茶土壤保水能力，而且还不会促进油茶土壤N2O排放，有利于发展高效节水林业和缓解全球气候变化。图5表1参35 Abstract:Objective The application of chemical fertilizer accelerates soil nitrous oxide (N2O) emission and intensifies global climate change. Soil moisture content is a key factor affecting soil N2O emission in arid and uneven rainfall distribution areas, so the application of water retaining agent (such as polyacrylamide) affects soil N2O emission. The purpose of this study is to explore the effect of polyacrylamid on soil N2O emission under the application of N and P fertilizer. Method Taking Camellia oleifera forest soil as the research object, different treatments were set, including different fertilizer additions (N, P, N+P, ck), different polyacrylamide dosage (C0: 0 g·kg−1, C1: 1.0 g·kg−1, C2: 2.0 g·kg−1) and their interaction. The soil N2O emission during the growth of C. oleifera seedlings was determined by static chamber gas chromatography. Result (1) The application of polyacrylamide significantly increased the soil moisture content of C. oleifera (P＜0.05), which increased with the increase of the application amount. Compared with C0, the soil moisture content of C1 and C2 increased by 47.1% and 57.4% respectively, but the application of polyacrylamide did not promote soil N2O emission (F=2.75, P＞0.05). (2) The application of P fertilizer significantly increased the cumulative soil N2O emission (P＜0.05), which increased by 13.3% compared with ck. (3) Compared with the soil supplemented only with polyacrylamide, the N2O emission fluxes of soil treated with 1.0 g·kg−1 polyacrylamide and N, P, N+P fertilizer increased significantly by 56.0%, 61.7%, and 40.7%, respectively (P＜0.05). The N2O emission fluxes of soil treated with 2.0 g·kg−1 polyacrylamide and P, N+P fertilizer increased significantly by 38.7% and 58.1%, respectively. Conclusion The application of polyacrylamide in C.oleifera soil can effectively improve soil water holding capacity, but will not promote soil N2O emission, which is conducive to the development of efficient water-saving forestry and the mitigation of global climate change. [Ch, 5 fig. 1 tab. 35 ref.] -
