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扦插繁殖是无性繁殖的重要技术手段之一，操作简单，应用广泛，后代很好地保持了亲本的优良遗传性状，但受母树年龄影响较大。对双色栎Quercus bicolor、使君子Quisqualis indiaca及水黄皮Pongamia pinnata 等树种的研究发现[1-3]：诱导插穗产生不定根是植物扦插成功的关键，随着母树年龄的增加，林木插穗生根能力出现下降，插穗生根率随母树年龄的增加逐渐降低[4-5]。解剖结构观察发现：不同年龄母树的插穗组织结构不同；植物开花度过幼年期后进入到成年期，是生理老化的开始，植物内部生根抑制物质增加，生根促进物质减少，再生作用降低、生活力下降[6]。一般来说，幼年期是无性繁殖采条的最佳时期。扦插生根过程中，吲哚乙酸氧化酶(IAAO)通过影响内源生长素(IAA)氧化及含量的变化来影响生根[7]，过氧化物酶(POD)活性升高被认为是诱导生根启动的信号，多酚氧化酶(PPO)在根起始阶段与酚类的代谢有关[8]。栓皮栎Quercus variabilis 是壳斗科Fagaceae栎属Quercus 植物，是中国重要的珍贵用材树种，经济和生态价值极高[9-10]。近年来，学者利用扦插繁殖对栓皮栎嫩枝扦插进行了相关研究[11-12]，但对不同母树年龄的栓皮栎扦插生根研究报道并不多。本研究以1年生、5年生及10年生栓皮栎母树的半木质化嫩枝为插穗材料，测定插穗的生根率、生根数量、根直径和根长等特征变化，观察不同时期插穗茎段的组织结构和酶活性变化，旨在揭示不同母树年龄栓皮栎不定根诱导形成的相关机制，为不同年龄栓皮栎的扦插繁殖提供参考。
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栓皮栎扦插繁殖试验在中国林业科学研究院科研温室进行。该温室顶部设有天窗和遮阳网，室内有风扇和湿帘。扦插期间室温为25~31 ℃，相对空气湿度≥85%，晴天9:00—11:00的光合有效辐射为800 μmol·m−2·s−1，二氧化碳(CO2)摩尔分数约380 μmol·mol−1[13]。试验苗床为南北走向，规格21.0 m×1.5 m，试验时间为2019年7—9月。
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2019年7月16日分别在中国林业科学研究荒漠化研究所1年生、5年生和10年生的栓皮栎母树上采集树冠中下部生长势良好、无病虫害的当年生嫩枝。将嫩枝修剪为8~10 cm的插穗，每个插穗顶端保留1~2个叶片，每个叶片保留1/3面积；每个插穗预留2~3个腋芽，插穗枝的顶端在距上端芽1 cm处平切，底端斜切。
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珍珠岩和泥炭按体积比7∶3配制成基质，用质量分数0.1%高锰酸钾灭菌后装入轻基质无纺布育苗袋中，育苗袋高9.0 cm，上下内径均为3.8 cm。
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参照ABT生根粉使用说明，以200 mg·L−1植物生长调节剂ABT-1号(北京艾比蒂生物科技有限公司)浸泡2 h处理插穗。①解剖结构观察试验。以1年生、5年生和10年生插穗为试验材料，各年龄母树的插穗设置3次重复，各重复45个插穗，共135个。②酶活性测定试验。各年龄母树的插穗设置3次重复，各重复150个插穗，共450个。③生根率统计试验。各年龄母树的插穗设置3次重复，各重复105个插穗，共315个。所有年龄处理共900个插穗，采用完全随机区组设计，在相对一致的环境下，进行统一浸泡处理。
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扦插前用小棒在基质内引孔，深度为2~3 cm。每个容器扦插1根插穗。扦插后用小棒将插穗周边的基质稍加压实，浇透水，将容器摆放在塑料托盘中。扦插完成后在插床搭建高约45 cm白色塑料薄膜拱棚，扦插基质湿度保持为55%~65%，拱棚内相对空气湿度保持为85%以上，天气晴朗时插穗上方30 cm处覆盖50%遮阳网。
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扦插60 d后，统计各处理的生根株数和每个插穗的生根数量，测量各插穗不定根的直径与长度。计算扦插生根率(%)。从各处理已生根插穗中随机抽取5个插穗，计算平均不定根数量、不定根长及不定根直径。
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栓皮栎生根过程中，扦插前进行第1次取样，每个处理随机取3根插穗，重复取样3次，取其基部2~3 cm茎段部分。10 d后再次取样，之后隔7 d取样1次，直到9月1日结束取样工作。所有样品均保存在FAA溶液(V甲醛∶V冰醋酸∶V70%酒精=1∶1∶18) 里，抽真空。常规石蜡切片，切片厚度为10~12 μm，甲苯胺蓝染色，在光学显微镜(Olympus BX51)下观察插穗基部组织结构并拍照。
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栓皮栎生根过程中，扦插前第1次取样，取其基部3~4 cm范围内的韧皮部，每次取样10根，设置3次重复，用锡箔纸包好后放入液氮中，再转移至−80℃冰箱进行保存；10 d后再次取样，之后7 d取样1次，直至9月1日结束。参考李墨野[14]和刘俊芳[15]方法测定样品PPO和POD活性，参考王小虎[16]测量IAAO活性。
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采用单因素方差分析和Duncan法进行多重比较，采用SPSS 19.0软件进行数据统计处理。
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由图1可知：栓皮栎生根部位为插穗基部，不定根从皮层长出。1年生栓皮栎嫩枝插穗在扦插17 d后发现白色不定根突出(图1A1)，31 d不定根形成(图1A2)，38 d不定根由白色发育为褐色，并出现根伸长的现象(图1A3)，44 d不定根数目增多(图1A4)。5年生栓皮栎嫩枝插穗在扦插44 d才发现白色的不定根形成(图1B4)，此前的插穗叶子长势良好，插穗顶部有愈伤组织形成。10年生栓皮栎插穗在整个实验期间未见不定根形成，且叶子逐渐干枯，部分插穗变黑，直至死亡(图1C4)。
