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高温会引起植物细胞成分、细胞组织结构和新陈代谢的变化[1-2]，严重时导致植物叶片萎蔫甚至死亡，是限制植物分布及生长的主要环境因子。与动物相比，植物不能移动，只能利用自身抵抗热害的能力来应对自然界中出现的高温热害，这种抵抗热害的能力就是耐热性[3]。植物的耐热性可以通过施用生长调节剂，如钙(主要为氯化钙)[4]、水杨酸[1-3]等或高温锻炼来提高。植物在非致死高温处理(即热锻炼)下可以获得耐热性[5-9]，通过感知温度信号并将这些信号转导成生物化学过程来启动温度锻炼，最终导致耐热性的发展[8]。热锻炼处理能使植物叶肉细胞及叶绿体在高温下保持结构稳定[8, 10]，减少活性氧积累[8]，提高抗氧化酶活性，调节渗透物质积累[11]，减少光抑制[12]等，从而提高植物耐热性。热锻炼能提高亚洲百合Asiatic lilies[13]，灰岩皱叶报春Primula forrestii和滇北球花报春Primula denticulate ssp. sinodenticulata[10]，菊花Chrysanthemum[11]等园林植物的耐热性，但针对热锻炼提高杜鹃花Rhododendron耐热性的研究迄今亦未见报道。周广等[14]通过多年对杜鹃花的引种驯化研究，发现高温热害是影响杜鹃花引种驯化和应用的主要因子。探究如何提高杜鹃花的耐热性，使其更加广泛地应用到园林中，是园林工作者亟待解决的问题。本研究以杜鹃花品种‘状元红’Rhododendron ‘Zhuangyuan Hong’生长健壮植株为试材，研究热锻炼对植物叶片解剖结构、光合作用和生理特征(包括细胞膜系统、渗透调节系统以及酶促抗氧化系统)变化的影响，揭示热胁迫下热锻炼处理对杜鹃花耐热性的影响及其作用机理，为杜鹃花的引种驯化以及园林应用提供理论依据。
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供试杜鹃花品种‘状元红’购于浙江嘉善，在陕西杨凌新天地日光温室[温度(25±1) ℃]培养，生长健壮。选取栽植于塑料盆里的大小一致的‘状元红’18盆，1株·盆-1。栽培基质为V(松针):V(泥炭土)＝1:2。试验在西北农林科技大学林学院实验楼人工气候箱中进行，处理光照度约为12 000 lx，光周期14 h，相对湿度80%。花盆随机摆放，2 d浇1次水并互换位置以减少位置的影响。试验开始前所有植株在22 ℃下适应3 d，随后随机选择一半植株移到30 ℃下热锻炼处理6 d，另一半依然置于22 ℃作为对照。6 d后，将处理组和对照组植株各取6盆并分成2组，转移到重度高温(38 ℃)和极端高温(42 ℃)下进行6 d胁迫试验，并把经过热锻炼的余下的3盆转移到人工气候箱(22 ℃)培养6 d。整个试验设6个处理(表 1)。
表 1 试验中的6个处理
Table 1. 6 treatments in this trial
处理 T热锻炼/℃ T热胁迫/℃ ckA 22 22 TA 30 22 ckB 22 38 TB 30 38 ckC 22 42 TC 30 42 -
处理结束后选取各盆植株从顶端开始数的第3片叶，将它们迅速切成3 mm × 1 mm大小，用体积分数为4%的戊二醛溶液固定过夜，之后用磷酸缓冲液漂洗，梯度乙醇依次脱水，并进行乙酸异戊酯置换，用K-850CO2临界点干燥仪(Quorum，英国)干燥，E-1045离子溅射仪(HITACHI，日本)喷金，再用JSM-6360LV钨灯丝扫描电子显微镜(JEOL，日本)进行观察拍照，记录叶片栅栏、海绵等组织排列情况。用Nano Measure 1.2测量软件测量叶片叶肉组织厚度，并计算栅栏海绵组织比、叶片组织结构疏松度(RS)和叶片组织结构紧密度(RCT)。栅栏海绵组织比＝栅栏组织厚度/海绵组织厚度×100%；叶片组织结构疏松度(RS)＝海绵组织厚度/叶片厚度×100%；叶片组织结构紧密度(RCT)＝栅栏组织厚度/叶片厚度×100%。
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使用LI-6400便携式光合荧光仪(LI-COR，美国)测定叶片的净光合速率(Pn)，气孔导度(Gs)，蒸腾速率(Ts)，细胞间隙二氧化碳摩尔分数(Ci)。测定时叶室面积为6 cm2，样品室流速设为500 μmol·s-1。
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处理结束后选取植株中部叶位的叶片测定各项生理参数。称取叶片0.1 g·次-1，重复测定3次。利用过氧化氢(H2O2)测试盒(南京建成生物工程研究所，A064)测定过氧化氢质量摩尔浓度，采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)质量摩尔浓度。采用蒽酮比色法测定可溶性糖质量分数，试剂盒法测定可溶性蛋白质质量分数(南京建成生物工程研究所，A045)，酸性茚三酮显色法测定游离脯氨酸(Pro)质量分数。并采用氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性，愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性，紫外吸收法测定过氧化氢酶(CAT)活性。
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利用Excel和IBM SPSS Statistics 19进行数据处理和方差分析，检验不同处理间的差异显著性。
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叶片是植物发展进化过程中对环境改变敏感且可塑性较大的器官，环境的变化常导致叶肉栅栏组织、海绵组织等解剖结构的响应与适应。由图 1可以看出：在38 ℃热胁迫下，相比未经过热锻炼的植株，经过热锻炼处理的植株栅栏组织细胞皱缩程度较轻，排列也较整齐；海绵组织则稍显疏松。在42 ℃热胁迫下，未经热锻炼的植株叶片海绵组织皱缩严重，栅栏组织细胞皱缩，其栅状排列几不可见；经热锻炼的植株叶片栅栏组织细胞皱缩但仍保持其栅状排列，海绵组织结构则严重破坏。结果表明，经热锻炼预处理的‘状元红’植株叶片能在热胁迫下较好地保持栅栏组织结构的稳定性。
图 1 各处理下‘状元红’叶片叶肉组织解剖结构
