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干旱作为植物重要的非生物胁迫之一，是全球面临的重大环境问题，严重影响植物的生长、发育和生存[1]。植物会通过形态、生理生化、光合作用及分子水平等层次的响应抵御干旱胁迫[2−9]。植物受干旱胁迫伤害时，脂膜过氧化导致丙二醛(MDA)积累，使蛋白质和核酸变性，导致膜流动性降低，膜透性增强，因此MDA的多少可衡量植物细胞受伤害的程度[10]；活性氧保护酶过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)协同作用可有效清除植物体内过多的自由基，从而维持植物体内活性氧代谢系统的平衡[11−12]；植物还会积累可溶性糖等渗透调节物质以提高细胞保水能力，从而维持细胞的正常生理过程来响应干旱胁迫[13−15]；干旱胁迫还能破坏植物水分代谢，导致叶绿素分解，影响光能电子传递和转换、光合磷酸化及暗反应等过程，使植物光合速率下降，严重时还可导致叶绿体光合机构的破坏，对植物体造成不可逆影响。叶绿素荧光参数对干旱胁迫的响应非常灵敏，可作为监测光合作用过程中光能的吸收、传递、耗散和分配的指标，判断植物干旱胁迫的程度；董斌等[16]利用叶绿素荧光检测油茶Camellia oleifera的干旱抗性，选育出抗干旱的油茶品种。
植物根系利用细胞水势低于土壤水势的原理进行吸水，聚乙二醇6000(PEG 6000)可降低溶液水势，根系不易从周围吸收水分，从而造成干旱胁迫[17]。已有学者[18−19]利用不同质量分数PEG 6000模拟不同程度的干旱胁迫对小麦Triticum aestvum和玉米Zea mays的影响。铁皮石斛Dendrobium candidum是兰科Orchidaceae多年生草本植物，兼具很高的药用和观赏价值，分布于中国安徽、浙江、福建等地[20−21]。目前，已将铁皮石斛野生资源成功进行驯化和人工移栽，实现了铁皮石斛的大面积规模化产业种植和近野生栽培，不仅提高了铁皮石斛的经济价值，还推动中国中药材产业的可持续发展[22]。在铁皮石斛产业化种植和近野生栽培过程中，水分是一个重要的限制性生态因子，因缺水引起的干旱严重影响铁皮石斛的产量和品质，因此了解干旱胁迫下铁皮石斛生理生化和叶绿素荧光参数的变化特征，对研究铁皮石斛耐干旱机制及铁皮石斛的近野生栽培意义重大。近年来，已有关于干旱对铁皮石斛的生长和生理特性变化的报道。阮凌暄等[23]研究发现：随着PEG 6000模拟干旱胁迫时间的延长和胁迫强度的增加，3年生盆栽铁皮石斛叶片活性氧积累呈上升趋势，保护酶POD和SOD活性先增加后降低，第8天时达到最大值，叶片叶绿素最大荧光(Fm)、最大光化学效率(Fv/Fm)和光化学猝灭系数(qp)逐渐降低，光反应能力降低。吕朝燕等[24]研究指出：3年生盆栽铁皮石斛叶片净光合速率和气孔导度随干旱胁迫时间的延长呈先升高后降低的趋势，而胞间二氧化碳 (CO2)摩尔分数和蒸腾速率则相反，呈先降低再升高的趋势，认为铁皮石斛为干旱避免型植物。为进一步探讨铁皮石斛抵抗干旱胁迫的生理特性，本研究拟通过不同质量分数PEG 6000模拟干旱胁迫，对铁皮石斛幼苗MDA、可溶性糖和可溶性蛋白、POD、CAT等生理生化指标和叶绿素质量分数、叶绿素荧光参数等进行分析，探讨铁皮石斛幼苗抗旱的生理和叶绿素荧光特性，以期为铁皮石斛的品种选育及产业化栽培和近野生栽培技术的建立提供参考。
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试验材料铁皮石斛‘晶品1号’D. candidum ‘Jingpin No. 1’幼苗于光照1500~3000 lx和(25±2) ℃的植物组织培养室培养60 d，每天光照和黑暗时间分别为14 h和10 h。
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在MS液体培养基中添加不同质量分数PEG 6000(5%、10%、20%、30%)模拟干旱胁迫，以不含PEG 6000 的MS液体培养基为对照(ck)[25]。选择长势良好，生长较一致的‘晶品1号’幼苗，接种于不同质量分数PEG 6000的培养液中进行培养，光照1500~3000 lx，每天光照和黑暗时间分别为 14 h和10 h，培养温度(25±2) ℃，每个处理60株，处理后每隔2 d定时取5株植株叶片和茎段观察细胞学结构(分别记为D2、D4、D6、D8、D10和D12)；取5株混合样测定铁皮石斛幼苗的MDA、POD、CAT、可溶性糖、可溶性蛋白和叶绿素等各项生理生化指标，选择5株植株测定叶片的叶绿素各荧光参数。每个处理3个生物学重复。
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采用琼脂糖包埋法对铁皮石斛‘晶品1号’茎段和叶片进行固定。具体做法为：试验当天将新鲜茎段和叶片样品置于磷酸盐(PBS)缓冲溶液(pH 7.4)中，配制质量分数为5%琼脂糖凝胶，待凝胶温度为50~60 ℃时，将新鲜茎段和叶片置于凝胶中，于室温冷却至凝胶凝固，完成样品的固定；将固定好的茎段和叶片置于震荡切片机上进行横切，切片厚度为50~100 μm，切好的茎段和叶片横切片置于载玻片上，滴加1滴PBS缓冲液(pH 7.4)，盖上盖玻片，于莱卡荧光显微镜(Leica DM-4000)下观察茎段和叶片的细胞结构变化，并拍照记录[26]。
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采用硫代巴比妥酸法(TBA法)测定丙二醛(MDA)质量摩尔浓度[27−28]；采用愈创木酚法测定POD酶活性；紫外分光光度法的CAT活性测定[11]；蒽酮法测定茎段的可溶性糖质量分数[29]；考马斯亮蓝比色法测定可溶性蛋白质量分数[30]。
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用紫外分光度法测定叶片的叶绿素质量分数[31]。分别取不同处理‘晶品1号’幼苗叶片，去叶脉叶缘，剪碎叶片，将0.1 g新鲜叶片放入10 mL离心管，加入8 mL体积分数为95% 乙醇提取液，避光浸提 24 h后，测定波长 663、645和470 nm处吸光度，并计算叶绿素质量分数。
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采用便携式调制叶绿素荧光仪(PAM-2500)，于9:00—11:00，选择从上往下数的第3片叶子，先用暗适应夹夹住叶片暗适应20 min，然后开始测定不同质量分数PEG 6000处理的铁皮石斛‘晶品1号’幼苗叶片的电子传递速率(ETR)、qP、光合效率(α)、非化学猝灭系数(qNP)和Fv/Fm等叶绿素荧光参数。每个处理测定5株，每株测定3次，取平均值。
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通过Excel 2018 整理所有原始数据，Graphpad 8.0作图，SPSS 20 进行方差分析，并采用单因素方差分析法和新复极差法对数据进行差异性分析和显著性比较，误差线用标准差表示。显著性水平为0.05。
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PEG 6000模拟干旱胁迫处理不同时间对铁皮石斛幼苗丙二醛质量摩尔浓度的影响差异显著(P＜0.05)。不同质量分数PEG 6000模拟干旱胁迫处理2~8 d时的铁皮石斛幼苗茎段丙二醛比较稳定，说明短时间(≤8 d)的不同质量分数PEG 6000模拟干旱胁迫处理对铁皮石斛细胞膜的影响较小，而到第8天时丙二醛急剧上升，到第10天时达最大值，比同期ck组分别增加2.36 (5% PEG 6000)、2.43 (10% PEG 6000)、2.03 (20% PEG 6000)和2.50倍 (30% PEG 6000)(图1)，说明不同质量分数PEG 6000模拟干旱胁迫对铁皮石斛幼苗细胞膜造成不同程度的伤害，PEG 6000质量分数越高(30%)对铁皮石斛细胞膜的伤害越大，抵御干旱的能力下降。
图 1 PEG 6000模拟干旱胁迫后铁皮石斛幼苗丙二醛的变化
Figure 1. Change of MDA contents in D. candidum seedlings under PEG 6000 simulated drought stress