图 1 不同年龄栓皮栎母树插穗在生根期间的外部形态
Figure 1. External morphological of mother cuttings of Q. variabilis at different ages during rooting
从表1可以看出：栓皮栎嫩枝扦插生根率及其根系特征存在明显的年龄效应。栓皮栎嫩枝扦插生根率和平均不定根数量从多到少依次均为1年生、5年生、10年生，各年龄插穗差异显著(P＜0.05)，平均不定根长和根直径从大到小依次均为5年生、1年生、10年生，各年龄插穗差异显著(P＜0.05)。
表 1 栓皮栎不同年龄母树插穗的生根情况
Table 1. Rooting of cuttings of Q. variabilis mother tree at different ages
年龄 生根率/% 平均不定根数量/条 平均不定根长/mm 平均不定根直径/mm 1年生 92.69±0.02 b 3.6±2.15 b 40.22±10.09 b 1.19±0.25 b 5年生 10.79±0.10 a 2.6±0.49 b 52.82±8.35 c 1.42±0.21 b 10年生 0 a 0 a 0 a 0 a 说明：数值为平均值±标准差，同列不同字母表示差异显著(P＜0.05) -
解剖学观察(图2)可知：插穗基部由外向内依次为表皮、皮层、厚壁组织、韧皮部、形成层及木质部等。扦插0 d时3个年龄的栓皮栎厚壁组织宽度不一，表现为5年生和10年生较大，1年生较小(图2A1、图2B1和图2 C1)。1年生栓皮栎嫩枝扦插生根约需44 d，经历诱导期—表达期—形成期—伸长期等阶段；5年生栓皮栎嫩枝扦插44 d后插穗生根才进入形成期，而10年生栓皮栎嫩枝则一直处于诱导期，未发生生根迹象。1年生和5年生栓皮栎嫩枝最终都形成了不定根，其根原基是在不定根形成后期产生，由此判断栓皮栎根原基为诱生型。1年生栓皮栎嫩枝扦插10 d时，插穗没有发现根原基的存在，处于不定根诱导期(图2A2)；扦插17 d后靠近表皮位置出现不定根，此时为不定根表达期(图2A3)；扦插31 d后不定根明显形成，此时为不定根形成期。不定根主要由靠近形成层附近的薄壁细胞分化而来，依次向外突破韧皮部、厚壁组织、皮层及表皮(图2A4)。扦插44 d后，不定根向外延伸，处于伸长阶段(图2A5)。5年生栓皮栎嫩枝扦插44 d后不定根出现，其由维管形成层附近的薄壁细胞分化而来，向外伸展，处于不定根的形成期(图2B5)。10年生栓皮栎嫩枝在整个生根过程中插穗基部的组织没有任何明显变化。
图 2 1年生、5年生及10年生栓皮栎解剖学结构观察
Figure 2. Anatomical structure of 1, 5 and 10-year-old Q. variabilis
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不同年龄栓皮栎嫩枝生根过程中的POD、PPO及IAAO活性变化规律存在差异。由图3可知：不同年龄插穗POD活性水平1年生和5年生要高于10年生；PPO活性水平从大到小依次为1年生、5年生、10年生；扦插17 d之前IAAO活性水平10年生大于5年生和1年生，17 d后从大到小依次为1年生、5年生、10年生。1年生和5年生插穗POD活性整体呈先上升后下降的单峰趋势，1年生在扦插17 d时达到峰值；5年生在扦插31 d时达到峰值，此时插穗都处于不定根的表达期(图2 A3、图2B4)。10年生插穗POD活性呈先下降后上升的趋势，在扦插17 d时达最低值。
图 3 栓皮栎扦插生根过程中酶活性变化
Figure 3. Changes of enzyme activities during the rooting process of Q. variabilis cuttings
1年生插穗的PPO活性呈先上升后下降的单峰趋势，在扦插17 d时出现峰值，此时PPO活性显著高于5年生和10年生插穗；5年生插穗的PPO活性则出现了双峰趋势，最大值出现在扦插31 d时，此时PPO活性与1年生插穗差异不显著，却显著高于10年生插穗；10年生插穗的PPO活性整体变化趋势不明显。
1年生和5年生插穗的IAAO活性整体上呈先上升后下降的单峰趋势，在扦插31 d时出现峰值，1年生IAAO活性显著高于5年生和10年生。此时1年生栓皮栎进入不定根形成期(图2 A4)，5年生进入不定根表达期(图2 B4)。10年生插穗IAAO活性整体变化呈现先下降后上升趋势。
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本研究发现：1年生和5年生栓皮栎扦插均产生了不定根，10年生无不定根；插穗生根率从高到低依次为1年生、5年生、10年生，且差异显著。可见植物插穗的母树年龄越小，不定根形成时间越短，生根率也越高。原因可能是母本年龄越小，代谢更加活跃，酶活性含量会增加，POD活性增加有利于增加细胞壁的强度[17]，能更好地抵御病原体入侵，有助于插穗生根，这与十月樱Prunus subhirtella ‘Autumnalis’和夏栎Quercus robur的研究类似[4, 18]。母树年龄越大，插穗的组织分化程度会更高，进行再分化的能力下降[19]；而随着年龄增加，韧皮纤维厚度会加大，韧皮纤维细胞壁厚，会增加生根的机械阻力[20]，这些都会影响不定根的生成。
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对插穗组织解剖结构的观察发现：栓皮栎的不定根根原基是在生根过程中形成的，由此判定栓皮栎根原基类型为诱生型。通常来说，诱生型根原基的出现需要一定时间，导致植物插穗难以生根[20]，这可能是栓皮栎插穗生根难的原因之一。栓皮栎插穗的皮层和韧皮部间存在连续的环状厚壁组织，观察发现5年生和10年生厚壁组织的宽度大于1年生，这可能也是造成栓皮栎5年生和10年生生根率低的原因。在沙棘Hippophae rhamnoide[21]及冬青llex×altaclerensis ‘Belhica Aurea’[22]扦插繁殖过程中也发现厚壁组织的存在和生根率不高存在一定相关性。
