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CONSTANS（CO）基因是植物响应光周期调控的重要基因，位于生物钟的输出途径上，能正调控下游开花基因SOC1和FT，进而调控植物开花。PUTTERILL等[1]首先在拟南芥Arabidopsis thaliana中分离出CO基因，反转录PCR（RT-PCR）检测到CO基因在根和叶中表达。ONOUCHI等[2]对花椰菜Brassica oleracea花叶病毒35S（Cauliflower mosaic virus 35S, CaMV 35S）融合CO（35S::CO）转化拟南芥研究发现，CO蛋白会诱导早花和丧失光周期敏感性。进一步研究发现[3]，CO在染色体上的位置介于生物节律钟基因和下游开花基因之间，可将光信号转变为开花信号。对拟南芥CO基因过表达研究[1]发现，CO基因过表达的植株比野生型提前开花，表明CO蛋白的活性决定开花时间；但这种调控在不同成员间并不一致，过表达COL1和COL2对植株开花时间没有影响[4]，过表达COL9则导致开花延迟，但COL9缺失突变体在长日照下又表现为早花，说明COL9不但抑制CO基因表达调控开花时间，同时下调FT的表达水平从而延迟成花转变[5]。COL3在拟南芥光形态建成时起正调控作用，促进侧根生长和花色素苷积累，并调节长日照敏感植物的花芽分化[6]。从形态来看，CO基因常以多拷贝的形式存在，如拟南芥的CO家族有17个成员[7]，水稻Oryza sativa中有16个成员[8]，甘蓝型油菜Brassica napus中也克隆到4个CO同源基因[9]。但各CO家族成员的功能存在明显差异。葡萄Vitis vinifera的VvCOL1主要在芽休眠过程中起作用，表明该基因参与光周期，控制芽休眠的诱导和维持[10]。拟南芥中过表达衣藻Chlamydomonas reinhardtii的CrCO会表现出早花表型，结合衣藻的研究发现：CrCO对淀粉的合成和细胞分裂有调节功能，推测CO在高等植物中可能仍保持调节淀粉合成[11]。大麦Hordeum vulgare的HvCO1和Hd1基因与CO亲缘关系最近，可以通过激活HvFT1诱导大麦开花[8]，但在转基因拟南芥中则丢失该功能[12]。拟南芥co突变体过表达牵牛花Ipomoea nil的PnCO基因可促进植物开花[13]。黑麦草Lolium perenne的LpCO可以互补拟南芥co突变体的晚花表型[14]，甜菜Beta vulgaris的BvCO1可以修复拟南芥co-2突变体的晚花表型[15]。大豆Glycine max的GmCO9影响根的发育，与种子的成熟密切相关[16]。毛果杨Populus trichocarpa的PtCO促使植株提前开花，也可调控植株的生长和芽的分化[17]。本研究以14个已被测序的物种为试验材料，通过生物信息学手段，从外显子-内含子结构、基因重复、基因差异表达分析等3个方面开展CO家族研究，为探讨不同家族成员的潜在功能提供依据。
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从植物基因组数据Phytozome（http://www.phytozome.net）中下载其中13个物种的全基因组序列、蛋白质及对应编码序列（coding sequence, CDS），分别为藻类植物1种，苔藓植物1种，蕨类植物1种，被子植物9种（长日照植物、短日照植物和日中性植物各3种），以无油樟Amborella trichopoda作为被子植物的对照。此外裸子植物1种（挪威云杉Picea abies），其相应序列来源于http://congenie.org。
数据查找步骤：①从PFAM蛋白质数据库获得CO结构域的隐马尔可夫模型（PF06203和PF00643）并作为查询序列，得到的数据储存于Windows平台环境下构建的各个物种全基因组氨基酸序列的本地数据库中。②利用HMMER软件包的hmmsearch程序，默认参数条件下在本地数据库进行BLASTP搜索，筛选出符合E-value≤0.01的蛋白质序列作为CO候选同源蛋白。③将备选CO基因的CDS序列通过BLASTN的比对，在全基因组核酸序列中搜索，获得CO在染色体上准确定位信息。④在PFAM蛋白质数据库和SMART蛋白质数据库下对搜索得到的所有同源候选基因蛋白质序列进行鉴定，剔除不含CO（PF06203和PF00643）结构域的氨基酸序列。以此完成各个物种CO家族所有成员的鉴定。
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利用MUSCLE的默认参数进行蛋白质多序列比对分析；使用MEGA 7.0对完成比对的蛋白质序列构建系统进化树；构建方法选用邻近法（NJ）；距离模型采用泊松矫正；空位缺失数据的处理采用两两删除；系统发育统计的可靠性检测采用bootstrap分析，使用1 000次重复。