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PEG 6000模拟干旱胁迫处理不同时间对铁皮石斛幼苗CAT和POD活性的影响差异显著(P＜0.05)。由图2A可以看出：铁皮石斛幼苗CAT活性随着不同质量分数PEG 6000处理时间的延长呈先上升后下降的趋势，且在处理10 d时CAT活性达到最高值，12 d时CAT活性下降(图2A)；铁皮石斛幼苗CAT活性随着PEG 6000质量分数的增加呈先上升后下降的趋势，PEG 6000质量分数为20%时CAT活性明显高于其他处理，且在处理第10天时，CAT活性是ck组的3.87倍；PEG 6000质量分数为30%时CAT活性降低，可能由于高质量分数PEG 6000可使细胞脱水，严重影响细胞正常生活，降低CAT活性。
图 2 PEG 6000模拟干旱胁迫后铁皮石斛幼苗CAT和POD活性的变化
Figure 2. Changes of CAT and POD enzyme activities in D. candidum seedlings after PEG 6000 simulated drought stress
由图2A和图2B可知：PEG 6000模拟干旱胁迫后，铁皮石斛幼苗POD活性的变化趋势与CAT活性基本一致。没有PEG 6000处理的铁皮石斛幼苗的POD活性几乎保持不变，随着PEG 6000处理时间延长，铁皮石斛POD活性均呈现先上升后下降的趋势，在处理第8天时达到最高值(图2B)，而后开始缓慢下降；PEG 6000模拟干旱处理后铁皮石斛幼苗POD活性均高于ck组，且随着PEG 6000质量分数的增加，POD活性呈先上升后下降的趋势，当PEG 6000质量分数为20%时达到峰值，为119×16.67 nkat·min−1·g−1 (图2B)。
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PEG 6000模拟干旱胁迫处理不同时间对铁皮石斛幼苗可溶性糖和可溶性蛋白质量分数的影响差异显著(P＜0.05)。可溶性糖不仅能够为植物提供碳源物质，还能维持一定的渗透压。从图3A可看出：铁皮石斛幼苗的可溶性糖质量分数随着PEG 6000质量分数的增加和处理时间的延长均呈上升趋势，到第12天时达最高，且随着PEG 6000质量分数的增加，可溶性糖质量分数呈上升趋势，PEG 6000为30%时，可溶性糖上升显著，说明铁皮石斛植株受到不同质量分数PEG 6000模拟干旱胁迫时，通过增加可溶性糖来维持植物体内细胞的渗透压。
图 3 PEG 6000模拟干旱胁迫后铁皮石斛幼苗可溶性糖和可溶性蛋白质量分数的变化
Figure 3. Changes of soluble sugar and soluble protein contents in D. candidum seedlings after PEG 6000 simulated drought stress
从图3B可知：不同质量分数PEG 6000处理对铁皮石斛幼苗的可溶性蛋白质量分数有显著影响(P＜0.05)，且随着PEG 6000处理时间的延长，铁皮石斛幼苗的可溶性蛋白质量分数均呈下降趋势，且在处理相同时间，PEG 6000质量分数越高，铁皮石斛幼苗的可溶蛋白质量分数越少。当PEG 6000质量分数为30%时，可溶性蛋白质量分数在第8~10天时下降。此时蛋白质分解加速，合成减少，说明铁皮石斛幼苗可在一定程度上消耗可溶性蛋白来调节适应 PEG 6000的胁迫处理，但需要一定的胁迫强度和时间。
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由图4A可知：PEG 6000模拟干旱胁迫对铁皮石斛幼苗茎段和叶片叶绿素质量分数有显著影响(P＜0.05)。随着PEG 6000模拟干旱胁迫时间的延长，铁皮石斛幼苗叶绿素质量分数呈现逐渐减少的趋势，在PEG 6000模拟干旱处理2~8 d时，叶绿素质量分数呈现缓慢下降的趋势，到第10天时，叶绿素质量分数急剧下降，较同一时间的ck分别下降了32.01% (5%PEG 6000)、35.03% (10%PEG 6000)、44.07% (20%PEG 6000)和57.06% (30%PEG 6000)，且随着PEG 6000质量分数的增加，叶绿素下降幅度明显增加。方差分析结果表明：不同质量分数PEG 6000处理对铁皮石斛幼苗叶绿素质量分数的有显著的影响(P＜0.05)。对不同质量分数PEG 6000处理12 d时铁皮石斛幼苗茎段和叶片琼脂糖包埋震荡切片观察发现：铁皮石斛茎段和叶片细胞内叶绿素随着PEG 6000质量分数的增加而减少(图4B)，与测得叶绿素质量分数的结果一致。
图 4 PEG 6000模拟干旱胁迫处理后铁皮石斛幼苗叶绿素质量分数(A)及在茎和叶上的分布(B)
Figure 4. Chlorophyll contents (A) and its distribution on stems and leaves (B) of D. candidum seedlings after PEG 6000 simulated drought stress treatment
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由图5A和5B可知：PEG 6000模拟干旱胁迫对铁皮石斛幼苗处理不同时间对α和ETR的影响差异显著(P＜0.05)。随着PEG 6000胁迫处理时间的延长和PEG 6000质量分数的增加，α和ETR均呈下降趋势，在4~8 d时下降的幅度最大。与ck组相比，随着PEG 6000质量分数的增加，α下降幅度增大(图5A)。在PEG 6000 为30%处理时ETR下降幅度最大，PEG 6000为20%和30%处理12 d时ETR达到最低(图5B)，说明PEG 6000胁迫处理会使铁皮石斛幼苗的光合作用减弱，且随着胁迫程度增加，光合作用减弱的幅度越大。这与PEG 6000胁迫处理下铁皮石斛叶绿素质量分数降低的结果一致。
图 5 PEG 6000模拟干旱胁迫后铁皮石斛幼苗光合效率和电子传递速率的变化
Figure 5. Changes of photosynthetic efficiency and electron transfer rate of D. candidumseedlings after PEG 6000 simulated drought stress
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由图6A可知：Fv/Fm随着不同质量分数PEG 6000处理时间的延长呈逐渐下降的趋势，在PEG 6000处理第2天时，Fv/Fm为0.723~0.743。未添加PEG 6000处理在第2~8天时，铁皮石斛幼苗Fv/Fm为0.703~0.743，说明光能转换正常，但到第10~12天时，Fv/Fm显著下降(P＜0.05)，光转换效率降低，可能由于长时间液体培养会对铁皮石斛幼苗生长产生不利影响。随着PEG 6000质量分数的增加，Fv/Fm呈现显著下降趋势(P＜0.05)，低质量分数PEG 6000 (5%)处理后第2~8天，Fv/Fm为0.698~0.713，说明低质量分数PEG 6000对铁皮石斛幼苗PSⅡ的损伤较小，而第8~12天逐渐下降；10%~30%PEG 6000处理后第4天，Fv/Fm开始显著下降，说明铁皮石斛幼苗受到模拟干旱胁迫后，植株的最大光能转换效率降低，PSⅡ受到胁迫损伤，严重影响铁皮石斛幼苗的光合作用。
图 6 PEG 6000模拟干旱胁迫后铁皮石斛幼苗叶绿素荧光参数的变化
Figure 6. Changes of chlorophyll fluorescence parameters of D.candidum seedlings after PEG 6000 simulated drought stress
