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滇杨Populus yunnanensis为杨柳科Salicaceae杨属Populus青杨派树种,主要分布于云南中北部和南部、贵州西部及四川西南部等地区[1]。因速生性强、易无性繁殖和适应性强等优良特性[2],滇杨在中国西南地区具有重要的经济、生态和社会效益[3]。但传统的滇杨遗传育种面临易感染黑斑病以及易遭蛀干虫害等问题[1]。相比之下,转基因育种能够将所需基因引入植物基因组培育新品种以及创制新种质[4]。然而,有效遗传转化体系的缺乏严重制约了滇杨转基因育种和功能基因组研究。
目前,有关滇杨再生体系的建立鲜有报道,仅有张春霞等[5]、辛培尧等[6]以滇杨叶片、叶柄和茎段为外植体进行不定芽的诱导,但均难以形成愈伤组织,不利于滇杨的高效再生和遗传转化研究。而关于滇杨遗传转化的研究尚未开展。据此,本研究以滇杨叶片为外植体,探讨植物生长调节剂对叶片愈伤组织、不定芽及生根的影响,从而建立高效的滇杨再生体系。在此基础上,利用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法对滇杨进行遗传转化研究,进而解析影响滇杨转化效率的各种因素,以期为滇杨的快速繁殖、定向育种及种质资源保存提供科学依据。
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将滇杨叶盘接种于含TDZ和NAA的MS和1/2 MS培养基上,20 d后叶盘切口处形成淡绿色瘤状组织且出现芽点。接种于MS培养基的叶盘在30 d后仅于切口处长出少量愈伤组织(图1A),而接种于1/2 MS培养基的叶盘均分化出紧密的淡绿色愈伤组织(图1B)。因此,选取1/2 MS作为基本培养基进行愈伤组织和不定芽的诱导。
此外,将叶盘(图2A)置于含有TDZ和NAA不同质量浓度组合的1/2MS培养基上,30 d后统计愈伤组织诱导率及生长情况。结果表明(表1):组合0.005 mg·L−1TDZ和0.010 mg·L−1 NAA培养基中的诱导效果最好,愈伤组织紧实,呈浅绿色(图2B),且诱导率达91.70%。
表 1 TDZ和NAA对愈伤组织诱导的影响
Table 1. Effects of TDZ and NAA on callus induction
植物生长调节剂组合 愈伤组织
诱导率/%愈伤组织状况 TDZ/
(mg·L−1)NAA/
(mg·L−1)0.001 0.010 36.00±12.73 e 浅黄色,疏松,长势较差 0.001 0.050 55.60±12.72 d 浅黄色,疏松,长势较差 0.002 0.010 63.90±9.64 cd 浅绿色,疏松,长势一般 0.002 0.050 83.30±8.35 abc 浅绿色,紧实,长势一般 0.005 0.010 91.70±8.35 ab 浅绿色,紧实,长势较好 0.005 0.050 77.80±4.79 bc 浅绿色,紧实,长势一般 说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。 将上述愈伤组织转接入含有TDZ和NAA不同质量浓度组合的分化培养基中,30 d后统计不定芽诱导率及芽生长状况。由表2可知:在分化培养基中,组合0.002 mg·L−1TDZ 和0.010 mg·L−1NAA培养基诱导不定芽的效果最佳,诱导率达75.00%,与其余组合的差异均达到显著水平(P<0.05),且不定芽健壮、生长旺盛(图2C)。
表 2 TDZ和NAA对不定芽诱导的影响
Table 2. Effects of TDZ and NAA on adventitious bud induction
植物生长调节剂组合 不定芽
诱导率/%不定芽生长状况 TDZ/
(mg·L−1)NAA/
(mg·L−1)0.001 0.010 8.30±14.43 cd 苗矮小,生长较差 0.001 0.050 5.50±4.79 cd 苗矮小,生长较差 0.002 0.010 75.00±14.43 a 苗健壮,生长旺盛 0.002 0.050 19.50±4.79 bc 苗细弱,生长一般 0.005 0.010 27.80±12.73 b 苗细弱,生长一般 0.005 0.050 16.60±14.43 bcd 苗细弱,生长一般 说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。 -
从表3可见:在组合为0.010 mg·L−1NAA和0.100 mg·L−1IBA的培养基中,植株生长旺盛(图3A),生根率高达96.70%,平均生根数为2.57条,均有较多的侧根及根毛(图3B);其次为组合0.010 mg·L−1NAA和0.050 mg·L−1IBA培养基,苗木长势较好,生根率为83.30%,平均生根数为1.93条。此外,当NAA为0.010 mg·L−1时,随着IBA质量浓度的增加,生根率逐渐升高,平均生根数也逐渐增多,同时不定根和组培苗的长势逐渐增强。而IBA为0.010 mg·L−1时,随着NAA质量浓度的增加,生根率逐渐降低,平均生根数逐渐减少,不定根和组培苗的长势减弱。因此,组合1/2 MS、0.010 mg·L−1NAA、0.100 mg·L−1 IBA培养基适合不定芽的生根诱导。
表 3 NAA和IBA对不定芽生根的影响
Table 3. Effects of NAA and IBA on the rooting of adventitious bud
