留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

高效降解菌Arthrobacter nicotianae ZAF-05对土霉素的减毒效应

朱蓉蓉 张赞 史艳可 林辉 张昕

朱蓉蓉, 张赞, 史艳可, 林辉, 张昕. 高效降解菌Arthrobacter nicotianae ZAF-05对土霉素的减毒效应[J]. 浙江农林大学学报, 2021, 38(6): 1213-1220. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200819
引用本文: 朱蓉蓉, 张赞, 史艳可, 林辉, 张昕. 高效降解菌Arthrobacter nicotianae ZAF-05对土霉素的减毒效应[J]. 浙江农林大学学报, 2021, 38(6): 1213-1220. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200819
ZHU Rongrong, ZHANG Zan, SHI Yanke, LIN Hui, ZHANG Xin. Reduction of toxicity of oxytetracycline by highly efficient degrading bacterium Arthrobacter nicotianae ZAF-05[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2021, 38(6): 1213-1220. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200819
Citation: ZHU Rongrong, ZHANG Zan, SHI Yanke, LIN Hui, ZHANG Xin. Reduction of toxicity of oxytetracycline by highly efficient degrading bacterium Arthrobacter nicotianae ZAF-05[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2021, 38(6): 1213-1220. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200819

高效降解菌Arthrobacter nicotianae ZAF-05对土霉素的减毒效应

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200819
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(31970093,31670110)
详细信息
    作者简介: 朱蓉蓉(ORCID: 00000-0002-7487-6350),从事微生物生态学研究。E-mail: 734632819@qq.com
    通信作者: 张昕(ORCID: 0000-0002-8762-171X),副教授,从事环境微生物学研究。E-mail: zhangxins@126.com
  • 中图分类号: S606

Reduction of toxicity of oxytetracycline by highly efficient degrading bacterium Arthrobacter nicotianae ZAF-05

  • 摘要:   目的  明确1株土霉素(oxytetracycline, OTC)高效降解菌降低OTC生物毒性的效应,为菌株的实际应用提供初步理论依据。  方法  以前期获得的OTC高效降解菌Arthrobacter nicotianae ZAF-05为对象,利用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(HPLC-Q-TOF-MS)分析了OTC的降解产物。以对OTC敏感的大肠埃希菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和斜生栅藻Scenedesmus obliquus作为指示生物,评估OTC降解产物的生物毒性。  结果  HPLC-Q-TOF-MS分析发现:经菌株ZAF-05作用后,体系中的高毒性OTC以及其自然水解产物差向异构土霉素(EOTC)含量显著降低,而低毒性的同分异构土霉素(ISO-OTC)含量略有上升。供试细菌和藻类在添加ZAF-05菌株的OTC体系中的生长情况明显好于OTC自然水解的处理和未添加降解菌的阴性对照,且差异极显著(P<0.01)。与原药和自然水解物相比,经过ZAF-05菌株降解的OTC代谢产物生物毒性大大降低。菌株的降解作用缓解了OTC对斜生栅藻细胞超微结构的伤害,细胞叶绿体及细胞壁受损减轻。  结论  降解菌ZAF-05能降低OTC残留的环境生物毒性,而毒性的降低可能与体系中高毒性物质被转化成无毒或低毒的代谢产物有关。图7表1参26
  • 图  1  TP447的色谱和质谱图