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POD、PPO和IAAO的活性与不定根形成关系密切[7]。扦插前POD活性升高，可以保护插穗免受活性氧自由基的侵害[12]。高活性POD有利于细胞分化产生不定根[23]，1年生和5年生插穗在不定根表达期POD活性出现峰值，使得插穗内的IAA含量降低，从而有助于不定根的形成[24]。随后POD活性开始下降，至不定根伸长期后又开始升高。10年生插穗则出现先下降后上升的趋势，其POD活性在扦插下降，预示其对插穗保护效果下降，自由基及活性氧对插穗细胞侵害加大，不利于不定根的形成。
PPO可以催化酚类物质，在根原基诱导和发育过程中起至关重要作用[25]。本研究中1年生栓皮栎生根过程中PPO活性呈单峰趋势，在扦插17 d(不定根表达期)出现峰值，此时高活性的PPO有助于催化酚类物质与IAA形成生根辅助因子“IAA-酚酸复合物”，以此促进生根[26-27]。5年生栓皮栎生根过程PPO活性水平呈双峰趋势，扦插31 d(形成期)，峰值明显大于扦插第10 d(诱导期)。诱导期(10 d)时插穗的切口暴露在外，高水平PPO活性可降低其被细菌侵害的可能[28]；至不定根形成期(31 d)，插穗需要更高的PPO活性来形成生根辅助因子促进生根。10年生的PPO活性整体趋势变化不明显，这可能是其难生根的原因。
IAAO通过调节内源IAA的水平来影响不定根的形成。1年生和5年生IAAO活性均呈现单峰趋势，且1年生的IAAO活性显著高于5年生。IAAO活性升高有助于消除插穗体内多余的IAA[29]，利于生根诱导[30]。10年生插穗IAAO的酶活性整体上趋势变化不大，并且在31 d出现下降的趋势，使得IAAO活性降低，内源IAA水平过高，导致生根率低。
总体上，1年生和5年生插穗在不定根表达期不定根开始形成，这时的POD和PPO活性最高；1年生IAAO活性低，5年生IAAO活性偏高，导致插穗体内IAA被大量降解，最终影响生根率。同时，ABT属于外源激素，对内源激素也会产生影响，所以IAAO活性也会受到一定影响。
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母树年龄影响插穗不定根的生成，栓皮栎嫩枝扦插生根率和平均不定根数量从高到低依次为1年生、5年生、10年生，平均生根率1年生为92.69%，5年生为10.79%，10年生为0。栓皮栎的生根类型为皮部生根型，其根原基属于诱生型根原基，不定根主要由靠近形成层附近的薄壁细胞分化而来，最终突破韧皮部、厚壁组织、皮层及表皮向外伸长，但皮层与韧皮部中间存在的连续环状厚壁组织对不定根的形成有一定的阻碍作用。POD活性增加有利于增加细胞壁强度，使植物能更好地抵御病菌，有助于插穗生根；PPO活性增加能促进生根辅助因子“IAA-酚酸复合物”的形成，IAAO活性增加有助于减少体内IAA含量，较低质量浓度的IAA有助于促进生根；栓皮栎插穗1年生和5年生POD、PPO及IAAO活性整体呈现“先上升后下降”趋势，POD和PPO活性升高有利于不定根的表达，IAAO活性升高有助于不定根的生成。
Rooting, anatomical analysis and changes of enzyme activity of softwood cuttings of Quercus variabilis at different ages
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摘要:
目的 探讨母树年龄对栓皮栎Quercus variabilis嫩枝扦插生根的影响，解析其可能成因，为栓皮栎扦插繁殖提供依据。 方法 以1年生、5年生和10年生栓皮栎母树的半木质化嫩枝为材料，用200 mg·L−1 生根粉(ABT-1号)浸泡处理2 h。扦插60 d后，测定各插穗生根率、生根数量、根直径、根长及多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)及吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性；采用石蜡切片法观察不同年龄插穗茎段的组织结构变化。 结果 ①母树年龄越大，嫩枝扦插生根率越低。②栓皮栎不定根根原基在不定根形成后期被诱导；不同年龄插穗产生不定根时间存在差异，1年生为17 d，5年生为44 d，10年生未产生不定根。③1年生和5年生母树的插穗中IAAO、PPO和POD这3种酶活性总体呈“先上升后下降”的单峰趋势，10年生母树的插穗POD活性总体呈增加趋势，PPO和IAAO活性变化不明显。 结论 母树年龄影响插穗不定根的生成，栓皮栎嫩枝扦插生根率和平均不定根数量从高到低依次为1年生、5年生、10年生，1年生平均生根率为92.69%，5年生的平均生根率为10.79%，10年生的为0。栓皮栎的生根类型为皮部生根型，其不定根原基类型为诱生根原基。高水平POD、PPO活性有助于不定根的诱导，IAAO活性升高有助于不定根的形成。图3表1参30 Abstract:Objective This study aims to explore the effect of mother tree age on the cutting rooting of Quercus variabilis as well as the possible causes, so as to provide basis for the cutting propagation of Q. variabilis. Method The semi-lignified shoots of 1, 5 and 10-year-old oak mother trees were soaked with 200 mg·L−1 root powder (ABT-1) for 2 h. The rooting rate, rooting number, root diameter, root length and