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联合国环境规划署《2013年全球汞评估报告》指出：中国是全球汞(Hg)的主要排放国，总排放量为全球的1/3，亚洲的3/4。表明在中国开展汞的生物地球化学研究对人体健康和生态安全具有重要意义[1]。湖泊水库等水体中的汞主要来自河流输入和大气沉降，甲基汞(MeHg)则来源于水体汞的甲基化或沉积物中MeHg的释放[2]，通过生物富集作用和食物链传递的生物放大作用，最终在人体内积累，对人类安全危害极大。丁之勇等[3]发现：中国31个湖泊沉积物中汞的平均质量分数为0.076 mg·kg−1；多个湖泊沉积物中汞的地累积指数达到中度或重度污染，潜在生态风险指数和平均污染程度仅次于镉(Cd)。张杰等[4]发现：太湖流域河流表层沉积物中汞的平均质量分数为0.109 mg·kg−1，超过背景值的采样点占47.87%，潜在生态风险评价处于中等或以上。近年来中国湖泊富营养化较为普遍，藻华时有发生，对湖泊水生生态系统造成极大威胁。溶解性有机质(DOM)是水生生态系统中水体天然有机质的主要成分(占97.1%)[5]，通常指能通过0.10~0.70 μm滤膜，包含不同结构、分子量的碳基有机化合物，包括单糖、氨基酸等小分子化合物和蛋白质、腐殖质等大分子化合物。随着藻类暴发性增长，大量初级生产力进入[6]，水体中DOM成分随之发生变化。如河流河口的硅藻Bacillariophyta藻华可显著增加DOM中碳水化合物的相对含量[7]，类蛋白质荧光组分的峰强变化规律与各浮游藻类密度呈显著相关(r＞0.80)[8]。一般认为，藻类正常生长的分泌物和降解的死亡藻体[9]都会造成沉积物中有机质的异常积累，从而改变水质参数，影响化合物形态的转化。DOM的—CH3、—CH2、—OH、—COOH、—C=O、—NH2等多种活性官能团可作为天然的载体与配体，与汞离子(Hg2+)发生氧化还原、络合、螯合、沉淀等一系列反应，从而影响水环境中汞元素的赋存形态、迁移性、溶解性以及最终归趋[10]。此外，DOM还会改变沉积物的氧化还原电位(Eh)和pH[11]、微生物种群等[12]环境因子，间接影响汞的形态转化。目前关于DOM影响汞甲基化的观点仍存在着较大分歧。有学者认为：DOM所含的还原态硫官能团能对汞产生络合作用，抑制其生物甲基化过程；也有研究者发现：较小的有机质会促进Hg的生物甲基化[13]，DOM可以直接或在金属离子催化作用下参与非生物甲基化过程[14]。有鉴于水体中DOM来源的复杂性及其化学结构与性质的差异性，在总量水平上研究其对汞的影响难以形成定论。因此，有必要从更微观的角度阐明DOM对汞形态转化影响的作用机制。根据极性和电荷特性，DOM可分为6个成分，即疏水性的碱性、酸性和中性DOM以及亲水性的碱性、酸性和中性DOM[15]。水体富营养化和藻华使得藻体腐解过程产生的有机物成为水环境中DOM的重要来源。本研究通过室内模拟实验，对不同腐解阶段的藻类DOM进行逐步分离，取得6个亲水和疏水性亚组分，系统研究这些亚组分对汞甲基化的影响，以期丰富淡水环境中汞的生物地球化学理论，为汞污染的控制和降低汞污染健康风险提供科学依据。
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供试藻体采自浙江省杭州市临安区某小型淡水湖泊。选取富营养化严重的湖水区域，用捞网收集水中浮藻，做好标记后放置在收纳箱内带回实验室。去除已腐烂的水藻及其他杂物后用水清洗干净，并用去离子水淋洗3次，冷冻干燥后备用。
冷冻干燥的第0、5、10、20、30、60天各取浮藻样品充分研磨，超纯水浸提法提取DOM[2]。浸提条件为20 mL超纯水与2.0 g浮藻样品混合，黑暗、恒温(25 ℃)下振荡24 h后高速离心；取0.45 μm玻璃纤维滤膜过滤离心后的上清液作为DOM样品，结晶，4 ℃保存备用。
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取DOM结晶，与溴化钾(KBr)固体混合后制成压片。使用傅里叶变换红外光谱仪(IR Prstige-21，日本岛津)测定不同腐解时期DOM的红外光谱。为减少干扰，在分析每个样品前先测定光谱背景值，通过环境空气、二氧化碳(CO2)和水(H2O)矫正光谱。调节扫描波数精度为0.01 cm−1，波数为400~4 000 cm−1。
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用蠕动泵将DOM样品的原液通过填满树脂的树脂柱，调节四氟丙烯活塞控制液体流动速率。为了防止树脂层中出现气泡，用可拆卸的玻璃砂芯片固定树脂。
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用体积分数95%的甲醇过Amberlite XAD 4和Amberlite XAD 8树脂柱，赶走柱中气泡，用蒸馏水淋洗至流出液的溶解性有机碳(DOC)质量浓度接近于0。用60 ℃的热水反复清洗阴离子交换树脂和阳离子交换树脂，直到阴离子交换树脂的浸洗水不再褐色、阳离子交换树脂的浸洗水几乎无泡沫；水洗后的阴、阳离子交换树脂用质量分数3%~5%的氢氧化钠(NaOH)和盐酸(HCl)溶液二次清洗，以碱－酸－碱的进液次序过阴离子交换树脂柱，以酸－碱－酸的次序过阳离子交换树脂柱。上述处理步骤完成后，将树脂放置于密封罐中备用[2]。