Figure 1. Mesophyll tissue anatomical structure of the leaves in 'Zhuangyuan Hong ' under each treatment
栅栏海绵组织比是栅栏组织厚度与海绵组织厚度的比值，可用叶片组织结构紧密度与组织结构疏松度的比值表示。叶片组织结构紧密度越大或组织结构疏松度越小，栅海比越大。从表 2可知，对照温度下，经热锻炼和未经热锻炼处理对叶片栅海比无显著影响。42 ℃时各处理叶片的栅海比与38 ℃时要低。而在同一热胁迫下，热锻炼组栅海比比对照组要高，在38 ℃时高24.8%，42 ℃时高31.3%。检测叶片组织结构紧密度发现，在对照温度下，热锻炼处理后叶片组织结构紧密度显著低于未经锻炼的叶片。38 ℃下热锻炼的叶片组织结构紧密度则有所增加，但差异不显著。42 ℃时热锻炼处理的叶片组织结构紧密度比未经锻炼的叶片增加了13.0%，差异显著。检测叶片组织结构疏松度发现，对照温度下，热锻炼对叶片组织结构疏松度没有显著差异。但当温度达到38 ℃和42 ℃时，热锻炼叶片组织结构疏松度值分别显著低于未经热锻炼的叶片。
表 2 不同温度下热锻炼对叶片叶肉组织结构的影响
Table 2. Effects of heat acclimation on mesophyll structure under different temperatures
处理 栅栏海绵组织比/% 叶片组织结构紧密度/% 叶片组织结构疏松度/% ckA 80.073±3.353 A 37.348±1.065 A 47.549 ± 0.907 B TA 69.917±1.449 AC 32.627±0.499 B 46.988 ± 0.583 B ckB 51.882±2.129 D 30.063±0.848 B 59.098 ± 2.041 A TB 64.747±2.435 BC 30.627±0.707 B 48.091 ± 1.380 B ckC 48.473±1.668 D 27.068±0.688 C 56.618 ± 1.196 A TC 63.656±1.285 C 30.589±0.453 B 48.491 ± 0.629 B 说明：同列不同大写字母表示任意两值之间在0.05概率水平差异显著 -
光合作用是植物对热胁迫最为敏感的生理过程之一[15]。表 3为热锻炼对‘状元红’叶片光合作用参数的影响。由表 3可知：在对照温度下，经热锻炼的植株叶片净光合速率(Pn)高于未经锻炼的叶片，表明此时植株光合作用受到影响，但差异不显著；在同一热激水平下，经热锻炼的植株叶片净光合速率均显著高于未经锻炼的叶片。对照温度下，经热锻炼的叶气孔导度(Gs)显著高于未经锻炼的叶片；在38 ℃胁迫下经热锻炼的叶片叶气孔导度值低于未经锻炼的叶片；而在42 ℃胁迫下则是高于未经热锻炼的叶片，但差异均不显著。高温胁迫时，经热锻炼的植株叶片胞间二氧化碳摩尔分数(Ci)均低于未经锻炼的叶片，38 ℃下，两者相差了25.5%，差异显著。测定叶片蒸腾速率(Ts)值发现，对照温度下，经热锻炼的叶片蒸腾速率值显著高于未经锻炼的叶片；38 ℃下经热锻炼的叶片蒸腾速率低于未经锻炼的叶片，42 ℃下则高于未经锻炼的叶片，但差异均不显著。
表 3 不同温度下热锻炼对叶片光合参数的影响
Table 3. Effects of heat acclimation on photosynthetic parameters under different temperatures
处理 Pn/(μmol·m-2·s-1) Gs/(mol·m-2·s-1) Ci/(μmol·mol-1) Ts/(mmol·m-2·s-1) ckA 2.471 ± 0.133 AC 0.029 ± 0.002 BD 190.793 ± 13.258 C 0.635 ± 0.055 B TA 2.512 ± 0.247 A 0.040 ± 0.006 A 228.181 ± 10.190 B 0.913 ± 0.059 A ckB 1.521 ± 0.200 BD 0.037 ± 0.002 AB 252.698 ± 26.497 B 0.826 ± 0.049 AB TB 2.330 ± 0.130 AC 0.030 ± 0.005 BC 201.296 ± 16.634 C 0.573 ± 0.080 B ckC 0.062 ± 0.010 F 0.021 ± 0.003 BD 337.407 ± 25.947 A 0.417 ± 0.027 B TC 0.110 ± 0.008 E 0.026 ± 0.002 ACD 314.980 ± 6.492 A 0.521 ± 0.048 B 说明：同列不同大写字母表示任意两值之间在0.05概率水平差异显著 -
高温影响细胞膜结构和活性氧积累，使得膜脂质过氧化，加重膜损害。从表 4可以看出，过氧化氢及MDA质量摩尔浓度变化趋势相同。在对照温度下，热锻炼对过氧化氢及MDA质量摩尔浓度的影响不显著。随着热胁迫程度的增加，过氧化氢及MDA质量摩尔浓度均减少。在38 ℃时，相比于未经锻炼的叶片，经热锻炼的叶片中过氧化氢质量摩尔浓度显著降低，MDA质量摩尔浓度变化则不显著。在42 ℃时，过氧化氢与MDA质量摩尔浓度变化均不显著。
表 4 不同温度下热锻炼对叶片过氧化氢和MDA质量摩尔浓度的影响
Table 4. Effects of heat acclimation on molality of H2O2 and MDA under different temperatures
处理 bH2O2/(mol·kg-1) bMDA/(mmol·kg-1) ckA 59.587 ± 3.945 E 0.036 ± 0.007 B TA 70.924 ± 7.977 DE 0.037 ± 0.005 B ckB 228.488 ± 6.828 A 0.054 ± 0.003 B TB 121.314 ± 7.414BCD 0.046 ± 0.002 B ckC 280.276 ± 9.703 AC 0.097 ± 0.007 A TC 233.264 ± 19.765 AB 0.083 ± 0.014 AB 说明：同列不同大写字母表示任意两值之间在0.05概率水平差异显著 -