activities of polyphenol oxidase (PPO), peroxidase (POD) and IAA-oxidase (IAAO) were determined after 60 d. The changes of tissue structure of stem segments of cuttings at different ages were observed by paraffin sectioning. Result (1) The older the mother tree was, the lower the cutting rooting rate was. (2) The adventitious root primordium of Q. variabilis was induced in the late stage of adventitious root formation. The adventitious root generation time of cuttings at different ages was different (17 d for trees of 1 year old , 44 d for 5 years old, and none for 10 years old). (3) The activities of IAAO, PPO and POD in the cuttings of 1-year-old and 5-year-old mother trees showed a single-peak trend of ‘first increasing and then decreasing’, while the activities of POD in the cuttings of 10-year-old mother trees showed an increasing trend. The activities of PPO and IAAO did not change significantly. Conclusion The age of mother trees affects the generation of adventitious roots of cuttings. The rooting rate and the average adventitious root number of Q. variabilis softwood cuttings from high to low are trees of 1 year old, 5 years old and 10 years old, with an average rooting rate of 92.69%, 10.79%, and 0, respectively. The rooting type of Q. variabilis is dermal rooting type and its adventitious root primordium is induced root primordium. High levels of POD and PPO activity are conducive to adventitious root induction, while increased IAAO activity is conducive to adventitious root formation. [Ch, 3 fig. 1 tab. 30 ref.] -
Key words:
- Quercus variabilis /
- cutting /
- age effect /
- rooting rate /
- anatomical structure /
- enzyme activity
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换锦花Lycoris sprengeri为石蒜属Lycoris球根花卉，春初出叶，叶片为带状，宽约1.0 cm，长约30.0 cm，叶顶钝圆；秋初开花，花茎高约60.0 cm，伞形花序4~6朵，6片倒披针形花瓣，长约4.5 cm，宽约1.0 cm；花多淡紫红色，花被顶端蓝色，花色花型丰富，是石蒜属特殊的复色花卉[1]。
目前，换锦花的花色性状改良主要以传统的种间杂交和选择育种为主，分子标记育种为辅的育种模式。徐炳声等[2]利用杂交授粉技术，以换锦花为母本，中国石蒜L. chinensis为父本，选育出粉白色的秀丽石蒜L.× elegans；张定成等[3]在安徽和淮南发现三倍体和二倍体野生换锦花资源，表明换锦花可能是由其他石蒜属植物杂交而来。然而换锦花生长周期长，在自然状态下授粉率低且结实少，种子萌发率低，制约了换锦花传统育种研究。为了克服传统杂交育种的缺陷，不少研究者利用现代分子生物学技术探索换锦花花色分子育种性状改良的有效手段[4−6]。花色苷生物合成途径是类黄酮生物合成的一个分支途径，主要由结构基因和调控基因共同调控，花色苷积累受光照、温度和水分等多种因素的影响，植物受到强光、低温、氮亏缺等逆境协迫时会大量合成花色苷以增强自身抗性[7]，花色苷的生物合成也受到植物体自身生长发育过程的影响[8]。大量研究表明：R2R3-MYB 是花色苷生物合成的重要调控因子，常与bHLH和WD40形成MBW复合体结合到结构基因启动子序列上共同调控葡萄Vitis vinifera、风信子Hyacinthus orientalis、苹果Malus pumila花色素苷的生物合成[9]。许振渊等[10]和侯朔等[11]克隆了换锦花R2R3-MYB转录因子LsMYB4和LsMYB5基因，周洋丽等[12]通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究发现LsMYB4和LsMYB5是换锦花花青素合成的抑制性转录因子。周洋丽[13]和薛惠敏等[14]成功克隆了换锦花LsANS、LsF3'H、LsUFGT1和LsUFGT2基因启动子序列，为研究换锦花花色形成的调控机制和遗传改良提供基础。为进一步探讨换锦花花色形成的调控网络，本研究根据换锦花花瓣(红色部分和蓝色部分)转录组信息筛选到与换锦花花色形成相关的差异R2R3-MYB转录因子LsMYB7并进行生物信息学分析，通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究该基因调控花色苷积累的相关功能，结果可为通过基因工程手段改良换锦花的花色奠定理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
