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光系统Ⅱ(PSⅡ)是植物对温度胁迫最敏感的光合系统组分[1-3]，利用非损伤、检测时间短、灵敏度高的快速叶绿素荧光诱导动力学技术[4-5]，可以方便地研究温度与PSⅡ光化学活性之间的关系。低温胁迫会引起快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线)趋向平缓、O相升高、J相下降或上升、I相和P 相下降、K 点和L点出现[6-8]等变化，反映出PSⅡ有活性的反应中心数量减少[9]，反应中心吸收和热耗散的能量增加[9-11]，以及PSⅡ受体侧的电子传递速率降低等光合作用的“内在变化”[11-12]。低温胁迫还会使叶片叶绿素降解[12-13]，导致光合作用的物质基础发生改变。目前多数研究采用离体试验材料、野外观测、设置单一温度处理等方式，温度与PSⅡ光化学活性的关系难以被准确描述。为获得不同胁迫程度下叶绿素荧光的综合性指标，当前研究主要利用隶属函数法[14-15]、主成分分析法[16-17]、TOPSIS综合评价法[18-19]和综合生物反应指数(integrated biomarker response，IBR)[20]计算综合指标。其中IBR评价法具有操作简单、实用性强和应用广泛的特点，但尚未用于计算低温胁迫下的叶绿素荧光综合指标。南极假山毛榉Nothofagus antarctica为壳斗科Fagaceae假山毛榉属Nothofagus落叶乔木或灌木，主要分布在南美洲南部的温带森林，耐寒能力极强[21]，为探索低温环境下南极假山毛榉光合生理特性，本研究采用连续测定与控制试验的方法，观测低温胁迫下南极假山毛榉叶片相对叶绿素含量(relative chlorophyll content)、OJIP曲线特征、快速叶绿素荧光诱导动力学测量(JIP-test)参数等的变化，并将JIP-test参数代入IBR评价法，用以阐明低温胁迫对南极假山毛榉PSⅡ光化学活性的影响规律，并检验IBR评价法用于计算低温胁迫下的叶绿素荧光综合指标的可行性。
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供试材料为2年生南极假山毛榉实生苗(山西省林业科学研究院基地培育)，株高(50±5) cm。2018年9月初，选取长势良好，无病虫害，大小相近的南极假山毛榉5盆，置于人工气候箱中适应培养3 d。人工气候箱参数为：温度25 ℃；昼夜相隔时间12 h；光照强度500 μmol·m−2·s−1；相对湿度(60±3)%，根据表土干燥情况适量浇水。设置25、15、5、−5、−15和−25 ℃等6个测试温度，从25 ℃依次降低，降温速率为2 ℃·h−1，待植株在5 ℃的人工气候箱中测试完毕，转移到3 ℃预冷的冰柜中，继续以2 ℃·h−1的速率依次降到−5、−15和−25 ℃；各温度下处理时间为24 h。冰柜装有人工光源，光照强度500 μmol·m−2·s−1，采用大气采样仪(QC-1S，北京市科安劳保新技术公司)从冰柜门缝隙处向内缓慢送气。
各测试温度下处理完成后，在原处理环境下关闭光源，使植株暗适应20 min；立刻进行快速叶绿素荧光诱导动力学测量，随后立即测定相对叶绿素含量。同1株上的2项测量均在同1片健康、成熟的叶片上进行，测量位置相互错开。每个处理5盆，每盆作为1个独立重复实验，测定5片·盆−1。以25 ℃处理为对照(ck)。10:00测定各项指标。
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采用叶绿素测定仪(SPAD-502Plus，KONICA MINOLTA，日本)测定各温度处理下植株的相对叶绿素含量(SPAD值)。
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采用叶绿素荧光仪(Yaxin-116G，雅欣理仪公司)测定快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP)，测定前暗适应20 min，选取叶肉部分用3 000 μmol·m−2·s−1饱和蓝闪光照射1 s，以10 μs (300 μs之前)、100 μs (300 μs～3 ms)和1 ms (3 ms之后)的间隔记录荧光信号，并计算叶绿素荧光动力学参数。
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叶片经过暗适应后再给予饱和蓝闪光照射，散发的荧光随时间变化的曲线，构成叶绿素荧光诱导动力学曲线。暗适应后出现最小荧光O相，此时PSⅡ处于“完全开放”状态；照射强光后，陆续出现J、I相，最终由于PSⅡ反应中心关闭，达到P相。将不同温度处理的OJIP曲线离差标准化。应用公式VO-P＝(Ft−FO)/(FP−FO)计算FO与FP间相对可变荧光强度(VO-P)，其中Ft表示t时的荧光强度，FO表示暗适应后的最小荧光强度，FP表示暗适应后的最大荧光强度。应用公式△VO-P＝VO-P(处理)−VO-P(ck)计算FO与FP间相对可变荧光强度差值(△VO-P)。FO与FJ、FK间的相对可变荧光强度差值(△VO-J和△VO-K)的计算方式同VO-P和△VO-P。
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暗适应后照光，O、L、K、J、I、P点分别表示最小荧光、0.15 ms荧光，0.30 ms荧光，2.00 ms荧光、30.00 ms荧光和最大荧光[22]，其中0.15和0.30 ms时的相对荧光强度用VL和VK表示，PSⅡ单位面积反应中心数量(RC/CSO)、单位反应中心吸收的能量(ABS/RC)、单位反应中心以热能形式耗散的能量(DIO/RC)、单位反应中心捕获的用于还原初级醌受体(QA)的能量(TRO/RC)、单位反应中心用于将电子从QA−传递到质体醌(PQ)的能量(ETO/RC)、单位反应中心用于将电子从QA−传递到光系统Ⅰ(PSⅠ)的能量(REO/RC)、PSⅡ光化学初级最大效率(φPO，意义与暗适应下PSⅡ的最大量子产额Fv/Fm相同)、PSⅡ捕获的电子从QA−传递到PQ的效率(ψEO)、电子从PQH2传递到PSⅠ最终受体侧的效率(δRO)、叶片性能指数(PIABS)等参数计算参照文献[22]和[23]。
