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滇杨组织培养再生及遗传转化体系建立

张晓琳 纵丹 李嘉其 杨玲 余进德 何承忠

辛鹏程, 魏天兴, 陈宇轩, 等. 山西西南部黄土丘陵区典型林分生态化学计量特征[J]. 浙江农林大学学报, 2024, 41(3): 549-556. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230573
引用本文: 张晓琳, 纵丹, 李嘉其, 等. 滇杨组织培养再生及遗传转化体系建立[J]. 浙江农林大学学报, 2024, 41(2): 314-321. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230304
XIN Pengcheng, WEI Tianxing, CHEN Yuxuan, et al. Ecological stoichiometric characteristics of typical forest stands in the Loess Hilly Region of southwest Shanxi[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2024, 41(3): 549-556. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230573
Citation: ZHANG Xiaolin, ZONG Dan, LI Jiaqi, et al. Regeneration system and genetic transformation of Populus yunnanensis[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2024, 41(2): 314-321. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230304

滇杨组织培养再生及遗传转化体系建立

DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230304
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(31860219);云南省教育厅自然科学基金资助项目(2021Y272)
详细信息
    作者简介: 张晓琳(ORCID: 0009-0005-9384-3844),从事林木育种与分子生物学研究。E-mail: sunnyxlz27@163.com
    通信作者: 何承忠(ORCID: 0000-0001-9487-8612),教授,博士,从事林木育种与分子生物学研究。E-mail: hcz70@163.com
  • 中图分类号: S722.3

Regeneration system and genetic transformation of Populus yunnanensis

  • 摘要:   目的  建立高效的滇杨Populus yunnanensis离体叶片再生及遗传转化体系,有助于滇杨基因工程育种研究。  方法  以滇杨叶片为外植体,研究不同植物生长调节剂组合对叶片愈伤组织和不定芽诱导及生根的影响,从而获得滇杨再生组培苗;进一步以农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法探讨菌液吸光度、侵染时间和共培养时间等对滇杨遗传转化效率的影响。  结果  滇杨愈伤组织诱导的最适培养基为1/2 MS + 0.005 mg·L−1噻苯隆(TDZ) + 0.010 mg·L−1萘乙酸(NAA),诱导率达91.7%;不定芽诱导的最佳培养基为1/2 MS + 0.002 mg·L−1 TDZ + 0.010 mg·L−1 NAA,诱导率为75.0%;生根最适培养基为1/2 MS + 0.010 mg·L−1 NAA + 0.100 mg·L−1吲哚乙酸(IBA),生根率高达96.7%,平均生根数为2.57条。利用pBI121-GUS载体转化滇杨,最适转化菌液吸光度D(600)为0.2,侵染时间为5 min,共培养时间为2 d;在分化过程中,抑制农杆菌生长的头孢霉素(Cef)最佳质量浓度为200 mg·L−1,抗性筛选中最佳培养基的卡那霉素(Kan)质量浓度为20 mg·L−1。对再生植株进行β-D-葡萄糖苷酸酶(GUS)组织化学染色和PCR鉴定,获得20株阳性植株,转化阳性率为45.45%。  结论  本研究成功建立了滇杨离体叶片再生和遗传转化体系。图5表5参27
  • 生态化学计量学主要关注生物地球化学循环过程中营养元素间的相互作用与平衡[1],从植物生态学、土壤学等多学科角度探究植物器官、物种、群落和生态系统的元素计量关系和规律,广泛用于判断植物体和群落的养分限制状况[2]、指导生态系统养分管理[3]、预测全球养分变化背景下的植被动态研究[4]。植物-凋落物-土壤是陆地生态系统重要的养分储存库,三者之间彼此影响和制约。植物养分输移活动通过叶片从大气中固定碳(C),依靠枝在植物各器官间进行养分运转,借助根系吸收和存储土壤中的养分,最后以凋落物淋溶、光降解、微生物分解和根系分泌等方式将C、氮(N)、磷(P)等元素归还土壤[5],因此,以上循环形成了植物-凋落物-土壤的C、N、P生态系统组分连续体,其关联性有助于深入认识植被各组分对营养元素的利用与分配规律。目前,研究多集中在区域土壤与植物单一器官(叶片)的生态化学计量比研究,如梁楚欣等[6]探究了滇东石漠化区不同植被恢复模式下土壤C、N、P质量分数及化学计量比的差异,王浩伊等[7]研究了大兴安岭不同生活型针叶林生态化学计量与生长阶段的关系,而对于植物多器官(叶、枝、根)-凋落物-土壤为整体的相关研究较少。因此,阐明植物-凋落物-土壤生态系统养分循环及调控机制,可揭示生态系统植物-凋落物-土壤之间的物质循环特征。黄土高原生态环境敏感,独特的地貌导致水土流失严重[8]。植被恢复能有效防治水土流失,随着人工恢复为主的“退耕还林还草”工程的实施[9],黄土高原植被覆盖率、土壤质量明显提升,形成了自然恢复和人工恢复为主的植被类型[10]。以往对黄土高原植被恢复的生态化学计量研究,集中在单一树种不同器官[11]、不同密度人工林土壤[12]等方面,关于不同植被恢复类型下植物各器官生态化学计量特征、凋落物与土壤生态化学计量特征关系的研究仍较少。鉴于此,为系统了解植被恢复过程中植物与土壤的生态过程,本研究以黄土丘陵区人工恢复植被油松Pinus tabuliformis林、刺槐Robinia pseudoacacia林、侧柏Platycladus orientalis林为研究对象,以自然恢复植被辽东栎Quercus liaotungensis天然次生林为对照,系统研究乔木叶、枝、根,凋落物和土壤生态化学计量特征,揭示黄土高原生态系统的生态过程、养分循环和限制因素,为黄土高原人工林植被恢复工作和森林经营改造提供科技支撑。