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荧光猝灭主要有光化学猝灭和非光化学猝灭，光化学猝灭是由碳代谢酶光活化和气孔开放引起的PSⅡ电子传递速率增加，光化学猝灭系数(qP)一定程度上反映PSⅡ反应中心的开放程度；非光化学猝灭是由能量转变导致的热耗散效率增加，qNP为非光化学猝灭系数。非光化学猝灭是一种保护途径，通过热耗散消耗过剩的光能，使光合机构免受伤害[32−33]。PEG 6000模拟干旱胁迫对铁皮石斛幼苗处理不同时间对qNP和qP的影响差异显著(P＜0.05)。由图6B可知：不同质量分数PEG 6000处理均使qP在第2~12天逐渐降低，且随着PEG 6000质量分数的增加而下降，说明PSⅡ反应中心的开放程度随之降低，参加光化学反应的激发能量明显降低，过剩的光能就会增加。由图6C可看出：当PEG 6000质量分数为0~10%时，铁皮石斛幼苗qNP随着处理时间的延长呈先上升后下降的趋势，PEG 6000为0和5%时，在处理的第10天qNP达最高值(0.584和0.593)，PEG 6000为10%时于第8天qNP达最高值(0.509)；PEG 6000为20%和30%时，铁皮石斛幼苗qNP随着处理时间的延长持续下降，说明低质量分数PEG 6000胁迫下，非光化学猝灭途径发挥了保护作用，qNP增大；但随着处理时间的延长或在高质量分数PEG 6000胁迫下，qNP自我保护机制达到一定限度，导致光合反应受到伤害，无法逆转，使qNP呈现持续下降的趋势。
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干旱是全球性环境问题之一。植物不能逃避恶劣的自然环境条件，只能加速适应各种逆境。大多数植物可改变自身的生理生化指标来响应干旱逆境胁迫，以维持植物正常生长。
MDA是细胞膜受到逆境胁迫伤害引起的膜脂过氧化产物，MDA质量摩尔浓度是判断植物细胞膜受到伤害程度的重要指标，MDA质量摩尔浓度越高说明细胞膜受伤程度越大[28, 34−35]。本研究中，铁皮石斛幼苗MDA质量摩尔浓度随PEG 6000质量分数和处理时间不同存在差异，短时间(≤8 d) PEG 6000模拟干旱胁迫处理后铁皮石斛幼苗MDA变化不大，对细胞膜影响较小，而长时间(≥10 d)处理后MDA急剧上升，且PEG 6000质量分数越高，MDA质量摩尔浓度越高，因此，PEG 6000模拟干旱程度增加会导致细胞膜受到极大的伤害，膜脂过氧化程度也越大。这与构树Broussonetia papyrifera[36]、北美红栎Quercus rubra[37]和大豆Glycine max[38]幼苗在干旱胁迫时MDA的变化一致。
小分子渗透调节物质葡萄糖、果糖、蔗糖等可溶性糖能通过渗透调节平衡细胞渗透势，提高细胞保水能力而维持细胞的正常生理过程。同时，干旱胁迫会导致植物细胞膜受损，透性增大，引起膜脂过氧化反应，会对蛋白质造成伤害，因此细胞内可溶性糖和蛋白变化能够稳定渗透调节能力，是反映植物抗旱性的有效指标之一[14, 39]。本研究中，铁皮石斛幼苗可溶性糖质量分数随PEG 6000质量分数和胁迫处理时间的延长呈上升趋势，说明铁皮石斛幼苗细胞通过积累可溶性糖来提高细胞液浓度，降低细胞膜的渗透势，维持体内细胞的渗透压保持自身正常的生理过程。这与玉米的可溶性糖质量分数随干旱胁迫的加剧逐渐升高的变化趋势一致[40]。在处理时间相同时，PEG 6000质量分数越高，铁皮石斛幼苗可溶性蛋白质量分数越低，说明干旱环境对铁皮石斛细胞造成极大的伤害。
植物体内较低的活性氧不会对植物细胞产生伤害[41]，而当植物受干旱胁迫时活性氧的代谢平衡被严重破坏，活性氧增多，攻击植物蛋白质上各种氨基酸残基，使蛋白质和叶绿素等分子解体，从而对植物细胞产生各种毒害作用。POD、CAT等保护酶能有效抑制和清除植物体内的各种活性氧和自由基[42]。本研究表明：PEG 6000模拟干旱处理铁皮石斛幼苗后，POD和CAT活性都呈现先上升后下降的趋势，POD和CAT酶活性的大幅提高大大增强对活性氧的抵抗能力和对植物光合机构的保护能力。该结果与三叶草Trifolium repens受到干旱胁迫时POD和CAT的活性变化一致[25]。因此，植物受干旱胁迫时通过提高相关保护酶活性来保持体内活性氧平衡。
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叶绿素是光合作用最重要的色素，光合作用时叶绿素吸收能量，为CO2转变为碳水化合物提供能量；水分是叶绿素的合成原料，干旱胁迫能使叶绿素合成减缓及叶绿素解体，直接导致叶绿素质量分数降低。本研究中PEG 6000模拟干旱处理铁皮石斛幼苗后，茎段和叶片叶绿素质量分数明显降低，与PEG模拟干旱胁迫不同抗逆性棉花Gossypium hirsutum的叶绿素变化趋势一致[43]。
叶绿素荧光和植物光合作用关系密切，当强光持续照射植物时，为了有效避免植物叶绿体内吸收的光能超过光合作用中发生光化学反应的能量消耗及过量的光能灼伤植物光合作用机构，植物以荧光的方式耗尽消散掉部分光能以起重要保护作用；自然条件下叶绿素荧光和植物光合速率呈负相关，叶绿素荧光变弱时光合速率就高，反之亦然。植物遭受胁迫的程度与光合作用的叶绿素荧光特性有着密切的关系[44]。本研究中，PEG 6000模拟干旱处理铁皮石斛幼苗，Fv/Fm、qP、ETR均呈下降趋势，表明PEG 6000干旱胁迫对植物光合作用产生了伤害；PEG 6000干旱胁迫使铁皮石斛幼苗qNP呈上升趋势，说明铁皮石斛幼苗通过启动非光化学猝灭途径来大量消耗PSⅡ反应中心吸收的过剩光能。随着PEG 6000胁迫的不断加重，qNP也开始呈现明显下降的趋势，可能是由于热耗散机制受阻，无法使耗散掉吸收的过剩光能，导致光系统受到不可逆转的损伤，影响光合作用。因此，植物受到干旱胁迫时光合作用能力降低从而影响植物的正常生长。
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通过研究对铁皮石斛幼苗进行PEG 6000模拟干旱胁迫处理后的生理和叶绿素荧光特性，发现铁皮石斛幼苗具有一定的抗旱能力，在适当干旱条件下可通过自身调节来达到正常生长的目的，但也有一定限度。在较低PEG 6000质量分数(≤5%)胁迫时，可以通过调节代谢实现自我保护，在高质量分数PEG 6000 (≥20%)时，干旱胁迫会损伤植物，影响生理过程和光合作用。20% PEG 6000胁迫10 d可作为铁皮石斛抗干旱品种筛选的标准；铁皮石斛幼苗可通过增加可溶性糖，减少可溶性蛋白，提高POD和CAT等防御酶活性抵抗和适应一定程度的干旱胁迫(≥20%PEG 6000处理≥10 d)；铁皮石斛幼苗的最大光能转换效率降低，PSⅡ受到胁迫损伤，同时，铁皮石斛幼苗通过启动qNP途径来消耗PSⅡ反应中心吸收的过剩光能，维持正常的光合作用。因此，可溶性糖和可溶性蛋白、防御酶POD和CAT以及叶绿体荧光参数均可作为铁皮石斛的耐干旱指标。
Effects of PEG 6000 simulated drought stress on physiological and chlorophyll fluorescence characteristics of Dendrobium candidum seedlings
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摘要:
目的 研究聚乙二醇6000(PEG 6000)模拟干旱对铁皮石斛Dendrobium candidum生理和叶绿素荧光特性的影响，为铁皮石斛的品种选育、产业化栽培和近野生栽培等提供参考。 方法 以铁皮石斛‘晶品1号’D. candidum ‘Jingpin No. 1’幼苗为实验材料，通过不同质量分数PEG 6000 (5%、10%、20%、30%)模拟干旱胁迫处理铁皮石斛幼苗，观察铁皮石斛幼苗茎段和叶片细胞结构，并检测铁皮石斛叶片过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)质量摩尔浓度、可溶性糖质量分数、可溶性蛋白质量分数、叶绿素质量分数及叶绿素荧光参数的动态变化。 结果 ①高质量分数PEG 6000 (20%~30%)处理后铁皮石斛茎段和叶片细胞内叶绿素质量分数减少。②PEG 6000模拟干旱胁迫处理对铁皮石斛幼苗可溶性糖和可溶性蛋白、MDA、POD和CAT有显著影响(P＜0.05)。可溶性糖质量分数随着PEG 6000质量分数的增加和处理时间的延长均呈上升趋势，到第12天时达最高值；可溶性蛋白则呈下降趋势；MDA质量摩尔浓度、POD活性和CAT活性随着PEG 6000质量分数的增加呈先上升后下降的趋势，在PEG 6000为20%时达到峰值。③PEG 6000模拟干旱处理对铁皮石斛幼苗最大光化学效率(Fv/Fm)、光合效率(α)、电子传递速度(ETR)、光化学猝灭系数(qP)和非化学猝灭系数(qNP)等叶绿素荧光参数有显著的影响(P＜0.05)。随着PEG 6000胁迫处理时间的延长和PEG 6000质量分数的增加，α、ETR、Fv/Fm和qP均呈显著下降趋势(P＜0.05)；而qNP则呈先上升后下降的趋势。 