植物生长调节剂组合 生根率/% 平均生根数/条 生长状态 NAA/(mg·L−1) IBA/(mg·L−1) 0.000 0.000 63.30±5.77 bc 1.33±0.49 bc 主根细长、无侧根苗长势较好 0.010 0.000 56.70±15.28 c 0.97±0.51 c 主根短少、侧根少、苗长势一般 0.010 0.100 96.70±5.77 a 2.57±0.25 a 主根粗壮、侧根发达、苗健壮 0.010 0.050 83.30±5.77 ab 1.93±0.57 ab 主根较粗、侧根较多、苗长势较好 0.010 0.010 66.70±15.28 bc 1.10±0.44 c 主根粗壮、侧根较少、苗长势一般 0.000 0.010 70.00±10.00 bc 1.23±0.30 bc 主根短少、侧根少、苗长势一般 0.050 0.010 63.30±5.77 bc 0.77±0.15 c 茎部有短根、苗长势一般 0.100 0.010 60.00±26.46 bc 0.70±0.40 c 主根短少、侧根少、苗长势一般 说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。 -
图4可见:当头孢霉素质量浓度为0时,农杆菌生长迅速,但随着头孢霉素质量浓度的增加,农杆菌的数量逐渐减少,当头孢霉素质量浓度≥200 mg·L−1时,可较好地抑制农杆菌的生长,此时,农杆菌数量为0 (图4)。此外,将叶盘接种至含有不同质量浓度头孢霉素(0、100、200、300和400 mg·L−1)培养基中进行培养,结果表明头孢霉素质量浓度为0时,叶盘分化率为97.20%,随着头孢霉素质量浓度的增加,叶盘的分化率无显著差异(表4)。因此,选取200 mg·L−1头孢霉素作为后续抑制农杆菌生长的最佳质量浓度。
图 4 不同质量浓度头孢霉素对农杆菌的抑制
Figure 4. Inhibition of different concentration of cefotaxime on A. tumefaciens
表 4 头孢霉素对滇杨不定芽分化的影响
Table 4. Effect of cefotaxime on regeneration of the adventitious buds of P. yunnanensis
头孢霉素质量
浓度/(mg·L−1)诱导率/% 生长状况 0 97.20±4.79 a 不定芽多,生长正常 100 88.90±12.73 a 不定芽较多,生长正常 200 83.30±8.35 a 不定芽较多,生长正常 300 83.30±8.35 a 不定芽较多,生长正常 400 83.30±8.35 a 不定芽较多,生长正常 说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。 -
由表5可知:当卡那霉素质量浓度为0时,叶盘分化率为88.90%。随着卡那霉素质量浓度的增加,叶盘分化率急剧下降。当卡那霉素质量浓度≥20 mg·L−1时,叶盘生长速度缓慢,叶盘开始变黄甚至褐化,且分化率均为0。因此,选取20 mg·L−1卡那霉素对滇杨转化植株进行抗性筛选。
表 5 不同质量浓度卡那霉素对叶盘分化的影响
Table 5. Effects of different concentrations of kanamycin on leaf disc differentiation
卡那霉素质量
浓度/(mg·L−1)诱导率/% 生长状况 0 88.90±12.73 a 产生大量不定芽 10 38.90±12.73 b 产生少量不定芽 20 0.00±0.00 c 生长速度缓慢,无不定芽的形成 30 0.00±0.00 c 叶盘变黄 40 0.00±0.00 c 叶盘变黑死亡 说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。 -
由图5可知:菌液D(600)=0.2时的转化率显著高于0.6和1.0时 (P<0.05),此时转化率最高(50%),随着D(600)的增加,转化率明显降低,可能由于较高的D(600)对叶盘产生了毒害作用(图5A);侵染时间为5 min时,转化率显著高于10和15 min,随着侵染时间的增加,转化率呈下降趋势(图5B);共培养2 d时,转化率最高,而较短的共培养时间和较长的共培养时间均导致转化效率降低,这是由于时间较短不利于基因与外植体整合,而时间较长会对叶盘造成伤害(图5C)。因此,菌液D(600)为0.2,侵染时间为5 min,共培养时间为2 d时,转化效率最高。
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通过农杆菌转化共获得44株抗性植株,分别取抗性植株叶片和茎段进行GUS染色。图6表明:有20株的叶片和茎段均显蓝色,说明GUS基因已成功转入滇杨并且能顺利表达。进一步提取经GUS染色鉴定的基因组DNA,进行GUS基因(预期2 239 bp)的PCR扩增,结果显示:经染色鉴定为阳性的植株均可扩增出清晰的GUS基因条带(图7)。最终获得阳性植株20株,阳性率为45.45%。
Regeneration system and genetic transformation of Populus yunnanensis
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摘要:
目的 建立高效的滇杨Populus yunnanensis离体叶片再生及遗传转化体系,有助于滇杨基因工程育种研究。 方法 以滇杨叶片为外植体,研究不同植物生长调节剂组合对叶片愈伤组织和不定芽诱导及生根的影响,从而获得滇杨再生组培苗;进一步以农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法探讨菌液吸光度、侵染时间和共培养时间等对滇杨遗传转化效率的影响。 结果 滇杨愈伤组织诱导的最适培养基为1/2 MS + 0.005 mg·L−1噻苯隆(TDZ) + 0.010 mg·L−1萘乙酸(NAA),诱导率达91.7%;不定芽诱导的最佳培养基为1/2 MS + 0.002 mg·L−1 TDZ + 0.010 mg·L−1 NAA,诱导率为75.0%;生根最适培养基为1/2 MS + 0.010 mg·L−1 NAA + 0.100 mg·L−1吲哚乙酸(IBA),生根率高达96.7%,平均生根数为2.57条。利用pBI121-GUS载体转化滇杨,最适转化菌液吸光度D(600)为0.2,侵染时间为5 min,共培养时间为2 d;在分化过程中,抑制农杆菌生长的头孢霉素(Cef)最佳质量浓度为200 mg·L−1,抗性筛选中最佳培养基的卡那霉素(Kan)质量浓度为20 mg·L−1。对再生植株进行β-D-葡萄糖苷酸酶(GUS)组织化学染色和PCR鉴定,获得20株阳性植株,转化阳性率为45.45%。 结论 本研究成功建立了滇杨离体叶片再生和遗传转化体系。图5表5参27 Abstract:Objective This study is aimed to establish a highly efficient system for regeneration and genetic transformation of in vitro leaves of Populus yunnanensis so as to help genetic engineering breeding research in P. yunnanensis. Method First, with P. yunnanensis leaves as explants, an investigation was conducted of the effects of different combinations of exogenous hormone concentrations on the induction of callus, adventitious bud differentiation and rooting so as to obtain regenerated seedlings of P. yunnanensis. Then, Agrobacterium tumefaciens mediated method was used to explore the effects of bacterial concentration, infection time and co-culture time on the genetic transformation efficiency of P. yunnanensis. Result The optimal medium for callus induction was 1/2 MS + 0.005 mg·L−1 thidiazuron (TDZ) + 0.010 mg·L−1 1-naphthylacetic acid (NAA), with an induction rate of 91.7%. The optimal medium for the induction of adventitious bud was 1/2 MS + 0.002 mg·L−1 TDZ + 0.010 mg·L−1 NAA, with an induction rate of 75.0% whereas the optimal medium for rooting was 1/2 MS + 0.010 mg·L−1 NAA + 0.100 mg·L−1 3-indolebutyric acid (IBA), and the rooting rate was as high as 96.7%, with an average number of 2.57 roots. The optimal concentration of transforming bacterium D(600) was 0.2, the infection time was 5 min, and the co-cultivation time was 2 days. During differentiation, the optimal concentration of cefotaxime to inhibit the growth of A. tumefaciens was 200 mg·L−1, and the optimal concentration of kanamycin in the screening medium for resistant buds was 20 mg·L−1. The regenerated plants were identified by β-glucuronidase (GUS) staining and PCR, identified 20 positive plants, with a positive transformation rate of 45.45%. Conclusion The leaf regeneration system and genetic transformation system of P. yunnanensis were successfully established. [Ch, 5 fig. 5 tab. 27 ref.] -