热胁迫下，植物通过细胞内溶质积累完成渗透调节，调节细胞水分环境的变化[13]。由表 5可以看出：在对照温度下，经热锻炼的‘状元红’植株叶片可溶性糖、可溶性蛋白质、游离脯氨酸质量分数均高于未经锻炼的植株叶片；随着热胁迫温度上升，热锻炼组中所有可溶性物质质量分数均低于未经锻炼组。胁迫温度达38 ℃时，热锻炼对可溶性糖、可溶性蛋白质质量分数影响差异不明显，对游离脯氨酸影响显著；胁迫温度达42 ℃时，热锻炼组叶片中可溶性糖、可溶性蛋白质均低于未锻炼组，且差异显著，但游离脯胺酸质量分数差异仍不明显。
表 5 不同温度下热锻炼对叶片可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸质量分数的影响
Table 5. Effects of heat acclimation on mass fraction of soluble sugar, soluble protein and pro under different temperatures
处理 w可溶性糖/(g·kg-1) w可溶性蛋白质/(g·kg-1) w游离脯氨酸/(mg·kg-1) ckA 5.21±0.56 C 3.069±0.232 B 22.047±2.353 C TA 5.38±0.43C 3.630±0.519B 22.756±2.327 C ckB 8.74±0.07B 5.719±0.516B 115.291±5.328 B TB 6.21±0.49B 3.375±0.683 B 71.060±1.693 D ckC 14.06±1.75A 13.091±0.436 A 238.044±9.924 A TC 9.63±0.28B 5.802±0.719B 198.695±15.290 AB 说明：同列不同大写字母表示任意两值之间在0.05概率水平差异显著 表 6 不同温度下热锻炼对叶片SOD, POD和CAT活性的影响
Table 6. Effects of heat acclimation on activity of SOD, POD and CAT under different temperatures
处理 SOD活性/(×16.67 nkat·g-1) POD活性/(×16.67 nkat·g-1·min -1) CAT活性/(×16.67 nkat·g-1·min -1) ckA 145.137 ± 10.347 B 380.339 ± 49.563 B 1 086.137 ± 98.127 A TA 191.140 ± 19.028 AB 213.361 ± 26.763 C 320.016 ± 0485 D ckB 257.455 ± 11.576 A 1 602.143 ± 182.715 AB 677.987 ± 35.843 B TB 203.359 ± 17.149 AB 355.912 ± 35.592 B 640.641 ± 0.370 B ckC 288.862 ± 6.454 A 639.578 ± 1.126 B 603.951 ± 34.782 B TC 277.837 ± 11.447 A 2 238.180 ± 4.294 A 959.962 ± 1.663 B 说明：同列不同大写字母表示任意两值之间在0.05概率水平差异显著 -
热胁迫下，植物体内活性氧产生与清除的平衡被打破，活性氧积累。SOD, POD和CAT是植物体内清除活性氧的重要保护酶[14]。对照温度下，经热锻炼的叶片中SOD活性高于未经锻炼的叶片；在38 ℃和42 ℃ 2个热胁迫水平下，经热锻炼的叶片SOD活性则低于未经锻炼的叶片，但差异并不明显。POD及CAT活性与SOD变化趋势相同，对照温度下，经热锻炼的叶片中POD及CAT活性均显著低于未经锻炼的叶片；38 ℃高温下，热锻炼组叶片POD及CAT活性均较低；42 ℃高温下，热锻炼组叶片CAT活性较高但与未锻炼组叶片差异并不显著，而POD活性则高出约2.5倍，差异显著。
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热锻炼能有效提高植株耐热性，降低热胁迫引起的伤害，如减缓高温引起的叶片组织结构损伤，减轻光合抑制，维持细胞膜稳定性等[1, 15-16]。本研究结果表明：经30 ℃热锻炼后，杜鹃花品种‘状元红’在38 ℃和42 ℃热胁迫下，耐热性得到提高；表现为叶片组织结构受损较轻，栅栏海绵组织比、组织结构紧密度以及净光合速率均有提高，过氧化氢、MDA质量摩尔浓度和可溶性糖、可溶性蛋白质及游离脯胺酸质量分数以及SOD活性均下降。此外，热锻炼对POD及CAT活性也有影响。对杜鹃花而言，经30 ℃热锻炼后，植株在38 ℃热胁迫下耐热性提高比较明显，而在42 ℃下耐热性变化不明显。这与XU等[8]发现热锻炼对高羊茅Festuca arundinacea和多年生黑麦草Lolium perenne的影响研究结果相同，即即使经过热锻炼，植株在经受极端热胁迫后(如42 ℃)，耐热性提高也不明显。
植物叶片的形态和解剖结构特征最能体现植物对环境的适应能力[16-17]。胡伟娟等[16]和申惠翡等[17]的研究发现，耐热性较高的植物种或品种栅海比和结构紧密度较高。本研究可知，热锻炼后植株叶片栅海比和结构紧密度均高于未锻炼的植株。这可以在一定程度上表明，热锻炼处理后的杜鹃花植株耐热性得到了提高。本研究还发现，热锻炼处理植株在2个应试热胁迫温度下，植株叶肉组织结构疏松度均低于未热锻炼的植株，与王凤兰等[18]的研究结果相同，即植株耐热性较强时，疏松度反而较低，疏松度与耐热性呈负相关。这主要是因为海绵组织厚度越大，即疏松度越高，越容易适应湿生环境，而这种环境中的植物耐热性往往较弱[17]。
光合作用是植物体内对热较敏感的生理过程之一。试验结果表明，热锻炼的植株叶片Pn在高温胁迫下要高于未经热锻炼的植株，表明热锻炼处理能减轻高温胁迫引起的光合抑制。ZHAO等[15]发现鸭茅Dactylis glomerata在经热锻炼处理后Pn要比未经热锻炼的显著增高，这与本实验结论相同。关于热胁迫对光合作用的抑制机制，早期研究认为，主要归因于气孔因素，即气孔导度下降会降低植物与外界二氧化碳的交换，大大减少二氧化碳的供应，造成光合作用原料供应不足进而引起净光合速率的下降；同时气孔导度下降降低蒸腾速率，减缓光合产物运输速率，进而造成光合产物在叶绿体中不断积累，间接制约净光合速率[19]。也有研究表明：光合作用受到抑制主要与叶肉细胞自身活性(如胞间二氧化碳摩尔分数增加)有关[20]。在38 ℃高温胁迫下，经热锻炼的植株净光合速率显著上升，此时胞间二氧化碳摩尔分数显著降低，提示热锻炼后净光合速率的上升可能归因于非气孔因素。但在42 ℃热胁迫下，热锻炼后的植株净光合速率显著上升时，胞间二氧化碳摩尔分数下降，气孔导度和和蒸腾速率上升，且变化均不显著，这表明净光合速率的上升是气孔及非气孔因素共同作用的结果。
