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机械损伤是植物生长过程中所面临最为普遍的胁迫之一[1]。植物不能通过躲避来免受机械损伤以及食叶昆虫和大型草食动物啃食的伤害。植物为了能够生存，在面对胁迫时通过启动体内防御反应信号系统应答外界的伤害，产生相应的防御反应[1]，诱导植物体提高抵抗能力[2]，从而获得系统免疫性，以提高植物的整体防御能力[3-4]。在植物受到损伤后，非结构性碳水化合物代谢会通过自身的改变来适应外界条件的变化。轻度刈割可以提高冷蒿Artemisia frigida可溶性碳水化合物含量和增加生物量[5]，马尾松Pinus massoniana针叶被损伤后可溶性糖先降低，后逐渐恢复到原来水平[6]。冷蒿是菊科Asteraceae蒿属Artemisia呈半匍匐状或直立状生长的多年生小半灌木。已对冷蒿的生态学特性[7]、抗性生理特性[8-9]以及不同放牧条件下抗氧化防御系统[10]和次生代谢产物[11]等变化进行了研究。张汝民等[12]和左照江等[13]对冷蒿挥发物和化感作用等方面的研究，也更加明确了冷蒿在草原退化中的重要地位与作用。本研究以内蒙古草原主要建群植物冷蒿为对象，通过不同强度机械损伤处理冷蒿叶片和枝条（以剪刀损伤和揉捏方式），模拟牲畜对冷蒿枝叶的采食和践踏，从冷蒿体内非结构性碳水化合物代谢入手，研究机械损伤处理后冷蒿叶片和根部蔗糖、葡糖糖、果糖、淀粉质量分数的变化，探讨冷蒿体内非结构性碳水化合物代谢对机械损伤的响应机制。
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供试材料冷蒿采自内蒙古自治区锡林浩特毛登牧场内蒙古大学草地生态学研究基地，地理位置为44°10′02′′ N，116°28′56′′ E，海拔1 160 m。全年平均气温为-0.4 ℃，1月最冷平均温度-22.3 ℃，7月最热平均气温18.8 ℃，≥0 ℃年积温为2 410.0 ℃，≥10 ℃积温为1 597.9°C，无霜期91.0 d，草原植物生长期为150 d左右。年降水量为365.6 mm，降水多集中在6-8月，占年降水量的80%左右。土壤为栗钙土。本研究区域主要草原植物为羊草Leymus chinensis，糙隐子草Cleistogenes squarrosa，克氏针茅Stipa krylovii，大针茅S. grandis，防风Saposhnikovia divaricata，冷蒿，瓣蕊唐松草Thalictrum petaloideum和阿尔泰狗哇花Heteropappus altaicus等。
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2014年6月中旬在采样地选取生长健壮的冷蒿植株，栽植于盛有采样地原土的花盆中（直径18 cm，高20 cm），1丛·盆-1，苗高20 cm，15~20小枝·丛-1。盆栽苗置于浙江农林大学实验室温室中，自然光照，相对湿度为（30 ± 2）%，白天气温为（25.0 ± 2.0） ℃，夜晚温度为（20.0 ± 2.0） ℃。缓苗生长20 d后进行实验处理。选取株高一致、生长良好、无病虫害冷蒿20盆，随机分为4组，以剪刀损伤冷蒿叶片，损伤1/4叶片为轻度、损伤1/3叶片为中度、损伤1/2叶片为重度、不作处理为对照。3盆·处理-1，每盆为1个独立重复。分别在处理前（0 h），处理6，12和24 h后，对冷蒿叶片和根系分别取样，样品用液氮速冻后放置于-80 ℃低温冰箱内保存。
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可溶性糖提取：称取植物样品0.2 g，液氮研磨匀浆，加蒸馏水5 mL，80 ℃恒温水浴30 min，不断搅拌，冷却，4 000 r·min-1离心5 min，沉淀用2 mL蒸馏水重复提取2次，合并上清液，定容至10 mL。用于可溶性糖测定。
淀粉水解：可溶性糖提取后的沉淀，加入2 mL蒸馏水，2 mL冷的6 mol·L-1盐酸，沸水浴30 min，4 000 r·min-1离心10 min，沉淀用3 mol·L-1盐酸 2 mL，沸水浴30 min重复提取2次；水浴时取出1滴提取液置白瓷板上，加1滴碘-碘化钾检查淀粉是否水解完全；合并上清液，冷却至室温加1滴酚酞，以6 mol·L-1氢氧化钠中和至溶液呈微红色。定容10 mL，用于淀粉质量分数测定。
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葡萄糖、果糖和蔗糖使用葡萄糖试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司生产）、果糖和蔗糖试剂盒（南京建成生物工程研究所南京建成科技有限公司生产）测定。具体方法按说明书操作。
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参照参考文献[13]的方法，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定淀粉质量分数。
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采用Origin 8软件（美国OriginLab公司）对实验数据进行统计分析和作图。统计方法采用One-Way ANOVA进行检验，并进行Tukey多重比较（P＜0.05）。每个变量数值表示为平均值＋标准误差。采用独立样本t检验进行冷蒿组织和机械损伤与对照组之间的差异。