    Figure  1  Extracted ion chromatograms and mass spectrum of TP447

    图  2  TP461的色谱和质谱图

    Figure  2  Extracted ion chromatograms and mass spectrum of TP461

    图  3  不同处理对枯草芽孢杆菌生长的影响

    Figure  3  Effects of different treatments on growth of B. subtilis

    图  4  不同处理对大肠埃希菌生长的影响

    Figure  4  Effects of different treatments on growth of E. coli

    图  5  不同处理对斜生栅藻生长的影响

    Figure  5  Effects of different treatments on growth of S. obliquus

    图  6  不同处理对斜生栅藻叶绿素的影响

    Figure  6  Effects of different treatments on chlorophyll content of S. obliquus

    图  7  不同处理下斜生栅藻的亚细胞形态

    Figure  7  Effects of different treatments on chlorophyll content of S. obliquus

    表  1  OTC及其推定代谢产物的相对丰度

    Table  1.   Relative abundance of OTC and the putative degradation products      

    可能的化合物保留时间/min分子式相对丰度
    阳性对照降解菌处理
    OTC 5.434 C22H24N2O9 13.872 7.254
    EOTC 4.893 C22H24N2O9 20.931 5.231
    ISO-OTC 6.550 C22H24N2O9 2.727 3.157
    脱甲基OTC 7.279 C21H22N2O9 37.278 4.142
    下载: 导出CSV
  • [1] TURKER G, AKYOL Ç, INCE O, et al. Operating conditions influence microbial community structures, elimination of the antibiotic resistance genes and metabolites during anaerobic digestion of cow manure in the presence of oxytetracycline [J]. Ecotoxicology Environ Saf, 2018, 147: 349 − 356.
    [2] LI Xuewen, XIE Yunfeng, WANG Jinfeng, et al. Influence of planting patterns on fluoroquinolone residues in the soil of an intensive vegetable cultivation area in northern China [J]. Sci Total Environ, 2013, 458/460: 63 − 69.
    [3] HALLER M Y, MULLER S R, MCARDELL C S, et al. Quantification of veterinary antibiotics (sulfonamides and trimethoprim) in animal manure by liquid chromatography-mass spectrometry [J]. J Chromatogr A, 2002, 952(1): 111 − 120.
    [4] HALLING-SØRENSEN B. Inhibition of aerobic growth and nitrification of bacteria in sewage sludge by antibacterial agents [J]. Arch Environ Contam Toxicol, 2001, 40(4): 451 − 460.
    [5] XIE Yunfeng, LI Xuewen, WANG Jinfeng, et al. Spatial estimation of antibiotic residues in surface soils in a typical intensive vegetable cultivation area in China [J]. Sci Total Environ, 2012, 430: 126 − 131.
    [6] CHENG Dengmiao, LIU Xinhui, WANG Liang, et al. Seasonal variation and sediment-water exchange of antibiotics in a shallower large lake in North China [J]. Sci Total Environ, 2014, 476/477: 266 − 275.
    [7] BARROS-BECKER F, ROMERO J, PULGAR A, et al. Persistent oxytetracycline exposure induces an inflammatory process that improves regenerative capacity in zebrafish larvae[J]. PLoS One, 2012, 7(5): e36827. doi: 10.1371/journal.pone.0036827.
    [8] CZEKALSKI N, BERTHOLD T, CAUCCI S, et al. Increased levels of multiresistant bacteria and resistance genes after wastewater treatment and their dissemination into Lake Geneva, Switzerland[J]. Front Microbiol, 2012, 3. doi: 10.3389/fmicb.2012.00106.
    [9] GUO Xiaohong, XIE Chengyun, WANG Lijuan, et al. Biodegradation of persistent environmental pollutants by Arthrobacter sp. [J]. Environ Sci Pollut Res, 2019, 26(9): 8249 − 8443.
    [10] MAKI T, HASEGAWA H, KITAMI H, et al. Bacterial degradation of antibiotic residues in marine fish farm sediments of Uranouchi Bay and phylogenetic analysis of antibiotic-degrading bacteria using 16S rDNA sequences [J]. Fisheries Sci, 2006, 72(4): 811 − 820.
    [11] SHAO Sicheng, HU Yongyou, CHENG Ce, et al. Simultaneous degradation of tetracycline and denitrification by a novel bacterium, Klebsiella sp. SQY5 [J]. Chemosphere, 2018, 209: 35 − 43.
    [12] LI Kuixiao, YEDILER A, YANG Min, et al. Ozonation of oxytetracycline and toxicological assessment of its oxidation by-products [J]. Chemosphere, 2008, 72(3): 473 − 478.
    [13] GRANADOS-CHINCHILLA F, RODRIGUEZ C. Tetracyclines in food and feeding stuffs: from regulation to analytical methods, bacterial resistance, and environmental and health implications[J]. J Anal Methods Chem, 2017. doi: 10.1155/2017/1315497.
    [14] HU Xiangang, ZHOU Qixing, LUO Yi. Occurrence and source analysis of typical veterinary antibiotics in manure, soil, vegetables and groundwater from organic vegetable bases, northern China [J]. Environ Pollut, 2010, 158(9): 2992 − 2998.
    [15] HOU Jie, WANG Chong, MAO Daqing, et al. The occurrence and fate of tetracyclines in two pharmaceutical wastewater treatment plants of Northern China [J]. Environ Sci Pollut Res, 2016, 23: 1722 − 1731.
    [16] SHI Yanke, LIN Hui, MA Junwei, et al. Degradation of tetracycline antibiotics by Arthrobacter nicotianae OTC-16[J]. J Hazard Mater, 2021, 403: 123996. doi: 10.1016/j.jhazmat.2020.123996.
    [17] 武鹏鹏, 王雅学, 沈洪艳. 土霉素对斜生栅藻的毒性效应研究[J]. 生态毒理学报, 2020, 15(4): 215 − 223.