结论 20% PEG 6000处理12 d可用作铁皮石斛抗干旱品种的筛选，铁皮石斛幼苗可通过增加可溶性糖质量分数，减少可溶性蛋白质量分数，提高POD和CAT活性等防御酶活性抵抗和适应一定程度的干旱胁迫；铁皮石斛幼苗的最大光能转换效率降低，光合系统Ⅱ(PS Ⅱ)受到胁迫损伤，严重影响铁皮石斛幼苗的光合作用。同时，铁皮石斛幼苗通过启动qNP途径来消耗PSⅡ反应中心吸收的过剩光能，维持正常的光合作用。因此，可溶性糖和可溶性蛋白、POD和CAT以及叶绿体荧光参数均可作为铁皮石斛耐干旱的指标。图6参44 Abstract:Objective The objective is to study the effects of PEG 6000 simulated drought on physiological and chlorophyll fluorescence characteristics of Dendrobium candidum, so as to provide reference for variety selection, industrial cultivation, and near wild cultivation of D. candidum. Method The seedlings of D. candidum ‘Jingpin No. 1’ were used as experimental materials and treated with PEG 6000 at different concentrations to simulate drought stress. The stem segment and leaf cell structure of D. candidum seedlings were observed, and the dynamic changes of peroxidase (POD), catalase (CAT) activity, malondialdehyde (MDA), soluble sugar, soluble protein, chlorophyll content and chlorophyll fluorescence parameters in D. candidum leaves were detected. Result (1) The content of chlorophyll in the stem and leaf cells of D. candidum decreased after treatment with high concentration of PEG 6000 (20%−30%). (2) PEG 6000 simulated drought stress significantly affected the content of soluble sugar and protein, MDA, POD and CAT activity of D. candidum seedlings. The soluble sugar content increased with the increase of PEG 6000 concentration and the extension of treatment time, reaching its highest value on the 12th day, while the soluble protein showed a downward trend. MDA content, POD and CAT activity increased first and then decreased with the increase of PEG 6000 concentration, reaching the peak at a PEG 6000 concentration of 20%. (3) PEG 6000 simulated drought treatment of D. candidum seedlings significantly affected chlorophyll fluorescence parameters such as maximum photochemical efficiency (Fv/Fm), photosynthetic efficiency (α), electron transfer rate (ETR), photochemical quenching coefficient (qP) and non-chemical quenching coefficient (qNP). With the extension of PEG 6000 stress treatment time and the increase of PEG 6000 concentration, α, ETR, Fv/Fm and qP showed a significant downward trend, while qNP showed a trend of first increasing and then decreasing. Conclusion 20% PEG 6000 treatment for 12 days can be used as a method for screening drought resistant varieties of D. candidum, which can resist and adapt to a certain degree of drought stress by increasing the content of soluble sugar, reducing the content of soluble protein and improving the activities of defense enzymes such as POD and CAT. The maximum light energy conversion efficiency of D. candidum seedlings decreases, and the photosystemⅡ (PSⅡ) is damaged by stress, which seriously affect the photosynthesis of D. candidum seedlings. At the same time, D. candidum seedlings consume the excess light energy absorbed by the PSⅡ reaction center by activating the qNP pathway to maintain normal photosynthesis. Therefore, soluble sugars and protein, POD and CAT, and chloroplast fluorescence parameters can all be used as indicators of drought resistance in D. candidum. [Ch, 6 fig. 44 ref.] -
核桃Juglans regia 为胡桃科Juglandaceae胡桃属Juglans植物[1]，其种仁含油量高，有“木本油料之王”的称号[2]。同时，核桃木材坚实，是良好的硬木材料。作为重要的经济林树种，核桃大多种植于土壤贫瘠的山坡沟坎，不与粮争地[3]。然而，核桃树体高大，与其他果树相比对矿质营养元素需求量较高，大量元素与核桃产量和品质形成紧密相关[4]，因此，提高核桃树体对矿质元素的吸收能力对于提高核桃产量和品质至关重要[5]。研究表明：在核桃树各器官中种仁的氮素质量分数最高，核桃树吸收累积的矿质营养元素中氮素被商品核桃(种仁、硬壳)携走的比例也最高，叶片次之[6]。可见，氮素可能是提高核桃产量和品质的关键营养元素。然而，过量施用氮肥会导致严重的环境问题，因此，提高氮素利用效率是提高核桃产量与品质的重中之重[7]。