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从图 1A中可以看出，机械损伤程度为轻度、中度、重度处理后，在24 h内冷蒿叶片蔗糖质量分数变化有明显差别。在轻度机械损伤后，叶片蔗糖随着处理时间的延长而增加，与对照相比，12和24 h分别增加了1.8%和1.1%（P＜0.05）；在中度机械损伤后，冷蒿叶片内蔗糖随着处理时间的延长继续增加，6,12和24 h分别比对照增加了4.5%,7.3%和4.1%（P＜0.05），表明此刻冷蒿叶片合成蔗糖的能力较强；经过重度损伤后，冷蒿叶片蔗糖质量分数开始下降，6和12 h分别比对照降低了6.1%和2.6%（P＜0.05），到24 h时，合成能力恢复，比对照增加了1.4%。冷蒿经过轻度、中度和重度损伤后，在6和12 h时，中度处理后蔗糖质量分数显著高于重度损伤，到24 h，三者的质量分数基本相同，说明蔗糖的合成能力在损伤冷蒿体内较强。
图 1 机械损伤对冷蒿叶片非结构性碳质量分数的影响
Figure 1. Effects of mechanical damage on non-structural carbohydrate content in leaves of Artemisia figida
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从图 1B中可以看出：分别进行轻度、中度、重度机械损伤处理的冷蒿，6 h葡萄糖质量分数较高，分别比对照增加了140.0%，64.8%和84.9%（P＜0.05）；到12 h，轻度处理葡萄糖质量分数增加了80.0%，中度和重度处理葡萄糖质量分数下降了5.1%和44.5%（P＜0.05）；到24 h，葡萄糖质量分数分别比对照下降了60.0%，74.6%和80.1%（P＜0.05）。冷蒿经过损伤处理后，6 h可显著增加体内葡萄糖质量分数，延长到24 h，体内葡萄糖显著下降，轻度、中度和重度处理后比6 h下降了83.3%，84.9%和89.2%（P＜0.05）。
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从图 1C中可以看出：冷蒿叶片经过轻度、中度和重度损伤处理后，果糖质量分数都发生下降，中度处理后，下降的程度最小。
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从图 1D中可以看出：轻度处理冷蒿后，6 h淀粉质量分数开始下降，24 h比对照降低了78.9%（P＜0.05）；中度处理后，淀粉开始上升，6和12 h分别比对照上升了11.4%和20.2%（P＜0.05），24 h比对照下降了67.1%（P＜0.05）；重度处理后，淀粉质量分数开始显著下降，分别比对照下降了43.4%，45.2%和77.2%（P＜0.05）。经过损伤处理后，到6 h，轻度、中度和重度处理之间，淀粉质量分数差异显著；到12 h，轻度、中度和重度处理之间，淀粉质量分数都有显著差异变化。
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从图 2A中可以看出：在轻度机械损伤后，根部蔗糖质量分数在6 h比对照下降了5.0%（P＜0.05），到12和24 h与对照相比分别增加了6.9%（P＜0.05）和0.7%，表明轻度损伤处理对冷蒿根部蔗糖合成的影响较小；在中度机械损伤处理后，冷蒿根部蔗糖质量分数随着处理时间的延长而明显下降，6，12和24 h分别比对照下降了37.4%，14.4%和33.9%（P＜0.05）；经过重度损伤后，冷蒿根部蔗糖质量分数6，12和24 h分别比对照下降了52.7%，50.6%和33.2%（P＜0.05）。冷蒿根部经过轻度、中度和重度损伤后，在6和12 h，轻度处理的蔗糖质量分数明显高于中度损伤，而中度损伤处理的蔗糖质量分数显著高于重度损伤；到24 h后，轻度损伤处理的蔗糖含量仍高于中度和重度损伤。
图 2 机械损伤对冷蒿根系非结构性碳质量分数的影响
Figure 2. Effects of mechanical damage on non-structural carbohydrate content in roots of Artemisia frigida
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从图 2B中可以看出：6 h葡萄糖质量分数较高，分别比对照增加了62.9%，94.3%和34.3%（P＜0.05）；到12 h，轻度损伤处理冷蒿根部葡萄糖质量分数回到对照水平，中度和重度处理葡萄糖质量分数下降了17.1%和28.6%（P＜0.05）；到24 h，轻度和重度处理葡萄糖质量分数比对照下降了2.9%和8.6%，而中度处理的葡萄糖质量分数与对照相比增加了2.9%。冷蒿经过损伤处理后，6 h根部葡萄糖质量分数显著增加，到24 h后，三者的合成能力基本相同且与对照相接近。