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计算方法参照文献并略有改动：①计算各项荧光参数在所有处理下的平均值m和标准差s；②代入公式(1)对各处理下的各项荧光参数(X)标准化，得到Y；③对不同温度处理下的各项荧光参数进行回归拟合，如果某项荧光参数的拟合曲线随着温度降低而上升，则Z＝Y，反之则Z＝−Y；④依据公式(2)计算不同温度处理下单项荧光参数的得分Si，其中|Zm
in|是某温度处理下所有荧光参数Z值的最小值的绝对值；⑤以某温度处理下某项荧光参数的Si值作为辐射线的长度绘制星状图，各温度处理下的综合生物反应指数(IBR)由顺时针相邻荧光参数的辐射线围成的三角形面积Ai之和得到公式(3)，公式(3)中的Ai依据公式(4)计算，公式(4)中的n为参与计算的荧光参数的个数。 $$ Y = \frac{{X - m}}{s}\text{；} $$ (1) $$ {S_i} = Z + {\rm{ }}\left| Z_{\rm{min}} \right|\text{；} $$ (2) $$ {I_{{\rm{BR}}}} = \mathop \sum \limits_{t = 11}^n {A_i}\text{；} $$ (3) $$ {A_i} = \frac{\,1\,}{\,2\,}\sin \left( {\frac{{360}}{n}} \right){S_i}{S_i}_{ + 1}\text{。} $$ (4) -
将各处理所得的IBR、Fv/Fm、
PIABS、相对叶绿素含量进行相关性分析，依据Pearson参数和显著性，检验IBR评价法用于计算低温胁迫下的叶绿素荧光综合指标的可行性。采用SPSS 22进行数据统计分析，应用最小显著差法(LSD)进行多重比较，采用Origin 2018进行回归分析和绘图。 -
由图1可知：15和5 ℃时相对叶绿素含量无显著变化，−5 ℃时开始显著下降，−25 ℃时极显著降低，与对照相比降低了63.8%。表明≤−5 ℃的低温环境会导致南极假山毛榉叶片相对叶绿素含量显著降低。
图 1 温度变化对相对叶绿素含量的影响
Figure 1. SPAD value of leaves under different temperature treatments
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由图2可知：5、15和25 ℃处理下OJIP曲线出现O、J、I、P各相(图2A、B)，表明这些温度下电子传递链运转正常；−5、−15和−25 ℃的OJIP曲线较为平缓(图2A)，缺少J相和I相(图2B)。将标准化的各处理曲线与ck相减，可见J相和I相合并，并且在光照极短时间(约0.03 ms)出现1个较大峰(图2C)，表明电子传递链严重受阻。OJIP曲线在5 ℃出现典型的K点(图2D)和L点(图2E)，表明PSⅡ供体侧和PSⅡ反应中心受损。
图 2 温度变化对叶绿素荧光动力学曲线的影响
Figure 2. Chlorophyll fluorescence kinetics curve of leaves under different temperature treatments
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由图3A可知：VK
随着温度降低，−5、−15和−25 ℃时均与对照达到显著差异，表明≤−5 ℃的低温处理会造成PSⅡ供体侧损伤。 
图 3 温度变化对南极假山毛榉快速叶绿素荧光诱导动力学曲线参数的影响
Figure 3. Parameters of chlorophyll a fluorescence transient under different temperature treatments
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−5、−15、−25 ℃处理下VL
上升明显(图3B)，表明≤−5 ℃的低温导致PSⅡ各单位之间的能量流通不畅。从−5 ℃到−25 ℃，RC/CSO随着温度降低逐渐减少(图3C)，但−15 ℃的RC/CSO显著高于−5 ℃，表明−15 ℃时PSⅡ单位面积反应中心数量出现短暂回升。从−5 ℃开始，随着温度降低，ABS/RC(图3D)、TRO/RC(图3E)和DIO/RC(图3F)持续增加，−25 ℃时分别比对照增加331.0%、134.7%和1 112.7%，表明由于缺少可供还原的QA，PSⅡ单位反应中心集聚了大量能量。 -
与对照相比，ETO/RC(图3G)和REO/RC(图3H)在−15和15 ℃时短暂下降，REO/RC在−25 ℃时又显著下降，表明高于−15 ℃的温度对PSⅡ受体侧的能量传输影响较小。当温度从25 ℃降低到5 ℃时，φPO(图3I)和ψEO(图3J)与对照相比无显著差异，δRO(图3K)仅在15 ℃时出现短暂下降；当温度继续降低到−5 ℃时，3项参数均显著下降，表明≤−5 ℃的低温对PSⅡ的电子传递效率有显著负面影响。
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随着温度降低，Fv/Fm与φPO的变化趋势相同(图4)。5 ℃时，
PIABS显著低于对照，−5、−15和−25 ℃时， PIABS接近于0，表明≥15 ℃的环境温度对南极假山毛榉叶片的光能吸收无显著影响，≤5 ℃时开始出现低温胁迫，≤−5 ℃会造成严重的冰冻胁迫(图5)。 
图 4 温度变化对Fv
/Fm的影响 Figure 4. Fv/Fm of leaves under different temperature treatments
图 5 温度变化对叶片性能指数的影响
Figure 5.