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DOM分离参照LEENHEER等[16]和CHEFETZ等[17]方法。根据DOM在不同类型树脂上吸附能力的差异，将其分为疏水碱性(HOB)、疏水中性(HON)、疏水酸性(HOA)、亲水碱性(HIB)、亲水中性(HIN)、亲水酸性(HIA)6种有机组分[18]。其中HOB通过0.10 和0.01 mol·L−1 盐酸溶液反洗XAD-8树脂后获得，HOA由0.10 mol·L−1 氢氧化钠溶液反洗XAD-8树脂后获得，HON通过空气干燥XAD-8树脂并用甲醇索式提取后获得；HIB由0.10 mol·L−1氨水(NH3·H2O)反洗BIO-RAD AG-MP-50离子交换树脂后获得，HIA由3.00 mol·L−1氨水反洗DUOLITE A-7离子交换树脂后获得，HIN用纯水淋洗DUOLITE A-7离子交换树脂后获得。得到的洗脱液置于40 ℃下旋转蒸发，再经过脱盐、冷冻干燥后获得固体样品得固体样品[18]。
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配制6个质量浓度梯度(100.00、200.00、400.00、800.00、1 600.00、3 200.00 ng·L−1)的氯化汞(HgCl2)溶液，测定未腐解藻体DOM各组分在不同氧气条件(好氧、厌氧)下对汞甲基化的影响。
将装有6种DOM亚组分样品的离心管分组，整齐地放入厌氧袋中，加入配套的厌氧产气包，快速挤出原有空气后密封，室温下放置24 h。
反应皿中加入60 mL经氮吹去氧的超纯水，分别加入DOM各组分，调节总有机碳(TOC)至10 mg·L−1，pH为7，静置1 d后，加入不同质量浓度HgCl2溶液。采用蒋红梅等[19]方法(蒸馏-乙基化结合气相色谱-冷原子荧光，CVAFS法)在BROOKS RAND测汞仪上测定甲基汞质量浓度(最低检出限为0.009 ng·L−1)。
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配制1 000.00 ng·L−1的Hg2+溶液，分别加入第0、5、10、20、30、60天DOM各亚组分，参照蒋红梅等[19]方法测定甲基汞质量浓度。
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数据处理和图表制作采用Origin 8.5及Omnic 8.2软件。MeHg测量按10%的平行操作，测定标样和空白样并做标准曲线。分析重复组数据时控制相对标准偏差低于12%。
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碱性疏水性有机物(HOB)对汞甲基化贡献最高，其次为HON和HIA，其他成分的贡献量都较小，且没有显著差异。3种疏水性有机亚组分的汞甲基化作用由强到弱依次为HOB、HON、HOA。由图1可知：不同氧气条件下，MeHg生成量均随Hg2＋质量浓度增加而增加，提示HOB具有明显促进汞甲基化的能力。Hg2+低于1 600 ng·L−1时，好氧条件下MeHg转化量随Hg2+质量浓度的增加而增加，转化率则降低(由13.0%降至1.7%)；厌氧条件下MeHg的转化量一直呈上升趋势，转化率则较为平稳；相比之下，厌氧条件更有利于MeHg的生成。HOA与HON一定程度上也能促进MeHg生成，但总体效果不如HOB。两者均在Hg2+质量浓度最大时达最大转化量，但MeHg转化率均随Hg2+质量浓度增加而下降。Hg2+质量浓度为3 200 ng·L−1时，3种组分的MeHg转化量厌氧条件均高于好氧条件。
图 1 不同Hg2+质量浓度下DOM各亚组分对汞甲基化的影响
Figure 1. Effect of DOM subcomponents on the production of MeHg at different initial Hg2+ concentrations
3种亲水性有机亚组分中，HIB能略微促进Hg2+的甲基化；厌氧条件下甲基汞生成量较少(最大值0.17 ng·L−1)；不同氧气条件下转化率均随Hg2+质量浓度增加而降低，好氧时最高值为29.0%，厌氧时最高值为13.0%。HIA在好氧条件下的MeHg转化量表现为先上升后下降(最大值为0.40 ng·L−1)，厌氧条件下的转化量很小(最大值0.15 ng·L−1)，转化率随Hg2+质量浓度的升高而降低。HIN对汞形态转化亦有一定的促进作用。好氧、厌氧条件下MeHg转化量随浓度变化的规律性不强，厌氧转化量更低；2种条件下转化率均大致随Hg2+浓度的升高而降低，但厌氧条件下最高转化率仅为好氧时的一半。