园林绿化废弃物资源化利用[1-2]已成为研究热点，其中堆肥化是一种比较理想的处理方式。由于园林绿化废弃物木质素含量较高、起始微生物数量较少等原因，堆肥效率较低，因此如何提高堆肥过程中的微生物数量成为推进园林绿化废弃物堆肥的关键[3-4]。添加微生物菌剂是提高堆体微生物数量最直接的方式之一。目前，针对木质素降解的菌剂较少，且多集中于液体菌剂。然而液体菌剂对无菌条件要求较高，运输及产品储存有诸多不便[5]。固体菌剂在生产和储存方面能弥补液体菌剂的不足，同时，固体菌剂生产成本更低、生产工艺也相对简单，对促进园林绿化废弃物堆肥化过程的优势更明显[6]。生产固体菌剂，除了设计固体发酵的培养基，还要优化其发酵条件，主要流程为试验设计、数学建模和优化设计3个部分[7]。合理的试验设计能用较少的试验数据进行建模，从而获取各因素范围内的最优解。已有研究对于固态发酵的优化多是使用响应面法[8-9]。但是有研究发现[10]：人工神经网络算法优化培养基比响应面法优化培养基验证结果更准确，误差更小。本研究拟采用单因素试验和正交试验确定作为固态发酵培养基碳源、氮源的较优种类和水平，然后根据碳氮源优化结果，通过单因素试验确定外加营养组分种类，最后采用均匀实验结合人工神经网络建模与优化，寻找2株木质素降解菌的外加营养组分接种量和最佳固体培养基发酵条件，以期得到最大发酵生物量，制作高效固体菌剂用于园林绿化废弃物堆肥。
1. 材料与方法
1.1 材料
菌株A为构巢曲霉Aspergillus nidulans、菌株Q为栓菌属1种Trametes sp.，均由北京林业大学土壤生物学实验室分离并保藏。
PDA培养基：马铃薯浸汁(200.000 g土豆去皮去芽，切成小块，加蒸馏水1 L保持微沸30 min后过滤)，葡萄糖 20.000 g，蛋白胨15.000 g，琼脂 20.000 g，pH自然。PDB液体培养基：马铃薯浸汁(同PDA培养基)，葡萄糖 20.000 g，蛋白胨15.000 g，pH自然。以上所有培养基均121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
1.2 方法
1.2.1 菌株培养
①菌株活化。将接种环置于酒精灯上燃烧，待冷却后挑取PDA斜面上的少许菌株接种至PDA培养基，封口后置于恒温培养箱活化。②液体菌种培养。将活化后纯培养的目标菌株的PDA培养基接至放有玻璃碎片的PDB液体培养基的三角瓶中，在IS-RDD3台式恒温振荡器中以25 ℃、200 r·min−1条件下培养5 d。③固态发酵。以30.000 g麸皮为发酵基质，添加碳氮源以及外加营养组分，于121 ℃高压蒸汽灭菌30 min后，冷却至室温备用。将液体菌种按20%的接种量(物料干质量)加入无菌水中混匀，接入物料，调节料水比，搅拌均匀后置于25 ℃条件下培养7 d，重复3次。
1.2.2 制作固态发酵培养基
①碳氮源筛选。采用单因素试验筛选固体发酵培养基的碳氮源种类。以麸皮为发酵基质，在米糠、木质素磺酸钠、玉米粉、蔗糖中筛选碳源，在豆饼粉、蛋白胨、酒石酸胺、尿素中筛选氮源，比较不同碳氮源对2株木质素降解菌生物量的影响，以选择能促进菌体生长发育的最佳碳氮源。采用L9(34)正交试验确定最佳添加量。根据最佳碳氮源的筛选结果，选择3个吸光度D(260)相对较高的添加量梯度进行L9(34)正交试验，探究碳氮源添加量对2株木质素降解菌生物量的影响，优化固态发酵基质配方。②外加营养组分筛选。采用单因素试验确定添加物质种类。以麸皮为发酵基质，在最佳碳氮源的基础上中添加营养组分：硫酸钙(CaSO4)、硫酸镁(MgSO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、氯化钠(NaCl)进行外加营养组分筛选，重复3次，选择3个D(260)最大的作为外加营养组分的种类，确定外加钙盐、镁盐、磷酸盐等对菌株A和菌株Q生长的影响。③培养基配方优化。采用均匀实验设计结合人工神经网络建模，进一步优化固态发酵培养基的外加营养组分添加量及其他发酵条件。
1.2.3 菌丝生物量的测定
将液体菌种用纱布过滤，同时以无菌水充分洗涤过滤物，过滤物即为纯菌体，在65 ℃的条件下烘干至恒量，留存备用。精密称取纯菌体0.010、0.030、0.050、0.100、0.150和0.200 g，加入25.000 mL体积分数为5%三氯乙酸溶液，80 ℃恒温水浴中搅拌提取25 min，取出后冰浴冷却，在4 ℃、8000 r·min−1条件下离心15 min，稀释2倍，以体积分数为5%的三氯乙酸为对照，用分光光度计测定D(260)，构建标准回归曲线。发酵物置于65 ℃条件下烘干至恒量，取0.500 g烘干至恒量的固态发酵物测定D(260)(与上述提取纯菌体中核酸的方式相同)。同时，以发酵7 d但未接种种子液的固态发酵物作为空白对照，在260 nm处测定提取液的D(260)，通过标准回归曲线预测菌丝干质量。
1.2.4 数据统计与分析
①数据采用Excel 2007和SPSS 22.0处理。碳氮源优化用单因素方差分析法，平均值多重比较用LSD最小显著性差异法(P＜0.05)。②采用均匀实验实现人工神经网络建模与优化。其一，基于Smooth L1损失函数的人工神经网络构建。该网络借鉴U-Net架构设计了编码器和解码器，添加了残差连接[11]，以缓解网络退化问题[12]，并采用Smooth L1损失函数[13]最小化观察值与模型预测值的误差。损失函数如下所示：SmoothL1(x)