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利用在线软件GSDS（Gene Structure Display Server）比较CO家族成员的CDS序列和基因序列，分析CO家族基因的外显子-内含子组成和分布，结合系统发育分析，探究CO在基因结构上的进化规律。
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利用植物基因组PGDD数据库（http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/）搜索染色体上的共线性片段，分析含有的CO基因的共线性区段，研究CO家族不同成员的相互联系和进化过程。
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搜索14个物种的国际核酸序列数据库（NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），发现水稻关于繁殖发育的转录组数据最为完整。利用GEO数据库（GSE56463）下载水稻8个不同时期不同部位（花芽、花、开花前的旗叶、开花后的旗叶、开花前的根、开花后的根、未成熟种子、成熟种子）的植物组织转录组数据（RNA-seq）。转录组数据全部采用FPKM标准化后的值。以水稻为例，从转录水平重点分析CO家族不同成员在花发育和种子形成过程中的表达变化，从而探讨它们可能的生物学功能。
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搜索14个物种蛋白质数据库中的CO家族成员，共鉴定出159个含有CO结构域的蛋白质序列。结果表明：CO常以多拷贝的形式存在于植物中，与以往的研究一致[8]。拷贝数最多的物种是大豆，鉴定出25个家族成员。其次在胡萝卜Daucus carota，小立碗藓Physcomitrella patens，菜豆Phaseolus vulgaris，番茄Solanum lycopersicum，黄瓜Cucumis sativus和蓖麻Ricinus communis中，分别鉴定到18，15，13，13，12和10个拷贝。在小麦，无油樟和卷柏Selaginella moellendorffii中，也发现了5，5和4个CO基因家族成员。挪威云杉和衣藻中拷贝数最少，各存在3个成员。
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使用邻近法对得到的14个物种159个CO蛋白序列构建系统发育进化树。由生成的无根系统进化树（图 1）可知，植物CO家族在进化中具有多样性，大部分同一谱系的物种基因都能聚类在同一进化枝上。根据结构域特征，选取支持度高且结构稳定的3个亚家族（分别命名为B1，B2和B3）作为后续研究CO基因的基础框架。其中B1亚家族含2个B-box结构域和1个CCT结构域；B2亚家族含1个B-box结构域，1个CCT结构域和1个锌指结构；B3亚家族含1个B-box结构域和1个CCT结构域。
图 1 CO家族成员的系统发育树
Figure 1. Phylogenetic tree of CO family members
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CO家族成员的预测结构（图 2）显示，多数物种的CO基因中存在2~4个外显子，同一亚家族内基因的外显子-内含子结构和长度高度相似，说明这些物种的CO基因家族成员之间的亲缘关系也较近，同时也证实了CO基因家族系统进化树的可信度。具体而言，B1亚家族中的大多数基因含2个外显子，1个内含子；B2亚家族中则表现为每个CO基因含4个外显子和3个内含子，且排列相位表现出“0，0，2”规律；B3亚家族相对较为复杂，多数的CO基因含有2个外显子，部分含有4个外显子，但也有例外，如CrCO3基因，不仅长度较大，还发现存在14个外显子和13个内含子，体现在系统进化树中则出现CrCO3分化为独立的进化枝。研究还发现，CO基因包含大量的相位为0的内含子，表明外显子改组可能在CO基因的进化中起着一定的作用，而外显子的插入和内含子的删除可以认为是形成多元化的CO基因以及功能差异的CO蛋白的原因之一。
图 2 B1，B2和B3亚家族CO基因外显子和内含子分布
Figure 2. Exon-intron structures of CO genes in B1, B2 and B3 subfamily