植物受到热胁迫会促使过氧化氢积累，从而导致细胞膜膜脂过氧化，膜热稳定性下降[8]。MDA是脂质过氧化作用的产物，对细胞膜有毒害作用，其含量变化能反映细胞膜脂过氧化作用强弱和细胞的受损程度[14]。植物在受到逆境伤害后可通过渗透调节物质调节细胞膨压，对减轻高温伤害有一定作用[21]。渗透物质的积累也间接表明了细胞受到了损害，且在一定范围内积累物质越多，细胞受损程度可能越大。XU等[8]在研究高羊茅和黑麦草时发现，同一胁迫温度下经热锻炼的植株叶片过氧化氢和MDA的积累比未经锻炼的要低，说明热锻炼处理能减轻细胞膜脂过氧化程度。本实验也发现，经热锻炼处理后，渗透物质积累较少，这表明细胞受损程度较轻，植株耐热性得到了提升。
对于在高温逆境下细胞膜逐渐积累的活性氧，植物发展出2种抗氧化系统，酶清除系统和非酶清除系统。酶清除系统包括能够将超氧自由基转化成过氧化氢的SOD和能够触发过氧化氢转化成水和氧气的CAT和POD[8]，本质为通过控制胞内活性氧含量来保护植物细胞。本研究中热锻炼后的植株叶片SOD活性得到了提高，与前人研究结果一致[8-9, 11]；但在38 ℃高温条件下，SOD，POD和CAT活性经热锻炼的均低于未经锻炼的，这可能是因为在这个温度下，热锻炼后过氧化氢和MDA的积累量较少，并不需要高活性的酶分解过氧化氢及MDA；而在42 ℃高温胁迫下，经热锻炼的植株SOD活性低，POD和CAT活性较高，同时过氧化氢含量较低，这可能是因为SOD受高温影响较大使得活性较低，而POD和CAT这2种酶则能保持较高活性，因此积累的过氧化氢主要依靠这2种酶清除的。
本实验从解剖结构、光合作用、生理生化特性等方面研究热锻炼对杜鹃花品种‘状元红’耐热性的影响，证实了热锻炼处理能提高植株叶片光合作用，减轻叶片叶肉以及细胞的受损程度，一定程度上提高杜鹃花植株耐热性。热锻炼处理对杜鹃花抵抗热胁迫具有一定的实践应用价值，但其分子机制还有待进一步研究。
Heat-resistance of Rhododendron with a heat acclimation pretreatment
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摘要: 为探究热锻炼对杜鹃花Rhododendron耐热性的影响及作用机制，对经30℃热锻炼的杜鹃花品种‘状元红’Rhododendron ‘Zhuangyuan Hong’在不同热胁迫下（38℃，42℃）的叶片解剖结构、光合作用及生理生化特征变化进行分析。结果显示：在热胁迫下，经过热锻炼的叶片与未经热锻炼的叶片相比，解剖结构受损较轻，能保持较高的栅海比和结构紧密度（RCT）；净光合速率（Pn）得到了提高，胞间二氧化碳摩尔分数（Ci）降低；过氧化氢（H2O2）及丙二醛（MDA）质量摩尔浓度均减少，渗透调节物质质量分数均减少；超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，而过氧化物酶（POD）及过氧化氢酶（CAT）活性在38℃高温下均降低，在42℃高温下均增高。试验表明，热锻炼处理能较好地保持叶片结构的稳定，并能提高叶片光合速率，同时减轻细胞受损程度，一定程度上提高了杜鹃花品种‘状元红’植株的耐热性。Abstract: The anatomy, photosynthesis, as well as physiological and biochemical characteristics (including the cell membrane, osmotic regulation, and enzymatic antioxidant systems) of leaves were investigated in Rhododendron 'Zhuangyuan Hong' to study the effects of heat acclimation on the thermostability of Rhododendron. Plants were exposed to two heat stress levels (38℃ and 42℃) for 6 days, respectively, with a heat acclimation pretreatment at 30℃ for 6 days. Results for a high temperature treatment showed that compared to leaves without heat acclimation, leaves with heat acclimation had less damage on the anatomy. The ratio of palisade and spongy, tissue was increased significantly and RCT also was increased. Leaves with heat acclimation maintained a significantly higher net photosynthetic rate(Pn) and lower intercellular CO2 concentration(Ci), and had a lower content of hydrogen peroxide (H2O2) and malondialdehyde (MDA), which helped stabilize cell structure. Also, activity of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) were lower at 38℃ with POD and CAT activities being higher at 42℃. This study showed that heat acclimation could maintain a stable leaf structure, could improve the photosynthetic rate, and could reduce the extent of cell damage; hence, to some degree improving thermostability.