$ = \left\{ {\begin{array}{*{20}{c}} {\begin{array}{*{20}{l}} {0.5{x^2}}\\ {|x| - 0.5} \end{array}}&{\begin{array}{*{20}{c}} {{\text{假如}}\;|x| {\text{＜}} 1}\\ {{\text{否则}}} \end{array}} \end{array}} \right.$ 。其二，基于AdamW算法[14]寻优。神经网络、AdamW算法基于Pytorch[15]实现。2. 结果与讨论
2.1 纯菌丝干质量和核酸量的线性关系
由图1可知：2株木质素降解菌菌丝中的核酸量与菌丝干质量在测试的范围之内可呈现良好的线性关系，说明通过测定D(260)来确定2株木质素降解菌固态发酵生物量的方法可行。菌株Q的线性方程为yQ=4.349 3x+0.044 6，R2=0.998 6；菌株A的线性方程为yA=4.081 4x+0.046 3，R2=0.995 7。
图 1 菌丝中核酸量与菌丝干质量的关系Figure 1 Relationship between the amount of nucleic acid in mycelium and the amount of mycelium2.2 固体发酵培养基的筛选
2.2.1 碳源对2株木质素降解菌生物量的影响
由图2可知：菌株A的4种碳源处理的D(260)差异不显著(P＞0.05)，但木质素磺酸钠的D(260)最高，分别较米糠、玉米粉和蔗糖处理高出14.900%、8.800%和8.200%。菌株Q的3种碳源处理的D(260)差异不显著(P＞0.05)，但玉米粉的D(260)最高，分别较木质素磺酸钠、米糠和蔗糖处理高出6.900%、3.600%和0.900%。菌株A为构巢曲霉，分泌的木质素降解相关酶系降解木质素效果显著[16-17]，同时木质素磺酸钠是木质素磺化改性得到的衍生化产品，因此，相比其他3种碳源，木质素磺酸钠更有利于促进菌株A细胞的快速生长，获得较高的菌丝生物量[18]。菌株Q在以玉米粉为碳源时的生物量最高，可能是因为玉米粉中含有大量的糖分、淀粉、多种矿质元素和维生素, 这些营养物质有利于菌株Q的生长繁殖[19]。因此，选择木质素磺酸钠作为菌株A的碳源，选用玉米粉作为菌株Q的碳源。
图 2 碳源对2株木质素降解菌生物量的影响Figure 2 Effect of carbon source on the biomass of two lignin-degrading bacteria2.2.2 氮源对2株木质素降解菌生物量的影响
由图3可知：菌株A的4种氮源处理的D(260)差异不显著(P＞0.05)，但豆饼粉的D(260)最高，分别较蛋白胨、酒石酸胺和尿素处理高出4.300%、3.000%和15.600%。菌株Q的D(260)在以豆饼粉为氮源时最高，且与其他处理差异显著(P＜0.05)，分别较蛋白胨、酒石酸胺和尿素处理高出6.700%、8.200%和14.400%。豆饼粉含大量碳水化合物、蛋白质及少量异黄酮类物质和可溶性多糖，可作为发酵的氮源及生长因子，有利于生物量的积累[20-21]。同时，豆饼粉来源稳定，价格低廉，能够快速被微生物利用，因此，选用豆饼粉为后续实验中菌株A和菌株Q的氮源。
图 3 氮源对2株木质素降解菌生物量的影响Figure 3 Effect of nitrogen source on the biomass of two lignin-degrading bacteria2.2.3 碳氮源添加量对2株木质素降解菌生物量的影响
由图4所示：菌株A在以木质素磺酸钠为最佳碳源时，添加量为2.500%、5.000%、10.000%处理间的D(260)差异不显著(P＞0.05)，但是数值相对较高。因此，菌株A的木质素磺酸钠选用2.500%、5.000%、10.000%添加量进行正交试验。菌株Q在以玉米粉为最佳碳源时，添加量为5.000%时D(260)值最高，与其他处理差异显著(P＜0.05)，0.625%、2.500%的D(260)也相对较高，因此，菌株Q的玉米粉选用0.625%、2.500%、5.000%添加量进行正交试验。菌株Q在添加量为5.000%时生物量达到最高，可能是由于在培养空间一定时，玉米粉的添加量越多，通气量降低，导致生物量的积累下降从而使菌株Q的生长受到了一定的抑制[16]。由图5可知：菌株A以豆饼粉为最佳氮源时，5种不同添加量处理的D(260)差异不显著(P＞0.05)。添加量为10.000%时D(260)最高，但是从经济角度考虑，最终选择豆饼粉添加量为1.250%、2.500%、5.000%进行正交试验。菌株Q以豆饼粉为最佳氮源时，添加量为1.250%、5.000%、10.000%时的D(260)显著高于另外2个添加量，因此选择这3个梯度进行正交试验。
图 4 碳源添加量对2株木质素降解菌生物量的影响Figure 4 Effect of carbon source addition on the biomass of two lignin-degrading bacteria