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从图 2C中可以看出：6和12 h轻度损伤处理后的冷蒿根部果糖质量分数较高，分别比对照增加了28.5%和41.0%（P＜0.05），到24 h，轻度处理果糖质量分数增加了8.2%（P＜0.05）；中度损伤处理的冷蒿根部果糖质量分数在6，12 h与对照相比，下降了1.0%和4.8%，到24 h果糖质量分数比对照增加了8.2%（P＜0.05）；经过重度损伤后，6，12和24 h冷蒿根部果糖质量分数比对照下降了0.4%，13.5%和1.7%。轻度处理后，根部果糖质量分数增加最多。
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从图 2D中可以看出：冷蒿轻度处理后，6 h根部淀粉质量分数开始下降，则到12和24 h淀粉质量分数上升，比对照增加了2.5%和5.3%（P＜0.05）；中度处理后，根部淀粉质量分数开始上升，6和12 h分别比对照上升了1.4%和4.9%，24 h比对照下降了12.7%（P＜0.05）；重度处理后，淀粉质量分数开始下降，分别比对照下降了2.3%,3.9%和21.9%（P＜0.05）。经过损伤处理后，在6和12 h，中度处理淀粉质量分数较高，高于轻度和重度损伤处理；到24 h，轻度、中度和重度处理之间，根部淀粉质量分数差异显著。
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糖是生物大分子物质。糖类是光合作用的产物，又是呼吸作用的底物，它为植物的生长发育提供碳骨架和能量，并能增强植物抗逆性。糖代谢是植物的基础代谢之一，它的中间产物能为蛋白质代谢、脂类代谢、核酸代谢及次生代谢提供原料。
植物体内的糖代谢属于基础代谢，各种可溶性糖和储藏的淀粉处于不断合成与分解的动态变化中，这是正常的生理代谢过程。植物光合产物主要是糖类，包括：葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉，糖类是光合作用的唯一直接产物。从研究结果图 1可看出：冷蒿叶片通过光合作用在体内积累的糖主要是蔗糖和淀粉，其质量分数较高；而葡萄糖和果糖合成了蔗糖，导致其在体内积累量较少，特别是葡萄糖，它既是合成淀粉的供体，又是合成蔗糖的供体。
当植物受到损伤后，特别是进行光合作用的叶片被损伤，其光合能力下降，形成的糖类质量分数发生变化，有些糖类将转化成抵抗损伤的应急产物。在损伤初期，6和12 h冷蒿受到轻度和中度机械损伤后，体内蔗糖质量分数较高，在12 h与对照相比轻度和中度处理蔗糖质量分数分别增加了1.8%和7.3%，可能是葡萄糖和果糖结合形成。从图 1可见：葡萄糖和果糖质量分数这时较高，在6 h轻度、中度和重度机械损伤处理后葡萄糖质量分数分别比对照增加了140.0%，64.8%和84.9%，说明冷蒿有能力继续合成蔗糖，在体内进行积累。这时轻度和中度处理的冷蒿叶片淀粉质量分数变化不大，说明淀粉的合成与分解未受到损伤的影响，处于动态平衡过程，而重度机械损伤后的淀粉质量分数与对照相比下降67.1%，说明淀粉进行分解反应，形成葡萄糖。到损伤后期，图 1D表明，3种损伤处理的淀粉质量分数都出现明显下降，说明淀粉进行分解形成葡萄糖。此时，葡萄糖一方面与果糖结合，形成蔗糖，导致蔗糖质量分数保持在较高水平，进行应激反应；另一方面葡萄糖参与应激反应，可能转化成其他中间代谢产物，为抵抗损伤提供应激物质和能量，因为葡萄糖分子在分解氧化过程中可以释放大量的能量。从图 1可说明：冷蒿受到损伤后，体内淀粉、蔗糖、葡萄糖质量分数发生变化，非结构性碳水化合物进行转化，参加应激反应，作为能量和物质的提供者。这些物质不是持续无控的而是快速间断和被调节的，反映了冷蒿的应激反应过程是一种时态的变化。受害程度的强弱和时间长短对冷蒿非结构碳水化合物代谢的变化有一定的影响。 王燕等[15]研究了马尾松Pinus massoniana受到不同程度的损伤后，其体内可溶性糖发生变化后逐渐恢复到原来水平。李镇宇等[16]研究发现：受赤松毛虫Dendrolimus spectabilis危害的油松松针内粗脂肪、单宁、生物碱含量增加,可溶性糖含量下降，其抗虫性增强；而油松Pinus tabulaeformis新长出的1年生针叶，水溶性总糖、粗脂肪、生物碱含量及总糖/氨基酸比例上升[17]；当小油松受害后2年生针叶内单宁、生物碱含量增加，水溶性糖、还原糖、糖/氨基酸比例下降[18]。
植物被刈割后，叶面积大幅度降低，其净光合速率也下降，由于地上部分的营养体减少，地下资源过剩促使植物产生更多的生活物质，补充形成应激反应所要的原料和能量[19]。因此，通过增加可溶性碳水化合物进行调节，DONAGHY等[20]在研究多年生黑麦草Lolium perenne刈割后发现，刈割损伤可以增加植物体内的非结构性碳化合物含量。王静等[5]对不同强度刈割后的冷蒿体内碳水化合物进行研究，发现冷蒿经过适度的刈割干扰，有利于体内碳水化合物和生物量的积累，其生长的可利用资源空间越多，可溶性碳水化合物含量增高。本研究表明：轻度和中度损伤冷蒿后，初期体内蔗糖、葡萄糖和淀粉质量分数上升，到后期葡萄糖和淀粉质量分数下降，可能它们形成了应激反应所需要的原料和能量，与前人的研究结果一致。
蔗糖是碳水化合物的主要运输形式，在植物叶片形成后，可直接运输到根部，为根生长、有机物代谢提供碳源和能量。从图 2可知：轻度损伤后，根内蔗糖质量分数较高，可能一部分来自葡萄糖和果糖结合而成，另一部分是由地上部分运输而来。经过重度损伤后，由于体内缺乏能量，葡萄糖和果糖未能合成蔗糖，使其质量分数不能升高。淀粉是根内积累的碳水化合物，冷蒿经过不同程度的损伤后，对其质量分数影响较小，但在24 h重度损伤后，其质量分数明显下降，可能是进行分解，形成葡萄糖为根系维持基础代谢提供能量。从根系结果也可看出，蔗糖和淀粉是冷蒿根内积累的2种主要非结构性碳水化合物。
