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光系统Ⅱ(PSⅡ)是植物对温度胁迫最敏感的光合系统组分[1-3],利用非损伤、检测时间短、灵敏度高的快速叶绿素荧光诱导动力学技术[4-5],可以方便地研究温度与PSⅡ光化学活性之间的关系。低温胁迫会引起快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线)趋向平缓、O相升高、J相下降或上升、I相和P 相下降、K 点和L点出现[6-8]等变化,反映出PSⅡ有活性的反应中心数量减少[9],反应中心吸收和热耗散的能量增加[9-11],以及PSⅡ受体侧的电子传递速率降低等光合作用的“内在变化”[11-12]。低温胁迫还会使叶片叶绿素降解[12-13],导致光合作用的物质基础发生改变。目前多数研究采用离体试验材料、野外观测、设置单一温度处理等方式,温度与PSⅡ光化学活性的关系难以被准确描述。为获得不同胁迫程度下叶绿素荧光的综合性指标,当前研究主要利用隶属函数法[14-15]、主成分分析法[16-17]、TOPSIS综合评价法[18-19]和综合生物反应指数(integrated biomarker response,IBR)[20]计算综合指标。其中IBR评价法具有操作简单、实用性强和应用广泛的特点,但尚未用于计算低温胁迫下的叶绿素荧光综合指标。南极假山毛榉Nothofagus antarctica为壳斗科Fagaceae假山毛榉属Nothofagus落叶乔木或灌木,主要分布在南美洲南部的温带森林,耐寒能力极强[21],为探索低温环境下南极假山毛榉光合生理特性,本研究采用连续测定与控制试验的方法,观测低温胁迫下南极假山毛榉叶片相对叶绿素含量(relative chlorophyll content)、OJIP曲线特征、快速叶绿素荧光诱导动力学测量(JIP-test)参数等的变化,并将JIP-test参数代入IBR评价法,用以阐明低温胁迫对南极假山毛榉PSⅡ光化学活性的影响规律,并检验IBR评价法用于计算低温胁迫下的叶绿素荧光综合指标的可行性。
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供试材料为2年生南极假山毛榉实生苗(山西省林业科学研究院基地培育),株高(50±5) cm。2018年9月初,选取长势良好,无病虫害,大小相近的南极假山毛榉5盆,置于人工气候箱中适应培养3 d。人工气候箱参数为:温度25 ℃;昼夜相隔时间12 h;光照强度500 μmol·m−2·s−1;相对湿度(60±3)%,根据表土干燥情况适量浇水。设置25、15、5、−5、−15和−25 ℃等6个测试温度,从25 ℃依次降低,降温速率为2 ℃·h−1,待植株在5 ℃的人工气候箱中测试完毕,转移到3 ℃预冷的冰柜中,继续以2 ℃·h−1的速率依次降到−5、−15和−25 ℃;各温度下处理时间为24 h。冰柜装有人工光源,光照强度500 μmol·m−2·s−1,采用大气采样仪(QC-1S,北京市科安劳保新技术公司)从冰柜门缝隙处向内缓慢送气。
各测试温度下处理完成后,在原处理环境下关闭光源,使植株暗适应20 min;立刻进行快速叶绿素荧光诱导动力学测量,随后立即测定相对叶绿素含量。同1株上的2项测量均在同1片健康、成熟的叶片上进行,测量位置相互错开。每个处理5盆,每盆作为1个独立重复实验,测定5片·盆−1。以25 ℃处理为对照(ck)。10:00测定各项指标。
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采用叶绿素测定仪(SPAD-502Plus,KONICA MINOLTA,日本)测定各温度处理下植株的相对叶绿素含量(SPAD值)。
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采用叶绿素荧光仪(Yaxin-116G,雅欣理仪公司)测定快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP),测定前暗适应20 min,选取叶肉部分用3 000 μmol·m−2·s−1饱和蓝闪光照射1 s,以10 μs (300 μs之前)、100 μs (300 μs~3 ms)和1 ms (3 ms之后)的间隔记录荧光信号,并计算叶绿素荧光动力学参数。