2019年8—9月于浙江农林大学石蒜属植物种质资源圃采集换锦花花瓣，取换锦花小花苞(2.0~3.5 cm)、大花苞(4.5~6.0 cm)、盛花期和败花期4个不同花发育时期(图1A)和不同花色无性系H1、H2、H3、H4和H5盛花期花瓣(图1B)，液氮速冻后于−80 ℃冰箱保存备用。
图 1 换锦花不同花发育时期(A)和不同花色无性系盛花期(B)Figure 1 Different stages of flower development (A) and peak flowering stage in different clonal plants (B)1.2 方法
1.2.1 换锦花花瓣总RNA提取和cDNA第1链的合成
采用RNAiso plus法提取换锦花花瓣总RNA[15]，参照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Takara)方法合成cDNA 第1链。
1.2.2 换锦花LsMYB7基因cDNA序列的PCR扩增
根据转录组测序信息设计LsMYB7基因 cDNA序列特异引物LsMYB7-F：CAAGCAGTGGTCTCAACA和LsMYB7-R：AGAACAGCACTACTAAAGGT，参照Premix PrimeSTAR HS的PCR扩增体系扩增目的基因cDNA序列，PCR扩增反应程序为94 ℃变性30 s；58 ℃ 退火30 s；72 ℃延伸90 s，32个循环，72 ℃延伸10 min，质量浓度为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，于凝胶成像系统(Bio-RAD)观察拍照；采用Hingene琼脂糖凝胶回收试剂盒(杭州麦克德勒科技有限公司)回收目的DNA，于−20 ℃保存备用。
1.2.3 目的基因连接和转化
参照pEASY-Blunt Zero Cloning Kit说明书将目的基因LsMYB7序列连接到pEASY-Blunt载体，转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞；在含有氨苄青霉素(Amp)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚 β-D-半乳糖苷(X-Gal)的LB培养基(Luria-Bertani medium)上培养过夜，挑取阳性克隆于LB液体(含50 mg·L−1 Amp)培养基中，37 ℃振荡培养，PCR检测呈阳性的菌液送浙江有康生物科技有限公司测序；采用质粒DNA提取试剂盒(杭州创试生物科技有限公司)提取目的序列重组质粒DNA，于−20 ℃保存。
1.2.4 LsMYB7及花色形成相关基因的表达
采用Primer 5.0设计LsMYB7基因和花色形成相关基因(LsCHS、LsF3H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2)的RT-qPCR引物(表1)，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(Takara)方法合成cDNA 第1链。参照SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)方法，于CFX96TM荧光定量 PCR 仪(BIO-RAD)进行RT-qPCR验证。RT-qPCR体系(20.0 uL)：cDNA(＜100 ng) 1.6 uL，正反引物各0.8 uL，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 uL，RNase Free ddH2O 6.8 uL。RT-qPCR程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，循环40次。以LsGADPH为内参基因[15]，2−ΔΔCt方法计算实时荧光各基因的相对表达量，重复3次。
表 1 RT-qPCR所用引物Table 1 Primers for fluorescence RT-qPCR引物 正向(5′→3′) 反向(5′→3′) LsGADPH AGGGTTTGATGACCACCGTGCA ACAGCCTTGGCAGCTCCAGTAC LsMYB7 GCGCGGAGTTCTTGGCTCTGAT TCTGGCACCGTTCTCATCACGC LsCHS CAAGACATGGTGGTGGTCGAGGTC CGAGGAGTTTGGTGAGCTGGTAGTC LsF3H AACCGAGGACGCAACGGAATGC ACCATCTTCATCGCAGCCACCA LsANS CGTGCCAGGTCTCCAGGTCTTCTA TCGAGAGTGTCACCGACGTGAACTA LsUFGT1 GGTGGTGAAGGATGAGGAAGGTAGG GTTGAACCGCTCGAACCGCAATC LsUFGT2
LsF3'HGCGTAGCCTTCTCCTTCCTCACCT
TTGTACAGCCATGCACAGAATCCGCCATGAATCGCTTCACCTCCTC
GCAACCAAGGCAAGAAATCA说明：引物参考文献[16]。 1.2.5 换锦花花瓣花色苷的HPLC测定
参照刘跃平等[17]方法提取并用高效液相色谱(HPLC)测定换锦花花瓣花色苷质量浓度。精密称量换锦花花瓣干粉0.040 0 g，加入2 mL体积分数为1%甲醇/HCl提取溶液，振荡混匀；20 ℃超声提取30 min；12 000 r·min−1，离心15 min，取上清液；0.45 μm滤膜过滤；梯度洗脱：流动相为甲醇(A)-体积分数为1%的甲酸水(B)，0~20 min(A体积分数从5%升至60%)，20~25 min(A体积分数从60%升至100%)，25~30 min(A体积分数保持100%)，流速1 mL·min−1，检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量10 uL；以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷等3个花色苷为标准品。每样3个生物学重复。