Responses of non-structural carbohydrate metabolism to mechanical damage in Artemisia frigida
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摘要: 为了探讨放牧过程牲畜采食和践踏损伤对冷蒿Artemisia frigida体内非结构性碳水化合物代谢的影响,对盆栽冷蒿枝叶采用不同程度(轻度、中度、重度)机械损伤的方式模拟放牧,测定了冷蒿叶片和根部蔗糖、葡萄糖、果糖和淀粉质量分数的变化。结果表明:在损伤初期,轻度和中度处理后冷蒿叶片中蔗糖、葡萄糖和淀粉质量分数显著增加(P<0.05);到损伤24 h,3种处理中蔗糖质量分数基本恢复到对照水平,而葡萄糖和淀粉质量分数显著下降,与对照相比,葡萄糖质量分数降了60.0%,74.6%和80.1%,淀粉质量分数下降了43.4%,45.2%和77.2%。葡萄糖和果糖结合成蔗糖,使其质量分数较高,在冷蒿体内积累。冷蒿根部非结构性碳水化合物质量分数变化与叶片相比是有所不同的。损伤初期,冷蒿根部葡萄糖质量分数上升,3种处理与对照相比分别增加了62.9%,94.3%和34.3%,果糖在轻度机械损伤处理后明显上升;到损伤后期,葡萄糖和果糖恢复到对照水平,蔗糖和淀粉随着损伤加强而下降。根部积累的主要是蔗糖和淀粉。冷蒿受损伤后,体内淀粉、蔗糖、葡萄糖质量分数发生变化,参加应急反应,同时轻度损伤可以增加冷蒿体内非结构性碳水化合物。Abstract: To determine the effect of grazing and trampling damage of livestock on the metabolism of non-structural carbohydrates in Artemisia frigida, mechanical damage at different degrees (light, moderate, and severe) was applied to simulate grazing. The content of starch, fructose, glucose, and sucrose in leaves and roots were determined. Results showed that in the early stage with light and moderate mechanical damage, sucrose, glucose, and starch content of A. frigida leaves increased significantly (P<0.05). Sucrose content under all the three treatments restored to the level of the control in 24 h; whereas glucose decreased by 60.0%, 74.6%, and 80.1%(P<0.05), respectively, under light, moderate, and high treatments, whereas starch content decreased by 43.4%, 45.2%, and 77.2% (P<0.05), respectively, under light, moderate, and heavy treatments. The variation pattern of non-structural carbohydrates in roots differed that in leaves. At early stage glucose content increased, by 62.9%, 94.3%, and 34.3% (P<0.05), respectively, under light, moderate, and heavy treatments. Fructose content increased significantly at early stage of light treatment. At late stages of three treatments, glucose and fructose contents were restored to the control level; however, sucrose and starch contents decreased with increasing damage. Sucrose and starch were accumulated mainly in roots. Thus, after treatments, the content of starch, sucrose, and glucose in A. frigida changed in response to emergency while mild damage increased the content of non-structural carbohydrates.