PIABS of leaves under different temperature treatments -
随着温度从25 ℃降至−25 ℃，VK
、VL、ABS/RC、DIO/RC、TRO/RC的拟合曲线持续上升，其余参数的拟合曲线持续下降(图3)，因此对VL 、VK、ABS/RC、DIO/RC、TRO/RC的标准后数值取正值，其余参数取负值，绘制星状图(图6)并计算IBR(图7)。与对照相比，IBR在5、−5和−15 ℃时显著增加，−25 ℃极显著升高。对IBR作回归分析显示：22 ℃为IBR拐点，高于或低于此温度均导致IBR升高；表明IBR与温度胁迫程度呈正相关，南极假山毛榉叶片对光能的吸收利用效率最佳值在22 ℃，≤5 ℃的低温会对南极假山毛榉PSⅡ光化学活性造成胁迫。 
图 6 不同温度处理下综合生物反应指数星状图
Figure 6. Star plots for biomarker responses under different temperature treatments
图 7 不同温度处理下的综合生物反应指数
Figure 7. IBR values under different temperature treatments
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对各温度处理下的Fv/Fm、PIABS、相对叶绿素含量、IBR和各测试温度进行相关性分析可见(表1)：IBR、相对叶绿素含量和温度均为显著负相关，表明IBR能较准确反映温度对南极假山毛榉PSⅡ光化学活性以及对相对叶绿素含量的影响。Fv/Fm和PIABS虽然也与温度呈显著相关，但与相对叶绿素含量无显著相关，表明IBR与相对叶绿素含量的相关度高于上述2项参数。
表 1 Fv
/Fm、IABS、相对叶绿素含量、IBR和温度的相关性分析 Table 1. Correlation analysis of Fv
/Fm, PIABS, SPAD value, IBR and temperature 参数 IBR PIABS Fv/Fm 相对叶绿
素含量测试
温度IBR 1 PIABS −0.73 1 Fv/Fm −0.72 0.94** 1 相对叶绿素含量 −0.95** 0.79 0.77 1 测试温度 −0.88* 0.90* 0.92* 0.90* 1 说明：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01 -
本研究中，当温度从25 ℃降低到15 ℃时，相对叶绿素含量、OJIP曲线、快速叶绿素荧光诱导动力学测量参数和IBR没有显著变化，说明15 ℃的环境温度对南极假山毛榉PSⅡ光化学活性的扰动轻微。当温度降低到5 ℃时，OJIP曲线出现K点和L点，PIABS开始显著下降，表明此阶段的低温主要对PSⅡ供体侧和反应中心构成胁迫，即放氧复合体(OCE)出现损伤，PSⅡ各单位之间的能量流通不畅。从−5 ℃降至−25 ℃，相对叶绿素含量显著降低，PSⅡ供体侧受损加剧；进入电子传递链的电子减少，引起电子传递效率下降；光反应的激发能不能及时传递到PSⅡ受体侧而大量积累，最终造成PSⅡ各单位之间的能量流通混乱，部分能量只能以热能的形式耗散。
OJIP曲线特征位点的变化能直观地反映出PSⅡ反应中心原初光化学反应的变化。HU等[9]发现低温处理下狗牙根Cynodon dactylon叶片OJIP曲线的相对荧光强度降低；曲丽娜等[7]进一步发现低温处理导致风箱果Physocarpus amurensis叶片的OJIP 曲线趋于平缓、P相下降、K点和L点出现；刘倩倩等[6]也得出相似结论，并发现低温处理导致O相上升。本研究发现：随着温度降低，南极假山毛榉叶片OJIP曲线的O相逐渐上升，−5、−15和−25 ℃的OJIP曲线趋于平滑，与前述研究结论相似；但前述物种均只涉及冷害胁迫(＞0 ℃)，而南极假山毛榉经历冻害胁迫(＜0 ℃)才出现上述现象，这可能与其耐寒性强有关。−5、−15和−25 ℃处理时OJIP曲线在0.03 ms附近出现新拐点，可能因为冰冻胁迫导致PSⅡ反应中心成为能量陷阱，能吸收光能但不能推动电子传递[22]，大量能量的积聚造成的。
JIP-test分析以OJIP曲线为数据基础，可提供大量反映光合器官的结构和功能的变化[23]。刘倩倩等[6]发现低温胁迫导致PSⅡ供体侧电子传递速率降低，PSⅡ反应中心数量减少；曲丽娜等[7]研究表明低温会造成放氧复合体受损，PSⅡ反应中心各单位之间的能量流通不畅，以及PSⅡ受体侧电子由初级电子受体(QA)向次级电子受体(QB)的传递过程受阻。伴随温度降低，南极假山毛榉的VK、VL、ABS/RC、TRO/RC和DIO/RC逐渐升高，RC/CSO逐渐减少，与前人研究结果相似；−15 ℃时RC/CSO出现短暂显著回升，推测是南极假山毛榉面对低温胁迫的应激反应，即通过增加PSⅡ单位面积光合机构含有的反应中心数量，以加大光能吸收量，弥补由于PSⅡ受体侧电子传递受阻而缺失的能量。
DUARTE等[20]利用IBR评价法，以JIP-test参数为数据源构建了光化学胁迫指数，证实了该参数与环境胁迫程度呈负相关关系。本研究发现IBR值与温度呈显著负相关，与DUARTE等[20]的结论相似。本研究还观察到，与Fv/Fm和
PIABS不同，IBR与相对叶绿素含量亦存在极显著负相关关系，可能预示IBR对低温胁迫的反映更具有广泛性。 多项研究显示，5 ℃的低温会引起Fv/Fm和PIABS显著降低[6-8，11]；本研究发现：高于5 ℃时南极假山毛榉叶片的Fv/Fm和IBR无显著变化，高于15 ℃时PIABS无显著变化，表明南极假山毛榉叶片PSⅡ的温度适应性强，这可能是南极假山毛榉耐寒性强的生理基础之一。研究还发现：冰冻胁迫对PSⅡ的光吸收能力抑制明显，预示在南极假山毛榉的生长季需要预防零度以下的寒潮侵袭。STECCONI等[24]发现南极假山毛榉的最适生长温度为18.5 ℃/7.0 ℃(昼/夜)，回归分析显示IBR的最小值出现在22 ℃，这一温度与上述研究结果仍有差距，可能与低温处理时间，以及参与计算IBR的参数种类有关，还需进一步探究。