1.2.6 亚细胞定位
采用XbaⅠ和BamHⅠ分步酶切法酶切亚细胞定位载体pAN580，再采用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit (杭州霆喜生物科技有限公司)将LsMYB7基因序列连接到pAN580上，并转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，在含有50 g·L−1Amp的LB培养基上进行筛选，挑选阳性克隆进行菌液PCR检测，成功构建pAN580-LsMYB7亚细胞定位载体，采用无内毒素质粒提取试剂盒(AxyPrep)提取pAN580-LsMYB7重组载体质粒DNA；聚乙二醇法(PEG 4000)转化烟草Nicotiana tabacum原生质体，用激光共聚焦荧光显微镜观察拍照。
1.2.7 VIGS沉默载体构建
采用双酶切法构建VIGS沉默载体pTRV2-LsMYB7：利用Primer 5.0设计长为400 bp的LsMYB7基因cDNA序列插入片段引物pTRV-LsMYB7-F: TACCGAATTCTCTAGAGAGGACAACATGCTACAATCCC和pTRV-LsMYB7-R：GCTCGGTACCGGATCCGCTCGAATCGCTAACATCCG；用限制性内切酶XbaI和BamHI分别双酶切VIGS载体(pTRV2)与LsMYB7基因的插入序列，T4 DNA连接酶连接载体与目的序列，转化大肠埃希菌DH5α，并在含有50 g·L−1 卡那霉素(Kan)的LB固体培养基筛选，提取pTRV2-LsMYB7重组质粒DNA。
1.2.8 换锦花花瓣瞬时转化
采用微量注射法转化换锦花花苞[12]，将重组质粒pTRV2-LsMYB7、pTRV2和pTRV1质粒DNA转化根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101，于YEP液体培养基(50 mg·L−1 Rif和50 mg·L−1 Kan)中，28 ℃，220 r·min−1振荡培养12~14 h；4 000 r·min−1, 离心10 min，去上清液；加入侵染液(10 mmol·L−1 MES + 200 μmol·L−1 AS + 10 mol·L−1 MgCl2，pH 5.6±0.03)重悬后的菌液D(600)=0.8~1.0；将pTRV1与pTRV2空载体、pTRV2-LsMYB7农杆菌液按照体积比1∶1混合均匀，室温黑暗静置4~6 h；使用1 mL注射器，吸取1 mL混合农杆菌菌液。选取3~4 d的换锦花花苞，在花苞基部缓慢注射混合根癌农杆菌菌液，充分侵染换锦花花苞，侵染5 d后采集花瓣用于LsMYB7和花色形成相关结构基因的表达分析(见1.2.4和表1)。
1.2.9 数据统计分析与作图
采用Excel 2020 统计和整理数据，采用SPSS 20.0 对数据进行差异显著性分析，采用Graphpad 8.0作图。
2. 结果与分析
2.1 LsMYB7 基因的克隆和序列分析
以换锦花花瓣的cDNA为模板，采用RT-qPCR技术扩增获得长度为951 bp 的LsMYB7 cDNA序列(图2)。该cDNA序列含有1个825 bp的开放阅读框(ORF)，编码274个氨基酸，分子量为6.84 kD，蛋白分子式为C2402H3981N825O982S258，理论等电点(pI)为5.04，不稳定系数为43.43，总体亲水性(GRAVY)为0.936。
2.2 LsMYB7氨基酸序列同源性分析
通过与美国国家生物技术信息中心(NCBI)搜索的其他植物MYB氨基酸同源序列进行比对，发现换锦花LsMYB7蛋白含有2个R2R3-MYB典型的SANT结构域R2和R3[18](图3)，属于R2R3-MYB类转录因子。与茶Camellia sinensis KAF5956278.1、狭叶油茶Camellia lanceoleosa KAI8015846.1、粗柄象腿蕉Ensete ventricosum RRT35038.1/RWV93016.1、椰子Cocos nucifera XP_KAG1363931.1、番红花Crocus sativus QBF29477.1、香根鸢尾Iris pallida KAJ6804060.1/KAJ6829988.1、河岸葡萄Vitis riparia XP_034676575.1和拟南芥Arabidopsis thaliana等其他植物的同源性为44.52%~60.57%，其中，与茶KAF5956278.1的同源性最高达60.57%，其次是香根鸢尾 KAJ6804060.1/KAJ6829988.1(59.32%)，与拟南芥AtMYB44(Q9FDW1.1)、AtMYB70(AEC07437.1)、AtMYB73(O23160.1)和AtMYB77(Q98N12.1)的同源性为44.52%~47.44%，且同源部分均集中在N端的R2R3 DNA结合结构域，而C端的同源性较低。
图 3 LsMYB7与其他植物的R2R3-MYB氨基酸同源序列比对Figure 3 Comparison of R2R3-MYB amino acid homologous sequences between LsMYB7 and other plants, R2R3-MYB2.3 LsMYB7系统进化与功能预测
从NCBI数据库下载拟南芥(AtMYB 16条)、换锦花(LsMYB 2条)和石蒜L. radiata (LrMYB 2条) R2R3-MYB氨基酸序列进行比对并构建系统进化树(图4)。参考拟南芥MYB基因家族的分类方法[19]，LsMYB7与拟南芥R2R3-MYB S22亚家族的AtMYB44、AtMYB70、AtMYB73和AtMYB77 聚为一类，由于拟南芥S22亚家族参与调控拟南芥的生长和发育过程，响应高盐、干旱低温等非生物胁迫反应，同一亚族基因的功能相似，结合花色基因表达分析，推测LsMYB7可能通过响应干旱和高温等调控换锦花花瓣花色苷的形成。