    WU Pengpeng, WANG Yaxue, SHEN Hongyan. Toxic effects of oxytetracycline on Scenedesmus obliquus [J]. Asian J Ecotoxicology, 2020, 15(4): 215 − 223.
    [18] 邹宁, 魏丕伟, 肖波, 等. 扁藻细胞电镜观察的制样技术[J]. 烟台教育学院学报, 2004, 10(3): 73 − 75, 97.

    ZOU Ning, WEI Piwei, XIAO Bo, et al. Sample preparation methods of Platymonas subcordiformis for the submicroscopic structure observation by transmission electric microscope (TEM) [J]. J Yantai Coll Educ, 2004, 10(3): 73 − 75, 97.
    [19] QI Weining, LONG Jian, FENG Changqing, et al. Fe3+ enhanced degradation of oxytetracycline in water by Pseudomonas [J]. Water Res, 2019, 160: 361 − 370.
    [20] HALLING-SØRENSEN B, LYKKEBERG A, INGERSLEV F, et al. Characterisation of the abiotic degradation pathways of oxytetracyclines in soil interstitial water using LC-MS-MS [J]. Chemosphere, 2003, 50(10): 1331 − 1342.
    [21] LI Zhaojun, QI Weining, FENG Yao, et al. Degradation mechanisms of oxytetracycline in the environment [J]. J Integr Agric, 2019, 18(9): 1953 − 1960.
    [22] HALLING-SØRENSEN B, SENGELØV G, TJRØNELUND J. Toxicity of tetracyclines and tetracycline degradation products to environmentally relevant bacteria, including selected tetracycline-resistant bacteria [J]. Arch Environ Contam Toxicol, 2002, 42(3): 263 − 271.
    [23] XU Dongmei, XIAO Yingping, PAN Hua, et al. Toxic effects of tetracycline and its degradation products on freshwater green algae [J]. Ecotoxicology Environogy Saf, 2019, 174: 43 − 47.
    [24] 张迪, 厉圆, 沈忱思, 等. 金霉素及其异构体降解产物对斜生栅藻的毒性效应研究[J]. 农业环境科学学报, 2019, 38(4): 756 − 764.