Effect of low temperature on photosystem Ⅱ in Nothofagus antarctica
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摘要:
目的 探究低温对南极假山毛榉Nothofagus antarctica光系统Ⅱ(PSⅡ)的影响，利用综合生物反应指数(IBR)评价法计算低温胁迫下的叶绿素荧光综合指标的可行性。 方法 采取逐步降低环境温度的方法(从25 ℃降至−25 ℃)，测量并分析南极假山毛榉叶片的相对叶绿素含量和快速叶绿素荧光，计算各温度下植株的综合生物反应指数，综合评价温度降低对PSⅡ光化学活性的影响。 结果 环境温度为15 ℃时，PSⅡ光化学活性无变化；环境温度为5 ℃时，放氧复合体损伤，PSⅡ各单位之间的能量流通受阻。低温(−5、−15和−25 ℃)导致相对叶绿素含量显著降低，PSⅡ供体侧受损加剧，电子传递效率下降，PSⅡ各单位之间的能量流通混乱，热耗散显著增加。各温度处理下植株的综合生物反应指数和相对叶绿素含量与测试温度均表现为显著负相关。 结论 低于−5 ℃的低温会对南极假山毛榉PSⅡ的光化学活性造成严重胁迫，综合生物反应指数可以综合评价低温胁迫对植株PSⅡ光化学活性和相对叶绿素含量的影响。图7表1参24 Abstract:Objective Nothofagus antarctica PSⅡ photochemical performance under low temperature was assessed and its results were used in calculation integrated biomarker response (IBR) to assess the synthetical indicator of chlorophyll fluorescence under low temperature stress. Method The environment temperature of N. antarctica was changed gradually (from 25 ℃ to −25 ℃). After exposed, relative chlorophyll content (SPAD value) and fast chlorophyll fluorescence were measured and analysed, IBR were calculated, to assess the effect of low temperature PSⅡ photochemical activity. Result 15 ℃ hardly affects the PSⅡ photochemical activity. Oxygen-evolving complex and energy flow between PSⅡ units were disturbed under −5 ℃. Under the low temperature of −5, −15 and −25 ℃, SPAD value was remarkably reduced, and the PSⅡ donor side, electron transport of PSⅡ, energy flow between PSⅡunits were all disturbed seriously; heat dissipation was remarkably increased. IBR under different temperature treatments have a significant negative correlation with SPAD value and temperature. Conclusion The damage of PSⅡ photochemical activity by low temperature (below −5 ℃) was serious, and IBR can be used as a comprehensive parameter to evaluate the effect of low temperatures on PSⅡ photochemical activity and SPAD value. [Ch, 7 fig. 1 tab. 24 ref.] -
当前，树体高大、通风透光性差和管理粗放是导致针叶树种种子园采种难和雌球花花量不足的重要原因，制约着林木种子园的精细化经营和管理[1]。截顶影响营养物质流向和分配，促进结实母枝更新，是植株达到矮化效应的重要方法，对实现“果园式”林木种子园具有重要指导意义[2−3]。国外学者对花旗松Pseudotsuga menziesii进行夏季截顶和修枝后发现：虽然树冠体积减少了，但是枝条上雌雄球花密度显著增加，通过调控栽植间距，提高了单位面积球果产量[4]；国内学者研究表明：截冠可提高樟子松Pinus sylvestris var. mongholica壮龄母树的产量和种子质量[3]；对马尾Pinus massoniana截顶处理后发现：中产和高产无性系的雌球花量能提高20％以上[1]。