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对拟南芥、菜豆、蓖麻3种植物CO家族的基因复制事件的研究可以用来检测CO基因家族中遗传差异间的联系和相应的扩张模式，CO家族的成员可作为锚定基因研究所在染色体区段的分子进化历史。染色体定位分析（图 3，图 4）表明，绝大多数的CO基因在基因组中是随机分布的，仅在少数位点形成串联的基因簇，因此大规模的基因复制事件可能在CO基因家族的进化过程中扮演着重要的角色。共线性分析发现，拟南芥、菜豆和蓖麻的染色体区域间存在强烈且保守的共线性。由图 3和图 4可知：拟南芥CO家族所在的共线性区域最多有22对基因；菜豆和蓖麻内部也存在广泛的共线性情况，例如PvCO5-PvCO7，RcCO5-RcCO10；此外，拟南芥与菜豆和蓖麻之间的共线性情况也非常普遍，例如AtCOL3-RcCO1，AtCOL3-PvCO1，PvCO7-RcCO4。根据这些基因的共线性分析结果可推测，CO家族中重复基因的扩张与基因组重复有着密切的联系。
图 3 物种内CO家族成员的共线性分析
Figure 3. Synteny analysis of CO family genes in species
图 4 物种之间CO家族基因共线性分析
Figure 4. Synteny analysis of CO family genes among species
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基因表达的差异性反映了基因的功能分化。水稻转录组表达谱显示（图 5），CO基因在花芽、花、根、旗叶和种子中都有表达，以OsCO3，OsCO6，OsCO7，OsCO8，OsCO9，OsCO11，OsCO12和OsCO16这8个基因的表达量较高，尤其是在开花后的根和开花前后的旗叶中的表达量更为明显。具体来看，OsCO3和OsCO6基因在花芽到花的转变过程、开花前后的根和旗叶中的表达量升高，在根中的表达量升高，在乳粒（未成熟的种子）到成熟种子的过程中表达量下降，说明OsCO3和OsCO6基因负向调控花芽到花的转变过程。OsCO8在花芽到花的转变过程、开花前后的根、开花前后的旗叶和乳粒到成熟种子的过程中表达量都呈现上升趋势，说明OsCO8对花的发育以及果实成熟有重要的调控作用。OsCO12在花芽到花的转变过程、开花前后的根和乳粒到成熟种子的过程中表达量上升，在开花前后的旗叶中的表达量下降，说明OsCO12对水稻花的发育起着最为关键的调控作用。OsCO7，OsCO9和OsCO11基因在花芽到花的转变过程、开花前后的旗叶和乳粒到成熟种子的过程中表达量下降，在开花前后的根中的表达量明显上升，说明OsCO7，OsCO9和OsCO11基因可以正向调控花芽到花的转变过程。OsCO16在花芽到花的转变过程中表达量下降，在开花前后的根和旗叶、乳粒到成熟种子的过程中表达量上升，说明OsCO16对花的发育和果实成熟有重要的调控作用。水稻中不同CO基因在不同时期不同组织器官中的表达量不同，表明同一家族不同基因之间存在功能上的差异。
图 5 水稻CO基因的表达谱
Figure 5. Expression profile of CO gene in rice
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CO基因是植物光周期途径中调控开花时间的重要基因。光周期途径中，PHYA，CRY1和CRY2基因相互作用，影响GI等生物节律钟基因，促进CO基因的表达；CO编码转录因子作用于FT[18]，使FT从维管束组织转移到茎顶端分生组织，致使花器官发育[19]。通过对14个物种的CO基因的分析，本研究发现：CO基因常以多拷贝的形式存在于植物中，与已有研究结果一致[20]；亲缘关系较近的物种，其CO基因的相似性较高；CO基因在裸子植物和被子植物、双子叶植物与单子叶植物、不同科和不同属植物之间都存在明显分化，表明CO基因在植物进化中既相对保守又不断进化，其进化过程与整个物种进化过程相对同步，说明CO基因可能对植物进化起到了重要作用。研究发现：单子叶植物发生过2次基因组重复[21]，一半的水稻基因组基因来源于基因组重复[22]。对水稻的基因表达分析发现：CO基因在花、叶、根和茎中都有表达，OsCO3的表达量在花芽到花的转变过程中上升，推测OsCO3负调控花芽到花的转变过程，与KIM等[23]发现的OsCO3通过负调控Hd3a和FT-like（FTL）的表达延迟短日照下水稻开花的结果一致；OsCO7基因在花芽到花的转变过程中表达量下降，说明OsCO7正调控Hd3a的表达，促进短日照下水稻的开花，与XUE等[24]研究结果一致。在短日照条件下，水稻的Hd1抑制Hd3a的转录从而控制开花转型[25]，这一结果和拟南芥CO基因在短日照条件下促进FT的表达控制开花转型相反，说明CO基因对于花芽到花的发育起到重要调控作用，进一步证实了水稻不同CO基因在功能上存在差异。本研究结果有助于更加深入地了解CO基因家族成员的潜在功能，为CO基因在光周期途径中调控成花发育过程提供理论依据。
Evolution of the flowering time gene CONSTANS in a photoperiod pathway