    研究区位于山西省临汾市吉县森林生态系统国家野外科学观测研究站所在地的蔡家川流域(35°53′~36°21′N,110°27′~110°07′E),该区地处黄土高原东南部半湿润地区,属于典型的黄土残塬沟壑区,季风气候显著,年平均气温为10 ℃,年平均降水量为579 mm,年平均蒸发量达1 729 mm,降水集中在6—9月,海拔为400~1 820 m。本研究选取蔡家川流域具有典型代表性的人工油松林、刺槐林、侧柏林、辽东栎天然次生林,林下植物主要为丁香Syringa oblata、黄刺玫Rosa xanthina、绣线菊Spiraea salicifolia、青蒿Artemisia caruifolia、连翘Forsythia suspensa、梾木Cornus macrophylla、糙苏Phlomoides umbrosa、紫菀Aster tataricus等。自1991年起,在蔡家川流域内进行退耕还林的全面植被恢复工作,流域内梁峁坡沟综合规划设计,营造人工林,保护天然林,栽植了油松、刺槐及侧柏等适应性强、耐干旱瘠薄的树种,该人工林为生态公益林,没有进行间伐、施肥等人工经营措施,天然林采取自然恢复的方式。研究区样地基本特征见表1

    表 1  研究区样地基本特征
    Table 1  Basic information about the sampling site in the study area
    林分海拔/m坡度/(°)坡向平均树高/m平均胸径/cm凋落物厚度/cm郁闭度/%林分密度/(株·hm−2)
    油松林 1 1472010.514.02.4501 680
    刺槐林 1 123710.512.92.9711 310
    侧柏林 1 18614西北7.58.41.0491 200
    辽东栎林1 14125东南9.311.23.1671 150
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    于2022年7—8月进行外业调查。在每个长势良好的人工油松林、刺槐林、侧柏林和天然次生林辽东栎林等典型样地,分设3个乔木样方(20 m×20 m),在样方内进行每木检尺,调查郁闭度、树高和胸径等指标。样方内挑选3株长势均匀的标准木,在树冠处同一层东、西、南、北4个方位采集健康成熟的叶片与细枝(直径<2 cm),在标准木的冠幅范围内随机钻取3个0~60 cm的土芯,用冲洗法获取根样品(直径<2 mm),分别混匀后装入塑封袋;在样方内按对角线法选取3个1 m×1 m的具有代表性的凋落物样方,采集枯枝落叶(未分解、半分解和已分解),混匀后装入塑封袋;五点取样法采集0~20 cm土层土壤样品,混匀后装入塑封袋。以上采集的样品带回实验室后,叶、枝、根在100 ℃杀青15 min,随后降温至65 ℃恒温,将叶、枝、根与凋落物烘干至恒量,粉碎,过0.15 mm筛。土壤样品自然风干后,研磨过0.25 mm筛。采用元素分析仪测定全碳、全氮,采用硫酸-高氯酸消煮-钼锑抗比色法测定全磷。

    采用SPSS 25.0对数据进行K-S检验,验证数据正态性;采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较不同林分类型及不同组分生态化学计量差异;经方差齐性检验,使用最小显著性差异法(LSD)进行显著性检验(α=0.05);采用R 4.3.1对其进行相关性分析;绘图均在Origin 2021和R 4.3.1中进行。

    图1可知:4个林分的植物叶、枝、根平均C质量分数分别为516.35、495.05、490.76 g·kg−1,平均N质量分数为19.14、6.75、10.46 g·kg−1,平均P质量分数为1.61、1.11、0.74 g·kg−1。各林分器官间叶的N、P质量分数显著高于枝和根(P<0.05)。

    图 1  不同林分植物各器官、凋落物和土壤C、N、P质量分数
    Figure 1  C, N and P contents of plant organs, litter and soil of different forest stands

    不同林分植物各器官-凋落物-土壤C、N、P质量分数存在显著差异(P<0.05)。油松叶、枝、根和凋落物C质量分数最高;辽东栎土壤C质量分数最高;刺槐叶、根和土壤N质量分数最高;辽东栎枝和凋落物N质量分数最高;侧柏各组分中的N质量分数均显著低于其他树种(P<0.05);油松叶和土壤P质量分数最高,侧柏叶、枝、根P质量分数最低。

    图2可知:4个林分的植物叶、枝、根平均C/N分别为31.44、107.79、92.40,平均C/P为360.02、547.72、751.41,平均N/P为12.25、6.11、14.58。根的C/N和C/P显著高于叶和枝(P<0.05)。

    图 2  不同林分植物各器官、凋落物和土壤C、N、P化学计量比
    Figure 2  C, N and P stoichiometric ratios of plant organs, litter and soil of different forest stands

    不同林分植物各器官-凋落物-土壤C/N、C/P、N/P存在显著差异(P<0.05)。侧柏叶、枝、根的C/N和C/P显著高于其他树种(P<0.05),枝、根、凋落物的C/P在不同林分中表现为辽东栎最低。油松凋落物的C/N、C/P、N/P显著高于其他树种(P<0.05)。辽东栎土壤的C/N、C/P、N/P显著高于其他树种(P<0.05),油松土壤的C/N、C/P、N/P显著低于其他树种(P<0.05)。