土壤中氮素主要分为无机氮和有机氮两大类，植物根系能够吸收利用的主要是无机氮，主要以硝态氮和铵态氮形式存在[8−9]。植物根系对无机氮转运调节途径可分为2种，即高亲和力(HATs)和低亲和力(LATs)的氮转运系统[10]，HATs 在外部铵态氮( ${\rm{NH}}_4^ +$)、硝态氮(${\rm{NO}}^ -_3 $)浓度低于 0.5 mmol·L−1时介导吸收大部分的无机氮，而 LATs 则是在 ${\rm{NH}}_4^ + $、${\rm{NO}}_3^ - $浓度高于 0.5或 1.0 mmol·L−1时介导吸收无机氮[10]。植物对铵态氮和硝态氮的吸收主要由铵转运蛋白和硝酸转运蛋白介导。土壤中同时含有植物可吸收利用的硝态氮和铵态氮时，由于植物吸收硝态氮需要先将其还原成铵态氮后才能进行同化利用，消耗的能量更多，所以植物对铵态氮表现出明显的偏好性，而且当植物受盐胁迫及活性氧的伤害时，铵态氮具有缓解作用，因此，介导植物对铵态氮吸收的铵转运蛋白在植物氮同化中起着重要作用[11]。铵转运蛋白基因主要有两大类族，分为AMT1和AMT2。在已知的铵转运蛋白中大部分 AMT1 家族的转运蛋白属于高亲和转运体[12]，如拟南芥Arabidopsis thaliana中有6个编码铵转运蛋白被鉴定，包括5个AMT1家族基因，1个AMT2家族基因。AMT1家族基因中，AtAMT1.1和AtAMT1.3对拟南芥根系铵态氮吸收的贡献率最高，为30%，AtAMT1.2、AtAMT1.5对拟南芥根系高亲和铵态氮吸收的贡献率略低于AtAMT1.1和AtAMT1.3[13]，AtAMT1.4在花粉中特异性表达[14]，在水稻Oryza sativa铵转运蛋白基因家族中AMT1家族有基因3个，其中OsAMT1.1和OsAMT1.2为高亲和力转运体[15]；而 AMT2 家族以低亲和为主，在拟南芥AMT2家族基因中AtAMT2.1 在低亲和范围内适度促进拟南芥根系对铵态氮吸收，主要在铵从根部到地上部运输中发挥作用[16]。AMT2 型蛋白通常在植物的不同组织中包括根、芽和叶中都有表达，如AtAMT2.1基因在拟南芥各器官中均有表达，主要表达在拟南芥的维管束及上皮层[17]，在拟南芥中AtAMT2.1与AtAMT1s之间还存在协同作用。此外，毛果杨Populus trichocarpa PtAMT2.1主要在叶片中，PtAMT2.2在叶柄中高表达。除此之外，玉米Zea mays[18]、番茄Lycopersicon esculentum [19]、欧洲油菜Brassica napus [20]等高等作物均鉴别出了AMT基因，但到目前为止，研究大多集中于高亲和的铵转运蛋白AMT1基因家族，对低亲和的铵转运蛋白AMT2基因家族的研究较少。因此，阐明AMT2的生物学功能和调控机制，对于提高核桃自身的氮效率和提高肥料利用效率都具有重要意义。
本研究以核桃JrAMT2过表达株系为供试材料，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及生理检测的方法鉴定JrAMT2基因在核桃植株体内的表达模式，进一步对核桃JrAMT2基因进行生物学功能分析，为核桃优良品种选育提供理论依据。
1. 材料和方法
1.1 植物材料
实验材料来自浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室保存的核桃野生型(WT)以及课题组2019年获得的核桃JrAMT2过表达阳性植株 [21]，其中JrAMT2基因构建于PCMBIA1300植物表达载体，载体抗性为卡那霉素(kanmycin，Kan)，利用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3103菌株介导将构建好的35S::JrAMT2::GFP过表达载体转化到核桃野生型体细胞胚中，植物筛选标记为潮霉素(hygromycin，Hyg)。本研究所用核桃组培苗为野生型体胚和JrAMT2过表达阳性体胚经脱水萌发获得，温室苗则由上述组培苗经生根、炼苗、驯化获得。
1.2 实验方法
1.2.1 生物信息分析运用
SOPMA(
https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html )网站在线分析JrAMT2蛋白质二级结构，运用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ )在线软件对JrAMT2 蛋白进行跨膜结构域的预测，通过 GSDS(http://gsds.gao-lab.org/ )软件在线分析JrAMT2基因结构。1.2.2 植株的培养
同一JrAMT2过表达阳性体胚萌出的植株为1个株系，选取3个核桃JrAMT2阳性株系，命名为JrAMT2-1、JrAMT2-2、JrAMT2-3，每个株系继代培养至50株以上，培养条件：温度为 25 ℃，湿度为 75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗，培养基为Driver&Kunivuki&McGranahan (DKW)培养基。
采用2步生根法获得核桃驯化植株，选取阳性体胚萌发后经4次继代培养的核桃组培苗作为实验材料。第1步进行根诱导，5~8 cm长的光生芽，转移到补充有10 mg·L−1吲哚丁酸钾(K-IBA)的DKW固体培养基，在黑暗中培养7 d，诱导根原基的发生；第2步，不定根诱导结束后将其转移到粗蛭石∶DKW培养基比例(体积比)为3∶2的固体培养基中，温度为25 ℃，湿度为75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗，培养时间为21~28 d，形成不定根，获得核桃不同株系生根植株[22]。
核桃苗不定根形成后取出用清水冲洗，多菌灵浸泡，移栽到泥炭∶蛭石∶珍珠岩比例(体积比)为2∶1∶1的混合土中，将移栽驯化成活后获得的核桃再生植株在温度为 25 ℃，湿度为 75%~80%，光照强度为2~15 klx，光照周期为16 h光照8 h黑暗的条件下培养[23]，获得核桃不同株系温室植株。
1.2.3 核桃JrAMT2基因阳性鉴定
选用阳性体胚萌发后经4次继代培养的核桃组培苗进行绿色荧光蛋白(GFP) 检测、PCR及RT-qPCR验证，引物见表1。从再生植株顶芽开始向下截取 1.5 cm，培养14 d 后观察植株表型，每个株系均5个生物学重复。选取植株顶芽、叶片、茎段混样提取DNA及RNA。 PCR 反应程序为：94 ℃预变性 2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火温度 30 s，68 ℃延伸 2 min，共 32 个循环；68 ℃延伸 7 min，PCR 反应产物进行质量分数为1.2%琼脂糖凝胶电泳。使用 The iQ5 Real-Time PCR Detection System 仪器进行RT-qPCR，测定转基因植株中JrAMT2的相对表达量。反应程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，40 个循环；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 15 s。通过 2−ΔΔCt方法计算定量结果[24]。
表 1 引物Table 1 Primers引物 序列(5′→3′) 用途 Actin-F GCCGAACGGGAAATTGTC 内参 Actin-R AGAGATGGCTGGAAGAGG 内参 QJrAMT2-F AGCAAATGGGGTTCCAGGTT 定量 QJrAMT2-R TGTCTCCCGCAGATAGAAGGTA 定量 GFP-F ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 鉴定 GFP-R TTACTTGTACAGCTCGTCCA 鉴定 JrAMT2-F CATGAATACCACACCGGCCTA 鉴定 取核桃野生型及核桃JrAMT2过表达株系组培苗的根、茎、小叶，根纵切、茎横切临时切片分别放置于体视荧光显微镜(Carl Zeiss Stereo D13covery V12，Axio Cam MRc system)在明场和蓝光(488 nm)激发条件下利用 ZEN lite 成像软件连续拍照[25-26]。
1.2.4 生长参数、铵态氮和硝态氮测定
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，从顶尖向下剪取1.5 cm茎段，含2~4片复叶，培养14 d，每个株系均5个生物学重复，测量株高及节间数。选取长势相同的核桃野生型及JrAMT2过表达植株采用2步生根法驯化，移栽后用直尺测量统计不同株系生长0、20、40 d的株高、节间长、叶片长度及叶片宽度。