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凤丹Paeonia ostii是中国著名的观赏兼油用、药用牡丹，也是观赏牡丹嫁接的优良砧木，在牡丹种苗产业化生产中具有重要地位[1]。凤丹在传统育苗中主要为露地播种繁殖，种子萌发时间长，萌发率较低[2]。凤丹种子存在双休眠特性[3]，新鲜成熟种子需要经过一段时间的后熟作用，解除下胚轴休眠才能萌发生根，生根后还需解除上胚轴休眠才长成正常成苗。前人研究表明：低浓度的赤霉素（GA3）比吲哚乙酸（IAA）和6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）更适合诱导凤丹种子萌发，凤丹种子萌发率随GA3浓度的升高而下降[4]。栽培牡丹种子生根前，各种物理或化学处理都未能打破上胚轴休眠，只有在种子根长至3 cm时，用赤霉素或低温处理才能有效解除其上胚轴休眠[5]。但有研究表明：GA3处理的种子从开始萌芽到出齐苗所需时间长达82 d，而低温处理的种子出齐苗所需时间仅有46 d左右[6]。因此，本研究将重点探讨低温处理和GA3处理对凤丹种子萌发的影响，寻找促进其萌发的最佳处理方法。穴盘育苗作为现代种苗繁殖方式，可以实现规模化、机械化生产，同时能有效地保护根系，提高出苗率[7]。本试验采用穴盘育苗的方式，用不同方法处理凤丹种子，探索促进凤丹种子萌发的有效方法，期望为牡丹种苗产业化生产提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
种子采自河南栾川。采种时间为2013年9月13日，千粒重471.64 g，实验开始时间为2013年10月21日。50目林木穴盘，规格为25 cm×48 cm×10 cm，穴孔口径为4.5 mm。基质：进口草炭、珍珠岩。
1.2 试验方法
1.2.1 不同处理对凤丹种子生根情况的影响
清水浸种1 h后，取出饱满下沉的种子，用体积分数为0.1%的甲醛消毒30 min后，作以下处理：100 mg·L-1GA3，200 mg·L-1GA3，300 mg·L-1GA3溶液分别浸种24 h。100粒·处理-1，3次重复。对照组清水浸种24 h。
将处理后的种子播进穴盘，覆基质1.5~2.0 cm，穴盘内基质为草炭:珍珠岩（1:1），将穴盘分别置于10，15，20℃的人工气候箱内，保持穴盘内基质湿度基本一致，隔7 d观察1次，记录生根时间。100 d后计算生根率和根长大于5 cm的种子比例。
生根率=（生根种子数/种子总数量）×100%。根长大于5 cm的种子比例=（根长大于5 cm的种子数量/种子总数量）×100%。
1.2.2 不同主根长对生根凤丹种子萌发的影响
将穴盘内主根长1~5 cm的种子和主根长＞5 cm的种子分别于4℃中处理30 d，取出后在20℃温室内进行发芽实验，50粒·处理-1，3次重复。隔3 d观察种子萌发情况，记录种子萌发时间，60 d后统计萌发率。种子萌发以上胚轴伸出1 cm时为标准。萌发时间为种子从温室取出到萌发时的时间。萌发率=（萌发种子数/冷藏种子总数量）×100%。萌发时间和萌发率用DPS 9.50进行ANOVA方差分析。
1.2.3 不同低温处理时间对生根凤丹种子萌发的影响
将生根后根长＞5 cm的种子于4℃中分别处理15，30，45，52 d后取出，移入温室。温室温度为20℃。50粒·处理-1，3次重复。记录种子萌发时间，60 d后统计萌发率。
萌发率=（萌发种子数/冷藏种子总数量）×100%。试验数据用DPS 9.50进行ANOVA方差分析。
1.2.4 下胚轴最膨大处直径及侧根数量对根长＞5 cm凤丹种子萌发的影响
分别测量根长＞5 cm的生根种子的下胚轴最膨大处直径和侧根数量，之后将其于4℃中分别处理30,45，52 d，记录种子萌发的时间，观察前5粒和最后5粒萌发种子下胚轴最膨大处直径和侧根数量对发芽时间的影响。用Excel计算下胚轴最膨大处直径和侧根数量的相关性。50粒·处理-1，3次重复。
相关系数取绝对值后，0~0.09为没有相关性，0.1~0.3为弱相关，0.3~0.5为中等相关，0.5~1.0为强相关。用DPS 9.50进行ANOVA方差分析。
2. 结果与分析
2.1 不同处理对凤丹种子生根情况的影响
图 1可知，10℃条件下，对照及100 mg·L-1 GA3处理种子均不发芽，在200 mg·L-1或300 mg·L-1质量浓度GA3处理下发芽时间也较长，达到70 d以上。在15℃培养条件下，随着GA3质量浓度增加发芽时间缩短；在4种质量浓度GA3处理下，20℃培养箱内发芽时间均较短，但差异不显著。结果显示：20℃和300 mg·L-1综合处理下，生根时间最短，在30 d左右即可开始生根。
不同处理对凤丹种子生根率的影响见图 2。相同温度条件下，种子生根率随GA3质量浓度升高而升高。10℃条件下，对照及100 mg·L-1 GA3处理的种子未生根；200 mg·L-1和300 mg·L-1 GA3处理下，生根率也均低于10%。15℃条件下，200 mg·L-1GA3处理生根率最高，较300 mg·L-1 GA3处理差异显著（P＜0.05），但均低于20℃处理。20℃条件下，300 mg·L-1 GA3处理种子生根率最高，达到92%。
图 2 不同处理对凤丹种子生根率的影响Figure 2. Different treatments on the rooting rate of Paeonia ostii同一处理条件下，一般认为根长越长生根质量越好[8]。播种100 d后统计主根长＞5 cm的幼苗比例，结果如图 3。10℃条件下，不同质量浓度GA3处理，主根长＞5 cm的幼苗均较少或没有。15℃和20℃条件下，随着GA3质量浓度升高，主根长＞5 cm的幼苗比例均呈增长趋势。15℃条件下，200 mg·L-1 GA3质量浓度处理的主根长＞5 cm的幼苗数量最多，优良植株比例占68%。20℃条件下，300 mg·L-1 GA3处理，主根长＞5 cm的种子比例在92%以上，生根质量最好。