    图3所示:典型林分植物叶、枝、根的C、N呈显著正相关(P<0.05)。叶C与凋落物C、土壤P呈极显著正相关(P<0.01),与凋落物P呈极显著负相关(P<0.01);叶N与凋落物N、P、土壤N呈显著正相关(P<0.05);枝C与凋落物C呈显著正相关(P<0.05),与凋落物N、P呈显著负相关(P<0.05);枝N与凋落物N、土壤C呈显著正相关(P<0.05);枝P与凋落物N、土壤C、N呈显著正相关(P<0.05);根C与凋落物C、土壤P呈极显著正相关(P<0.01),与凋落物P呈极显著负相关(P<0.01);根N与凋落物N、土壤N呈显著正相关(P<0.05);凋落物C与凋落物P、土壤C呈显著负相关(P<0.05),与土壤P呈极显著正相关(P<0.01);土壤N与土壤P呈极显著正相关(P<0.01)。

    图 3  典型林分植物各器官-凋落物-土壤化学计量特征的相关性关系
    Figure 3  Correlations between plant organs, litter and soil stoichiometric characteristics of typical forest stands

    叶C/N与凋落物C/N呈显著正相关(P<0.05);叶N/P与凋落物C/N呈显著负相关(P<0.05);根C/P与凋落物C/N呈显著正相关(P<0.05),与土壤C/P、N/P呈显著负相关(P<0.05);凋落物C/N、C/P均与土壤C/N、C/P呈极显著负相关(P<0.01),与N/P呈极显著负相关(P<0.001);土壤C/N与土壤C/P、N/P呈极显著正相关(P<0.001);土壤C/P与土壤N/P呈极显著正相关(P<0.001)。

    植物C、N、P养分分配及环境因子共同决定了植物的生长发育和营养水平[13]。本研究中4种林分乔木叶片C、N、P平均质量分数分别为516.35、18.64、1.61 g·kg−1,叶片C质量分数较全球植物叶片平均值(461.60 g·kg−1)偏高,但是N、P质量分数低于全球平均水平(20.60、2.00 g·kg−1)[1]。说明该研究区的C储备丰富,N、P较为贫瘠。这与黄土高原土壤结构松散,水土流失严重,植物难以从土壤中吸收N、P元素有关[14],亦与中国土壤P质量分数普遍较低的规律一致[15]。本研究中,油松叶片、枝、根C质量分数高于其他植被,表明油松体内积累了更多的有机质,能更好地抵御不良环境的侵扰,这与马钦彦等[16]对针叶树种的研究结果一致。相关研究表明:植物C质量分数越高,植物对外界不利条件的抵抗能力越强[17]。油松作为常绿针叶树种,叶片角质层发达,含有大量木质素与单宁等含碳化合物,具有更强的叶片韧性,可以更好地承受外界物理损伤。刺槐各组分间N质量分数显著高于其他植被类型,刺槐作为豆科Leguminosae植物,通过根瘤固定空气中的N,具有较强的固氮能力[18],可以缓解黄土高原普遍缺N的现象。

    植物叶C/N、C/P与植物的固氮能力、养分吸收和利用效率存在正反馈机制,与植物生长速率存在负反馈机制[19]。本研究中,刺槐叶C/N、C/P最低,表明刺槐在生长过程中生长速率较快。相关研究表明:植物叶N/P能够解释植物养分的受限制情况[20]。本研究中,油松、侧柏和辽东栎叶的平均N/P为8.34~13.71。胡耀升等[21]研究表明:当N/P<14时,植物的生长受N的限制;当14<N/P<16时,植物的生长受N、P共同限制。而本研究结果表明:黄土丘陵区油松、侧柏、辽东栎的生长主要受N限制,刺槐N/P为15.24,说明刺槐的生长同时受N和P的限制。凋落物是植物与土壤养分循环之间的纽带[22],其分解速率的快慢和养分释放的多少决定了植物的养分利用效率和土壤养分的供应状况[23]。其中,凋落物的C/N、C/P能反映其分解速率,C/N、C/P较低时凋落物更易分解。本研究中,油松凋落物C/N、C/P高于其他树种,不易分解,这是因为油松凋落物中较高的C和较低的C/N抑制了微生物的分解作用[24]。有研究发现:凋落物N/P也可以表征其分解速率的受限制情况[25]。本研究中,黄土丘陵区4种林分凋落物N/P均低于25,表明研究区凋落物分解主要受N限制。研究区土壤C/N、C/P平均值远小于全国平均值[26],这与郭鑫等[27]的研究结果一致,表明研究区土壤有机质分解矿化作用较快,不利于土壤有机质积累,且土壤P的有效性较高,土壤微生物受P的限制作用较小。作为衡量土壤质量的重要参数,土壤N/P可以表征土壤养分限制情况,本研究中黄土丘陵区土壤N/P远低于中国陆地平均水平[26],表明研究区内植物生长主要受限于土壤N。

    在长期的进化过程中,植物通过调节养分配置,形成相应的元素分配规律,从而产生对应的生长特性,以适应外界环境的变化。本研究中不同器官C、N、P质量分数及其计量比存在密切联系,叶与根的C、N质量呈显著正相关,说明叶与根养分分配具有协同性,这与王淳等[28]的研究结果一致。不同器官间的C/N、C/P、N/P均呈显著正相关,说明不同器官之间相互促进,协同增长;植物资源利用在不同植物器官间是一致的,同时也受相同元素限制。因此,分析植物、凋落物和土壤间C、N、P及化学计量特征的相关关系,有助于解释生态系统养分循环的内部调控规律[29]