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，培养14 d，采用2步生根法获得核桃生根植株，植株分为地上部分及地下部分2个部分，清洗植株，分别测定地上部分及地下部分鲜质量，于105 ℃下杀青，80 ℃烘干至恒量，称取干质量。使用苏州科铭生物技术有限公司的植物铵态氮(ZATD-1-G)和植物硝态氮(ZXTD-1-G)试剂盒测定地上部分及地下部分铵态氮和硝态氮质量分数，每个株系均5个生物学重复。
1.2.5 植株叶绿体观察、叶绿素质量分数及叶绿素荧光测定
分别选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗，取顶尖向下第2节间处复叶。将该叶片置于0.35 mol·L−1氯化钠中研磨破碎至絮状，取悬液于高倍光学显微镜下观察，找到视野中单个完整的叶肉细胞，观察细胞中的叶绿体, 使用image J软件计算叶绿体表面积与单层细胞表面积比率。每个株系均5个生物学重复。
采用丙酮浸取法测定叶绿素质量分数。分别取0.1 g核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系组培苗长势一致的叶片，剪碎，置于15 mL离心管中，加入10 mL体积分数 80%丙酮溶液，于室温黑暗处浸提，直至管内材料褪色变白，以80%丙酮溶液为对照，测定663和646 nm处吸光值，每个株系均5个生物学重复。wt=[(wa+8wb)×Vt×(mFW×1 000)−1]，叶绿素 a 质量分数(wa) =20.3×D(646)，叶绿素 b 质量分数(Cb)=8.04×D(663)。其中：wt为叶绿素质量分数(mg·g−1)，Vt为提取液总体积(mL)，mFW为叶片鲜质量(g)，D(646)和D(663)分别为646和663 nm处的吸光度。
叶绿素荧光测定使用M-PEA(multi-function plant efficiency analyser)多功能植物效率分析仪(英国Hansatech公司)测定。选取生长状态一致的核桃野生型与3个核桃JrAMT2过表达株系温室苗由上向下第3片叶片暗处理30 min，在饱和脉冲光(5 000 μmol·m−2·s−1) 下进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线) 的测定和绘制。参照SCHANSKE等[27]的方法分析叶绿素荧光诱导动力学参数(JIP-test)。
1.2.6 数据分析
利用SPSS 26软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比较(邓肯法)，显著性水平为0.05。使用GraphPad Prism 7.0软件绘图。
2. 结果与分析
2.1 核桃JrAMT2基因生物信息学分析
核桃 JrAMT2基因的全长为 1 464 bp，起始密码子为 ATG，终止密码子为 TGA。经过美国国家生物技术信息中心(NCBI)在线序列比对显示：该基因的序列编码的氨基酸序列属于 Ammonium Transporter Family，编码487个氨基酸(图1)，蛋白分子量为52.458 kD，预测分子式为C2433H3715N601O646S23，含有7 418个原子，理论等电点为7.11，不稳定指数为35.61，脂溶指数为101.56，亲水性平均值为0.472。该段蛋白质中包含20种常见氨基酸：亮氨酸质量分数最高，达到11.7%，其次分别为甘氨酸11.1%，丙氨酸10.9%，缬氨酸8.6%，半胱氨酸质量分数最低，仅为1.0%。JrAMT2蛋白中分别含有29个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和29个碱性氨基酸残基(Arg+Lys) (表2)。
表 2 JrAMT2基因氨基酸组成Table 2 Composition of JrAMT2 amino acids氨基酸 数量/个 占比/% 氨基酸 数量/个 占比/% 氨基酸 数量/个 占比/% 丙氨酸 53 10.90 组氨酸 9 1.80 苏氨酸 27 5.50 精氨酸 11 2.30 异亮氨酸 25 5.10 色氨酸 18 3.70 天冬酰胺 16 3.30 亮氨酸 57 11.70 酪氨酸 17 3.50 天冬氨酸 15 3.10 赖氨酸 18 3.70 缬氨酸 42 8.60 半胱氨酸 5 1.00 甲硫氨酸 18 3.70 吡咯赖氨酸 0 0.00 谷氨酰胺 11 2.30 苯丙氨酸 24 4.90 晒半胱氨酸 0 0.00 谷氨酸 14 2.90 脯氨酸 24 4.90 甘氨酸 54 11.10 丝氨酸 29 6.00 对核桃JrAMT2蛋白跨膜区的预测结果表明：该蛋白N端在膜外，C端存在膜内，共含有11个跨膜螺旋，跨膜螺旋区段分别位于24~46、59~81、129~151、158~180、195~214、227~244、254~276、288~310、314~333、346~368和398~420，推测JrAMT2属于跨膜蛋白，并在N端存在信号肽(图2A)。
对JrAMT2 蛋白二级结构的预测结果显示：JrAMT2的氨基酸组成中有4种构象，其中 α- 螺旋有 201 个氨基酸，占比 43.12%；延伸链有 93个氨基酸，占比19.10%；β- 转角有 30个氨基酸，占比 6.16%；无规则卷曲有154个氨基酸，占比 31.62%。JrAMT2 铵转运蛋白主要由 α- 螺旋和无规则卷曲组成(图2B)。
对JrAMT2基因结构的分析显示：JrAMT2基因由4个外显子，3个内含子组成。与拟南芥AtAMT2基因相比，拟南芥基因结构多了1个外显子和1个内含子，与山核桃Carya cathayensis CcAMT2基因[28]、栓皮栎Quercus suber QsAMT2基因[29]相比，外显子和内含子数量相同，同源性较高(图2C)。
2.2 核桃JrAMT2过表达植株阳性验证
在成功构建35S::JrAMT2::GFP的过表达载体并通过农杆菌介导转化核桃体胚后，对同一无性系JrAMT2体胚经脱水萌发获得的再生植株进行阳性鉴定。利用PCR技术，以核桃JrAMT2过表达植株3个株系(JrAMT2-1、JrAMT2-2和JrAMT2-3) DNA为模板，进行外源GFP基因(729 bp)的PCR验证，检测到大小约为 750 bp的电泳条带，与GFP基因大小符合(图3A)；进行目的基因JrAMT2加外源GFP基因全长(2193 bp)的PCR验证，检测到大小为2000 bp的电泳条带，与目的基因大小符合(图3B)；以核桃JrAMT2过表达植株3个株系的cDNA为模板，利用实时定量PCR技术对JrAMT2基因表达量进行检测，结果显示：核桃JrAMT2过表达植株3个株系JrAMT2基因相对表达量分别为野生型的10.58、12.80和14.94倍，显著上调(图3C)，表明核桃JrAMT2过表达植株中JrAMT2基因稳定表达。
图 3 PCR 和RT-qPCR 对核桃组培苗的JrAMT2基因的检测Figure 3 Detection of JrAMT2 gene in J. regia tissue culture seedlings by PCR and qRT-PCR对获得的过表达株系进行GFP荧光阳性鉴定，分别将核桃过表达及野生型幼苗(图4A)的小叶、茎、根置于荧光体视显微镜下在波长为488 nm蓝光激发下拍摄。结果显示：过表达植株的小叶、茎、根表面呈现均匀的绿色荧光，其中腋芽处荧光更明亮(图4B1~6)，野生型核桃幼苗的小叶、茎、根在荧光下拍摄无绿色荧光激发(图4B7~12)，说明JrAMT2蛋白在腋芽处积累。为进一步研究JrAMT2基因在核桃幼苗中的表达，对过表达株系及野生型组培苗的茎段进行横切，根进行纵切后，进行GFP荧光检测，结果显示：核桃JrAMT2过表达植株茎段横切中呈现均匀的绿色荧光，其中在维管组织中荧光更明亮，野生型植株茎段横切面无绿色荧面光(图4B1~12)；核桃JrAMT2过表达植株根段纵切面中呈现均匀的绿色荧光，且在维管组织中荧光更明亮，野生型植株根段纵切面无绿色荧光(图4C1~8)。表明JrAMT2基因在核桃幼苗的根和茎中均可稳定表达，其中JrAMT2蛋白在根和茎的维管束组织中积累。
图 4 铵态氮转蛋白基因JrAMT2在核桃苗中稳定表达Figure 4 Stable expression of ammonium nitrogen transfer protein gene JrAMT2 in J. regia2.3 核桃JrAMT2基因的生物学功能分析
2.3.1 核桃JrAMT2过表达植株生长表型分析