以上结果表明：藻体DOM总体上可促进水体中Hg2+的甲基化反应。分离出的6个亚组分中，3个疏水性有机物对甲基汞产生的影响要强于3个亲水性有机物，以HOB的促进作用最为明显。DOM影响重金属在水体中形态变化过程的根本原因是其可以与重金属离子形成络合物，从而影响后者形态、生物有效性和毒性。有机分子的结构组成可以影响DOM对金属的亲合力。GUGGENBERGER等[20]发现：亲水性酸性物质对金属离子有较强的络合能力，是疏水性酸性物质的2~8倍，与本研究中亲水性DOM更易与溶液中的Hg2+结合、降低水体汞甲基化的结论一致。生物配体模型[21]认为：亲水性DOM与自由金属离子络合后使得自由离子平衡浓度下降，进而降低金属离子在有DOM存在时的有效性，与本研究结论也较为一致。研究发现：随着Hg2+质量浓度升高，甲基汞转化率逐渐降低，表明在较高的Hg2+质量浓度条件下，参与甲基化反应DOM的甲基供体数量不足，与LIANG等[22]结论一致。
自然环境下，汞的甲基化特别是生物甲基化主要发生在厌氧条件下。本研究发现，不同亚组分在好氧/厌氧条件下对甲基汞产生的影响不同。对于HOB来说，厌氧条件更利于汞的甲基化反应，厌氧条件下甲基汞产生量高于好氧条件，而其他成分在好氧、厌氧条件下的甲基汞产生量则无太大变化。
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对不同腐解时长下的藻体DOM作红外光谱(图2)分析可知：未腐解的DOM各官能团种类最为丰富，随腐解时间的延长，基团簇度呈逐渐减少趋势；腐解第60天时，1 364 cm−1处的叔丁基[—C(CH3)]、2 900 cm−1处的饱和C—H键(—CH3)的伸缩和亚甲基(—CH2—)的反对称伸缩、3 400 cm−1处游离态和缔合态的羟基(O—H伸缩振动)的峰已很不明显。总体来看，腐解0~10 d的DOM官能团变化较小，较稳定。对比1 060 cm−1处的波动，可以看出不同腐解时长下C—O键的簇数明显下降。综上所述，不同腐解时长下，DOM官能团的数量和种类均发生变化，并影响各亚组分对汞的甲基化作用。
图 2 不同腐解时期DOM红外光谱图
Figure 2. IR spectra of DOM at different decomposition intervals
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HOB、HOA和HON为DOM的3个疏水性有机组分。由图3可知：不同腐解时间产生的HOB，汞甲基化能力不尽相同。腐解初期(0~10 d)甲基化能力呈下降趋势，第10天MeHg转化量仅为0.20 ng·L−1，10~20 d转化量大幅增加，增幅达61.9%，之后小幅波动，第60天时达最高值(0.71 ng·L−1)。腐解初期(0~10 d)HOA对汞的甲基化基本没有影响，但随腐解时间增长，HOA的汞甲基化能力逐渐加强。相比之下，HON促进汞甲基化能力总体较大；腐解初期略低，但最小值(第10天)也达到了1.20 ng·L−1，此后转化量大幅增加，第60天达到最大转化量(1.55 ng·L−1)。
图 3 不同腐解时间DOM亚组分对MeHg生成量的影响
Figure 3. Variation of MeHg concentrations of DOM subcomponents at different decomposition intervals
相比而言，3个亲水性组分的汞甲基化能力略低。其中，HIB的甲基汞转化量最小，HIA和HIN随着腐解时间的增加，汞甲基化能力先增加后降低，在第60天时达到了最低，与疏水性有机组分的结果正好相反。
以上研究结果表明，随着腐解的进行，亲水性组分的促进汞甲基化能力表现为先升高再降低乃至消失；疏水性组分则表现为先降低再逐渐升高。3种疏水性亚组分对汞甲基化的影响效应均在60 d时达到极值。随着藻类腐解进程，藻体逐渐释放出大量DOM。冯胜等[23]发现：狐尾藻Myriophyllum verticillatum腐烂过程中释放出大量类蛋白物质，DOM荧光组分和荧光峰呈先逐渐增强后逐渐降低趋势；表明在腐解过程中，DOM先增加后减少。藻类DOM以类色氨酸成分为主，可以很快被微生物利用并降解转变为类腐殖质物质[24]。本研究中，疏水性亚组分的汞甲基化能力高于亲水性亚组分，由此推测：水体DOM的疏水性亚组分是汞甲基化的主导原因，即DOM对汞甲基化的影响主要为疏水性亚组分对汞甲基化的影响。SWIETLIK等[18]研究：HON富含碳氢化合物、多碳(＞5)脂肪族醇、酯、酮和芳香结构，具有比其他亚组分更加丰富的官能团(如羟基、羰基和羧基等)，因此作为甲基化电子供体更为有效，促进汞甲基化能力也更强。
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DOM的6种亚组分中，疏水性亚组分的汞甲基化能力高于亲水性亚组分，其中以HOB为最，原因在于亲水性亚组分易与游离态的Hg2+发生络合，降低后者生物有效性；疏水性亚组分因表面官能团更为丰富，不易与Hg2+络合，更有利于Hg2+甲基化。随着游离Hg2+的增加，甲基供体数量逐渐减少，甲基汞转化率逐渐降低。
富营养化藻类的DOM主要包含羟基、甲基、亚甲基、芳环C=C等官能团，随腐解时间延长，这些基团的簇度逐渐减少，使得不同腐解时期DOM各组分对汞的形态转化呈现较大差异。
藻体腐解过程中，DOM的疏水性有机组分汞甲基化能力高于亲水性有机组分；不同腐解时长下释放的相同亚组分，其汞甲基化效应亦有所差异。
Influence of algal derived dissolved organic matter on mercury methylation in water
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摘要:
目的 探究藻源溶解性有机质(DOM)各亚组分在不同腐解时间、不同汞(Hg2+)质量浓度下对水体中汞甲基化的影响。 方法 应用树脂串联技术分离藻体DOM的6种亚组分，利用室内培养方式进行Hg2+的甲基化试验。 结果 藻类DOM主要由羟基、烃基和芳环C=C等官能团组成；未经腐解的DOM各亚组分中，疏水性有机组分对汞甲基化的影响高于亲水性有机组分；随腐解时间延长，DOM官能团逐渐减少，疏水性有机组分对汞甲基化的影响表现为先降低后升高；亲水性有机组分抑制汞甲基化。 结论 DOM相对含量的升高抑制了汞的甲基化，DOM降解后，释放出来的Hg2+被微生物重新利用，甲基化程度加剧。图3参24 -
关键词:
- 汞 /
- 溶解性有机质(DOM) /
- 甲基化 /
- 有机质亚组分 /
- 藻类
Abstract:Objective To determine the effects of subcomponents of algae dissolved organic matter (DOM) on mercury methylation at different decomposition intervals and different Hg2+ concentrations. Method Six subcomponents of the DOM derived from the algae through a tandem connection of resin, and then conducted simulation experiments separately. Result Algae DOM was mainly composed of hydroxyl group, alkyl group and C=C of aromatic hydrocarbon, etc. Different subcomponents of DOM before decomposition, the influence of hydrophobic component on mercury methylation was significantly stronger than that of hydrophilic component. With the progress of algal decomposition, the relative content of functional groups was gradually decreasing while the influence of hydrophobic components on Hg methylation first weakened and then enhanced during the decomposition process and hydrophilic component can inhibit Hg methylation. Conclusion The increase in relative content of DOM results in the inhibition of Hg methylation. After the decomposition of DOM, the Hg2+ released got methylated by bacteria again, which helped promote the degree of methylation. [Ch, 3 fig. 24 ref.] -
Key words:
- mercury /
- dissolved organic matter /
- methylation /
- DOM subcomponents /
- algae
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当前，树体高大、通风透光性差和管理粗放是导致针叶树种种子园采种难和雌球花花量不足的重要原因，制约着林木种子园的精细化经营和管理[1]。截顶影响营养物质流向和分配，促进结实母枝更新，是植株达到矮化效应的重要方法，对实现“果园式”林木种子园具有重要指导意义[2−3]。国外学者对花旗松Pseudotsuga menziesii进行夏季截顶和修枝后发现：虽然树冠体积减少了，但是枝条上雌雄球花密度显著增加，通过调控栽植间距，提高了单位面积球果产量[4]；国内学者研究表明：截冠可提高樟子松Pinus sylvestris var. mongholica壮龄母树的产量和种子质量[3]；对马尾Pinus massoniana截顶处理后发现：中产和高产无性系的雌球花量能提高20％以上[1]。
赤霉素(GAs)被认为是一种重要的双萜类植物生长调节剂，参与松树球花分化与茎伸长等许多重要的生长发育过程[5−6]。FERNÁNDEZ等[7]对辐射松Pinus radiata不同组织中内源GAs测定后发现：GA3在营养芽和雄球花中质量分数较高但比较稳定，而GA4则差异明显，推测GA4可能与它们的发育调节有关。赤霉素等激素比值的变化可表征树体内激素的不同吸收或运转规律。较高水平的Z型细胞分裂素和较低水平的脱落酸(ABA)及其代谢产物可能与雌球花的形成有关，在顶芽发育过程中GA和ABA往往表现出拮抗作用，外源注射GA4/7使顶梢ABA合成减少或通过其他途径加速了ABA代谢产物的分解，进而降低顶芽内源ABA及ABA分解代谢的主导产物ABA葡萄糖酯(ABA-ge)的质量分数，改变了它们的比值，进而提高雌球花的分化能力，增加雌球花的数量，但其机制尚不清楚[8−9]。