图 5 氮源接种量对2株木质素降解菌生物量的影响Figure 5 Effect of nitrogen source inoculum on the biomass of two lignin-degrading bacteria2.2.4 正交试验
由表1和表2可知：菌株A的碳氮源添加量为木质素磺酸钠5.000%、豆饼粉5.000%时D(260)最大，高达0.249。菌株Q的碳氮源添加量为玉米粉0.625%、豆饼粉10.000%时D(260)最大，高达0.261。因此选定菌株A的碳氮源添加量为木质素磺酸钠5.000%和豆饼粉5.000%，菌株Q的碳氮源添加量为豆饼粉10.000%和玉米粉0.625%。
表 1 菌株A正交设计试验L9(34)Table 1 Orthogonal design experiment of strain A L9 (34)处理 豆饼粉/% 木质素磺酸钠/% D(260) T1 1.250 2.500 0.228±0.009 T2 1.250 5.000 0.241±0.001 T3 1.250 10.000 0.207±0.018 T4 2.500 2.500 0.216±0.007 T5 2.500 5.000 0.213±0.008 T6 2.500 10.000 0.245±0.010 T7 5.000 2.500 0.237±0.010 T8 5.000 5.000 0.249±0.003 T9 5.000 10.000 0.241±0.007 表 2 菌株Q正交设计试验L9(34)Table 2 Orthogonal design experiment of strain Q L9 (34)处理 豆饼粉/% 玉米粉/% D(260) T1 1.250 0.625 0.101±0.003 T2 1.250 2.500 0.224±0.006 T3 1.250 5.000 0.214±0.005 T4 5.000 0.625 0.101±0.003 T5 5.000 2.500 0.162±0.008 T6 5.000 5.000 0.232±0.020 T7 10.000 0.625 0.261±0.003 T8 10.000 2.500 0.191±0.002 T9 10.000 5.000 0.102±0.003 2.3 外加营养组分筛选
由图6表明：菌株A的5种外加营养组分处理的D(260)差异不显著(P＞0.05)，但外加CaSO4、MgSO4、KH2PO4时的D(260)值最大，因此，这3种被定为最佳外加营养组分。微生物除了碳源和氮源，还需要一定量的无机盐来调节其生长代谢。镁盐作为许多重要酶的激活剂能够影响蛋白质的合成以及基质氧化；磷则是核酸和蛋白质的重要组成成分，能够影响微生物的生长[22]，这与本研究结果一致。
图 6 菌株A和菌株Q在不同营养组分培养基上的生长Figure 6 Growth of strain A and strain Q on the medium with different nutrient components2.4 均匀实验结合人工神经网络建模与优化
在以2.2.4和2.3实验结果为前提的条件下，设计6因素5水平10组的均匀实验。再通过神经网络对所有数据进行预测，得到实测值与仿真值的对比(表3和表4)。结果发现：各观察值与测量值误差较小，基本相同。综上，该模型预测值具备参考性。
表 3 菌株Q均匀实验设计及结果Table 3 Strain Q uniform test design and results试验号 因素水平(实际用量/%) D(260) MgSO4 KH2PO4 FeSO4·7H2O 接菌量 料水比 海藻糖 实测值1 1(0.600) 2(0.800) 3(1.000) 5(25.000) 7(1.00∶0.50) 10(16.000) 0.4110 仿真值1 1(0.600) 2(0.800) 3(1.000) 5(25.000) 7(1.00∶0.50) 10(16.000) 0.4109 实测值2 2(0.800) 4(1.200) 6(0.600) 10(25.000) 3(1.00∶0.65) 9(12.000) 0.4500 仿真值2 2(0.800) 4(1.200) 6(0.600) 10(25.000) 3(1.00∶0.65) 9(12.000) 0.4499 实测值3 3(1.000) 6(0.600) 9(1.200) 4(20.000) 10(1.00∶0.95) 8(8.000) 0.4800 仿真值3 3(1.000) 6(0.600) 9(1.200) 4(20.000) 10(1.00∶0.95) 8(8.000) 0.4801 实测值4 4(1.200) 8(1.000) 1(0.600) 9(20.000) 6(1.00∶0.30) 7(4.000) 0.4430 仿真值4 4(1.200) 8(1.000) 1(0.600) 9(20.000) 6(1.00∶0.30) 