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Key words:
- botany /
- Artemisia frigida /
- mechanical damage /
- non-structural carbohydrate
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植物繁育系统是指直接影响后代遗传组成的所有有性特征，包括花部特征、开放式样、花各性器官寿命长短，自交亲和程度与交配系统等[1]。作为植物重要的繁殖器官，花内部器官发育和外部形态特征与植物的传粉效率、交配方式密不可分。因此，系统研究植物的花部特征和繁育系统有助于理解其繁殖过程限制因子的生态效应，对生物多样性保育具有重要价值[2]。
长柱紫茎Stewartia rostrata为山茶科Theaceae紫茎属Stewartia的落叶灌木或小乔木，主要分布于浙江西北部、安徽南部及西部、江西北部及湖南东部，地理分布较为狭窄。花白繁茂，花瓣多带有形状、颜色不一的红斑，树干造型多样；集中开花，观赏价值极高，在园林绿地应用潜力巨大。近年来，由于人类干扰频繁和自然环境恶化，长柱紫茎的野外生存受到极大的威胁，迫切需要开展保育生物学系列研究。实地调查发现：尽管盛花期花量极大，但长柱紫茎群落下层幼苗稀少，天然更新不良，与同属的濒危植物紫茎Stewartia sinensis衰退型种群结构类似[3−4]。紫茎属木本植物幼苗幼树稀少，其原因可能涉及群落环境(如植物间竞争排斥关系、植物与传粉昆虫关系)与非生物环境(如阴雨天气的出现)的限制作用、种子发芽受阻、花部特征与繁育系统影响传粉过程造成种子发育质量不良等。已有研究表明[5]：紫茎的种子发芽率无论是实验室还是圃地最高仅为10%，甚至为0。长柱紫茎和紫茎在同属中亲缘关系最为接近，形态特征、生物学特性有许多相近之处，推测此2个种的繁育过程受阻有相似之处。
目前，紫茎属已有研究集中于群落结构[4]、繁殖技术[5]、种子发芽[6]、植物种分类[7]及系统发育[8]等方面，未发现有关紫茎属特别是长柱紫茎花部特征、传粉过程的限制因素、繁育系统所属类型等的报道。繁育系统类型是否对长柱紫茎结实率和种子败育产生影响，其衰退型种群结构是否与其繁育系统类型有关，生境自然条件变化是否影响传粉昆虫的行为，从而影响繁殖成功率；这些都是当前亟待深入研究的科学问题。为此，本研究以长柱紫茎为材料，通过观察(测)长柱紫茎花部特征和昆虫访花特性、测定花粉活力和柱头可授性、测算杂交指数和花粉胚珠比等，深入揭示其繁殖过程限制因素的影响，为紫茎属种群更新、人工扩繁及园林推广应用提供科学依据，为紫茎属的濒危植物致濒机制研究提供思路。
1. 材料与方法
1.1 试验区概况
研究地浙江农林大学东湖校区(30°15′28″N，119°43′35″E)海拔101.3 m，属于中亚热带季风气候，四季分明，年平均气温为16.1 ℃，全年降水量为1 628.6 mm，年降水日为154 d，无霜期为236 d。研究地周边地带性植被为亚热带常绿阔叶林。选择3 a生长柱紫茎为材料，株高为2.5~3.0 m。研究时间为2021年4—6月。
1.2 开花动态及花部特征观察(测)
1.2.1 开花动态
于花蕾期随机选取30朵花挂牌标记，每天16:00观察直至单花开放；开花当天及开花第2天8:00—18:00连续观察，每隔2 h定点观测1次并拍照，之后每天观测1次。观察花的开花动态，记录单花结构、花朵大小和形状、雄雌蕊位置形态变化、花瓣颜色、苞片颜色、萼片颜色、花药开裂时间等，直至花部萎蔫[9]。
1.2.2 花部形态特征
于盛花期，在15株植株上随机选取30朵发育良好的花，测定花部结构参数，记录花冠直径、苞片长宽、花瓣长宽、萼片长宽、子房直径及长度等数据。
1.3 花粉活力测定
1.3.1 花粉离体培养
随机采集当天开放花朵的花粉，设置5种蔗糖质量浓度(0、5、10、15、20 g·Ｌ−1)处理，于25 ℃下培养6 h后观察并统计花粉萌发率。
1.3.2 花粉活力测定
随机采集当天开放花朵的花粉，分别采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法、碘-碘化钾(I2-KI)染色法，筛选最适蔗糖质量浓度培养6 h后测定花粉活力，以加热致死的花粉作对照，每个处理3次重复。在光学显微镜下随机选取3个视野统计着色花粉数，每个视野花粉数不少于100粒[10]。
1.3.3 花粉萌发率测定