研究表明：外界因素首先通过植株内源激素质量分数及其比值的变化对生长和成花起作用[10]。营养芽转变为生殖芽也是植株体内各种激素在时间和空间上相互作用产生的综合结果，取决于促进和抑制开花这2类激素的平衡[11]。植物顶芽会抑制侧芽的发生，去除顶芽或抑制顶端优势则会促进侧芽的产生。截顶可通过抑制植株顶端优势形成，影响植株体内生长素和细胞分裂素的合成与再分配。在生产上，许多针叶树正是利用截顶与修枝、植物生长调节剂诱导等措施控制树体的生殖与营养生长平衡[12−13]。马尾松是中国南方主要的速生丰产优质用材树种和最重要的脂用树种[14]，其雌球花多分布于主枝或侧枝顶端，生殖芽和营养芽都由新生枝梢产生，其生理状态与花芽分化密切相关[15−20]。因此，本研究采用盆栽控制试验，以高产的马尾松无性系为试材，在花原基形成前期设置生产上常用的截顶和赤霉素诱导试验，研究树体内源激素质量分数及其比值的变化和平衡，以期为马尾松结实母树的树体管理提供理论指导和技术支持。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
试验地点位于浙江省淳安县林业总场有限公司姥山分场国家马尾松良种基地(29°32′34″N, 119°04′04″E)。供试材料选用马尾松第2代无性系种子园中结实能力强的209号无性系，于2017年选取无性系同一个母株上生长基本一致的穗条进行嫁接。2018年3月，将生长势相对一致、侧枝数量相近的无性系嫁接苗移栽至无纺布容器内。容器规格为直径70 cm，高度60 cm，每个容器内放入50 kg马尾松第2代无性系种子园内0~40 cm土层的酸性红壤，土壤pH 4.71、全氮3.59 g·kg−1、全磷0.34 g·kg−1、全钾16.90 g·kg−1、碱解氮248.00 mg·kg−1、速效磷5.48 mg·kg−1、速效钾228.00 mg·kg−1、有机质67.60 g·kg−1、交换性钙3.10 cmol·kg−1、交换性镁0.34 cmol·kg−1。每盆栽植1株，栽植后立即浇水，无性系植株按照完全随机配置，放置在铺设有地布的苗圃地内，株行距为1.5 m×1.5 m。苗木栽培常规管理。苗木培育期间，为保证生长条件和栽培管理一致，不施肥，干旱时滴灌，及时除草。
在处理前，对供试幼树的树高、地径、枝长、枝粗和轮枝数进行本底调查，树高为189.3~204.2 cm，地径为35.63~40.12 mm，枝长为45.5~96.5 cm，枝粗为17.89~21.68 mm，每株树均为3层轮枝。
1.2 试验设计和取样
1.2.1 截顶和赤霉素诱导试验处理
设置未截顶、截顶后保留1层轮枝、截顶后保留2层轮枝、未截顶+100 mg·L−1赤霉素(GA4/7)、未截顶+200 mg·L−1 GA4/7和未截顶+400 mg·L−1 GA4/7共6个处理，分别记为NT、T1、T2、NT+G100、NT+G200和NT+G400。每个处理设置3个重复，每个重复3个分株。在2021年6月15日，T1和T2截顶处理采用修枝剪自下而上分别一次性截除第1层和第2层轮枝处以上的顶梢，NT+G100、NT+G200和NT+G400处理在植株叶面分别均匀喷施100、200和400 mg·L−1的GA4/7混合液，喷施至针叶湿润且叶尖有液体下滴时为止，NT处理以喷施去离子水作为对照。
1.2.2 观测和取样
各处理在每株自下而上的第1层轮枝处(H1)和第2层轮枝处(H2)选择东、西、南、北4个方位的一级侧枝及顶梢(H3)作为固定观测对象。分别于2021年花原基形成前期(S1，6月20日)、花原基形成期(S2，7月20日)和花原基形成后期(S3，8月20日)测定枝长和枝粗。同时，于S1、S2和S3时期，分别在H1处4个方位的一级侧枝顶端选取1.0 g以上针叶，置于液氮中速冻，带回实验室，保存于−80 ℃超低温冰箱中，用于内源激素质量分数测定，研究截顶和GA4/7诱导对花原基形成期前后的针叶主要激素质量分数及其比值影响。2022年4月25日调查每株观测枝的雌球花数量。
此外，还针对T1、T2和NT处理，分别在截顶处理(2021年6月15日)后1、4、7、10、13、16和19 d取样。每次取样选取第1层轮枝处(H1)、第2层轮枝处(H2)一级分枝顶端和顶梢处(H3)的针叶，每个部位取样1.0 g以上，带回实验室，保存于−80 ℃超低温冰箱中，研究截除顶梢后短期内内源激素质量分数在时间和空间上的变化特征。每个处理设置3个重复，每个重复3个分株。
1.3 内源激素测定
委托南京瑞源生物技术有限公司采用安捷伦1290高效液相色谱仪串联Qtrap 6500质谱仪(AB公司)测定内源激素。测定的内源激素包括：吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA4和GA7)、水杨酸(SA)和玉米素核苷(ZR)。。
1.4 数据分析