图 4 LsMYB7与拟南芥R2R3-MYB蛋白系统进化树Figure 4 Phylogenetic tree between LsMYB7 and R2R3-MYB from A. thaliana2.4 换锦花花瓣花色苷质量浓度
利用HPLC分别测定换锦花4个花发育时期和5个不同花色无性系(H1、H2、H3、H4和H5)盛花期花瓣的花色苷质量浓度(图5A和5B)，结果表明：换锦花花瓣花色苷的主要成分为矢车菊素，含有少量的天竺葵素和飞燕草素，说明花色苷的种类和质量浓度决定换锦花花色的多样性。随着换锦花花器官的生长发育，花瓣花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度呈逐渐下降的趋势，小花苞时期矢车菊素质量浓度大约是败花期的3倍，说明换锦花花瓣花色苷的积累可能主要在花瓣发育的早期完成(图1A和5A)；在浅色换锦花无性系H4和H5中，矢车菊素质量浓度明显低于深色换锦花无性系H1、H2和H3(图1B和5B)。因此，从换锦花不同花发育时期和不同花色无性系花瓣颜色和花色苷质量浓度来看，矢车菊素对换锦花花瓣的颜色影响最大，矢车菊素质量浓度越高，换锦花花瓣的颜色就越深。
图 5 换锦花不同花发育时期(A)和不同花色无性系(B)花瓣的花色苷质量浓度Figure 5 Anthocyanin contents in petals of different stages of flower development (A) and different clones (B) of L. sprengeri2.5 换锦花LsMYB7和花色形成相关基因的表达
2.5.1 在换锦花不同发育时期的表达
利用RT-qPCR对LsMYB7和换锦花花色形成相关基因(LsC4H、LsCHS、LsF3H、LsF3'H、LsANS和LsUFGT1、LsUFGT2)在换锦花不同发育时期花瓣中的表达进行分析，结果(图6)表明：LsMYB7与LsCHS和LsF3'H基因的表达随着换锦花花苞发育呈逐渐上升趋势，LsC4H、LsCHS、LsUFGT1、LsUFGT2、LsF3'H和LsMYB7在败花期大量表达，LsF3H则在花苞发育前期几乎无表达，盛花期开始大量表达，而在败花期表达量开始下降；LsANS、LsUFGTs等花色苷合成的后期基因在盛花期的表达最低。其中LsCHS和LsF3'H基因的表达与花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度正好相反(图5A)。
图 6 换锦花LsMYB7和花色形成结构基因在不同花发育时期的表达Figure 6 Expression of LsMYB7 and structure genes related to anthocyanin biosythesis in different flower development stages2.5.2 在换锦花不同花色无性系花瓣中的表达
LsMYB7和换锦花花色形成关键基因LsC4H、LsCHS、LsF3H、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2在换锦花不同花色无性系中的表达差异显著(图7)。2个花色苷合成的前期基因LsC4H和LsCHS及后期基因LsANS在淡色的无性系换锦花花瓣中表达量高。LsF3H在蓝色为主的H3无性系中表达量达到最高。LsMYB7在H1和H4中表达量比较高。LsMYB7基因的表达与LsCHS和LsF3'H基因的表达正好相反，而与不同花色无性系花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度基本一致，这一结果与不同花发育时期的基因表达结果一致。因此，LsMYB7可能对LsCHS和LsF3'H基因的表达有一定的调控作用。
图 7 换锦花LsMYB7和花色形成结构基因在不同无性系中的表达Figure 7 Expression of LsMYB7 and structure genes related to anthocyanin biosythesis in different flower clones2.6 换锦花LsMYB7基因的亚细胞定位
通过双酶切法构建亚细胞定位载体pAN580-LsMYB7，转化烟草原生质体，于激光共聚焦荧光显微镜观察，LsMYB7荧光信号定位在细胞核中(图8)，说明LsMYB7基因为转录因子基因，在细胞核中起转录调控的作用。
2.7 LsMYB7基因沉默后对换锦花花瓣花色苷形成相关基因表达的影响
构建LsMYB7的VIGS基因沉默载体pTRV2-LsMYB7，通过微量注射法转化换锦花花苞，LsMYB7 基因沉默后，换锦花同朵花中一半花瓣明显变短，且颜色变深(图9A)；对LsMYB7和花色苷形成相关基因在换锦花花瓣中的表达进行分析(图9B和C)，与ck (空载)相比，LsMYB7基因换锦花花瓣中的表达量明显下降，同时，花色苷形成相关基因LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达量极显著下降(P＜0.01)，而LsF3H基因的表达量反而上升，LsC4H基因表达变化不大，说明LsMYB7转录因子可能参与调控花瓣的生长发育，且对LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达起正调控作用，而对LsF3H基因的表达起负调控作用。
图 9 LsMYB7基因沉默后表型变化及花色苷形成相关基因的表达Figure 9 Phenotype and relative expression levels of LsMYB7 and genes related to anthocyanin biosynthesis after LsMYB7 silencedA.表型变化；B. LsMYB7基因的表达；C. 花色苷形成相关基因的表达**表示差异极显著(P＜0.01)3. 讨论