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摘要: CONSTANS（CO）是植物响应光周期调节的重要基因和监测日照长度的重要元件，可将光信号和生物钟信号转变为开花信号，激活下游基因（FT）的表达，从而诱导植物开花。选取14个已被测序的物种，采用生物信息学手段，从外显子-内含子结构、基因重复、基因差异表达等方面开展CO基因家族研究。结果表明：14个物种共鉴定到159个CO家族成员，CO基因常以多拷贝的形式存在，多数含2~4个外显子，在进化过程中表现出多样性。CO家族重复基因的扩张与基因组重复相关。CO在水稻Oryza sativa根、旗叶、花和种子中均有表达，花芽到花的转变过程中OsCO3的表达量上升，而OsCO7下降，说明水稻CO家族成员之间存在功能差异。Abstract: CONSTANS(CO), an essential element for monitoring the duration of a day and an important gene responding to photoperiod regulation, can transform light and biological clock signals into flowering signals, as well as activate the expression of downstream genes (FT), which induces plant flowering. However, their evolutionary history and patterns have not been examined systematically. In this study, a total of 14 species, whose whole-genomes have been sequenced, were selected. Then, via the analyses of bioinformatics, the CO family was studied in regards to exon-intron structure, gene duplication, and differential expression. Results showed 159 members in the CO family. For each plant species, the CO family existed in the form of multiple copies. Almost every copy contained 2 to 4 exons indicating diversity in the evolution process. The synteny analysis showed that expansion of duplicate genes in the CO family was related to genome duplication. In addition, the gene differential expression analysis showed that CO members were expressed in roots, flag leaves, flowers, and seeds of rice (Oryza sativa). Especially, OsCO3 was up-regulated in the process of floral development; whereas, the expression of OsCO7 was down-regulated. This suggested that members of the CO gene family played different roles in rice.
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Key words:
- botany /
- CO /
- CO family /
- phylogenetic /
- synteny analysis /
- gene duplication
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木材构造特征是木材识别的主要依据[1], 包括宏观构造、微观构造和超微构造, 对木材化学、物理性质有重大影响, 也是木材分类的主要依据, 因此国内外木材研究学者对木材构造特征进行了广泛的研究, 如1992年出版的《中国木材志》收录了528种代表树种的木材构造特征。此后, 又对《中国木材志》未涉及到的部分树种的木材构造特征进行研究[2-3]。挥发性有机物成分是指植物通过次生代谢所产生的产物[4], 与植物对环境的适应能力[5]及其抵抗不利条件[6]密切相关, 其药用和生态价值极高。如萜类化合物[7-8]通常具有调节神经系统、镇静大脑、抗菌消炎和净化空气等作用。吴楚材等[9]从植物体中采集挥发性气体进行化学成分研究。