选取开放前1 d至开放后第3天的花朵，每个阶段选取10朵，测定最适蔗糖质量浓度培养下的花粉活力，以加热致死的花粉为对照。在光学显微镜下观察统计花粉萌发率，每视野内花粉数不少于100粒。
1.4 柱头可授性测定
随机选取开放前1 d至开放后7 d的花朵，将柱头放在凹面载玻片上，完全浸泡于质量分数3%的过氧化氢(H2O2)溶液中，30 min后在体式显微镜下观察，若有气泡产生则表明柱头有活性，反之则无[11]。
1.5 花粉胚珠比计算
随机选取不同植株的20朵即将开放的花蕾，记录每朵花的雄蕊数。随机选取1个花药，用解剖针将花药捣碎，蒸馏水定容至1 mL，吸取1 µL液体在光学显微镜下统计花粉数量；每朵花选取3个花药，重复3次，取平均数乘雄蕊数再乘1 000得出单花花粉量。解剖相对应的子房，统计胚珠数[12]。根据CRUDEN[13]标准，计算花粉胚珠比(单花花粉总数/单花胚珠数，P/O)；并由此判断长柱紫茎繁育系统类型。
1.6 杂交指数估算
按照DAFNI[14]标准，通过杂交指数(OCI)评判繁育系统类型。用游标卡尺测定花冠直径；观察记录花药开裂时间与柱头可授期，雌雄蕊是否同时成熟；记录花药与柱头之间的相对空间关系。
1.7 访花昆虫观察
随机选择5株长柱紫茎，于晴天9:00—17:00连续观察访花昆虫。每株长柱紫茎选择10朵花，每2 h观察1次，每天观察5次，记录访花昆虫的种类和访花时间[15]。
2. 结果与分析
2.1 开花动态及花部形态特征
2.1.1 开花动态
长柱紫茎居群花期为5月初至5月中下旬，约17 d (2021年5月1—17日)，单花花期2 d。5月1日该居群的第1朵花开放，5月8日单日开花最多，占总开花数的15%，达到盛花期，5月13日进入末花期。
长柱紫茎单花开放过程分为花蕾期(苞片、萼片包裹花蕾)、初展期(花药、柱头显露)、盛放期(花瓣平展)、凋落期(花瓣枯萎)及坐果期(子房膨大结实) 5个过程(图1)。具体的，①花蕾期(图1A和B)，苞片、萼片呈绿色，紧紧包裹花蕾。临近开放时，绿色的苞片和萼片从基部向边缘转为紫红色，同时向外伸展，逐渐显现出花苞。花苞顶部受光影响，呈现红斑。②初展期(图1C)，单花花瓣展开，花药和柱头显露，弯曲的花丝慢慢伸展高出柱头。③盛放期(图1D)，花瓣完全平展，雄蕊高于柱头伸展，柱头反向弯曲，呈5裂。④凋落期(图1E和F)，花瓣枯萎、脱落，开放24~32 h后，花药逐渐由橘黄色变为淡棕色，花冠极易掉落，柱头萎蔫，萼片和苞片逐渐收缩，花朵直径变小。⑤坐果期(图1G和H)，子房膨大，萼片和苞片再逐渐展开，由红色转为绿色，果实由绿色转为棕色，逐渐木质化。
2.1.2 花部形态特征
长柱紫茎的平均单花直径为(50.2±11.7) mm (表1)，花瓣5枚，白色，边缘裂状，有1~3枚花瓣带红斑(图1K)；每花具1对叶状苞片(图1J-1)，披针叶形，开花时基部由绿色转为紫红色；萼片5枚(图1J-2)；雄蕊50~84枚，长17~19 mm，花丝黄色呈线形，基部连合成短管，花丝的连合处不及花丝长度的1/3(图1J-4)，花药橘黄色，干后变为淡棕色；雌蕊1枚，长14~16 mm，柱头呈5裂(图1J-5)，花朵盛开时花丝高于柱头；子房5室，每室4枚胚珠，稀2~3枚，中轴胎座。
表 1 长柱紫茎的花部形态特征Table 1 Flower characteristics of S. rostrata花器官 平均值±标准误 花器官 平均值±标准误 花器官 平均值±标准误 花梗长/mm 5.2±1.4 萼片宽/mm 8.8±2.2 带斑的花瓣宽/mm 19.6±2.9 花冠直径/mm 50.2±11.7 花瓣数/枚 5±0 雄蕊数/枚 64.9±11.8 苞片数/片 2±0 花瓣长/mm 28.5±3.7 雄蕊长/mm 17.5±1.5 苞片长/mm 15.5±4.2 花瓣宽/mm 20.0±3.1 胚珠数/枚 18.6±2.4 苞片宽/mm 9.4±2.4 花斑长/mm 8.9±2.8 雌蕊长度/mm 14.2±1.1 萼片数/枚 5±0 花斑宽/mm 8.2±2.7 子房直径/mm 5.0±0.7 萼片长/mm 15.2±3.3 带斑的花瓣长/mm 20.2±5.7 子房长/mm 3.7±0.5 2.2 花粉活力测定
2.2.1 花粉离体培养的适宜蔗糖质量浓度
在无蔗糖培养基下，长柱紫茎花粉萌发率仅为13.7%；随着培养基蔗糖质量浓度的增加，花粉萌发率增大，在15 g·L−１出现峰值，为69.3%。当蔗糖质量浓度为20 g·L−１时，花粉萌发率降至33.3%。因此，15 g·L−１的蔗糖培养基为最适培养基(图2)。