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叶片经过暗适应后再给予饱和蓝闪光照射,散发的荧光随时间变化的曲线,构成叶绿素荧光诱导动力学曲线。暗适应后出现最小荧光O相,此时PSⅡ处于“完全开放”状态;照射强光后,陆续出现J、I相,最终由于PSⅡ反应中心关闭,达到P相。将不同温度处理的OJIP曲线离差标准化。应用公式VO-P=(Ft−FO)/(FP−FO)计算FO与FP间相对可变荧光强度(VO-P),其中Ft表示t时的荧光强度,FO表示暗适应后的最小荧光强度,FP表示暗适应后的最大荧光强度。应用公式△VO-P=VO-P(处理)−VO-P(ck)计算FO与FP间相对可变荧光强度差值(△VO-P)。FO与FJ、FK间的相对可变荧光强度差值(△VO-J和△VO-K)的计算方式同VO-P和△VO-P。
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暗适应后照光,O、L、K、J、I、P点分别表示最小荧光、0.15 ms荧光,0.30 ms荧光,2.00 ms荧光、30.00 ms荧光和最大荧光[22],其中0.15和0.30 ms时的相对荧光强度用VL和VK表示,PSⅡ单位面积反应中心数量(RC/CSO)、单位反应中心吸收的能量(ABS/RC)、单位反应中心以热能形式耗散的能量(DIO/RC)、单位反应中心捕获的用于还原初级醌受体(QA)的能量(TRO/RC)、单位反应中心用于将电子从QA−传递到质体醌(PQ)的能量(ETO/RC)、单位反应中心用于将电子从QA−传递到光系统Ⅰ(PSⅠ)的能量(REO/RC)、PSⅡ光化学初级最大效率(φPO,意义与暗适应下PSⅡ的最大量子产额Fv/Fm相同)、PSⅡ捕获的电子从QA−传递到PQ的效率(ψEO)、电子从PQH2传递到PSⅠ最终受体侧的效率(δRO)、叶片性能指数(PIABS)等参数计算参照文献[22]和[23]。
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计算方法参照文献并略有改动:①计算各项荧光参数在所有处理下的平均值m和标准差s;②代入公式(1)对各处理下的各项荧光参数(X)标准化,得到Y;③对不同温度处理下的各项荧光参数进行回归拟合,如果某项荧光参数的拟合曲线随着温度降低而上升,则Z=Y,反之则Z=−Y;④依据公式(2)计算不同温度处理下单项荧光参数的得分Si,其中|Zm
in|是某温度处理下所有荧光参数Z值的最小值的绝对值;⑤以某温度处理下某项荧光参数的Si值作为辐射线的长度绘制星状图,各温度处理下的综合生物反应指数(IBR)由顺时针相邻荧光参数的辐射线围成的三角形面积Ai之和得到公式(3),公式(3)中的Ai依据公式(4)计算,公式(4)中的n为参与计算的荧光参数的个数。 $$ Y = \frac{{X - m}}{s}\text{;} $$ (1) $$ {S_i} = Z + {\rm{ }}\left| Z_{\rm{min}} \right|\text{;} $$ (2) $$ {I_{{\rm{BR}}}} = \mathop \sum \limits_{t = 11}^n {A_i}\text{;} $$ (3) $$ {A_i} = \frac{\,1\,}{\,2\,}\sin \left( {\frac{{360}}{n}} \right){S_i}{S_i}_{ + 1}\text{。} $$ (4) -
将各处理所得的IBR、Fv/Fm、
PIABS、相对叶绿素含量进行相关性分析,依据Pearson参数和显著性,检验IBR评价法用于计算低温胁迫下的叶绿素荧光综合指标的可行性。采用SPSS 22进行数据统计分析,应用最小显著差法(LSD)进行多重比较,采用Origin 2018进行回归分析和绘图。 -
由图1可知:15和5 ℃时相对叶绿素含量无显著变化,−5 ℃时开始显著下降,−25 ℃时极显著降低,与对照相比降低了63.8%。表明≤−5 ℃的低温环境会导致南极假山毛榉叶片相对叶绿素含量显著降低。
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由图2可知:5、15和25 ℃处理下OJIP曲线出现O、J、I、P各相(图2A、B),表明这些温度下电子传递链运转正常;−5、−15和−25 ℃的OJIP曲线较为平缓(图2A),缺少J相和I相(图2B)。将标准化的各处理曲线与ck相减,可见J相和I相合并,并且在光照极短时间(约0.03 ms)出现1个较大峰(图2C),表明电子传递链严重受阻。OJIP曲线在5 ℃出现典型的K点(图2D)和L点(图2E),表明PSⅡ供体侧和PSⅡ反应中心受损。