    本研究中典型林分植物各器官C、N与凋落物C、N呈显著正相关,叶C/N与凋落物C/N呈显著正相关,可见,植物与凋落物在各元素间存在较强的相关性,这是因为叶片是凋落物的直接来源,两者之间存在养分转移。叶和根的N与土壤N呈显著正相关关系,表明叶和根与土壤供给的氮之间相互促进。凋落物C与土壤C呈显著负相关,凋落物C/N、C/P与土壤C/N、C/P、N/P间呈显著负相关,说明凋落物是植物地上部分与土壤之间的介质,凋落物分解速率的快慢,影响着凋落物与土壤之间的养分循环关系[30]。凋落物分解速率慢,其自身养分含量高,返还到土壤中的养分将减少,因此,凋落物与土壤元素之间存在负相关关系。

    山西西南部黄土丘陵区典型林分乔木叶、枝、根、凋落物和土壤的生态化学计量特征具有显著差异,油松林具有较好的固碳能力,刺槐林具有较好的固氮效果。刺槐生长受N、P限制;油松、侧柏、辽东栎生长受N限制;研究区土壤氮缺乏且凋落物分解受N限制。典型林分植物叶、枝、根之间化学计量特征显著正相关,说明植物各器官养分分配具有协同性,凋落物与土壤之间化学计量特征显著负相关,表明凋落物和土壤之间的养分动态变化具有协变性。因此,从养分限制角度考虑,建议在晋西北黄土丘陵区人工林管护过程中合理营造刺槐混交林,增强固氮能力,并缓解N元素的养分限制性。

  • 图  1  滇杨叶片愈伤组织的诱导

    Figure  1  Induction of callus in leaves of P. yunnanensis

    图  2  滇杨不定芽诱导

    Figure  2  Induction of adventitious buds in P. yunnanensis

    图  3  滇杨不定芽生根诱导

    Figure  3  Induction of adventitious rooting in P. yunnanensis

    图  4  不同质量浓度头孢霉素对农杆菌的抑制

    Figure  4  Inhibition of different concentration of cefotaxime on A. tumefaciens

    图  5  不同因素对滇杨转化率的影响

    Figure  5  Effects of different factors in the transformation efficiency of P. yunnanensis

    图  6  再生植株GUS染色结果

    Figure  6  GUS staining results of regenerated plants

    图  7  GUS基因PCR检测

    Figure  7  PCR analysis of GUS gene

    表  1  TDZ和NAA对愈伤组织诱导的影响

    Table  1.   Effects of TDZ and NAA on callus induction

    植物生长调节剂组合愈伤组织
    诱导率/%
    愈伤组织状况
    TDZ/
    (mg·L−1)
    NAA/
    (mg·L−1)
    0.0010.01036.00±12.73 e浅黄色,疏松,长势较差
    0.0010.05055.60±12.72 d浅黄色,疏松,长势较差
    0.0020.01063.90±9.64 cd浅绿色,疏松,长势一般
    0.0020.05083.30±8.35 abc浅绿色,紧实,长势一般
    0.0050.01091.70±8.35 ab浅绿色,紧实,长势较好
    0.0050.05077.80±4.79 bc浅绿色,紧实,长势一般
      说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。
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    表  2  TDZ和NAA对不定芽诱导的影响

    Table  2.   Effects of TDZ and NAA on adventitious bud induction

    植物生长调节剂组合不定芽
    诱导率/%
    不定芽生长状况
    TDZ/
    (mg·L−1)
    NAA/
    (mg·L−1)
    0.0010.0108.30±14.43 cd苗矮小,生长较差
    0.0010.0505.50±4.79 cd苗矮小,生长较差
    0.0020.01075.00±14.43 a苗健壮,生长旺盛
    0.0020.05019.50±4.79 bc苗细弱,生长一般
    0.0050.01027.80±12.73 b苗细弱,生长一般
    0.0050.05016.60±14.43 bcd苗细弱,生长一般
      说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。
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    表  3  NAA和IBA对不定芽生根的影响

    Table  3.   Effects of NAA and IBA on the rooting of adventitious bud

    植物生长调节剂组合生根率/%平均生根数/条生长状态
    NAA/(mg·L−1)IBA/(mg·L−1)
    0.000 0.000 63.30±5.77 bc 1.33±0.49 bc 主根细长、无侧根苗长势较好
    0.010 0.000 56.70±15.28 c 0.97±0.51 c 主根短少、侧根少、苗长势一般
    0.010 0.100 96.70±5.77 a 2.57±0.25 a 主根粗壮、侧根发达、苗健壮
    0.010 0.050 83.30±5.77 ab 1.93±0.57 ab 主根较粗、侧根较多、苗长势较好
    0.010 0.010 66.70±15.28 bc 1.10±0.44 c 主根粗壮、侧根较少、苗长势一般
    0.000 0.010 70.00±10.00 bc 1.23±0.30 bc 主根短少、侧根少、苗长势一般
    0.050 0.010 63.30±5.77 bc 0.77±0.15 c 茎部有短根、苗长势一般
    0.100 0.010 60.00±26.46 bc 0.70±0.40 c 主根短少、侧根少、苗长势一般
      说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P0.05)。
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    表  4  头孢霉素对滇杨不定芽分化的影响

    Table  4.   Effect of cefotaxime on regeneration of the adventitious buds of P. yunnanensis

    头孢霉素质量
    浓度/(mg·L−1)
    诱导率/%生长状况
    097.20±4.79 a不定芽多,生长正常 
    10088.90±12.73 a不定芽较多,生长正常
    20083.30±8.35 a不定芽较多,生长正常
    30083.30±8.35 a不定芽较多,生长正常
    40083.30±8.35 a不定芽较多,生长正常
      说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。
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    表  5  不同质量浓度卡那霉素对叶盘分化的影响

    Table  5.   Effects of different concentrations of kanamycin on leaf disc differentiation