7(4.000) 0.4431 实测值5 5(1.400) 10(1.400) 4(1.200) 3(15.000) 2(1.00∶0.50) 6(0.000) 0.3860 仿真值5 5(1.400) 10(1.400) 4(1.200) 3(15.000) 2(1.00∶0.50) 6(0.000) 0.3859 实测值6 6(0.600) 1(0.600) 7(0.800) 8(15.000) 9(1.00∶0.80) 5(16.000) 0.4620 仿真值6 6(0.600) 1(0.600) 7(0.800) 8(15.000) 9(1.00∶0.80) 5(16.000) 0.4619 实测值7 7(0.800) 3(1.000) 10(1.400) 2(10.000) 5(1.00∶0.95) 4(12.000) 0.4630 仿真值7 7(0.800) 3(1.000) 10(1.400) 2(10.000) 5(1.00∶0.95) 4(12.000) 0.4635 实测值8 8(1.000) 5(1.400) 2(0.800) 7(10.000) 1(1.00∶0.30) 3(8.000) 0.2930 仿真值8 8(1.000) 5(1.400) 2(0.800) 7(10.000) 1(1.00∶0.30) 3(8.000) 0.2929 实测值9 9(1.200) 7(0.800) 5(1.400) 1(5.000) 8(1.00∶0.65) 2(4.000) 0.4450 仿真值9 9(1.200) 7(0.800) 5(1.400) 1(5.000) 8(1.00∶0.65) 2(4.000) 0.4453 实测值10 10(1.400) 9(1.200) 8(1.000) 6(5.000) 4(1.00∶0.80) 1(0.000) 0.4230 仿真值10 10(1.400) 9(1.200) 8(1.000) 6(5.000) 4(1.00∶0.80) 1(0.000) 0.4231 表 4 菌株A均匀试验设计及结果Table 4 Strain A uniform test design and results试验号 因素水平(实际用量/%) D(260) CaSO4 MgSO4 KH2PO4 接菌 料水比 海藻糖 实测值1 1(0.600) 2(0.800) 3(1.000) 5(25.000) 7(1.00∶0.50) 10(16.000) 0.3930 仿真值1 1(0.600) 2(0.800) 3(1.000) 5(25.000) 7(1.00∶0.50) 10(16.000) 0.3930 实测值2 2(0.800) 4(1.200) 6(0.600) 10(25.000) 3(1.00∶0.65) 9(12.000) 0.4020 仿真值2 2(0.800) 4(1.200) 6(0.600) 10(25.000) 3(1.00∶0.65) 9(12.000) 0.4020 实测值3 3(1.000) 6(0.600) 9(1.200) 4(20.000) 10(1.00∶0.95) 8(8.000) 0.4260 仿真值3 3(1.000) 6(0.600) 9(1.200) 4(20.000) 10(1.00∶0.95) 8(8.000) 0.4260 实测值4 4(1.200) 8(1.000) 1(0.600) 9(20.000) 6(1.00∶0.30) 7(4.000) 0.3930 仿真值4 4(1.200) 8(1.000) 1(0.600) 9(20.000) 6(1.00∶0.30) 7(4.000) 0.3930 实测值5 5(1.400) 10(1.400) 4(1.200) 3(15.000) 2(1.00∶0.50) 6(0.000) 0.3900 仿真值5 5(1.400) 10(1.400) 4(1.200) 3(15.000) 2(1.00∶0.50) 6(0.000) 0.3900 实测值6 6(0.600) 1(0.600) 7(0.800) 8(15.000) 9(1.00∶0.80) 5(16.000) 0.4320 仿真值6 6(0.600) 1(0.600) 7(0.800) 8(15.000) 9(1.00∶0.80) 5(16.000) 0.4320 实测值7 7(0.800) 3(1.000) 10(1.400) 2(10.000) 5(1.00∶0.95) 4(12.000) 0.4110 仿真值7 7(0.800) 3(1.000) 10(1.400) 2(10.000) 5(1.00∶0.95) 4(12.000) 0.4110 实测值8 8(1.000) 5(1.400) 2(0.800) 7(10.000) 1(1.00∶0.30) 3(8.000) 0.3650 仿真值8 8(1.000) 5(1.400) 2(0.800) 7(10.000) 1(1.00∶0.30) 3(8.000) 0.3650 实测值9 9(1.200) 7(0.800) 5(1.400) 1(5.000) 8(1.00∶0.65) 2(4.000) 0.3770 仿真值9 9(1.200) 7(0.800) 5(1.400) 1(5.000) 8(1.00∶0.65) 2(4.000) 0.3770 实测值10 10(1.400) 9(1.200) 8(1.000) 6(5.000) 4(1.00∶0.80) 1(0.000) 0.4210 仿真值10 10(1.400) 9(1.200) 8(1.000) 6(5.000) 4(1.00∶0.80) 1(0.000) 0.4210 2.5 菌株在优化后固体发酵培养基上的生长情况