图 2 不同蔗糖质量浓度对长柱紫茎花粉活力的 影响Figure 2 Effects of different sucrose concentrations on pollen viability2.2.2 不同方法测定花粉活力
采用I2-KI染色，活力较强的花粉会呈现蓝黑色，但在操作时，易混入杂质，视野中观察到的蓝黑色不够明显，不利于计数。采用TTC染色，有活力的花粉会呈现红色；但观察到大部分花粉未变红，说明TTC染色不利于测定长柱紫茎的花粉活力。因此，TTC染色法和I2-KI染色法均不适合长柱紫茎花粉活力的测定。实际研究中，与TTC染色法和I2-KI染色法相比，花粉离体培养下，花粉会萌发较长的花粉管，更有利于观察。
2.2.3 不同开放时间花粉萌发率
采用15ｇ·L−１的蔗糖培养基培养花粉，由图3可知：开放前1 d，花粉萌发率较高，为49.3%，开花当天花粉活力最高，为65.0%。之后花粉活力逐渐下降，到第3天，已降至11.7%。
图 3 不同时间下长柱紫茎花粉活力Figure 3 Pollen germination rate of S. rostrata tested in different time2.3 柱头可授性
由图4可知：开放前1 d长柱紫茎花药尚未开裂，柱头合拢，呈白色，可授性弱。开放1~2 d，柱头逐渐张开，具有较强可授性，之后可授性逐渐增强。到第3天柱头开始萎蔫，由白色转变为棕黄色，可授性强。在开放的第4天，柱头完全展开，向外反卷呈5裂，呈棕黄色、萎蔫皱巴的状态，此时花粉活性最强。之后，柱头可授性逐渐下降，到第7天，柱头基本失去可授性。
图 4 长柱紫茎开花过程中柱头可授性Figure 4 Changes in stigma receptivity of S. rostrata during flowering process2.4 花粉胚珠比
根据统计结果，长柱紫茎花粉数为(1 618 666.7±254 775.4)粒，胚珠数为(18.6±2.4)枚，花粉/胚珠比(P/O)为2 108.0~195 525.0，平均为87 025.1。依照CRUDEN的标准，判断长柱紫茎的繁育系统属于专性异交。
2.5 杂交指数测算
依照DAFNI的评判标准，测算长柱紫茎的杂交指数。长柱紫茎成熟花朵的花冠直径平均为50.24 mm，大于6 mm，记为3。雌雄蕊在成熟时间上一致，记为0；在花蕾期，长柱紫茎的柱头高于雄蕊，当花朵完全盛开时，雄蕊高于雌蕊，柱头和花药存在空间分离，记为1。因此，OCI结果为4，说明长柱紫茎的繁育类型属于以异交为主，需要传粉者，部分自交亲和。
2.6 访花昆虫观察
长柱紫茎上观察到的访花昆虫有熊蜂Bombus sp.、中华蜜蜂Apis cerana、黑带食蚜蝇Episyrphus balteatus、叶甲Chrysomelidae和日本弓背蚁Camponotus japonicus等，有效传粉者主要为熊蜂，其他种类出现频率低或进行无效传粉(图5)。长柱紫茎的开花高峰为7:00—11:00，昆虫的访花时间也集中在这段时间。黑带食蚜蝇在同一朵花上同一部位停留超过20 s，舔食花蜜，但数量较少，传粉作用不佳(图5A)。熊蜂单次访花时间为2~5 s，访花频率很高，在较短时间内频繁地在多朵花间逗留。访花时喜欢头部向下，整个身体钻入花冠筒，身上的绒毛黏附花粉量大，与柱头接触面积大，可有效传粉(图5B)。中华蜜蜂与熊蜂行为相似，但出现频率不及熊蜂，且体积小，能够黏附到的花粉少(图5C)。叶甲外壳光滑，花粉难以黏附。偶见1只在花冠上停留较长时间，与柱头未进行有效接触，传粉贡献小(图5D)。日本弓背蚁的足部和腹部会黏附花粉，徘徊逗留，偶尔实现有效传粉(图5E)。
3. 讨论
3.1 花部特征与传粉适应性
花部特征包含花部构成(结构、颜色、气味等)和开放式样(开花数目、大小及类型等)，因此可以从花部特征、开放式样解析植物与传粉者的生态依存关系。植物为了与传粉者的行为习惯相适应而使其花部形态结构、颜色等逐步进化[16]。对于蜂类，白色和黄色是可见花色。长柱紫茎花冠白色，平均直径达(50.2±11.7) mm，花丝黄色，颜色耀眼，同时平展的花冠为传粉昆虫提供停靠点，符合蜂媒花特征，此类花部特征与四川牡丹Paeonia decomposita一致[17]。同一物种内不同个体或居群间花色差异即花色多态性，传粉者的偏好因为花色差异造成访花频率的差异[18]。长柱紫茎的白色花瓣上常出现红色，推测是为适应单一的传粉媒介而进化出的特征，以便增加对其他类昆虫的吸引力，从而提高传粉效率[19]。