    卡那霉素质量
    浓度/(mg·L−1)
    诱导率/%生长状况
    0 88.90±12.73 a 产生大量不定芽
    10 38.90±12.73 b 产生少量不定芽
    20 0.00±0.00 c 生长速度缓慢,无不定芽的形成
    30 0.00±0.00 c 叶盘变黄
    40 0.00±0.00 c 叶盘变黑死亡
      说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。
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    HE Chengzhong, ZHANG Zhiyi, CHEN Baokun, et al. Preliminary exploration on genetic improvement strategy of Populus yunnanensis [J]. Journal of West China Forestry Science, 2004, 33(1): 44 − 48.
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图(7) / 表(5)
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出版历程
  • 收稿日期:  2023-05-15
  • 修回日期:  2023-12-13
  • 录用日期:  2023-12-21
  • 网络出版日期:  2024-03-21
  • 刊出日期:  2024-04-01

滇杨组织培养再生及遗传转化体系建立

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230304
    基金项目:  国家自然科学基金资助项目(31860219);云南省教育厅自然科学基金资助项目(2021Y272)
    作者简介:

    张晓琳(ORCID: 0009-0005-9384-3844),从事林木育种与分子生物学研究。E-mail: sunnyxlz27@163.com

    通信作者: 何承忠(ORCID: 0000-0001-9487-8612),教授,博士,从事林木育种与分子生物学研究。E-mail: hcz70@163.com
  • 中图分类号: S722.3

摘要:   目的  建立高效的滇杨Populus yunnanensis离体叶片再生及遗传转化体系,有助于滇杨基因工程育种研究。  方法  以滇杨叶片为外植体,研究不同植物生长调节剂组合对叶片愈伤组织和不定芽诱导及生根的影响,从而获得滇杨再生组培苗;进一步以农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法探讨菌液吸光度、侵染时间和共培养时间等对滇杨遗传转化效率的影响。  结果  滇杨愈伤组织诱导的最适培养基为1/2 MS + 0.005 mg·L−1噻苯隆(TDZ) + 0.010 mg·L−1萘乙酸(NAA),诱导率达91.7%;不定芽诱导的最佳培养基为1/2 MS + 0.002 mg·L−1 TDZ + 0.010 mg·L−1 NAA,诱导率为75.0%;生根最适培养基为1/2 MS + 0.010 mg·L−1 NAA + 0.100 mg·L−1吲哚乙酸(IBA),生根率高达96.7%,平均生根数为2.57条。利用pBI121-GUS载体转化滇杨,最适转化菌液吸光度D(600)为0.2,侵染时间为5 min,共培养时间为2 d;在分化过程中,抑制农杆菌生长的头孢霉素(Cef)最佳质量浓度为200 mg·L−1,抗性筛选中最佳培养基的卡那霉素(Kan)质量浓度为20 mg·L−1。对再生植株进行β-D-葡萄糖苷酸酶(GUS)组织化学染色和PCR鉴定,获得20株阳性植株,转化阳性率为45.45%。  结论  本研究成功建立了滇杨离体叶片再生和遗传转化体系。图5表5参27

English Abstract

辛鹏程, 魏天兴, 陈宇轩, 等. 山西西南部黄土丘陵区典型林分生态化学计量特征[J]. 浙江农林大学学报, 2024, 41(3): 549-556. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230573
引用本文: 张晓琳, 纵丹, 李嘉其, 等. 滇杨组织培养再生及遗传转化体系建立[J]. 浙江农林大学学报, 2024, 41(2): 314-321. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230304
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Citation: ZHANG Xiaolin, ZONG Dan, LI Jiaqi, et al. Regeneration system and genetic transformation of Populus yunnanensis[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2024, 41(2): 314-321. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230304
  • 滇杨Populus yunnanensis为杨柳科Salicaceae杨属Populus青杨派树种,主要分布于云南中北部和南部、贵州西部及四川西南部等地区[1]。因速生性强、易无性繁殖和适应性强等优良特性[2],滇杨在中国西南地区具有重要的经济、生态和社会效益[3]。但传统的滇杨遗传育种面临易感染黑斑病以及易遭蛀干虫害等问题[1]。相比之下,转基因育种能够将所需基因引入植物基因组培育新品种以及创制新种质[4]。然而,有效遗传转化体系的缺乏严重制约了滇杨转基因育种和功能基因组研究。

    目前,有关滇杨再生体系的建立鲜有报道,仅有张春霞等[5]、辛培尧等[6]以滇杨叶片、叶柄和茎段为外植体进行不定芽的诱导,但均难以形成愈伤组织,不利于滇杨的高效再生和遗传转化研究。而关于滇杨遗传转化的研究尚未开展。据此,本研究以滇杨叶片为外植体,探讨植物生长调节剂对叶片愈伤组织、不定芽及生根的影响,从而建立高效的滇杨再生体系。在此基础上,利用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法对滇杨进行遗传转化研究,进而解析影响滇杨转化效率的各种因素,以期为滇杨的快速繁殖、定向育种及种质资源保存提供科学依据。

    • 以西南林业大学苗木基地栽培的10年生滇杨优株为母株,采集1年生枝条,剪切为45 cm长度的枝段,于室温条件下水培,取嫩叶作为试验材料。

    • 根癌农杆菌为GV3101,含β-D-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因及卡那霉素(Kan)筛选标记的质粒载体pBI121 (pBI121-GUS),菌株和质粒均由实验室保存。

    • 以嫩叶作为外植体,将叶片冲洗干净后置于体积分数为2%的次氯酸钠(NaClO)消毒150 s,用体积分数为75%的乙醇浸泡10 s,无菌水清洗3次,用无菌滤纸吸干叶片表面水分。将叶片剪切成1.0 cm2小方块(叶盘),叶背向下接种于分化培养基上。