赤霉素(GAs)被认为是一种重要的双萜类植物生长调节剂，参与松树球花分化与茎伸长等许多重要的生长发育过程[5−6]。FERNÁNDEZ等[7]对辐射松Pinus radiata不同组织中内源GAs测定后发现：GA3在营养芽和雄球花中质量分数较高但比较稳定，而GA4则差异明显，推测GA4可能与它们的发育调节有关。赤霉素等激素比值的变化可表征树体内激素的不同吸收或运转规律。较高水平的Z型细胞分裂素和较低水平的脱落酸(ABA)及其代谢产物可能与雌球花的形成有关，在顶芽发育过程中GA和ABA往往表现出拮抗作用，外源注射GA4/7使顶梢ABA合成减少或通过其他途径加速了ABA代谢产物的分解，进而降低顶芽内源ABA及ABA分解代谢的主导产物ABA葡萄糖酯(ABA-ge)的质量分数，改变了它们的比值，进而提高雌球花的分化能力，增加雌球花的数量，但其机制尚不清楚[8−9]。
研究表明：外界因素首先通过植株内源激素质量分数及其比值的变化对生长和成花起作用[10]。营养芽转变为生殖芽也是植株体内各种激素在时间和空间上相互作用产生的综合结果，取决于促进和抑制开花这2类激素的平衡[11]。植物顶芽会抑制侧芽的发生，去除顶芽或抑制顶端优势则会促进侧芽的产生。截顶可通过抑制植株顶端优势形成，影响植株体内生长素和细胞分裂素的合成与再分配。在生产上，许多针叶树正是利用截顶与修枝、植物生长调节剂诱导等措施控制树体的生殖与营养生长平衡[12−13]。马尾松是中国南方主要的速生丰产优质用材树种和最重要的脂用树种[14]，其雌球花多分布于主枝或侧枝顶端，生殖芽和营养芽都由新生枝梢产生，其生理状态与花芽分化密切相关[15−20]。因此，本研究采用盆栽控制试验，以高产的马尾松无性系为试材，在花原基形成前期设置生产上常用的截顶和赤霉素诱导试验，研究树体内源激素质量分数及其比值的变化和平衡，以期为马尾松结实母树的树体管理提供理论指导和技术支持。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
试验地点位于浙江省淳安县林业总场有限公司姥山分场国家马尾松良种基地(29°32′34″N, 119°04′04″E)。供试材料选用马尾松第2代无性系种子园中结实能力强的209号无性系，于2017年选取无性系同一个母株上生长基本一致的穗条进行嫁接。2018年3月，将生长势相对一致、侧枝数量相近的无性系嫁接苗移栽至无纺布容器内。容器规格为直径70 cm，高度60 cm，每个容器内放入50 kg马尾松第2代无性系种子园内0~40 cm土层的酸性红壤，土壤pH 4.71、全氮3.59 g·kg−1、全磷0.34 g·kg−1、全钾16.90 g·kg−1、碱解氮248.00 mg·kg−1、速效磷5.48 mg·kg−1、速效钾228.00 mg·kg−1、有机质67.60 g·kg−1、交换性钙3.10 cmol·kg−1、交换性镁0.34 cmol·kg−1。每盆栽植1株，栽植后立即浇水，无性系植株按照完全随机配置，放置在铺设有地布的苗圃地内，株行距为1.5 m×1.5 m。苗木栽培常规管理。苗木培育期间，为保证生长条件和栽培管理一致，不施肥，干旱时滴灌，及时除草。
在处理前，对供试幼树的树高、地径、枝长、枝粗和轮枝数进行本底调查，树高为189.3~204.2 cm，地径为35.63~40.12 mm，枝长为45.5~96.5 cm，枝粗为17.89~21.68 mm，每株树均为3层轮枝。
1.2 试验设计和取样
1.2.1 截顶和赤霉素诱导试验处理
设置未截顶、截顶后保留1层轮枝、截顶后保留2层轮枝、未截顶+100 mg·L−1赤霉素(GA4/7)、未截顶+200 mg·L−1 GA4/7和未截顶+400 mg·L−1 GA4/7共6个处理，分别记为NT、T1、T2、NT+G100、NT+G200和NT+G400。每个处理设置3个重复，每个重复3个分株。在2021年6月15日，T1和T2截顶处理采用修枝剪自下而上分别一次性截除第1层和第2层轮枝处以上的顶梢，NT+G100、NT+G200和NT+G400处理在植株叶面分别均匀喷施100、200和400 mg·L−1的GA4/7混合液，喷施至针叶湿润且叶尖有液体下滴时为止，NT处理以喷施去离子水作为对照。
1.2.2 观测和取样
各处理在每株自下而上的第1层轮枝处(H1)和第2层轮枝处(H2)选择东、西、南、北4个方位的一级侧枝及顶梢(H3)作为固定观测对象。分别于2021年花原基形成前期(S1，6月20日)、花原基形成期(S2，7月20日)和花原基形成后期(S3，8月20日)测定枝长和枝粗。同时，于S1、S2和S3时期，分别在H1处4个方位的一级侧枝顶端选取1.0 g以上针叶，置于液氮中速冻，带回实验室，保存于−80 ℃超低温冰箱中，用于内源激素质量分数测定，研究截顶和GA4/7诱导对花原基形成期前后的针叶主要激素质量分数及其比值影响。2022年4月25日调查每株观测枝的雌球花数量。
此外，还针对T1、T2和NT处理，分别在截顶处理(2021年6月15日)后1、4、7、10、13、16和19 d取样。每次取样选取第1层轮枝处(H1)、第2层轮枝处(H2)一级分枝顶端和顶梢处(H3)的针叶，每个部位取样1.0 g以上，带回实验室，保存于−80 ℃超低温冰箱中，研究截除顶梢后短期内内源激素质量分数在时间和空间上的变化特征。每个处理设置3个重复，每个重复3个分株。
1.3 内源激素测定
委托南京瑞源生物技术有限公司采用安捷伦1290高效液相色谱仪串联Qtrap 6500质谱仪(AB公司)测定内源激素。测定的内源激素包括：吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA4和GA7)、水杨酸(SA)和玉米素核苷(ZR)。。
1.4 数据分析
采用SPSS 20.0软件对不同截顶强度和赤霉素诱导处理的结果进行差异性分析。试验数据经Levene检验满足方差齐性后，采用单因素和Duncan差异性检验(P＜0.05)进行方差分析和多重比较。图和表中数据均为平均值±标准误。
2. 结果与分析
2.1 截顶与GA4/7诱导对马尾松雌球花量和新梢生长的影响