Key words:
- Populus yunnanensis /
- leaf /
- callus /
- regeneration system /
- genetic transformation
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表 1 TDZ和NAA对愈伤组织诱导的影响
Table 1. Effects of TDZ and NAA on callus induction
植物生长调节剂组合 愈伤组织
诱导率/%愈伤组织状况 TDZ/
(mg·L−1)NAA/
(mg·L−1)0.001 0.010 36.00±12.73 e 浅黄色,疏松,长势较差 0.001 0.050 55.60±12.72 d 浅黄色,疏松,长势较差 0.002 0.010 63.90±9.64 cd 浅绿色,疏松,长势一般 0.002 0.050 83.30±8.35 abc 浅绿色,紧实,长势一般 0.005 0.010 91.70±8.35 ab 浅绿色,紧实,长势较好 0.005 0.050 77.80±4.79 bc 浅绿色,紧实,长势一般 说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。 表 2 TDZ和NAA对不定芽诱导的影响
Table 2. Effects of TDZ and NAA on adventitious bud induction
植物生长调节剂组合 不定芽
诱导率/%不定芽生长状况 TDZ/
(mg·L−1)NAA/
(mg·L−1)0.001 0.010 8.30±14.43 cd 苗矮小,生长较差 0.001 0.050 5.50±4.79 cd 苗矮小,生长较差 0.002 0.010 75.00±14.43 a 苗健壮,生长旺盛 0.002 0.050 19.50±4.79 bc 苗细弱,生长一般 0.005 0.010 27.80±12.73 b 苗细弱,生长一般 0.005 0.050 16.60±14.43 bcd 苗细弱,生长一般 说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。 表 3 NAA和IBA对不定芽生根的影响
Table 3. Effects of NAA and IBA on the rooting of adventitious bud
植物生长调节剂组合 生根率/% 平均生根数/条 生长状态 NAA/(mg·L−1) IBA/(mg·L−1) 0.000 0.000 63.30±5.77 bc 1.33±0.49 bc 主根细长、无侧根苗长势较好 0.010 0.000 56.70±15.28 c 0.97±0.51 c 主根短少、侧根少、苗长势一般 0.010 0.100 96.70±5.77 a 2.57±0.25 a 主根粗壮、侧根发达、苗健壮 0.010 0.050 83.30±5.77 ab 1.93±0.57 ab 主根较粗、侧根较多、苗长势较好 0.010 0.010 66.70±15.28 bc 1.10±0.44 c 主根粗壮、侧根较少、苗长势一般 0.000 0.010 70.00±10.00 bc 1.23±0.30 bc 主根短少、侧根少、苗长势一般 0.050 0.010 63.30±5.77 bc 0.77±0.15 c 茎部有短根、苗长势一般 0.100 0.010 60.00±26.46 bc 0.70±0.40 c 主根短少、侧根少、苗长势一般 说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。 表 4 头孢霉素对滇杨不定芽分化的影响
Table 4. Effect of cefotaxime on regeneration of the adventitious buds of P. yunnanensis
头孢霉素质量
浓度/(mg·L−1)诱导率/% 生长状况 0 97.20±4.79 a 不定芽多,生长正常 100 88.90±12.73 a 不定芽较多,生长正常 200 83.30±8.35 a 不定芽较多,生长正常 300 83.30±8.35 a 不定芽较多,生长正常 400 83.30±8.35 a 不定芽较多,生长正常 说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。 表 5 不同质量浓度卡那霉素对叶盘分化的影响
Table 5. Effects of different concentrations of kanamycin on leaf disc differentiation
卡那霉素质量
浓度/(mg·L−1)诱导率/% 生长状况 0 88.90±12.73 a 产生大量不定芽 10 38.90±12.73 b 产生少量不定芽 20 0.00±0.00 c 生长速度缓慢,无不定芽的形成 30 0.00±0.00 c 叶盘变黄 40 0.00±0.00 c 叶盘变黑死亡 说明:数据为平均值±标准差。同列不同小写字母表示不同组合间差异显著(P<0.05)。 -
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