    • 将叶盘接种于含有噻苯隆(TDZ,质量浓度分别为0.001、0.002、0.005 mg·L−1)、萘乙酸(NAA,质量浓度分别为0.010和0.050 mg·L−1)的MS和1/2 MS培养基上进行诱导分化。每瓶接种4个外植体,每个处理接种10瓶,置于暗条件下培养,30 d后统计愈伤组织诱导率。

      将获得的愈伤组织继续接种于上述培养基中进行不定芽诱导,置于光条件下培养, 30 d后统计不定芽诱导率。

    • 以1/2 MS为基本培养基,添加不同质量浓度组合的NAA (0、0.010、0.050、0.100 mg·L−1)和吲哚乙酸(IBA,0、0.010、0.050、0.100 mg·L−1)。待不定芽生长至2~3 cm时转接于生根培养基中,每瓶接种3个不定芽,每个处理接种10瓶,置于光条件下培养,30 d后统计生根率和单株生根数。

      以上培养基均添加20.0 g·L−1蔗糖和4.5 g·L−1琼脂,在光照强度为2 000~2 500 lx、光照时间为12 h(光)/12 h(暗)、温度为(25±2) ℃条件下培养。

    • 采用液氮速冻法将pBI121-GUS质粒转化至农杆菌中,加入LB培养液,置于28 ℃恒温振荡培养箱(200 r·min−1)培养,待菌液吸光度D(600)达0.6~0.8时,吸取菌液,涂布于添加不同质量浓度头孢霉素(0、100、200、300和400 mg·L−1)的LB固体培养基上,28 ℃倒置培养48 h,观察农杆菌生长情况。同时,将叶盘接种于添加不同质量浓度头孢霉素(0、100、200、300和400 mg·L−1)的分化培养基上进行筛选,每瓶接种3个叶盘,每个处理接种10瓶。30 d后统计分化率。

    • 将叶盘接种于添加不同质量浓度卡那霉素(0、10、20、30和40 mg·L−1)的分化培养基中进行筛选。每瓶接种3个叶盘,每个处理接种10瓶,置于暗条件下培养,30 d后观察统计不定芽生长情况。

    • 取1.2.3获得的滇杨组培苗,将叶片剪切为1.0 cm2叶盘,采用吸光度D(600)为0.2、0.6和1.0的农杆菌菌液对其侵染,每种浓度侵染时间分别为5、10和15 min,侵染后分别进行共培养0、2和4 d。将共培养后的叶盘接种于含有头孢霉素和卡那霉素筛选培养基进行筛选。40 d后统计产生抗性芽的叶盘数,并统计转化率,转化率=产生抗性芽的叶盘数/叶盘总数×100%。当抗性芽高度达2~3 cm时,接种至生根培养基中培养约20 d。

    • 取1.2.6中的抗性植株及野生型再生苗的叶片置入GUS染色液(体积比为X-Gluc Solution∶GUS Buffer=1∶50)中,抽真空30 min,37 ℃保育24 h,体积分数为75%的乙醇脱色3 h,观察叶片着色情况。进一步将GUS染色为蓝色的植株提取基因组DNA,以野生型再生苗为阴性对照,PCR扩增GUS基因,引物序列为GUS-F:5′-TCTCAGAAGACCAAAGGGCAA-3′;GUS-R:5′-TGCGCCAGGAGAGTTGTTG-3′,片段大小为2 239 bp。PCR扩增体系:12.5 µL Taq PCR Master Mix,1.0 µL DNA模板,GUS-F和GUS-R (10.0 µmol·L−1)各1.0 µL,ddH2O补足至20.0 µL。扩增条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30个循环;72 ℃延伸10 min。

    • 所有数据采用Excel 2016进行记录处理,利用SPSS 26.0进行单因素方差分析(ANOVA),采用Duncan’s法进行差异显著性分析。

    • 将滇杨叶盘接种于含TDZ和NAA的MS和1/2 MS培养基上,20 d后叶盘切口处形成淡绿色瘤状组织且出现芽点。接种于MS培养基的叶盘在30 d后仅于切口处长出少量愈伤组织(图1A),而接种于1/2 MS培养基的叶盘均分化出紧密的淡绿色愈伤组织(图1B)。因此,选取1/2 MS作为基本培养基进行愈伤组织和不定芽的诱导。

      图  1  滇杨叶片愈伤组织的诱导

      Figure 1.  Induction of callus in leaves of P. yunnanensis

      此外,将叶盘(图2A)置于含有TDZ和NAA不同质量浓度组合的1/2MS培养基上,30 d后统计愈伤组织诱导率及生长情况。结果表明(表1):组合0.005 mg·L−1TDZ和0.010 mg·L−1 NAA培养基中的诱导效果最好,愈伤组织紧实,呈浅绿色(图2B),且诱导率达91.70%。

      图  2  滇杨不定芽诱导

      Figure 2.  Induction of adventitious buds in P. yunnanensis

      表 1  TDZ和NAA对愈伤组织诱导的影响

      Table 1.  Effects of TDZ and NAA on callus induction

      植物生长调节剂组合愈伤组织
      诱导率/%
      愈伤组织状况
      TDZ/
      (mg·L−1)
      NAA/
      (mg·L−1)
      0.0010.01036.00±12.73 e浅黄色,疏松,长势较差
      0.0010.05055.60±12.72 d浅黄色,疏松,长势较差
      0.0020.01063.90±9.64 cd浅绿色,疏松,长势一般
      0.0020.05083.30±8.35 abc浅绿色,紧实,长势一般
      0.0050.01091.70±8.35 ab浅绿色,紧实,长势较好
      0.0050.05077.80±4.79 bc浅绿色,紧实,长势一般
        说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。