与S1时期相比，到S3时期时，T1和T2处理后H1处的枝长增长量分别比NT高181.55%和119.31% (P＜0.05)，枝粗增长量分别高出NT的35.78%和9.17% (P＜0.05)；H2处的枝长和枝粗增长量分别比NT高的150.45%和111.49% (P＜0.05)。T1处理下的枝长和枝粗增长量略高于T2处理，但差异不显著(表1)。截顶后第2年，T1与T2处理的标准枝雌球花密度均显著高于NT，其中，T1处理H1处的雌球花密度较NT增加126.00%，T2处理H1和H2处的雌球花密度较NT分别增加82.67%和 66.52%。说明截顶削弱了顶端优势，促进下层结实母枝的生长和结实层下移，雌球花密度增加。
表 1 截顶和赤霉素诱导处理对雌球花密度和枝生长的影响Table 1 Effect of top pruning and gibberellin induction on female cones density and branch growth处理 H1 H2 H3 枝长净增
长量/cm枝粗净增
长量/cm雌球花密度/
(个·枝−1)枝长净增
长量/cm枝粗净增
长量/cm雌球花密度/
(个·枝−1)枝长净增
长量/cm枝粗净增
长量/cm雌球花密度/
(个·枝−1)NT 2.33±0.11 d 1.09±0.08 b 1.50±0.06 c 2.22±0.10 c 0.87±0.03 c 2.33±0.09 c 9.33±0.26 ab 1.66±0.09 a 2.94±0.13 b NT+G100 5.26±0.16 bc 1.03±0.06 b 2.93±0.12 ab 3.89±0.13 b 1.76±0.09 ab 3.17±0.15 ab 11.80±0.31 a 1.69±0.09 a 4.50±0.19 a NT+G200 8.42±0.25 a 1.18±0.09 ab 3.27±0.16 a 6.22±0.18 a 1.76±0.10 ab 3.39±0.16 ab 9.67±0.28 ab 1.06±0.04 ab 4.67±0.21 a NT+G400 6.14±0.17 b 1.56±0.11 a 2.67±0.10 ab 5.22±0.14 ab 2.01±0.12 a 3.33±0.16 ab 12.33±0.33 a 1.04±0.03 ab 3.33±0.15 b T1 6.56±0.18 b 1.48±0.09 a 3.39±0.16 a － － － － － － T2 5.11±0.14 bc 1.19±0.07 ab 2.74±0.11 ab 5.56±0.15 ab 1.84±0.11 ab 3.88±0.18 a － － － 说明：同列不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)；－表示无此项。 在S3时期，截顶与赤霉素处理相比，除T1和T2处理H1处的枝长增长量显著(P＜0.05)低于NT+G200处理外，T1与T2处理的雌球花密度与NT+G100、NT+G200、NT+G400处理结果差异均不显著；T1和T2处理其他轮枝处的枝长和枝粗增长量与GA4/7各处理间差异不显著。说明截顶和赤霉素处理均促进了马尾松结实母枝生长和雌球花形成。
2.2 截顶和GA4/7诱导对不同时期针叶主要激素质量分数及其比值的影响
2.2.1 截顶的影响
在S1时期，与NT相比，T1和T2处理的针叶IAA质量分数分别下降11.24%和9.62%，T2处理的IAA质量分数高于T1处理，但随着截顶程度的加重而降低(图1A)；T1和T2处理的GA7质量分数分别下降0.27%和1.26% (图1B)，GA4分别下降9.36%和12.62% (图1C)，ZR分别下降23.38%和18.77% (图1D)，而ABA分别增加15.09%和8.15%，T1处理的ABA质量分数高于T2处理(图1E)，但T1和T2处理两者间差异不显著。
图 1 截顶及GA4/7诱导对不同时期主要激素质量分数及其比值变化的影响Figure 1 Effect of top pruning and GA4/7 induction on changes in the content of major hormones and their ratios at different periods在S2时期，无论截顶与否，针叶IAA、GA7、GA4和ZR质量分数均较S1时期增加，其中，T1处理的IAA、GA7、GA4和ZR质量分数分别增加了1.21、1.21、0.92和0.80 ng·g−1，T2处理分别增加了1.45、0.77、0.86和0.76 ng·g−1，显著高于NT处理的增加量(0.30、24.67、0.04和0.11 ng·g−1，P＜0.05)，截顶处理后ABA质量分数较S1时期降低，其中，T1和T2处理分别降低52.97和48.06 ng·g−1。说明受截顶影响，在之后1个月时间，IAA、GA7、GA4和ZR质量分数呈恢复增长变化，其质量分数在S2时期并未受截顶强度加重显著降低。
在S3时期，与S2时期相比，T1和T2处理下针叶IAA、GA7、GA4和ZR质量分数下降，其中，T1处理分别下降6.32%、7.21%、46.03%和30.04%，T2处理分别下降6.52%、5.52%、42.16%和28.03%；与S1时期相比，T1处理的针叶IAA、GA7、GA4和ZR质量分数分别增加7.34%、2.08%、2.65%和1.58%，T2处理分别增加9.30%、0.55%、4.32%和0.76%；而T1和T2处理的针叶ABA质量分数较S1和S2时期持续降低。
由图1F看出：在S1时期，T1和T2处理的(IAA+GA7+GA4+ZR)/ABA比值较低，分别为7.22和7.61，均低于NT (8.33)，而在S2时期，T1和T2处理的(IAA+GA7+GA4+ZR)/ABA比值迅速增加，分别为11.32和11.23，均高于NT (10.21)，进一步印证了在花原基形成前期实施截顶，内源激素的比值显著下降，在花原基形成期间，生长促进型激素恢复增长，抑制型激素下降，内源激素的比值显著增加。