图 3 不同处理下主根长>5 cm的种子比例Figure 3. Proportion of seeds with 5 cm longer main root under different treatments综上可知，为了缩短凤丹种子萌发时间，提高种子萌发率和发芽质量，可以用20℃和300 mg·L-1 GA3同时诱导凤丹种子的萌发。
2.2 不同根长对低温条件下生根凤丹种子萌发的影响
HAO等[8]将根长1.5，3.0，4.5，6.0 cm的种子分别进行低温处理，结果表明：只有根长为6.0 cm的种子会萌发，低温处理只能打破根长为6.0 cm的种子的休眠。景新明等[5]认为只有根长大于3 cm的种子经过低温处理后才能萌发。林松明等[6]在打破凤丹种子上胚轴休眠的研究中将根长4 cm作为判断标准。本研究发现，当穴盘透气不良时，根长小于5 cm的种子易腐烂，根长大于5 cm的种子极少有腐烂现象。综合以上因素，本研究选择根长大于5 cm的生根种子作为低温打破上胚轴休眠的试验材料。
第24天时根长大于5 cm的种子上胚轴开始萌发，根长小于5 cm的种子第39天时开始萌发，差异显著（P＜0.05）。至60 d时，根长大于5 cm的种子萌发率达到80.67%，而根长小于5 cm的种子萌发率仅为32.17%，差异显著（P＜0.05）。故需低温处理打破生根凤丹种子上胚轴休眠时，选择根长＞5 cm者效果最佳。
表 1 不同根长对生根凤丹种子萌发的影响Table 1. Effect of different root length on rooted Paeonia ostii根长/cm 萌发时间/d 萌发率/% ≤5 38.67±1.53 a 32.17 ± 1.26 b >5 23.67±1.53 b 80.67 ±2.57 a 2.3 不同低温处理时间对生根凤丹种子萌发的影响
由图 4可知：生根凤丹种子随低温处理时间的增加，萌发所需的时间缩短，处理45 d时所需萌发时间最短，为9 d，此后随着低温处理时间的增加，所需萌发时间增加，但种子萌发率呈上升趋势。处理52 d后萌发率最高，达到84%，但耗时过长，且与低温处理30 d的萌发率差异不大，故以低温处理30 d较好。
图 4 不同低温处理时间对生根凤丹种子发芽的影响Figure 4. Effect of different cold treatments on seed germination of rooted Paeonia ostii低温处理45 d的生根种子需要9 d开始萌发，共耗时54 d，低温处理30 d的生根种子24 d后开始萌发，同样共耗时54 d，2种处理下萌发率差异不大，从生产角度考虑，30 d为适宜的低温处理时间。
2.4 下胚轴最膨大处直径及侧根数量对主根长大于5 cm凤丹种子萌发的影响
生根种子下胚轴最膨大处直径和侧根数量与种子萌发存在一定相关性，统计结果见表 2和表 3。
表 2 相关系数统计Table 2. Statistic table of correlation coefficients最膨大处直径 侧根数量 萌发时间 最膨大处直径 1 侧根数量 0.40 ± 0.13 1 萌发时间 -0.63 ± 0.02 -0.70 ± 0.01 1 表 3 下胚轴最膨大处直径及侧根数量对生根凤丹种子发芽的影响Table 3. Eifect of the largest-hypocotyl diameter and lateral root-number on germination of rooted Paeonia ostii萌发顺序 处理30d 处理45d 处理52d 直径/mm 侧根数量/根 萌发时间/d 直径/mm 侧根数量/根 萌发时间/d 直径/mm 侧根数量/根 萌发时间/d 1 3.23±0.02 5.00±0.00 24.00±1.00 a 3.48±0.02 18.33±0.58 9.00±1.00 a 2.59±0.02 10.00±0.00 15.00 ± 1.00 a 2 3.03±0.03 14.33±0.58 24.33±1.53 a 3.5±0.05 17.00±2.00 9.33±0.58 a 3.34±1.20 11.00±1.00 15.33±0.58 a 3 2.98±0.01 12.00±1.00 27.33±0.58 a 3.5±0.10 11.00±2.00 12.33±0.58 a 3.16±0.05 5.33±0.58 15.33±1.53 a 4 2.41±0.04 13.33±0.58 27.00±1.00 a 3.05±0.08 6.33±1.53 11.67±0.58 a 3.34±0.01 11.33±0.58 18.00±0.00 a 5 2.89±0.03 10.33±1.53 27.33±0.58 a 2.86±0.02 15.33±1.53 12.33±1.53 a 2.9±0.03 8.67±0.58 18.33±0.58 a 46 2.50±0.10 6.00±1.00 51.33±1.53 b 2.74±0.03 7.00±0.00 30.00±0.00 b 2.71±0.11 8.67±1.53 32.67±0.58 b 47 2.91±0.09 6.00±2.00 51.33±0.58 b 2.90±0.02 8.33±0.58 30.33±0.58 b 2.57±0.09 6.00±1.00 32.67±0.58 b 48 2.73±0.20 9.00±3.00 54.00±1.00 b 1.84±0.35 3.33±1.53 32.67±0.58 b 2.67±0.56 5.33±1.53 33.33±0.58 b 49 2.67±0.12 6.00±.002 54.33±1.53 b 2.49±0.10 1.33±0.58 33.33±1.53 b 2.85±0.02 8.00±0.00 36.00±1.00 b 50 2.53±0.05 5.00±1.00 57.00±2.00 b 2.56±0.15 6.33±1.53 36.00±2.00 b 2.82±0.04 2.00±0.00 39.00±2.00 b 表 2显示，最膨大处直径和侧根数量相关系数为0.40，相关性不显著；最膨大处直径和萌发时间的相关系数绝对值为0.63，呈显著负相关；侧根数量和萌发时间的相关系数绝对值为0.70，呈显著负相关。因此，下胚轴最膨大处直径对侧根数量影响较小，随着下胚轴最膨大处直径的增加，所需萌发时间缩短，随着侧根数量增加，所需萌发时间缩短。