      将上述愈伤组织转接入含有TDZ和NAA不同质量浓度组合的分化培养基中,30 d后统计不定芽诱导率及芽生长状况。由表2可知:在分化培养基中,组合0.002 mg·L−1TDZ 和0.010 mg·L−1NAA培养基诱导不定芽的效果最佳,诱导率达75.00%,与其余组合的差异均达到显著水平(P<0.05),且不定芽健壮、生长旺盛(图2C)。

      表 2  TDZ和NAA对不定芽诱导的影响

      Table 2.  Effects of TDZ and NAA on adventitious bud induction

      植物生长调节剂组合不定芽
      诱导率/%
      不定芽生长状况
      TDZ/
      (mg·L−1)
      NAA/
      (mg·L−1)
      0.0010.0108.30±14.43 cd苗矮小,生长较差
      0.0010.0505.50±4.79 cd苗矮小,生长较差
      0.0020.01075.00±14.43 a苗健壮,生长旺盛
      0.0020.05019.50±4.79 bc苗细弱,生长一般
      0.0050.01027.80±12.73 b苗细弱,生长一般
      0.0050.05016.60±14.43 bcd苗细弱,生长一般
        说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。
    • 表3可见:在组合为0.010 mg·L−1NAA和0.100 mg·L−1IBA的培养基中,植株生长旺盛(图3A),生根率高达96.70%,平均生根数为2.57条,均有较多的侧根及根毛(图3B);其次为组合0.010 mg·L−1NAA和0.050 mg·L−1IBA培养基,苗木长势较好,生根率为83.30%,平均生根数为1.93条。此外,当NAA为0.010 mg·L−1时,随着IBA质量浓度的增加,生根率逐渐升高,平均生根数也逐渐增多,同时不定根和组培苗的长势逐渐增强。而IBA为0.010 mg·L−1时,随着NAA质量浓度的增加,生根率逐渐降低,平均生根数逐渐减少,不定根和组培苗的长势减弱。因此,组合1/2 MS、0.010 mg·L−1NAA、0.100 mg·L−1 IBA培养基适合不定芽的生根诱导。

      表 3  NAA和IBA对不定芽生根的影响

      Table 3.  Effects of NAA and IBA on the rooting of adventitious bud

      植物生长调节剂组合生根率/%平均生根数/条生长状态
      NAA/(mg·L−1)IBA/(mg·L−1)
      0.000 0.000 63.30±5.77 bc 1.33±0.49 bc 主根细长、无侧根苗长势较好
      0.010 0.000 56.70±15.28 c 0.97±0.51 c 主根短少、侧根少、苗长势一般
      0.010 0.100 96.70±5.77 a 2.57±0.25 a 主根粗壮、侧根发达、苗健壮
      0.010 0.050 83.30±5.77 ab 1.93±0.57 ab 主根较粗、侧根较多、苗长势较好
      0.010 0.010 66.70±15.28 bc 1.10±0.44 c 主根粗壮、侧根较少、苗长势一般
      0.000 0.010 70.00±10.00 bc 1.23±0.30 bc 主根短少、侧根少、苗长势一般
      0.050 0.010 63.30±5.77 bc 0.77±0.15 c 茎部有短根、苗长势一般
      0.100 0.010 60.00±26.46 bc 0.70±0.40 c 主根短少、侧根少、苗长势一般
        说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P0.05)。

      图  3  滇杨不定芽生根诱导

      Figure 3.  Induction of adventitious rooting in P. yunnanensis

    • 图4可见:当头孢霉素质量浓度为0时,农杆菌生长迅速,但随着头孢霉素质量浓度的增加,农杆菌的数量逐渐减少,当头孢霉素质量浓度≥200 mg·L−1时,可较好地抑制农杆菌的生长,此时,农杆菌数量为0 (图4)。此外,将叶盘接种至含有不同质量浓度头孢霉素(0、100、200、300和400 mg·L−1)培养基中进行培养,结果表明头孢霉素质量浓度为0时,叶盘分化率为97.20%,随着头孢霉素质量浓度的增加,叶盘的分化率无显著差异(表4)。因此,选取200 mg·L−1头孢霉素作为后续抑制农杆菌生长的最佳质量浓度。

      图  4  不同质量浓度头孢霉素对农杆菌的抑制

      Figure 4.  Inhibition of different concentration of cefotaxime on A. tumefaciens

      表 4  头孢霉素对滇杨不定芽分化的影响

      Table 4.  Effect of cefotaxime on regeneration of the adventitious buds of P. yunnanensis

      头孢霉素质量
      浓度/(mg·L−1)
      诱导率/%生长状况
      097.20±4.79 a不定芽多,生长正常 
      10088.90±12.73 a不定芽较多,生长正常
      20083.30±8.35 a不定芽较多,生长正常
      30083.30±8.35 a不定芽较多,生长正常
      40083.30±8.35 a不定芽较多,生长正常
        说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。
    • 表5可知:当卡那霉素质量浓度为0时,叶盘分化率为88.90%。随着卡那霉素质量浓度的增加,叶盘分化率急剧下降。当卡那霉素质量浓度≥20 mg·L−1时,叶盘生长速度缓慢,叶盘开始变黄甚至褐化,且分化率均为0。因此,选取20 mg·L−1卡那霉素对滇杨转化植株进行抗性筛选。

      表 5  不同质量浓度卡那霉素对叶盘分化的影响

      Table 5.  Effects of different concentrations of kanamycin on leaf disc differentiation