2.2.2 截顶与GA4/7诱导的对比分析
由图1A~D可知：在S1时期，T1和T2处理的针叶IAA、GA7、GA4和ZR质量分数显著低于NT+G100、NT+G200和NT+G400处理，而ABA质量分数显著增加 (P＜0.05)，其中，T1处理下的IAA、GA7、GA4和ZR质量分数分别比GA4/7处理低38.25%~56.39%、24.05%~27.06%、73.91%~101.09%和47.39%~76.31%，ABA质量分数比GA4/7处理高15.92%~27.52%；T2处理下的IAA、GA7、GA4和ZR质量分数分别比GA4/7处理低35.77%~53.59%、25.30%~29.17%、80.79%~109.04%和40.08%~67.56%，ABA质量分数则比GA4/7处理高10.53%~22.88%。
在S1~S3期间，NT+G100、NT+G200和NT+G400处理的IAA质量分数逐渐降低，马尾松针叶GA7、GA4和ZR质量分数均先增加后降低，S3时期的激素质量分数低于S1时期，ABA则先降低后增加；截顶与GA4/7诱导后主要激素质量分数的变化趋势不同，T1和T2处理的马尾松针叶IAA、GA7、GA4和ZR质量分数均为先增加后降低，但是，S3时期的激素高于S1时期，ABA则为持续降低。从图1F可看出：在S2时期，NT+G400处理的(IAA+GA7+GA4+ZR)/ABA比值最高，比NT+G200、NT+G100、T2和T1处理依次高5.97%、12.34%、20.67%和21.64%。
2.3 截顶后短期内内源激素质量分数在时间和空间上的变化特征
2.3.1 短期内的动态变化
由图2A可知：在花原基形成前期截除顶梢，T1和T2处理的马尾松针叶IAA质量分数呈先降低后增加的趋势，到第16天时比NT高33.33%~45.45%。截顶后针叶的GA7质量分数趋势变化不显著，T1处理和T2处理的针叶GA7质量分数也均无显著性差异(图2B)。截顶后马尾松针叶的GA4质量分数呈显著下降 (P＜0.05)，在第10天达到最低，并比NT处理显著低24.26%~35.32% (P＜0.05)，之后逐渐增加(图2C)。T1和T2处理的马尾松针叶ZR质量分数均比NT处理显著低4.39%~57.65% (P＜0.05)，而T1和T2处理间差异不显著(图2D)。说明截顶处理打破了马尾松原有的激素平衡，使针叶中的IAA和GA4生长促进型激素出现短期内先下降后升高的现象。T1和T2处理的ABA质量分数呈降低趋势，但始终高于NT处理(图2E)。在第1~4天时，T1和T2处理马尾松针叶的SA质量分数急剧上升，之后逐渐下降，至第16天时，与NT处理差异不显著(图2F)。
图 2 不同截顶程度对马尾松针叶内源激素质量分数动态变化的影响Figure 2 Effect of different levels of topping on the dynamic changes of endogenous hormone contents in the needles of P. massoniana2.3.2 不同高度处的空间变化
在不同高度处，未截顶的马尾松针叶IAA质量分数从高到低依次为H3、H2、H1，T2处理IAA质量分数为H2大于H1；在第10天之后，T1处理H1处的针叶IAA质量分数显著高于T2处理(图2A，P＜0.05)。在第13天之后，未截顶H3处的马尾松针叶GA7质量分数与H2和H1处相比差异不显著(图2B)，T2处理H1处针叶GA7质量分数和H1处差异不显著，未截顶的针叶GA4质量分数从高到低依次为 H3、H2、H1，T2处理GA4质量分数为H2大于H1，T1处理H1处针叶的GA4质量分数在截顶后第10天低于T2处理，之后逐渐高于T2处理(图2C)。未截顶的ZR质量分数从高到低依次为 H3、H2、H1，T2处理针叶的ZR质量分数在H2处最高，T1处理H1处的ZR质量分数始终最低(图2D)。说明截顶强度影响着不同轮枝处针叶的IAA、GA4和ZR激素质量分数。未截顶的ABA质量分数从高到低依次为H1、H2、H3，T2处理ABA质量分数为H1大于H2，T1处理H1处的针叶ABA质量分数比T2处理高2.85%~7.84% (图2E)。未截顶时，SA质量分数在H1、H2和H3处差异不显著，随截顶程度的加重，在第1~13天，T1处理H1处的SA质量分数比T2处理H1处显著高1.88%~90.88% (P＜0.05，图2F)。
3. 讨论
已有研究表明：通过截顶可以增加母树对光能的有效利用，影响叶面积与营养储藏水平，也对侧枝的生长具有重要影响[3, 21]。本研究发现：马尾松树体截顶后不仅促进了枝梢的生长，而且显著增加了雌球花密度。这与KOLPAK等[4]在夏季对花旗松进行截顶和修枝的研究结果相类似。截顶和修枝后花旗松枝条上的雌雄球花量增加，提高了单位面积球果产量。王福森等[2]研究也表明：樟子松截顶后促使母树结实层下移，平均单株球果数增加。截顶处理可以控制树体顶端优势，促使结实母枝更新。通过与赤霉素处理对比发现：截顶处理的雌球花密度与其差异不显著，说明截顶不仅可作为种子园树体管理的有效措施，而且也可促进雌球花形成。郑一等[1]研究马尾松不同结实能力无性系同样发现：截顶可提高中产和高产无性系的雌球花量20％以上。陈虎等[22]对16年生马尾松无性系截顶处理发现：随着截顶强度的增加，母树生长和结实能力增强，在保留1轮枝的情况下结实最多；HAN等[23]对红松P. koraiensis截干后同样得出结果枝数量增加，结实量提高的结果。因此，截顶处理可以控制马尾松树体顶端优势，促使结实母枝更新。植物激素，尤其赤霉素通过其自身前馈和反馈调节参与松树花器官发育并在调节植株生长、控制树势或适应逆境过程中发挥重要作用[7, 24]。马尾松顶端优势强，雌球花多分布在主枝或侧枝的顶端，植株顶芽会抑制侧芽的发生，去除顶芽或抑制顶端优势则会促进侧芽的产生。