    ZHANG Di, LI Yuan, SHEN Chensi, et al. Understanding the toxic effects of chlortetracyclineandits and its isomer degradation products on Scenedesmus obliquus [J]. J Agro-Environ Sci, 2019, 38(4): 756 − 764.
    [25] STAEHELIN L A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes [J]. Photosynth Res, 2003, 76(1/3): 185 − 196.
    [26] ALBERTSSON P. A quantitative model of the domain structure of the photosynthetic membrane [J]. Trends Plant Sci, 2001, 6(8): 349 − 354.
  • [1] 马淑雯, 刘鑫, 周小琴, 方晓波, 郑华宝, 毛浩楠, 杨雨, 孟祺绅, 张成.  海绵热解炭固定化微生物吸附-降解餐饮废水中油脂的研究 . 浙江农林大学学报, 2023, 40(2): 293-303. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220338
    [2] 沈毅, 漆梦雯, 羊桂英, 周琪欢, 余婷, 李吴晗, 莫建初.  黑翅土白蚁共生真菌对水稻秸秆生物降解研究 . 浙江农林大学学报, 2023, 40(6): 1224-1231. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230140
    [3] 李雅琳, 李素艳, 孙向阳, 郝丹, 蔡琳琳, 常晓彤.  基于人工神经网络算法的2株木质素降解菌固体菌剂的制备 . 浙江农林大学学报, 2022, 39(2): 364-371. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210311
    [4] 李雅琳, 李素艳, 孙向阳, 郝丹, 蔡琳琳, 常晓彤.  1株木质素降解菌的筛选、鉴定及液态发酵条件优化 . 浙江农林大学学报, 2021, 38(6): 1297-1304. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200814
    [5] 孟童瑶, 李素艳, 邹荣松, 余克非, 付冰妍, 揭阳.  固定化木质素降解菌对园林废弃物堆肥的影响 . 浙江农林大学学报, 2021, 38(1): 38-46. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200219
    [6] 李雨桐, 何鑫龙, 彭一帆, 胡勰克, 王昱杭, 赵婷, 吴胜春, 梁鹏.  藻源溶解性有机质对汞甲基化的影响 . 浙江农林大学学报, 2021, 38(2): 362-368. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200146
    [7] 余宁尔, 吴胜春, 梁鹏.  不同因子对土霉素与汞络合反应中溶解性气态汞的影响 . 浙江农林大学学报, 2020, 37(5): 907-913. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20190568
    [8] 石莉莉, 谭贤, 郦行杰, 郭明.  新型催化功能纤维素的制备及催化降解四环素机制 . 浙江农林大学学报, 2016, 33(5): 881-889. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2016.05.022
    [9] 陈梦扬, 姚泽秀, 李永春, 吴涵韬, 徐秋芳, 魏健, 秦华.  雷竹林土壤染料降解真菌筛选与脱色效果初步研究 . 浙江农林大学学报, 2016, 33(3): 418-426. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2016.03.007
    [10] 杜敬霆, 孙朋飞, 张昕.  生物吸附及微生物降解对4-溴联苯醚污染水体的修复 . 浙江农林大学学报, 2016, 33(3): 434-439. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2016.03.009
    [11] 蒋玉俭, 李新鑫, 孙飞飞, 余学军.  竹林土壤中纤维素降解菌的筛选及产酶条件优化 . 浙江农林大学学报, 2015, 32(6): 821-828. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2015.06.001
    [12] 郦宜斌, 郭明, 燕冰宇, 郭斌, 王春歌.  新型水热方法降解纤维素及降解产物分析 . 浙江农林大学学报, 2014, 31(5): 730-738. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.05.011
    [13] 可晓, 陈双林, 张小平, 郭子武.  雷竹林存留有机覆盖物高效降解菌株分离及产酶条件优化 . 浙江农林大学学报, 2012, 29(2): 244-250. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2012.02.014
    [14] 程大莉, 蒋身学, 张齐生.  二氧化钛/竹炭复合材料的吸附-光催化降解苯酚的动力学研究 . 浙江农林大学学报, 2010, 27(2): 205-209. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2010.02.007
    [15] 刘占孟, 唐朝春, 李静, 鲍东杰.  活性炭催化臭氧化降解亚甲基蓝实验 . 浙江农林大学学报, 2009, 26(3): 406-410.
    [16] 周国英, 李河.  竹材木质素选择性降解菌株的分子鉴定 . 浙江农林大学学报, 2008, 25(4): 497-501.
    [17] 罗锡平, 傅深渊, 周春晖.  纳米二氧化钛改性竹炭光催化降解2,4-二氯苯酚的研究 . 浙江农林大学学报, 2007, 24(5): 524-527.
    [18] 周明兵, 汤定钦.  高等植物赤霉素生物合成及其关键酶的研究进展 . 浙江农林大学学报, 2004, 21(3): 344-348.
    [19] 何光训.  杉木连栽林地土壤酚类物质降解受阻的内外因 . 浙江农林大学学报, 1995, 12(4): 434-439.
    [20] 张月季, 洪健, 徐正, 高其康, 游汝恒.  桑皱褶花叶病及皱褶螺原体的研究 . 浙江农林大学学报, 1994, 11(2): 171-176.
  • 加载中
  • 链接本文:

    https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20200819

    https://zlxb.zafu.edu.cn/article/zjnldxxb/2021/6/1213

图(7) / 表(1)
计量
  • 文章访问数:  586
  • HTML全文浏览量:  118
  • PDF下载量:  240
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2021-01-08
  • 修回日期:  2021-08-09
  • 网络出版日期:  2021-12-08
  • 刊出日期:  2021-12-08

高效降解菌Arthrobacter nicotianae ZAF-05对土霉素的减毒效应

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200819
    基金项目:  国家自然科学基金资助项目(31970093,31670110)
    作者简介:

    朱蓉蓉(ORCID: 00000-0002-7487-6350),从事微生物生态学研究。E-mail: 734632819@qq.com

    通信作者: 张昕(ORCID: 0000-0002-8762-171X),副教授,从事环境微生物学研究。E-mail: zhangxins@126.com
  • 中图分类号: S606