表 3显示，同一处理天数下，如30 d，优先萌发的5粒生根种子下胚轴最膨大处直径达到3.0 mm或侧根数量大于10根，自24 d即开始萌发，而最后5粒种子则在51 d后萌发，它们下胚轴最膨大处直径＜3.0 mm且侧根数量小于10根，萌发所需时间明显长于前者。45和52 d处理的生根种子同样有此规律。故初步认定，生根种子下胚轴膨大至3.0 mm或侧根数量大于10根时，可以优先萌发。
3. 讨论
本研究发现，以20℃结合300 mg·L-1GA3处理穴盘内的凤丹种子，生根率最高，生根时间最短。这与刘心民[9]在15℃下处理同样穴盘内凤丹种子生根率最高的结论不一致；4℃处理30 d后可有效打破凤丹种子上胚轴休眠，处理时间越长萌发率越高，出苗整齐度也随之增加。这与张玉刚等[10]的报道基本一致，与郑相穆等[3]认为的凤丹种子低温（5℃）春化阶段所需的临界时间是60 d的研究不一致。但4℃处理时间过长会导致萌发时间延迟。低温打破凤丹种子上胚轴休眠的原理，可能是因为在低温春化期种子的内含物质发生了变化。周仁超等[11]推断紫斑牡丹Paeonia rockii种子萌发需要一定的营养支持，但其胚乳主要为脂类物质，不易水溶，难被胚吸收，低温后某些脂类物质发生了变化，成为易被胚吸收的物质，从而促进了种子的萌发。GA3处理亦能打破凤丹种子上胚轴休眠。林松明等[6]发现：300 mg·kg-1 GA3处理的凤丹种子萌发较快，只需31 d，这低于本实验从低温处理到萌发的54 d，但GA3处理的种子幼苗初期生长势强，生长迅速，且生长速度很快减慢，生长势变弱，而低温处理的种子幼苗萌发后一直保持较强的生长势头，且抗病能力强，从生产优质种苗的角度考虑，合适的低温处理时间是打破凤丹上胚轴休眠的最好方法。
主根长＞5 cm时打破上胚轴所需时间短，萌发率高，与景新明等[12]认为根长＞3 cm时才能打破休眠基本一致，但本实验发现生根的凤丹种子在根长＞5 cm时萌发率更高。林松明[13]的研究表明，根长达到4 cm时，胚的后熟已经完成，并生长到足以感受低温信号的体积，根长6~7 cm时胚中可溶性糖的含量急剧降低，上胚轴不再需要大量营养。这一结果验证了本实验将根长＞5 cm作为判断标准的可靠性。其中主根长＞5 cm且下胚轴最膨大处直径＞3.0 mm，或侧根数量达到10根或以上均可优先萌发。因此凤丹种子穴盘育苗中，20℃结合300 mg·L-1GA3处理，30 d左右即可生根，40 d后多数生根种子主根长＞5 cm，低温处理30 d后，下胚轴最膨大处直径＞3.0 mm或侧根数量达到10根的生根种子移入温室5 d后即可萌发。
采用容器育苗，可以促进凤丹根系的发育，有利于地上部的生长。Durgea等[14]认为，容器苗是所有苗型中最优良的苗型，也是成本最低的育苗体制。实验过程中发现，长时间不生根的种子在穴盘中容易腐烂，特别是根长＜5 cm的生根种子，低温处理移入温室后腐烂率较高，穴盘的透气性、基质含水量过高等原因可能导致这一状况的发生。完善穴盘的透气透水性，加强基质水分管理是将来实验需要改进的地方。
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图 1 各处理下‘状元红’叶片叶肉组织解剖结构
Figure 1 Mesophyll tissue anatomical structure of the leaves in 'Zhuangyuan Hong ' under each treatment
表 1 试验中的6个处理
Table 1. 6 treatments in this trial
处理 T热锻炼/℃ T热胁迫/℃ ckA 22 22 TA 30 22 ckB 22 38 TB 30 38 ckC 22 42 TC 30 42 
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表 2 不同温度下热锻炼对叶片叶肉组织结构的影响
Table 2. Effects of heat acclimation on mesophyll structure under different temperatures
处理 栅栏海绵组织比/% 叶片组织结构紧密度/% 叶片组织结构疏松度/% ckA 80.073±3.353 A 37.348±1.065 A 47.549 ± 0.907 B TA 69.917±1.449 AC 32.627±0.499 B 46.988 ± 0.583 B ckB 51.882±2.129 D 30.063±0.848 B 59.098 ± 2.041 A TB 64.747±2.435 BC 30.627±0.707 B 48.091 ± 1.380 B ckC 48.473±1.668 D 27.068±0.688 C 56.618 ± 1.196 A TC 63.656±1.285 C 30.589±0.453 B 48.491 ± 0.629 B 说明：同列不同大写字母表示任意两值之间在0.05概率水平差异显著