采用SPSS 20.0软件对不同截顶强度和赤霉素诱导处理的结果进行差异性分析。试验数据经Levene检验满足方差齐性后，采用单因素和Duncan差异性检验(P＜0.05)进行方差分析和多重比较。图和表中数据均为平均值±标准误。
2. 结果与分析
2.1 截顶与GA4/7诱导对马尾松雌球花量和新梢生长的影响
与S1时期相比，到S3时期时，T1和T2处理后H1处的枝长增长量分别比NT高181.55%和119.31% (P＜0.05)，枝粗增长量分别高出NT的35.78%和9.17% (P＜0.05)；H2处的枝长和枝粗增长量分别比NT高的150.45%和111.49% (P＜0.05)。T1处理下的枝长和枝粗增长量略高于T2处理，但差异不显著(表1)。截顶后第2年，T1与T2处理的标准枝雌球花密度均显著高于NT，其中，T1处理H1处的雌球花密度较NT增加126.00%，T2处理H1和H2处的雌球花密度较NT分别增加82.67%和 66.52%。说明截顶削弱了顶端优势，促进下层结实母枝的生长和结实层下移，雌球花密度增加。
表 1 截顶和赤霉素诱导处理对雌球花密度和枝生长的影响Table 1 Effect of top pruning and gibberellin induction on female cones density and branch growth处理 H1 H2 H3 枝长净增
长量/cm枝粗净增
长量/cm雌球花密度/
(个·枝−1)枝长净增
长量/cm枝粗净增
长量/cm雌球花密度/
(个·枝−1)枝长净增
长量/cm枝粗净增
长量/cm雌球花密度/
(个·枝−1)NT 2.33±0.11 d 1.09±0.08 b 1.50±0.06 c 2.22±0.10 c 0.87±0.03 c 2.33±0.09 c 9.33±0.26 ab 1.66±0.09 a 2.94±0.13 b NT+G100 5.26±0.16 bc 1.03±0.06 b 2.93±0.12 ab 3.89±0.13 b 1.76±0.09 ab 3.17±0.15 ab 11.80±0.31 a 1.69±0.09 a 4.50±0.19 a NT+G200 8.42±0.25 a 1.18±0.09 ab 3.27±0.16 a 6.22±0.18 a 1.76±0.10 ab 3.39±0.16 ab 9.67±0.28 ab 1.06±0.04 ab 4.67±0.21 a NT+G400 6.14±0.17 b 1.56±0.11 a 2.67±0.10 ab 5.22±0.14 ab 2.01±0.12 a 3.33±0.16 ab 12.33±0.33 a 1.04±0.03 ab 3.33±0.15 b T1 6.56±0.18 b 1.48±0.09 a 3.39±0.16 a － － － － － － T2 5.11±0.14 bc 1.19±0.07 ab 2.74±0.11 ab 5.56±0.15 ab 1.84±0.11 ab 3.88±0.18 a － － － 说明：同列不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)；－表示无此项。 在S3时期，截顶与赤霉素处理相比，除T1和T2处理H1处的枝长增长量显著(P＜0.05)低于NT+G200处理外，T1与T2处理的雌球花密度与NT+G100、NT+G200、NT+G400处理结果差异均不显著；T1和T2处理其他轮枝处的枝长和枝粗增长量与GA4/7各处理间差异不显著。说明截顶和赤霉素处理均促进了马尾松结实母枝生长和雌球花形成。
2.2 截顶和GA4/7诱导对不同时期针叶主要激素质量分数及其比值的影响
2.2.1 截顶的影响
在S1时期，与NT相比，T1和T2处理的针叶IAA质量分数分别下降11.24%和9.62%，T2处理的IAA质量分数高于T1处理，但随着截顶程度的加重而降低(图1A)；T1和T2处理的GA7质量分数分别下降0.27%和1.26% (图1B)，GA4分别下降9.36%和12.62% (图1C)，ZR分别下降23.38%和18.77% (图1D)，而ABA分别增加15.09%和8.15%，T1处理的ABA质量分数高于T2处理(图1E)，但T1和T2处理两者间差异不显著。
图 1 截顶及GA4/7诱导对不同时期主要激素质量分数及其比值变化的影响Figure 1 Effect of top pruning and GA4/7 induction on changes in the content of major hormones and their ratios at different periods在S2时期，无论截顶与否，针叶IAA、GA7、GA4和ZR质量分数均较S1时期增加，其中，T1处理的IAA、GA7、GA4和ZR质量分数分别增加了1.21、1.21、0.92和0.80 ng·g−1，T2处理分别增加了1.45、0.77、0.86和0.76 ng·g−1，显著高于NT处理的增加量(0.30、24.67、0.04和0.11 ng·g−1，P＜0.05)，截顶处理后ABA质量分数较S1时期降低，其中，T1和T2处理分别降低52.97和48.06 ng·g−1。说明受截顶影响，在之后1个月时间，IAA、GA7、GA4和ZR质量分数呈恢复增长变化，其质量分数在S2时期并未受截顶强度加重显著降低。