摘要:   目的  明确1株土霉素(oxytetracycline, OTC)高效降解菌降低OTC生物毒性的效应,为菌株的实际应用提供初步理论依据。  方法  以前期获得的OTC高效降解菌Arthrobacter nicotianae ZAF-05为对象,利用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(HPLC-Q-TOF-MS)分析了OTC的降解产物。以对OTC敏感的大肠埃希菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和斜生栅藻Scenedesmus obliquus作为指示生物,评估OTC降解产物的生物毒性。  结果  HPLC-Q-TOF-MS分析发现:经菌株ZAF-05作用后,体系中的高毒性OTC以及其自然水解产物差向异构土霉素(EOTC)含量显著降低,而低毒性的同分异构土霉素(ISO-OTC)含量略有上升。供试细菌和藻类在添加ZAF-05菌株的OTC体系中的生长情况明显好于OTC自然水解的处理和未添加降解菌的阴性对照,且差异极显著(P<0.01)。与原药和自然水解物相比,经过ZAF-05菌株降解的OTC代谢产物生物毒性大大降低。菌株的降解作用缓解了OTC对斜生栅藻细胞超微结构的伤害,细胞叶绿体及细胞壁受损减轻。  结论  降解菌ZAF-05能降低OTC残留的环境生物毒性,而毒性的降低可能与体系中高毒性物质被转化成无毒或低毒的代谢产物有关。图7表1参26

English Abstract

朱蓉蓉, 张赞, 史艳可, 林辉, 张昕. 高效降解菌Arthrobacter nicotianae ZAF-05对土霉素的减毒效应[J]. 浙江农林大学学报, 2021, 38(6): 1213-1220. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200819
引用本文: 朱蓉蓉, 张赞, 史艳可, 林辉, 张昕. 高效降解菌Arthrobacter nicotianae ZAF-05对土霉素的减毒效应[J]. 浙江农林大学学报, 2021, 38(6): 1213-1220. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200819
ZHU Rongrong, ZHANG Zan, SHI Yanke, LIN Hui, ZHANG Xin. Reduction of toxicity of oxytetracycline by highly efficient degrading bacterium Arthrobacter nicotianae ZAF-05[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2021, 38(6): 1213-1220. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200819
Citation: ZHU Rongrong, ZHANG Zan, SHI Yanke, LIN Hui, ZHANG Xin. Reduction of toxicity of oxytetracycline by highly efficient degrading bacterium Arthrobacter nicotianae ZAF-05[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2021, 38(6): 1213-1220. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200819
  • 抗生素因其广谱的抗菌特性和促进生长作用广泛应用于医疗卫生、畜牧及水产养殖等领域[1]。然而,进入机体的抗生素仅有小部分发挥作用,剩下约30%~90%会随着代谢排出体外[2-4],并且以原药的形式输入周边环境[5]。一些化学性质稳定的抗生素会在环境中长期残留,不仅对周边植物[6]、鱼类[7]造成不利影响,其产生的选择压力还能够诱导耐药菌群的出现和抗性基因的传播[8]。鉴于其巨大的风险和威胁,抗生素以及抗性基因已经被世界卫生组织列为21世纪最重要的污染源之一。残留抗生素的去除和抗生素污染环境的修复成为保障生态安全和生命健康的重要举措。残留抗生素的去除主要有理化处理和生物降解2种途径,其中生物降解因为价格低廉、操作简便且不会造成二次污染而备受青睐[9]。当前关于利用微生物进行抗生素生物降解的研究日益增多,并已积累不少优良的菌种资源[10-11]。但抗生素被降解并不能确保转化产物的安全性,一些原药被代谢后可能会产生毒性更高的中间产物[12]。因此对降解菌株代谢产物的生物毒性评估和生态安全性评价是菌株能够实际应用的必要保证。土霉素(oxytetracycline,OTC)是当今应用范围最广、用量最多的抗生素之一[13],由于性状稳定已在陆地、水体等多种环境中被高频次检出[14-15]。本研究前期分离获得1株OTC高效降解菌Arthrobacter nicotianae ZAF-05,该菌株环境适应性好,能在液体体系、粪肥和土壤中发挥积极的降解作用[16]。本研究以该菌株为实验对象,利用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(HPLC-Q-TOF-MS)初步解析菌株作用下OTC的降解产物,并以对OTC敏感的大肠埃希菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和水生生物斜生栅藻Scenedesmus obliquus作为指示生物,评估OTC降解产物的生物毒性,以期为菌株的安全使用提供初步理论依据。