      卡那霉素质量
      浓度/(mg·L−1)
      诱导率/%生长状况
      0 88.90±12.73 a 产生大量不定芽
      10 38.90±12.73 b 产生少量不定芽
      20 0.00±0.00 c 生长速度缓慢,无不定芽的形成
      30 0.00±0.00 c 叶盘变黄
      40 0.00±0.00 c 叶盘变黑死亡
        说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。
    • 图5可知:菌液D(600)=0.2时的转化率显著高于0.6和1.0时 (P<0.05),此时转化率最高(50%),随着D(600)的增加,转化率明显降低,可能由于较高的D(600)对叶盘产生了毒害作用(图5A);侵染时间为5 min时,转化率显著高于10和15 min,随着侵染时间的增加,转化率呈下降趋势(图5B);共培养2 d时,转化率最高,而较短的共培养时间和较长的共培养时间均导致转化效率降低,这是由于时间较短不利于基因与外植体整合,而时间较长会对叶盘造成伤害(图5C)。因此,菌液D(600)为0.2,侵染时间为5 min,共培养时间为2 d时,转化效率最高。

      图  5  不同因素对滇杨转化率的影响

      Figure 5.  Effects of different factors in the transformation efficiency of P. yunnanensis

    • 通过农杆菌转化共获得44株抗性植株,分别取抗性植株叶片和茎段进行GUS染色。图6表明:有20株的叶片和茎段均显蓝色,说明GUS基因已成功转入滇杨并且能顺利表达。进一步提取经GUS染色鉴定的基因组DNA,进行GUS基因(预期2 239 bp)的PCR扩增,结果显示:经染色鉴定为阳性的植株均可扩增出清晰的GUS基因条带(图7)。最终获得阳性植株20株,阳性率为45.45%。

      图  6  再生植株GUS染色结果

      Figure 6.  GUS staining results of regenerated plants

      图  7  GUS基因PCR检测

      Figure 7.  PCR analysis of GUS gene

    • 杨树Populus作为乔木树种的模式植物,一些种的再生体系已得到广泛研究,其中辽宁杨P.×liaoningensis和河北杨P. hopeiensis在以叶片为外植体进行愈伤组织诱导和不定芽分化时,均以MS为最佳培养基[78],而大青杨P. ussuriensis和毛果杨P. trichocarpa则以WPM培养基较为适宜[910]。本研究采用MS为基本培养基时,滇杨叶片外植体褐化较严重,而1/2 MS基本培养基中的外植体呈嫩绿色,说明1/2 MS培养基适合滇杨叶片外植体的培养,该结果也与张春霞等[5]的研究结果一致。表明不同杨树种的外植体愈伤组织和不定芽生长所需要的无机元素和营养物质具有差异性[1113]

      植物生长调节剂的种类和质量浓度对植物愈伤组织和不定芽的诱导至关重要[1415]。本研究选取了不同质量浓度的TDZ和NAA进行组合添加至愈伤组织及不定芽诱导培养基中,发现TDZ质量浓度为0.005 mg·L−1时,叶盘的愈伤组织诱导率较高,而当TDZ质量浓度为0.001 mg·L−1时,愈伤组织诱导率较低。同时,适宜质量浓度的NAA (0.010 mg·L−1)与低质量浓度的TDZ (0.002 mg·L−1)对不定芽的诱导有明显的促进作用。该结果与乌日罕等[8]对河北杨的研究结果一致。此外,杨树不定芽的生根是其再生的关键步骤[16],青海青杨P. cathayana var. qinghai、胡杨P. euphratica和金叶杨P. nigra ‘Jinye’的最佳生根培养基为1/2 MS + IBA,生根率可达90%以上[1719],而彭言劼等[20]筛选出大叶杨P. lasiocarpa的最适生根培养基为1/2 MS + NAA。辛培尧等[21]研究发现:滇杨不定芽在1/2 MS + 0.020 mg·L−1NAA生根培养基中进行培养,10 d开始生根。本研究在1/2 MS + 0.010 mg·L−1 NAA + 0.100 mg·L−1 IBA培养基中,不定芽提前至5 d开始生根,且根系粗壮,须根多,生根率高达96.7%。说明采用IBA与NAA的组合更有利于滇杨不定芽的生根诱导。

    • 在卡那霉素抗性筛选中,发现当卡那霉素质量浓度为20 mg·L−1时,滇杨叶盘的生长受到严重抑制,而李春利等[22]研究表明:当卡那霉素质量浓度为30 mg·L−1时,毛白杨P. tomentosa愈伤组织不能分化形成不定芽。说明不同树种的不同受体材料对筛选剂的敏感度不同,因此选择合适的筛选剂质量浓度对获得转化植株至关重要[23]。此外,LI等[24]选用250 mg·L−1头孢霉素作为毛果杨的抑菌浓度。而本研究发现:200 mg·L−1头孢霉素就能完全抑制农杆菌生长,且对滇杨不定芽的生长影响较小。农杆菌质量浓度、侵染时间及共培养时间对植物的遗传转化效率起到重要作用[2527]。本研究对这3个因素分析发现:当菌液吸光度为0.2,侵染时间为5 min,共培养为2 d时,最有利于滇杨的遗传转化,这与LI等[24]在毛果杨中的研究结果相似。

      本研究以滇杨叶片为外植体,探讨了植物生长调节剂对叶片愈伤组织、不定芽诱导及其生根的影响,成功建立了滇杨离体叶片再生体系,并在此基础上,通过卡那霉素抗性筛选,利用农杆菌介导法从菌液吸光度、侵染时间和共培养时间开展了较为系统的研究,构建了滇杨的遗传转化体系。

参考文献 (27)

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