植物R2R3-MYB转录因子广泛参与调控次生代谢、细胞形态发生、激素刺激、环境胁迫应答、分生组织形成和细胞周期等过程[20]。根据C-末端的不同，拟南芥R2R3-MYB基因家族可分成22个不同的亚族，其中，拟南芥S4、S5、S6和S7亚族基因参与花青素和类黄酮类化合物生物合成途径的结构基因的转录调控[18, 21−22]，换锦花LsMYB4、LsMYB5和拟南芥S4亚族基因聚为一类。通过花青素形成相关基因表达和VIGS基因沉默技术研究表明，LsMYB4和LsMYB5对花青素生物合成基因的表达有负调控的作用[10−12]。
S22亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70主要参与拟南芥响应高盐、干旱、低温等非生物胁迫反应，其中，AtMYB73基因启动子中含有ABA响应元件ABRE及干旱胁迫和热胁迫顺式作用元件。AtMYB73突变体atmyb73在干旱胁迫处理下，ABA 下游基因ABI2、ABI5 的表达水平均较野生型明显增强。外源 ABA 处理野生型和突变体种子、幼苗，获得了与干旱胁迫处理类似的结果[23−24]。本研究结果表明：LsMYB7蛋白含有2个R2R3-MYB典型的SANT结构域R2和R3，属R2R3-MYB类转录因子，且R2和R3的保守结构域与其他植物高度同源，系统进化树分析结果显示LsMYB7和S22亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70聚为一类，推测LsMYB7可能与S22亚族基因有相似的功能。
本研究中，LsMYB7基因的表达与换锦花花色苷形成相关基因LsCHS、Ls4CL2和LsUFGT2的表达趋势一致，推测LsMYB7可能参与换锦花花瓣花色苷的生物合成。而LsMYB7属于拟南芥S22亚族，未见该亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70参与花色苷的生物合成的转录调控。已有报道认为AtMYB73/44能够参与调控拟南芥对干旱胁迫的响应[25−26]，而干旱胁迫可诱导植物细胞合成和积累花色苷。花色苷的光化学性质、亚细胞积累位点及在植物器官、组织中的空间分布决定了花色苷能强化植物的耐旱性，其中，花色苷提高植物细胞在干旱胁迫下的抗氧化能力可能是花色苷强化植物耐旱性的主要原因[27]。有研究表明：干旱胁迫可激活紫麦Triticum aestioum ‘Guizi 1’、甘薯Ipomoes batats等植物花色苷合成相关基因表达，通过提高花青素含量抵御干旱胁迫[28−29]。本研究中LsMYB7 基因沉默后，花色苷形成相关基因LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达明显下降，说明LsMYB7可能直接或间接调控花色苷的积累，而LsMYB7与S22亚族基因聚为一类，由于换锦花开花季为夏末秋初的8—9月，此时多为高温和干旱季节，因此推测LsMYB7可能通过对干旱胁迫响应来调控花色苷形成相关基因的表达，大量积累花色苷。这一研究结果与云南文山辣椒Capsicum annuum、番茄Lycopersicon esculentum的研究[30−31]相似，因此，植物可以通过干旱胁迫激活与花色苷合成相关基因的表达水平促进花色苷积累，进而提高抗旱能力。
4. 结论
本研究通过RT-qPCR获得长为951 bp 的LsMYB7 cDNA序列，开放阅读框(ORF) 825 bp，编码274个氨基酸，LsMYB7为R2R3-MYB转录因子家族，定位于细胞核，与其他植物R2R3-MYB有较高的同源性。系统进化分析表明LsMYB7和参与调控干旱等非生物胁迫响应的S22亚族基因聚为一类；LsMYB7基因主要在败花期和花色苷含量较高的H1无性系中表达，与花色苷合成相关基因的表达趋势一致；LsMYB7基因沉默后，换锦花部分花瓣明显变短，颜色变深，LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2等花色苷形成相关基因的表达显著下调，因此，LsMYB7参与调控换锦花花瓣的生长发育，且通过对LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2花色苷形成相关基因的表达调控花色苷的积累。此外，LsMYB7可能通过响应干旱胁迫激活花青素合成相关基因表达促进花色苷积累，进而提高换锦花的抗旱能力，LsMYB7调控花色苷积累抵御干旱的机制需要进一步研究。
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图 1 不同年龄栓皮栎母树插穗在生根期间的外部形态
Figure 1 External morphological of mother cuttings of Q. variabilis at different ages during rooting
图 2 1年生、5年生及10年生栓皮栎解剖学结构观察
Figure 2 Anatomical structure of 1, 5 and 10-year-old Q. variabilis
图 3 栓皮栎扦插生根过程中酶活性变化
Figure 3 Changes of enzyme activities during the rooting process of Q. variabilis cuttings
表 1 栓皮栎不同年龄母树插穗的生根情况
Table 1. Rooting of cuttings of Q. variabilis mother tree at different ages
年龄 生根率/% 平均不定根数量/条 平均不定根长/mm 平均不定根直径/mm 1年生 92.69±0.02 b 3.6±2.15 b 40.22±10.09 b 1.19±0.25 b 5年生 10.79±0.10 a 2.6±0.49 b 52.82±8.35 c 1.42±0.21 b 10年生 0 a 0 a 0 a 0 a 说明：数值为平均值±标准差，同列不同字母表示差异显著(P＜0.05) 
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20220143
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