    • OTC高效降解菌A. nicotianae ZAF-05于2019年分离自制药厂活性污泥。OTC敏感菌革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌No 1.821、革兰氏阴性菌大肠埃希菌No 1.12882均来自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),OTC敏感斜生栅藻购自上海光宇生物技术有限公司。

    • OTC购于Solarbio公司,纯度>99%。LB培养基用于细菌的培养,主要配方为胰蛋白胨10 g·L−1;酵母提取物5 g·L−1;氯化钠5 g·L−1,pH 7.2。BG11合成培养基用于供试斜生栅藻的培养,购自上海光宇生物技术有限公司并按说明书指导方法使用。质谱所用甲醇和乙腈等相关试剂均购自Merck公司(Kenilworth, 美国)。

    • 制备不同密度降解菌菌悬液,绘制细胞数量与悬液600 nm波长下吸光度[D(600)]的标准曲线,根据标准曲线得到合适密度的细菌悬液。在OTC终质量浓度为100 mg·L−1的LB培养基中接入终密度为1.5×105 CFU·mL−1的降解菌。培养2 d后,取样菌悬液经过滤除菌、过柱萃取后利用HPLC-Q-TOF-MS技术检测OTC降解产物。质谱数据由Agilent 6545 Q-TOF质谱仪获得,使用电喷雾电离源,以正离子和负离子模式工作。具体工作条件:离子化压力3 500 V,裂解电压75 V,碰撞能30 eV,质荷比50~1 200。筛选获得可能的转化产物以TPs表示。以添加OTC但不接种降解菌的处理为阳性对照,以不添加OTC但接种降解菌的处理为阴性对照,所有处理均设置3个平行。

    • 降解产物毒性测定设置4个处理。对照A(ckA):添加300 mg·L−1 OTC的LB液体培养基。T1处理:添加300 mg·L−1 OTC的LB培养基,接种降解菌;培养4 d后20 000 r·min−1高速离心2 min,取过滤除菌后的上清备用。T2处理:添加300 mg·L−1OTC的LB液体培养基,自然降解4 d。对照B(ckB):LB液体培养基。①OTC降解产物对细菌的生物毒性。取2组各4支试管,按1∶1(v/v)加入LB培养液和上述4个处理样品,定容至体积5 mL。分别依次接入1.5×105 CFU·mL−1的枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌新鲜菌悬液,菌液密度确定方法同1.3.1。37 ℃下震荡培养,每隔24 h取样测定菌液吸光度[D(600)],用以表征细菌数量。②OTC降解产物对供试藻的生物毒性。取1组4个三角瓶,依次加入16 mL BG11培养基和2 mL上述4个处理样品,混匀后接种终密度为1.2×103个·mL−1新鲜藻种。于25 ℃、12 h (光照) /12 h (黑暗)光周期条件下静置培养,每天定时摇晃4~5次,每隔24 h取样测定吸光度[D(680)]。培养4 d后取样藻液,参考武鹏鹏等[17]的方法测定藻液叶绿素质量浓度,参考邹宁等[18]的方法观察藻细胞结构。

    • 各处理均3个平行,所得数据利用SPSS 16.0进行方差分析,在0.01水平下确认差异显著性。

    • OTC降解产物的生物毒性既取决于残留的OTC,也取决于降解过程中产生的中间代谢产物。培养2 d后,对各处理悬液产物进行HPLC-Q-TOF-MS分析发现:降解菌组和阳性对照中均检出了TP447和TP461,阴性对照中则未检出;推测TP447和TP461可能为OTC降解相关中间产物。图1 A图1 B可见:在7.279 min时TP447出现了明显的特征峰,其图谱特征以及出峰时间与QI等[19]发现的脱甲基OTC一致;由图1 C图1 D可见:TP447在正、负离子作用下均出现了脱甲基OTC特有的离子碎片图谱,推测TP447可能是OTC水解产物——脱甲基OTC。TP461在4~7 min区段内出现了多个特征峰(图2 A),参考文献[20]可知:OTC出峰时间在5.434 min时,差向异构OTC(epioxytetracycline,EOTC)出峰时间在4.893 min时,同分异构OTC(isomeric oxytetracyline,ISO-OTC)出峰时间在6.550 min时;此3个化合物出峰时间、质荷比和分子离子峰图谱与TP461相同,推测TP461可能为OTC(图2 B)、EOTC (图2 C)和ISO-OTC (图2 D)的混合物。由表1可知:降解菌培养体系中OTC、EOTC和脱甲基OTC相对丰度极显著低于阳性对照(P<0.01),表明菌株ZAF-05在加速OTC分解的同时,还可能抑制了OTC向脱甲基OTC和EOTC的转化,使得体系中EOTC和脱甲基OTC丰度降低。