在S3时期，与S2时期相比，T1和T2处理下针叶IAA、GA7、GA4和ZR质量分数下降，其中，T1处理分别下降6.32%、7.21%、46.03%和30.04%，T2处理分别下降6.52%、5.52%、42.16%和28.03%；与S1时期相比，T1处理的针叶IAA、GA7、GA4和ZR质量分数分别增加7.34%、2.08%、2.65%和1.58%，T2处理分别增加9.30%、0.55%、4.32%和0.76%；而T1和T2处理的针叶ABA质量分数较S1和S2时期持续降低。
由图1F看出：在S1时期，T1和T2处理的(IAA+GA7+GA4+ZR)/ABA比值较低，分别为7.22和7.61，均低于NT (8.33)，而在S2时期，T1和T2处理的(IAA+GA7+GA4+ZR)/ABA比值迅速增加，分别为11.32和11.23，均高于NT (10.21)，进一步印证了在花原基形成前期实施截顶，内源激素的比值显著下降，在花原基形成期间，生长促进型激素恢复增长，抑制型激素下降，内源激素的比值显著增加。
2.2.2 截顶与GA4/7诱导的对比分析
由图1A~D可知：在S1时期，T1和T2处理的针叶IAA、GA7、GA4和ZR质量分数显著低于NT+G100、NT+G200和NT+G400处理，而ABA质量分数显著增加 (P＜0.05)，其中，T1处理下的IAA、GA7、GA4和ZR质量分数分别比GA4/7处理低38.25%~56.39%、24.05%~27.06%、73.91%~101.09%和47.39%~76.31%，ABA质量分数比GA4/7处理高15.92%~27.52%；T2处理下的IAA、GA7、GA4和ZR质量分数分别比GA4/7处理低35.77%~53.59%、25.30%~29.17%、80.79%~109.04%和40.08%~67.56%，ABA质量分数则比GA4/7处理高10.53%~22.88%。
在S1~S3期间，NT+G100、NT+G200和NT+G400处理的IAA质量分数逐渐降低，马尾松针叶GA7、GA4和ZR质量分数均先增加后降低，S3时期的激素质量分数低于S1时期，ABA则先降低后增加；截顶与GA4/7诱导后主要激素质量分数的变化趋势不同，T1和T2处理的马尾松针叶IAA、GA7、GA4和ZR质量分数均为先增加后降低，但是，S3时期的激素高于S1时期，ABA则为持续降低。从图1F可看出：在S2时期，NT+G400处理的(IAA+GA7+GA4+ZR)/ABA比值最高，比NT+G200、NT+G100、T2和T1处理依次高5.97%、12.34%、20.67%和21.64%。
2.3 截顶后短期内内源激素质量分数在时间和空间上的变化特征
2.3.1 短期内的动态变化
由图2A可知：在花原基形成前期截除顶梢，T1和T2处理的马尾松针叶IAA质量分数呈先降低后增加的趋势，到第16天时比NT高33.33%~45.45%。截顶后针叶的GA7质量分数趋势变化不显著，T1处理和T2处理的针叶GA7质量分数也均无显著性差异(图2B)。截顶后马尾松针叶的GA4质量分数呈显著下降 (P＜0.05)，在第10天达到最低，并比NT处理显著低24.26%~35.32% (P＜0.05)，之后逐渐增加(图2C)。T1和T2处理的马尾松针叶ZR质量分数均比NT处理显著低4.39%~57.65% (P＜0.05)，而T1和T2处理间差异不显著(图2D)。说明截顶处理打破了马尾松原有的激素平衡，使针叶中的IAA和GA4生长促进型激素出现短期内先下降后升高的现象。T1和T2处理的ABA质量分数呈降低趋势，但始终高于NT处理(图2E)。在第1~4天时，T1和T2处理马尾松针叶的SA质量分数急剧上升，之后逐渐下降，至第16天时，与NT处理差异不显著(图2F)。
图 2 不同截顶程度对马尾松针叶内源激素质量分数动态变化的影响Figure 2 Effect of different levels of topping on the dynamic changes of endogenous hormone contents in the needles of P. massoniana2.3.2 不同高度处的空间变化
在不同高度处，未截顶的马尾松针叶IAA质量分数从高到低依次为H3、H2、H1，T2处理IAA质量分数为H2大于H1；在第10天之后，T1处理H1处的针叶IAA质量分数显著高于T2处理(图2A，P＜0.05)。在第13天之后，未截顶H3处的马尾松针叶GA7质量分数与H2和H1处相比差异不显著(图2B)，T2处理H1处针叶GA7质量分数和H1处差异不显著，未截顶的针叶GA4质量分数从高到低依次为 H3、H2、H1，T2处理GA4质量分数为H2大于H1，T1处理H1处针叶的GA4质量分数在截顶后第10天低于T2处理，之后逐渐高于T2处理(图2C)。未截顶的ZR质量分数从高到低依次为 H3、H2、H1，T2处理针叶的ZR质量分数在H2处最高，T1处理H1处的ZR质量分数始终最低(图2D)。说明截顶强度影响着不同轮枝处针叶的IAA、GA4和ZR激素质量分数。未截顶的ABA质量分数从高到低依次为H1、H2、H3，T2处理ABA质量分数为H1大于H2，T1处理H1处的针叶ABA质量分数比T2处理高2.85%~7.84% (图2E)。未截顶时，SA质量分数在H1、H2和H3处差异不显著，随截顶程度的加重，在第1~13天，T1处理H1处的SA质量分数比T2处理H1处显著高1.88%~90.88% (P＜0.05，图2F)。