为了进一步研究核桃JrAMT2基因的生物学功能，将3个JrAMT2过表达植株与野生型核桃植株培养14 d。结果表明：与野生型相比，核桃JrAMT2过表达植株均生长旺盛，株高显著增加，节间显著增长(P＜0.05，图5A)。3个JrAMT2过表达株系株高分别为3.87、4.23和4.12 cm，节间长分别为0.33、0.35和0.34 cm，野生型植株株高为3.30 cm，节间长为0.28 cm，与野生型相比，3个JrAMT2过表达株系株高分别增加了17.0%、28.0%和29.0% (图5B)，节间长分别增加了19.0%、25.0%和24.0% (图5C)。综上所述，JrAMT2过表达对核桃幼苗的生长有显著提高作用。
图 5 核桃JrAMT2过表达离体培养植株表型分析Figure 5 Phenotypic analysis of J. regia JrAMT2 overexpression plant in vitro culture对核桃JrAMT2过表达植株进一步驯化培养，成功获得核桃JrAMT2过表达温室苗。对其生长表型进行分析(图6A)，定植后培养40 d，核桃JrAMT2过表达温室苗的株高、节间长、叶片长度、叶片宽度增加显著高于野生型(P＜0.05)。培养至第20天时，与野生型相比，核桃JrAMT2过表达温室苗3个株系株高分别增加21.9%、26.0%和24.6% (图6B)，节间长分别增加41.2%、27.7%和26.3% (图6C)，叶片长度分别增加18.7%、16%和30.7% (图6D)，叶片宽度分别增加41.3%、48.2%和55.1% (图6E)；培养至第40天时，与野生型相比，JrAMT2过表达温室苗3个株系株高分别增加53.6%、68.2%和62.1%，节间长分别增加37.2%、50.3%和44.8%，叶片长度分别增加了27.8%、34.1%和49.3%，叶片宽度分别增加24.3%、19.5%和29.2%。综上所述，核桃JrAMT2过表达温室苗与野生型相比，株高、节间长、叶片大小均显著增加，进一步证明JrAMT2基因过表达加快了核桃的生长速度。
图 6 核桃JrAMT2过表达阳性温室苗性状分析Figure 6 Character analysis of J. regia JrAMT2 overexpression positive greenhouse seedlings2.3.2 核桃JrAMT2过表达植株对氮素吸收分析
为探究JrAMT2基因在核桃中是否存在差异表达，将核桃野生型及核桃JrAMT2过表达植株进行2步生根，获得核桃JrAMT2过表达生根植株，将其分为地上部分与地下部分。与野生型相比，核桃JrAMT2过表达生根植株地下部分不定根生长旺盛(图7A)。对核桃JrAMT2过表达植株地上部分及地下部分差异分析，分别提取3个核桃JrAMT2过表达株系生根植株地上部分及地下部分RNA，利用实时定量PCR技术，分析地上部分及地下部分JrAMT2基因表达的差异。结果表明：3个JrAMT2过表达株系地上部分JrAMT2基因表达量分别是野生型的11.94、12.70和15.06倍，地下部分JrAMT2基因表达量分别是野生型的19.07、23.34和24.00倍(图7B)。对核桃野生型及3个JrAMT2过表达株系地上部分及地下部分进行干质量和鲜质量测定。结果表明：3个JrAMT2过表达株系地上部分鲜质量和干质量显著高于野生型(P＜0.05)，与野生型相比，鲜质量分别增加23.45%、33.67%和56.26%，干质量分别增加23.45%、43.89%和56.26%；3个JrAMT2过表达株系地下部分干质量和鲜质量显著高于野生型(P＜0.05)，与野生型相比，鲜质量分别增加222.65%、199.24%和344.38%，干质量分别增加222.65%、199.24%和354.33%(图7C)。
图 7 核桃JrAMT2过表达植株氮素吸收分析Figure 7 Character analysis of the regenerated plants with expression of JrAMT2 in J. regia基于核桃JrAMT2过表达植株表型变化，本研究进一步测定核桃JrAMT2过表达植株对硝态氮及铵态氮吸收。结果表明：与野生型相比，核桃3个JrAMT2过表达株系地上部分及地下部分铵态氮质量分数显著增加(P＜0.05)，地上部分分别增加59.1%、32.3%和55.1%，地下部分别增加68.1%、61.9%和114.1% (图7D)；核桃3个JrAMT2过表达株系地上部分硝态氮质量分数显著降低(P＜0.05)，地下部分硝态氮质量分数显著增加(P＜0.05)，地上部分分别降低10.1%、7.1%和13.6%，地下部分别增加63.5%、75.7%和70.3% (图7E)。综上所述，JrAMT2基因主要作用于核桃地下部分，且JrAMT2基因过表达促进植株地下部分对铵态氮和硝态氮的吸收，并介导了铵态氮从地下部到地上部的运输。
2.3.3 核桃JrAMT2过表达植株叶绿素质量分数及叶绿素荧光特性分析
对核桃JrAMT2过表达植株叶色与叶片细胞叶绿体进行观察。核桃JrAMT2过表达植株叶色与野生型相比颜色较深(图8A)，在显微镜下观察3个核桃JrAMT2过表达植株株系及野生型叶绿体特征发现，3个核桃JrAMT2过表达株系扩张的栅栏叶肉细胞中的叶绿体更致密(图8B)。进一步分析发现：对3个阳性株系进行总叶绿素质量分数测定，3个核桃JrAMT2过表达株系叶绿素质量分数显著高于野生型(P＜0.05)，野生型总叶绿素质量分数为3.53 mg·g−1，核桃JrAMT2过表达阳性植株3个株系总叶绿素质量分数分别为4.64、4.69和6.10 mg·g−1，与野生型相比分别增加了32.6%、34.0%和74.3% (图8C)；JrAMT2过表达株系叶绿体表面积在单层细胞表面积的占比显著高于野生型(P＜0.05)，野生型叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率为0.56，3个核桃JrAMT2过表达株系叶绿体表面积与单层细胞表面积的比值分别为0.67、0.68和0.69，与野生型相比分别增加了19.41%、21.18%和22.94% (图8D)。综上所述，JrAMT2基因过表达提高了叶绿体表面积与单层细胞表面积的比率及核桃叶肉细胞内叶绿素的积累。
图 8 核桃JrAMT2过表达植株叶绿体及叶绿素质量分数分析Figure 8 Analysis of chloroplast and chlorophyll content in J. regia with JrAMT2 overexpression对3个核桃JrAMT2过表达株系进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线测定。结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系的O (Fo点)相、K相降低，J点、I点、P (Fm)及J~P点振幅均提高，OJIP曲线较陡，表明JrAMT2基因一定程度上提高了叶片的活性(图9A)。与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系暗适应后的最大荧光强度(Fm)、最大量子产额(Fv/Fm)均提高，Fm分别提高了47.1%、45.9%、50.2%，Fv/Fm分别提高了15.6%、13.4%、14.7%，表明JrAMT2基因一定程度上提高了光系统Ⅱ(PSⅡ)的光化学效率(图9B)。计算归一化处理的OJIP曲线(Vt)[Vt =(Ft−Fo /(Fm−Fo)，Ft为任意时刻t的荧光值]，并计算相对荧光差异ΔVt[ΔVt = Vt处理−Vt对照，用ΔK、ΔJ值分别显示在300 μs和20 ms处的ΔVt值，表示放氧复活体的活性(OEC)]。结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系ΔK、ΔJ值下降且＜0 (图9C)，表明JrAMT2基因一定程度上提升了核桃叶片PSⅡ供体侧及受体侧电子传递效率及放氧复活体的活性。