      图  1  TP447的色谱和质谱图

      Figure 1.  Extracted ion chromatograms and mass spectrum of TP447

      图  2  TP461的色谱和质谱图

      Figure 2.  Extracted ion chromatograms and mass spectrum of TP461

      表 1  OTC及其推定代谢产物的相对丰度

      Table 1.  Relative abundance of OTC and the putative degradation products      

      可能的化合物保留时间/min分子式相对丰度
      阳性对照降解菌处理
      OTC 5.434 C22H24N2O9 13.872 7.254
      EOTC 4.893 C22H24N2O9 20.931 5.231
      ISO-OTC 6.550 C22H24N2O9 2.727 3.157
      脱甲基OTC 7.279 C21H22N2O9 37.278 4.142
    • 图3显示:72 h的培养期内,枯草芽孢杆菌在各处理中均有不同程度的生长,随时间推移细胞数量逐渐增加。具体来看,ckB处理下枯草芽孢杆菌生长良好,不同培养时间下细胞的吸光度[D(600)]始终最大,培养72 h时达2.563。相比之下,ckA处理72 h时D(600)仅0.334,表明受试细菌的生长受到明显抑制,极显著低于T1处理[D(600)=2.336]和ckB(P<0.01)。同时T2处理下吸光度一直处于较低水平[D(600)=0.424,72 h],与T1差异极显著(P<0.01)。提示OTC的自然水解过程并不能明显降低液体中OTC及其水解产物的毒性,降解菌ZAF-05能有效分解OTC,降低OTC及中间代谢产物的毒性;T1处理下细菌细胞数量与ckB最为接近,说明降解菌减轻了OTC及中间代谢产物对枯草芽孢杆菌生长的不利影响。

      图  3  不同处理对枯草芽孢杆菌生长的影响

      Figure 3.  Effects of different treatments on growth of B. subtilis

      OTC的降解产物对大肠埃希菌生长的影响呈现出与枯草芽孢杆菌一致的态势(图4)。T2处理下,大肠埃希菌生长受阻,72 h培养期内,与ckA处理差异均不显著,说明OTC自然水解的解毒作用甚微。T1处理下,整个培养期内大肠埃希菌细胞数量始终处于较高水平,仅次于ckB,培养后期(48~72 h)甚至超过后者,推测可能是经ZAF-05降解后,OTC中间代谢产物为细菌生长提供了额外的碳源。

      图  4  不同处理对大肠埃希菌生长的影响

      Figure 4.  Effects of different treatments on growth of E. coli

    • 图5可以看出:斜生栅藻在4个不同处理中的长势不同,ckB处理下供试藻生长良好[D(680)=1.064,96 h],而ckA中培养96 h后斜生栅藻吸光度[D(680)]仅0.028,表明OTC抑制斜生栅藻生长,生理毒性较强。T1处理下,斜生栅藻细胞数量与ckB无显著差异,远高于T2和ckA,说明降解菌株ZAF-05有效缓解了OTC对斜生栅藻的生物毒害。培养0~48 h,T2处理的吸光度与ckA比较差异不明显,尽管48 h后有所增加但远不及T1,说明OTC能发生自然水解,但解毒作用有限。

      图  5  不同处理对斜生栅藻生长的影响

      Figure 5.  Effects of different treatments on growth of S. obliquus

    • 图6可以看出:ckB处理下斜生栅藻叶绿素质量浓度为2.126 mg·L−1,ckA为0.193 mg·L−1。可见,OTC的存在大大降低了藻的叶绿素质量浓度。与ckA相比,T1处理一定程度上缓解了叶绿素的减少(0.555 mg·L−1),但仍极显著低于ckB (P<0.01)。结合图5认为:尽管T1与ckB的藻类细胞数量相差不大,但其叶绿素质量浓度却显著降低,说明尽管降解菌ZAF-05能高效降解OTC,但短期(96 h)内,仍不能完全转化毒性物质,培养体系中残留的毒性可能会影响斜生栅藻的叶绿素合成。