如表5所示：按照人工神经网络算法模型预测的优化后固体发酵培养基进行实验验证，该优化条件下菌株Q的D(260)为0.6020，实测值为0.5960，误差为1.000%；预测得到菌株A的D(260)为0.4850，实测值为0.4780，误差为1.500%。
表 5 人工神经网络寻优结果Table 5 Optimization results of artificial neural network试验号 实际用量/% D (260) MgSO4 KH2PO4 FeSO4·7H2O 接菌量 料水比 海藻糖 菌株Q仿真值 1.434 0.115 1.497 6.000 1.000∶0.992 1.000 0.6020 菌株Q实测值 1.434 0.115 1.497 6.000 1.000∶0.992 1.000 0.5960 菌株A仿真值 0.123 0.213 1.280 21.000 1.000∶1.000 19.000 0.4850 菌株A实测值 0.123 0.213 1.280 21.000 1.000∶1.000 19.000 0.4780 3. 结论
本研究结果表明：人工神经网络算法优化后菌株Q的预测值为0.6020，实测值为0.5960，误差为1.000%；菌株A的预测值为0.485，实测值为0.478，误差为1.500%。基于人工神经网络构建的模型拟合度较好。
根据单因素试验和人工神经网络算法结果，确定了2株木质素降解菌的最优固体发酵条件。菌株Q：固体菌剂培养基基质为麸皮30.000 g作为基底，添加豆饼粉10.000%和玉米粉0.625%，外加营养组分为MgSO4 1.434%、KH2PO4 0.115%和FeSO4·7H2O 1.497%；接种条件为接菌量6.000%、料水比1.000∶0.992、保护剂1.000%。菌株A：固体菌剂培养基基质为麸皮30.000g作为基底，添加豆饼粉5.000%和木质素磺酸钠为5.000%，外加营养组分为MgSO4 0.123 %、KH2PO4 0.213 %、FeSO4·7H2O 1.280%；接种条件为接菌量21.000%、料水比1∶1、保护剂19.000%。
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图 1 南昌市平均降水量、平均气温图和试验土壤含水量、土壤温度动态图
Figure 1 Dynamic diagram of mean rainfall and medial temperature in Nanchang, and dynamic diagram of soil water content and soil temperature
图 3 不同聚丙烯酰胺添加和施肥对土壤含水量的影响
Figure 3 Effects of different polyacrylamide addition and fertilization on soil moisture content
图 4 不同聚丙烯酰胺添加和施肥对土壤N2O排放通量的影响
Figure 4 Effects of different polyacrylamide addition and fertilization on soil N2O emission flux
图 5 施磷肥对N2O累积排放量的影响
Figure 5 Influence of phosphate fertilizer on N2O cumulative emission
表 1 不同处理对土壤N2O排放通量、土壤含水量和N2O累积排放量的影响
Table 1. Effects of different treatments on soil N2O emission flux, soil moisture content and cumulative N2O emission
处理 df F N2O排放通量 土壤含水量 N2O累积排放量 N 1 5.41* 13.72** 1.35 P 1 6.27* 5.05* 5.41* N+P 1 2.23 4.19 0.49 C 2 0.66 200.89** 2.75 N+C 2 0.13 1.34 0.18 P+C 2 2.45 3.78* 2.24 N+P+C 2 3.13* 4.17* 1.71 说明：N表示施氮处理，P表示施磷处理，C表示施加聚丙烯 酰胺处理；*P＜0.05，**P＜0.01 
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