已有研究表明：树木木质部汁液中细胞分裂素和ABA质量分数与比值在胁迫信号传递中起着重要作用，较高质量分数的Z型细胞分裂素和较低水平的ABA及其代谢产物可能与雌球花的形成有关[25−26]。通过分析花原基形成期间3个阶段的主要激素质量分数与标准枝雌球花量相关性，均发现在花原基形成期，截顶处理后GA4、IAA、GA7和ZR质量分数与雌球花量相关性最高，与ABA质量分数呈显著负相关。研究表明：未截顶时，不同高度处的IAA、GAs和ZR质量分数从高到低依次为H3、H2、H1。在花原基形成前期截顶，受胁迫的影响，促进生长型激素IAA和GA4质量分数呈先降低后增加的动态变化，T2处理依然表现为H2大于H1，截顶后20 d左右，主要激素水平可恢复稳定；在花原基形成期，下部枝条的IAA、GAs和ZR质量分数较花原基形成前期显著增加，(IAA+GA+ZR)/ABA比值大幅提升，说明截顶削弱了顶端优势，促使下部侧枝的激素质量分数在空间上随高度的降低和截顶程度的加重而变化，打破了树体原有的养分平衡，可能通过内源激素的合成、极性运输和信号转导等途径，调节着营养生长与生殖生长之间的平衡。这可能是促进侧芽更快地生长和雌球花形成的主要原因之一[9, 20, 27]。
在顶芽发育过程中，GA和ABA往往表现出拮抗作用，外源注射GA4/7使顶梢ABA合成减少或通过其他途径加速了ABA代谢产物的分解，进而降低顶芽内源ABA及ABA分解代谢的主导产物ABA葡萄糖酯(ABA-ge)的质量分数。GA4/7的使用也可增加反式玉米素核苷(t-ZR)水平和降低异戊烯基腺嘌呤(IP型)细胞分裂素，改变了它们的比值，进而提高雌球花的分化能力，增加雌球花的数量[28−30]。本研究通过截顶处理和GA4/7诱导的对比试验同样得出：在花原基形成期，截顶和GA4/7诱导处理可显著降低ABA质量分数，增加ZR质量分数。国内外育种工作者已经利用GA4、GA7等极性较小的赤霉素可促进多种松树开花和诱导雌雄球花分化的能力，在生产上积累了丰富的经验[31−32]。虽然截顶处理与赤霉素诱导马尾松针叶的内源激素质量分数变化趋势有所不同，但均表明通过树体内主要激素质量分数及其比值平衡的变化，可以调控树体的生长发育，进而指导生产。此外，持续截顶或修枝措施，也是控制顶端优势的方式，对激素变化也有影响。但NEILSEN等[32]对辐射松修枝研究发现：持续修剪对枝条生长有长期影响，造成枝粗增长缓慢。
4. 结论
在花原基形成前期实施截顶和赤霉素处理均可促进马尾松结实母枝更新和雌球花形成，与针叶内源激素质量分数的变化密切相关。截除顶梢后，马尾松针叶的IAA、GA7、GA4和ZR质量分数显著下降，而ABA质量分数显著增加。截顶影响着内源激素重新分配，(IAA+GA7+GA4+ZR)/ABA比值在花原基形成期显著升高。截顶与GA4/7诱导后主要激素质量分数的变化趋势不同，在S1至S3时期，赤霉素诱导后的IAA质量分数逐渐降低，GA7、GA4和ZR质量分数先增加后降低，ABA质量分数则先降低后增加。研究结果表明：生产上通过持续截顶，优化截干技术和控制树势，配合激素诱导，可促进结实母树更新和调控雌球花形成。
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图 1 温度变化对相对叶绿素含量的影响
不同字母表示在0.05水平上差异显著
Figure 1 SPAD value of leaves under different temperature treatments
图 2 温度变化对叶绿素荧光动力学曲线的影响
A. 不同温度处理的OJIP曲线(5次重复的平均值)；B. 离差标准化的OJIP曲线；C. FO与FP间相对可变荧光强度差值；D. FO与FJ间相对可变荧光强度差值；E. FO与FK间相对可变荧光强度差值
Figure 2 Chlorophyll fluorescence kinetics curve of leaves under different temperature treatments
图 3 温度变化对南极假山毛榉快速叶绿素荧光诱导动力学曲线参数的影响
图中曲线为多项式回归拟合结果，R2表示拟合优度判定系数。不同字母表示在0.05水平上差异显著
Figure 3 Parameters of chlorophyll a fluorescence transient under different temperature treatments
图 4 温度变化对Fv
/Fm的影响 不同字母表示在0.05水平上差异显著
Figure 4 Fv/Fm of leaves under different temperature treatments
图 5 温度变化对叶片性能指数的影响
不同字母表示在0.05水平上差异显著
Figure 5
PIABS of leaves under different temperature treatments
图 6 不同温度处理下综合生物反应指数星状图
Figure 6 Star plots for biomarker responses under different temperature treatments
表 1 Fv
/Fm、IABS、相对叶绿素含量、IBR和温度的相关性分析 Table 1. Correlation analysis of Fv
/Fm, PIABS, SPAD value, IBR and temperature 参数 IBR PIABS Fv/Fm 相对叶绿
素含量测试
温度IBR 1 PIABS −0.73 1 Fv/Fm −0.72 0.94** 1 相对叶绿素含量 −0.95** 0.79 0.77 1 测试温度 −0.88* 0.90* 0.92* 0.90* 1 说明：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01 
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