在强大的选择压力下，很多植物形成了“大量、集中开放”的开花模式，有利于吸引访花昆虫在短时间大量、密集表达访花行为，从而增加传粉机会[20]。长柱紫茎花期为5—6月，属于浙江的梅雨季节，阴雨天气极大地减少了传粉昆虫的活动。长柱紫茎集中开花，持续开花时间短，日均开花数量多，有利于提高繁殖成功率。此开花式样呈现的特征与山茶科Theaceae濒危植物金花茶Camellia nitidissima的研究结果一致[21]。长柱紫茎的有效传粉者主要为熊蜂，在阴雨天气熊蜂频繁地在同一植株上访花，且开花植株又少，原生境植株间相距较远，不利于花粉在植株间传播，结果增加同株异花授粉的可能性，降低接受花粉的质量，从而影响长柱紫茎的结实率。
3.2 繁育系统
参照CRUDEN[13]所述标准，长柱紫茎的繁育系统为专性异交。长柱紫茎P/O极高，达87 025.1，意味着长柱紫茎更加趋向于远交；但根据DAFNI[14]的标准，长柱紫茎OCI为4，判断其繁育系统为异交为主，部分自交亲和，需要传粉者。长柱紫茎开花后雄蕊逐渐伸长，最后花药高于柱头，且花蕾期有花药散粉现象，因此长柱紫茎的花部特征增加了自花授粉的可能性。在自然界中，绝大部分被子植物倾向于自交与异交结合的混合交配模式，只有极少数利用单一交配模式完成授粉[22]。综合得出：长柱紫茎的繁育系统属于倾向于异交的混合交配系统，当其异株(异花)授粉受阻时，可表现为自交亲和，自交是长柱紫茎适应长期阴雨环境的繁殖保障策略，此种混合交配系统与流苏树Chionanthus retusus相似[23]。
有效的传粉过程包含大量有活力的花粉、可授期的柱头及有效传粉媒介[24]三大要素。长柱紫茎平均雄蕊数为(64.9±11.8)枚，单花平均花粉量多达(1 618 666.7±254 775.4)粒，为传粉昆虫提供丰厚的报酬，且花粉黏附力强，易被传粉昆虫携带，为异交授粉提供了充足的物质保障，故花粉数量不是其繁殖受限的原因。柱头可授期长，达7 d，在第3和第4天达到最强活力，为实施人工授粉的最佳时期。柱头5裂增加传粉表面积和柱头可授期长为异花授粉提供了基本保障，有利于提高传粉效率和结实率，此现象与陈雄伟等[25]观测紫背天葵Begonia fimbristipula的结果一致。当天开花的花朵保持最强活力(65.0%)，随着开花时间增加，花粉活力显著下降，到第2天仅38.3%，第3天降至11.7%。观察发现长柱紫茎大多数花朵寿命很短，开花损失率高，花粉强活力和较强柱头可授性仅1 d的相遇期，严重影响花朵的传粉效率。无论授粉与否，长柱紫茎在开花24~32 h后，花冠和雄蕊都存在易脱落的现象，脱落后花粉迅速失活，大大减少了受精的可能性[26]。推测已授粉花朵脱落可能与营养资源限制有关，减少繁殖成本[27]；未授粉花朵可能通过短寿命减小花展示程度，从而减少同株异花传粉的概率[28]。
P/O是衡量植物对雄性资源分配量的指标[29]，高P/O值可能是对传粉效率低造成柱头接受的花粉量少、质量低的补偿[30]，多样化的传粉媒介有利于提高授粉成功率。长柱紫茎授粉受限可能与传粉者的种类、数量有关。长柱紫茎的主要传粉昆虫熊蜂，飞行距离远，访花频率高，多朵花之间穿梭，携带花粉量大，有效地进行异花传粉，但其他昆虫传粉效率较低，有效传粉媒介单一。长柱紫茎花粉离开花朵后迅速失活，不利于传粉昆虫远距离完成植株之间的传粉，因此居群间的基因不能充分交流[31]。
4. 结论
综上所述，长柱紫茎花冠白色和花丝黄色，与蜂类传粉特性相适应，为典型蜂媒花；传粉受阴雨天气影响，集中开花模式是对恶劣天气的有效适应，但传粉昆虫单一。开花24~32 h，花冠和雄蕊都极易脱落从而导致花粉迅速失活。以上因素限制了长柱紫茎的繁殖。集中开花模式、花粉量大、柱头5裂及可授期长等花部特征是长柱紫茎维持繁殖成功的基本保障。长柱紫茎繁育系统属于以异交为主，需要传粉者，当其授粉受阻时，可表现为自交亲和，自交是长柱紫茎适应长期阴雨天气的繁殖策略。
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图 1 机械损伤对冷蒿叶片非结构性碳质量分数的影响
Figure 1 Effects of mechanical damage on non-structural carbohydrate content in leaves of Artemisia figida
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2016.04.011
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