3. 讨论
已有研究表明：通过截顶可以增加母树对光能的有效利用，影响叶面积与营养储藏水平，也对侧枝的生长具有重要影响[3, 21]。本研究发现：马尾松树体截顶后不仅促进了枝梢的生长，而且显著增加了雌球花密度。这与KOLPAK等[4]在夏季对花旗松进行截顶和修枝的研究结果相类似。截顶和修枝后花旗松枝条上的雌雄球花量增加，提高了单位面积球果产量。王福森等[2]研究也表明：樟子松截顶后促使母树结实层下移，平均单株球果数增加。截顶处理可以控制树体顶端优势，促使结实母枝更新。通过与赤霉素处理对比发现：截顶处理的雌球花密度与其差异不显著，说明截顶不仅可作为种子园树体管理的有效措施，而且也可促进雌球花形成。郑一等[1]研究马尾松不同结实能力无性系同样发现：截顶可提高中产和高产无性系的雌球花量20％以上。陈虎等[22]对16年生马尾松无性系截顶处理发现：随着截顶强度的增加，母树生长和结实能力增强，在保留1轮枝的情况下结实最多；HAN等[23]对红松P. koraiensis截干后同样得出结果枝数量增加，结实量提高的结果。因此，截顶处理可以控制马尾松树体顶端优势，促使结实母枝更新。植物激素，尤其赤霉素通过其自身前馈和反馈调节参与松树花器官发育并在调节植株生长、控制树势或适应逆境过程中发挥重要作用[7, 24]。马尾松顶端优势强，雌球花多分布在主枝或侧枝的顶端，植株顶芽会抑制侧芽的发生，去除顶芽或抑制顶端优势则会促进侧芽的产生。已有研究表明：树木木质部汁液中细胞分裂素和ABA质量分数与比值在胁迫信号传递中起着重要作用，较高质量分数的Z型细胞分裂素和较低水平的ABA及其代谢产物可能与雌球花的形成有关[25−26]。通过分析花原基形成期间3个阶段的主要激素质量分数与标准枝雌球花量相关性，均发现在花原基形成期，截顶处理后GA4、IAA、GA7和ZR质量分数与雌球花量相关性最高，与ABA质量分数呈显著负相关。研究表明：未截顶时，不同高度处的IAA、GAs和ZR质量分数从高到低依次为H3、H2、H1。在花原基形成前期截顶，受胁迫的影响，促进生长型激素IAA和GA4质量分数呈先降低后增加的动态变化，T2处理依然表现为H2大于H1，截顶后20 d左右，主要激素水平可恢复稳定；在花原基形成期，下部枝条的IAA、GAs和ZR质量分数较花原基形成前期显著增加，(IAA+GA+ZR)/ABA比值大幅提升，说明截顶削弱了顶端优势，促使下部侧枝的激素质量分数在空间上随高度的降低和截顶程度的加重而变化，打破了树体原有的养分平衡，可能通过内源激素的合成、极性运输和信号转导等途径，调节着营养生长与生殖生长之间的平衡。这可能是促进侧芽更快地生长和雌球花形成的主要原因之一[9, 20, 27]。
在顶芽发育过程中，GA和ABA往往表现出拮抗作用，外源注射GA4/7使顶梢ABA合成减少或通过其他途径加速了ABA代谢产物的分解，进而降低顶芽内源ABA及ABA分解代谢的主导产物ABA葡萄糖酯(ABA-ge)的质量分数。GA4/7的使用也可增加反式玉米素核苷(t-ZR)水平和降低异戊烯基腺嘌呤(IP型)细胞分裂素，改变了它们的比值，进而提高雌球花的分化能力，增加雌球花的数量[28−30]。本研究通过截顶处理和GA4/7诱导的对比试验同样得出：在花原基形成期，截顶和GA4/7诱导处理可显著降低ABA质量分数，增加ZR质量分数。国内外育种工作者已经利用GA4、GA7等极性较小的赤霉素可促进多种松树开花和诱导雌雄球花分化的能力，在生产上积累了丰富的经验[31−32]。虽然截顶处理与赤霉素诱导马尾松针叶的内源激素质量分数变化趋势有所不同，但均表明通过树体内主要激素质量分数及其比值平衡的变化，可以调控树体的生长发育，进而指导生产。此外，持续截顶或修枝措施，也是控制顶端优势的方式，对激素变化也有影响。但NEILSEN等[32]对辐射松修枝研究发现：持续修剪对枝条生长有长期影响，造成枝粗增长缓慢。
4. 结论
在花原基形成前期实施截顶和赤霉素处理均可促进马尾松结实母枝更新和雌球花形成，与针叶内源激素质量分数的变化密切相关。截除顶梢后，马尾松针叶的IAA、GA7、GA4和ZR质量分数显著下降，而ABA质量分数显著增加。截顶影响着内源激素重新分配，(IAA+GA7+GA4+ZR)/ABA比值在花原基形成期显著升高。截顶与GA4/7诱导后主要激素质量分数的变化趋势不同，在S1至S3时期，赤霉素诱导后的IAA质量分数逐渐降低，GA7、GA4和ZR质量分数先增加后降低，ABA质量分数则先降低后增加。研究结果表明：生产上通过持续截顶，优化截干技术和控制树势，配合激素诱导，可促进结实母树更新和调控雌球花形成。
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图 1 不同Hg2+质量浓度下DOM各亚组分对汞甲基化的影响
Figure 1 Effect of DOM subcomponents on the production of MeHg at different initial Hg2+ concentrations
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