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由图3A可知:VK
随着温度降低,−5、−15和−25 ℃时均与对照达到显著差异,表明≤−5 ℃的低温处理会造成PSⅡ供体侧损伤。 -
−5、−15、−25 ℃处理下VL
上升明显(图3B),表明≤−5 ℃的低温导致PSⅡ各单位之间的能量流通不畅。从−5 ℃到−25 ℃,RC/CSO随着温度降低逐渐减少(图3C),但−15 ℃的RC/CSO显著高于−5 ℃,表明−15 ℃时PSⅡ单位面积反应中心数量出现短暂回升。从−5 ℃开始,随着温度降低,ABS/RC(图3D)、TRO/RC(图3E)和DIO/RC(图3F)持续增加,−25 ℃时分别比对照增加331.0%、134.7%和1 112.7%,表明由于缺少可供还原的QA,PSⅡ单位反应中心集聚了大量能量。 -
与对照相比,ETO/RC(图3G)和REO/RC(图3H)在−15和15 ℃时短暂下降,REO/RC在−25 ℃时又显著下降,表明高于−15 ℃的温度对PSⅡ受体侧的能量传输影响较小。当温度从25 ℃降低到5 ℃时,φPO(图3I)和ψEO(图3J)与对照相比无显著差异,δRO(图3K)仅在15 ℃时出现短暂下降;当温度继续降低到−5 ℃时,3项参数均显著下降,表明≤−5 ℃的低温对PSⅡ的电子传递效率有显著负面影响。
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随着温度降低,Fv/Fm与φPO的变化趋势相同(图4)。5 ℃时,
PIABS显著低于对照,−5、−15和−25 ℃时, PIABS接近于0,表明≥15 ℃的环境温度对南极假山毛榉叶片的光能吸收无显著影响,≤5 ℃时开始出现低温胁迫,≤−5 ℃会造成严重的冰冻胁迫(图5)。 -
随着温度从25 ℃降至−25 ℃,VK
、VL、ABS/RC、DIO/RC、TRO/RC的拟合曲线持续上升,其余参数的拟合曲线持续下降(图3),因此对VL 、VK、ABS/RC、DIO/RC、TRO/RC的标准后数值取正值,其余参数取负值,绘制星状图(图6)并计算IBR(图7)。与对照相比,IBR在5、−5和−15 ℃时显著增加,−25 ℃极显著升高。对IBR作回归分析显示:22 ℃为IBR拐点,高于或低于此温度均导致IBR升高;表明IBR与温度胁迫程度呈正相关,南极假山毛榉叶片对光能的吸收利用效率最佳值在22 ℃,≤5 ℃的低温会对南极假山毛榉PSⅡ光化学活性造成胁迫。 -
对各温度处理下的Fv/Fm、PIABS、相对叶绿素含量、IBR和各测试温度进行相关性分析可见(表1):IBR、相对叶绿素含量和温度均为显著负相关,表明IBR能较准确反映温度对南极假山毛榉PSⅡ光化学活性以及对相对叶绿素含量的影响。Fv/Fm和PIABS虽然也与温度呈显著相关,但与相对叶绿素含量无显著相关,表明IBR与相对叶绿素含量的相关度高于上述2项参数。
表 1 Fv
/Fm、IABS、相对叶绿素含量、IBR和温度的相关性分析 Table 1. Correlation analysis of Fv
/Fm, PIABS, SPAD value, IBR and temperature 参数 IBR PIABS Fv/Fm 相对叶绿
素含量测试
温度IBR 1 PIABS −0.73 1 Fv/Fm −0.72 0.94** 1 相对叶绿素含量 −0.95** 0.79 0.77 1 测试温度 −0.88* 0.90* 0.92* 0.90* 1 说明:*表示P<0.05,**表示P<0.01
Effect of low temperature on photosystem Ⅱ in Nothofagus antarctica
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摘要:
目的 探究低温对南极假山毛榉Nothofagus antarctica光系统Ⅱ(PSⅡ)的影响,利用综合生物反应指数(IBR)评价法计算低温胁迫下的叶绿素荧光综合指标的可行性。 方法 采取逐步降低环境温度的方法(从25 ℃降至−25 ℃),测量并分析南极假山毛榉叶片的相对叶绿素含量和快速叶绿素荧光,计算各温度下植株的综合生物反应指数,综合评价温度降低对PSⅡ光化学活性的影响。 结果 环境温度为15 ℃时,PSⅡ光化学活性无变化;环境温度为5 ℃时,放氧复合体损伤,PSⅡ各单位之间的能量流通受阻。低温(−5、−15和−25 ℃)导致相对叶绿素含量显著降低,PSⅡ供体侧受损加剧,电子传递效率下降,PSⅡ各单位之间的能量流通混乱,热耗散显著增加。各温度处理下植株的综合生物反应指数和相对叶绿素含量与测试温度均表现为显著负相关。 结论 低于−5 ℃的低温会对南极假山毛榉PSⅡ的光化学活性造成严重胁迫,综合生物反应指数可以综合评价低温胁迫对植株PSⅡ光化学活性和相对叶绿素含量的影响。图7表1参24 Abstract:Objective Nothofagus antarctica PSⅡ photochemical performance under low temperature was assessed and its results were used in calculation integrated biomarker response (IBR) to assess the synthetical indicator of chlorophyll fluorescence under low temperature stress. Method The environment temperature of N. antarctica was changed gradually (from 25 ℃ to −25 ℃). After exposed, relative chlorophyll content (SPAD value) and fast chlorophyll fluorescence were measured and analysed, IBR were calculated, to assess the effect of low temperature PSⅡ photochemical activity. Result 15 ℃ hardly affects the PSⅡ photochemical activity. Oxygen-evolving complex and energy flow between PSⅡ units were disturbed under −5 ℃. Under the low temperature of −5, −15 and −25 ℃, SPAD value was remarkably reduced, and the PSⅡ donor side, electron transport of PSⅡ, energy flow between PSⅡunits were all disturbed seriously; heat dissipation was remarkably increased. IBR under different temperature treatments have a significant negative correlation with SPAD value and temperature. Conclusion The damage of PSⅡ photochemical activity by low temperature (below −5 ℃) was serious, and IBR can be used as a comprehensive parameter to evaluate the effect of low temperatures on PSⅡ photochemical activity and SPAD value. [Ch, 7 fig. 1 tab. 24 ref.] -
表 1 Fv
/Fm、IABS、相对叶绿素含量、IBR和温度的相关性分析 Table 1. Correlation analysis of Fv
/Fm, PIABS, SPAD value, IBR and temperature 参数 IBR PIABS Fv/Fm 相对叶绿
素含量测试
温度IBR 1 PIABS −0.73 1 Fv/Fm −0.72 0.94** 1 相对叶绿素含量 −0.95** 0.79 0.77 1 测试温度 −0.88* 0.90* 0.92* 0.90* 1 说明:*表示P<0.05,**表示P<0.01 -
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20190366