      图  6  不同处理对斜生栅藻叶绿素的影响

      Figure 6.  Effects of different treatments on chlorophyll content of S. obliquus

    • 将斜生栅藻置于电镜下放大12 000倍观察细胞超微结构,由图7可见:ckB处理下斜生栅藻细胞截面为典型的椭圆形,细胞壁边缘整齐,细胞器界限清晰,叶绿体数量多,几乎布满整个细胞,平行排列的类囊体整齐地堆叠在叶绿体内。在叶绿体片层间的基质中可见电子密度较大的淀粉粒,淀粉粒数目较多(图7A)。相比之下ckA(图7B)和T2处理(图C)中的细胞壁边缘不整齐,略有缺刻,叶绿体数量少,且结构松散甚至破裂变形。叶绿体中基粒类囊体片层结构减少,形态模糊不清,且排列无序无方向。T1处理下(图7D),斜生栅藻细胞叶绿体少于ckB,但结构仍然完整,整齐地分布在细胞壁周围,类囊体的片层结构清晰可见且平行排列整齐,细胞结构完整无明显损伤。以上结果证明:与T2和ckA相比,T1处理对斜生栅藻的亚细胞结构影响更小,再次证明降解菌ZAF-05能够有效降解并降低OTC的生物毒性。

      图  7  不同处理下斜生栅藻的亚细胞形态

      Figure 7.  Effects of different treatments on chlorophyll content of S. obliquus

    • A. nicotianae ZAF-05是实验室前期分离获得的1株OTC高效降解菌,该菌株不仅能良好降解OTC,还对四环素和金霉素具有一定的去除能力,具有广泛的应用潜力。有些环境残留抗生素在消解时可能会被转化成毒性更高的中间代谢产物。如LI等[21]发现:经臭氧处理5~30 min后OTC大量分解,但产生的代谢产物比OTC的生物毒性更高,其生态危害也更大。因此明确降解菌株的代谢产物生物毒性是菌株能实际发挥作用的前提和保障。本研究采用HPLC-Q-TOF-MS技术解析了OTC的降解产物,最终获得脱甲基OTC、EOTC和ISO-OTC 3种代谢中间产物,其中脱甲基OTC和EOTC为自然水解产物,在降解菌体系和对照中均有出现,但对照中相对丰度远高于降解菌处理体系。研究[22-23]表明:四环素类抗生素的差向异构体,往往具有比母体化合物更高的毒性,而OTC水解形成的ISO-OTC毒性却较OTC及其衍生物(如EOTC)要小得多[23]。本研究中,对照中EOTC相对丰度为降解菌体系的4倍,而ISO-OTC在降解菌体系的相对丰度略高于对照,因此推测A. nicotianae ZAF-05促进了OTC及其高毒代谢产物EOTC向低毒物质(如ISO-OTC)的转化,降低了体系生物毒性。

      本研究以大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和模式藻斜生栅藻为靶标生物,考察了OTC及其降解产物对供试细菌和藻类的影响。结果表明:OTC不仅抑制细菌和供试藻增殖,还导致藻细胞变形,引起叶绿体片层结构破裂,与同属四环素族的金霉素的细胞毒性表现一致[24]。OTC被降解后,细菌和藻细胞生长的抑制作用减轻,藻叶绿素合成和叶绿体超微结构的伤害作用缓解。说明降解菌ZAF-05促进体系中OTC及其高毒代谢产物EOTC向低毒物质转化,从而降低了生物毒性。

      叶绿体是藻进行光合作用的重要细胞器,内部密布排列整齐的基粒内囊体,基粒内囊体既是叶绿素也是光合系统存在的场所,光合作用过程中的光反应在此进行[25-26],因此基粒类囊体结构的完整性和有序性是叶绿体进行正常、高效的光能转换的首要前提,对于保障光合作用的顺利进行具有重要意义。本研究中OTC的存在破坏了藻细胞叶绿体中基粒内囊体片层结构的完整,影响了光合作用。这可能是OTC导致藻细胞数量减少的一个重要原因。而添加菌株ZAF-05后,藻内叶绿体仍整齐地分布在细胞壁周围,类囊体片层结构清晰可见且平行排列整齐,细胞结构完整无明显损伤,再一次证实,ZAF-05的降解作用能降低OTC的生物毒性,提高其生态安全性。

参考文献 (26)

目录

    /

    返回文章
    返回