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表 3 不同温度下热锻炼对叶片光合参数的影响
Table 3. Effects of heat acclimation on photosynthetic parameters under different temperatures
处理 Pn/(μmol·m-2·s-1) Gs/(mol·m-2·s-1) Ci/(μmol·mol-1) Ts/(mmol·m-2·s-1) ckA 2.471 ± 0.133 AC 0.029 ± 0.002 BD 190.793 ± 13.258 C 0.635 ± 0.055 B TA 2.512 ± 0.247 A 0.040 ± 0.006 A 228.181 ± 10.190 B 0.913 ± 0.059 A ckB 1.521 ± 0.200 BD 0.037 ± 0.002 AB 252.698 ± 26.497 B 0.826 ± 0.049 AB TB 2.330 ± 0.130 AC 0.030 ± 0.005 BC 201.296 ± 16.634 C 0.573 ± 0.080 B ckC 0.062 ± 0.010 F 0.021 ± 0.003 BD 337.407 ± 25.947 A 0.417 ± 0.027 B TC 0.110 ± 0.008 E 0.026 ± 0.002 ACD 314.980 ± 6.492 A 0.521 ± 0.048 B 说明：同列不同大写字母表示任意两值之间在0.05概率水平差异显著
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表 4 不同温度下热锻炼对叶片过氧化氢和MDA质量摩尔浓度的影响
Table 4. Effects of heat acclimation on molality of H2O2 and MDA under different temperatures
处理 bH2O2/(mol·kg-1) bMDA/(mmol·kg-1) ckA 59.587 ± 3.945 E 0.036 ± 0.007 B TA 70.924 ± 7.977 DE 0.037 ± 0.005 B ckB 228.488 ± 6.828 A 0.054 ± 0.003 B TB 121.314 ± 7.414BCD 0.046 ± 0.002 B ckC 280.276 ± 9.703 AC 0.097 ± 0.007 A TC 233.264 ± 19.765 AB 0.083 ± 0.014 AB 说明：同列不同大写字母表示任意两值之间在0.05概率水平差异显著
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表 5 不同温度下热锻炼对叶片可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸质量分数的影响
Table 5. Effects of heat acclimation on mass fraction of soluble sugar, soluble protein and pro under different temperatures
处理 w可溶性糖/(g·kg-1) w可溶性蛋白质/(g·kg-1) w游离脯氨酸/(mg·kg-1) ckA 5.21±0.56 C 3.069±0.232 B 22.047±2.353 C TA 5.38±0.43C 3.630±0.519B 22.756±2.327 C ckB 8.74±0.07B 5.719±0.516B 115.291±5.328 B TB 6.21±0.49B 3.375±0.683 B 71.060±1.693 D ckC 14.06±1.75A 13.091±0.436 A 238.044±9.924 A TC 9.63±0.28B 5.802±0.719B 198.695±15.290 AB 说明：同列不同大写字母表示任意两值之间在0.05概率水平差异显著
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表 6 不同温度下热锻炼对叶片SOD, POD和CAT活性的影响
Table 6. Effects of heat acclimation on activity of SOD, POD and CAT under different temperatures
处理 SOD活性/(×16.67 nkat·g-1) POD活性/(×16.67 nkat·g-1·min -1) CAT活性/(×16.67 nkat·g-1·min -1) ckA 145.137 ± 10.347 B 380.339 ± 49.563 B 1 086.137 ± 98.127 A TA 191.140 ± 19.028 AB 213.361 ± 26.763 C 320.016 ± 0485 D ckB 257.455 ± 11.576 A 1 602.143 ± 182.715 AB 677.987 ± 35.843 B TB 203.359 ± 17.149 AB 355.912 ± 35.592 B 640.641 ± 0.370 B ckC 288.862 ± 6.454 A 639.578 ± 1.126 B 603.951 ± 34.782 B TC 277.837 ± 11.447 A 2 238.180 ± 4.294 A 959.962 ± 1.663 B 说明：同列不同大写字母表示任意两值之间在0.05概率水平差异显著
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