图 9 铵态氮转运蛋白JrAMT2基因表达对核桃叶绿素荧光的影响Figure 9 Effect of ammonium nitrogen transporter JrAMT2 gene on chlorophyll fluorescence of J. regia用JIP-test参数对OJIP曲线进行定量分析，结果显示：核桃3个JrAMT2过表达株系在t=0时的最大光化学效率(φPo)、反应中心捕获的光能用于${\rm{Q}}_{\rm{A}}^- $下游电子传递的量子产量(ΨEo)、吸收的能量用于电子传递的量子产量(φEo)上升，分别上升了14.62%、44.59%、65.80%；在J点的相对可变荧光强度(VJ)、最小荧光强度与最大荧光强度比值(Fo/Fm)、反应中心关闭净速率(dV/dto)下降，分别下降了31.03%、35.29%、49.34% (图9D)，表明JrAMT2基因一定程度上提高了PS反应中心的量子比率及产额；对单位PS反应中心比活性参数分析，结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系在t=0 时的单位反应中心捕获的用于电子传递的能量(ETo/RC)、在t=0 时的单位反应中心传递到电子链末端的能量(REo/RC)无明显变化，在t=0 时单位反应中心吸收的能量(ABS/RC)、在t=0 时单位反应中心耗散的能量(DIo/RC)、在 t=0 时单位反应中心捕获的用于还原QA的能量(TRo/RC)显著下降，分别为36.43%、58.67%、27.22%，表明JrAMT2基因一定程度提高了核桃叶片反应中心活性和用于电子传递的能量份额，增强了电子传递能力(图9E)；对单位受光截面比活性参数分析，结果显示：与野生型相比，3个核桃JrAMT2过表达株系在 t=tFM(暗适应后达到最大荧光强度时间点)时的单位受光截面耗散的能量(DIo/CSm)无明显变化，在 t=tFM时单位受光截面吸收的能量(ABS/CSm)、在t=tFM时单位受光截面捕获的用于还原QA的能量(TRo/CSm)、在 t=tFM时单位受光截面捕获的用于电子传递的能量(ETo/CSm)、在t=tFM时单位受光截面传递到电子链末端的能量(REo/CSm)上升，分别上升了 47.79%、69.39%、145.10%、303.62%(图9F)，表明JrAMT2基因一定程度提高核桃叶片单位受光截面的电子传递的份额及电子传递效率。综上所述，JrAMT2基因过表达促进核桃的光合作用。
3. 讨论
氮素作为植物生长发育必不可少的营养元素，是核酸、蛋白质、酶、叶绿素、植物激素等的重要组成部分[30]。自然界中可供利用的氮素资源有限，作物高产就需要化肥的投入。中国的化肥投入总量逐渐升高，但化肥利用率很低，给自然环境带来极大的负担 [31−32]，因此合理使用化肥，提高作物对氮素的吸收效率是促进农业生态化发展的重要途径。铵转运蛋白基因AMTs是广泛存在于动物、植物、微生物中用于运输${\rm{NH}}_4^+ $的载体蛋白，从分子层面提高植物对氮素的利用具有重要意义。前人研究发现：在拟南芥中，氮饥饿能诱导AtAMT1.1、AtAMT2.1基因上调表达，并且AtAMT2基因的表达水平随着氮饥饿时间的延长而增加[33-34]。在充足或高氮条件下，观察到拟南芥中AtAMT2.1及水稻根中OsAMT1.2基因表达水平仍上调 [35-36]，其中氮素形态对AMT基因转录水平的调控也取决于AMT基因个体和植物物种。
本研究对核桃JrAMT2过表达植株进行初步的功能验证，对JrAMT2基因进行生物信息学分析表明：JrAMT2蛋白中含有29个酸性氨基酸残基(Asp+Glu)和29个碱性氨基酸残基(Arg+Lys)。该蛋白N端在膜外，C端存在膜内，共含有11个跨膜螺旋结构域，与李畅[36]预测的OsAMT2.1蛋白结构域特点相同，且与夏金泽等[37]研究的木薯Manihot esculenta MeAMT2.6基因的蛋白结构相似。AMT2 型蛋白通常在植物的各种组织中表达，包括根、芽和叶。前人研究发现：杜梨 Pyrus betulifolia PbAMT2基因在所有器官中均有表达，但在根部表达最高[38]。在拟南芥中发现：AtAMT2.1基因主要在维管组织中表达，在芽中的表达高于根[15]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株进行绿色荧光观察发现：JrAMT2蛋白在核桃苗整株均有表达，且在芽及根茎的维管束中荧光更明亮，说明与拟南芥相同，核桃JrAMT2蛋白在所有器官中表达，且主要在维管组织中表达。
在植物生长发育重要阶段充足的氮素营养供给可以促进其生长发育，增加产量，对植物外施氮素能增加植株株高及叶面积[39]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株生长性状分析发现：JrAMT2基因在核桃中过表达对植株生长发育有调控作用，主要表现在过表达植株株高、节间长显著增加。对过表达植株生根驯化结果显示：过表达植株生物量显著增加，根系发达。对核桃JrAMT2过表达植株移栽驯化，定植后植株生长速率显著高于野生型，主要表现在节间伸长快，叶面积增加。AMT2是具有铵吸收功能的铵转运蛋白，且在维管组织表达，暗示着该基因可能参与铵向木质部的装载，介导铵在植物中的长距离运输。研究发现：拟南芥AtAMT2.1除了对根吸收氮素有一定贡献外，主要作用于${\rm{NH}}_4^+ $从根部到茎部的运输[40]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株地上部分和地下部分基因表达测定发现：植株地下部分JrAMT2基因表达量显著高于地上部分，且植株地下部分生物量的增加显著高于地下部分，说明核桃JrAMT2基因主要在地下部分表达。对核桃JrAMT2过表达植株对铵态氮和硝态氮吸收测定结果表明：核桃JrAMT2过表达植株地上部分仅对铵态氮的吸收显著上调，地下部分对铵态氮与硝态氮的吸收均显著上调，说明JrAMT2基因促进植株对铵态氮和硝态氮的吸收，并介导了铵态氮从地下部分到地上部分的运输。氮素营养还会通过影响叶绿素合成和叶绿素荧光参数的变化来参与光能的利用和调控[41]。有研究表明：水稻OsAMT2.1基因敲除株系的光合特性与野生型相比出现下降趋势，同样说明了AMT2基因对植物光合作用有调控作用[36]。本研究对核桃JrAMT2过表达植株叶绿素质量分数及叶绿素荧光参数变化的测定结果显示：JrAMT2基因显著提高了核桃的叶绿体表面积与单层细胞表面积比率、叶绿素质量分数及叶绿素荧光参数中叶片放氧复活体活性、量子产额、电子传递效率。
4. 结论
JrAMT2作为铵态氮转运基因，促进核桃对铵态氮和硝态氮的吸收，且介导铵态氮从根部到茎部的运输，对核桃生长发育、光合作用等有积极作用，对研究核桃高效利用氮素及良种的筛选有重要意义。
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图 1 PEG 6000模拟干旱胁迫后铁皮石斛幼苗丙二醛的变化
Figure 1 Change of MDA contents in D. candidum seedlings under PEG 6000 simulated drought stress
图 2 PEG 6000模拟干旱胁迫后铁皮石斛幼苗CAT和POD活性的变化
Figure 2 Changes of CAT and POD enzyme activities in D. candidum seedlings after PEG 6000 simulated drought stress
图 3 PEG 6000模拟干旱胁迫后铁皮石斛幼苗可溶性糖和可溶性蛋白质量分数的变化
Figure 3 Changes of soluble sugar and soluble protein contents in D. candidum seedlings after PEG 6000 simulated drought stress
图 4 PEG 6000模拟干旱胁迫处理后铁皮石斛幼苗叶绿素质量分数(A)及在茎和叶上的分布(B)
Figure 4 Chlorophyll contents (A) and its distribution on stems and leaves (B) of D. candidum seedlings after PEG 6000 simulated drought stress treatment
图 5 PEG 6000模拟干旱胁迫后铁皮石斛幼苗光合效率和电子传递速率的变化
Figure 5 Changes of photosynthetic efficiency and electron transfer rate of D. candidumseedlings after PEG 6000 simulated drought stress
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