近年来随着气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术的发展, 对木材挥发物的研究逐渐增多, 如孙继平等[10]探讨了2种肤小蠹Phloeosinus对几种针叶树挥发物的行为反应; 徐磊等[11]分析了5种针叶树球果所含挥发性物质与丽江球果花蝇Strobilomyia lijiangensis危害关系; 李阳等[12]测定分析了4种樟科Lauraceae园林树种挥发性物质的有效成分及其杀菌能力。黑壳楠Lindera megaphylla为樟科山胡椒属Lindera多年生常绿乔木, 观赏性强, 抗逆性好, 分布范围广, 枝、果、叶所含芳香油具备杀菌、驱虫和净化空气等功效, 是一种集观赏、生态和药用于一体的优质园林树种[13-14]。中国民间用其抽提物抗肿瘤和愈合伤口, 用其根治风湿麻木、胃寒气滞, 用其树皮治疗咽喉肿痛、湿疹瘙痒、外伤出血等[15]。卞京军等[16]研究了黑壳楠树叶精油的有机物成分, 分离鉴定出有机物成分87种。国外日本学者从黑壳楠的根中提取出d-荷苞牡丹碱(d-dicentrine), 发现它具有抗肿瘤作用[17], 同时还从花和花梗中分离出6个阿朴菲型生物碱[18]和1个新异喹啉生物碱[19]。未检索到国内外关于其木质部挥发性有机物成分的研究报道。另外, 木材构造特征作为区分黑壳楠木材与其他木材的重要理论依据, 也未见报道。因此本研究拟通过研究黑壳楠木材的构造特征, 以期为区分黑壳楠与其他木材提供重要的理论依据, 并采用GC-MS技术分析黑壳楠木材挥发性有机物成分的主要组分, 为科学评定和深层次开发利用黑壳楠资源提供科学依据。
1. 材料及方法
1.1 材料
所选黑壳楠活立木树龄约100 a, 胸径为1.79 m, 直径为0.54 m, 取样处离地高度1.3 m, 沿树干东、西、南、北4个方向用树木生长锥(长500 mm, 直径5.15 mm)钻取4根木芯样(钻取至树干髓心), 用密封袋密封处理(标记东、南、西、北方向)后, 带回实验室。取样点位于四川省雅安市云峰寺后山, 海拔为1 024.2 m, 29°76′N, 102°87′E; 东邻成都平原, 西接青藏高原, 地处高原东南麓陡峭坡地边缘; 气候类型是以亚热带季风气候为基带的山地气候, 气候温和, 雨量充沛; 1961-2010年雅安市年平均气温为16.2 ℃, 年平均降水量为1 270.9 mm[20]。
1.2 实验方法
1.2.1 木材构造特征研究方法
取南、北向木芯样, 砂纸打磨后, 分别在肉眼、放大镜和手持显微镜下观察黑壳楠木芯样生长轮、管孔、轴向薄壁组织、木射线、纹理、构造等宏观特征。标记南、北向木芯样的生长轮, 以每20轮龄为梯度截断木芯样, 取经过编号的5支试管, 分别盛少量蒸馏水, 加入5段截断后的木芯样, 置入水浴锅内蒸煮至木材软化, 软化后的木材用TU-231大型滑走式切片机切片, 参照《木材鉴别方法通则》[21]制片, 风干后放在OLYMPUS BX51光学显微镜下观察其微观构造并拍摄照片; 用冰醋酸-过氧化氢法进行离析, 并制备临时性试片, 在显微镜下拍摄图片, 利用计算机图像测量分析系统测量木材的构造特征参数和组织比量, 并利用JSM-6490LV扫描电子显微镜观察黑壳楠木材超微观构造特征, 补充完善其微观构造特征。
1.2.2 挥发性有机物成分研究方法
取黑壳楠东、西向木芯样, 粉碎, 取≤30目的样品(4.0 ± 0.1) g置于萃取瓶中, 将固相微萃取手柄插入瓶中, 伸出萃取头, 在85 ℃下(能够最大限度检测其挥发性有机物成分化学成分的最佳温度)保温40 min; 退回萃取头, 拔出SPME手柄, 得其挥发性有机物成分样品。解析时间为3 min。将挥发性有机物成分经过GC-MS分析后, 把分离化合物质谱数据经计算机检索与质谱库相匹配, 并以人工解析为辅, 利用色谱峰面积归一化法计算各化学成分的相对百分含量。①色谱条件:HP-INNOWax毛细管色谱柱(柱长30 m, 内径0.25 mm, 膜厚0.25 um); 进样量为1 μL, 分流比50:1;进样口温度为250 ℃; 载气为高纯氦气; 柱温箱升温程序:120 ℃保持3 min, 以5 ℃·min-1速率升温到140 ℃保持4 min, 以2 ℃·min-1速率升温到160 ℃保持10 min; 流速:1 mL·min-1[22]。②质谱条件:离子源为EI, 电离能70 eV, 辅助加热区为280 ℃, 离子源230 ℃, 四级杆150 ℃, 采集模式为全扫描, 质量扫描范围50~550, 溶剂延迟3 min[22]。
2. 结果与分析
2.1 宏观构造特征
黑壳楠树皮灰褐色至灰黑色, 木材呈黄白色或浅灰绿色, 心边材区分不明显; 木材表面有较弱光泽; 气微香, 味略辛; 木材纹理直至斜, 木材构造细腻且均匀; 生长轮不明显至略明显; 心材轮间细线颜色较边材轮间细线颜色深; 散生; 宽度较均匀, 3~8轮·cm-1; 横切面上管孔肉眼下略可见, 放大镜下明晰, 大小略一致, 分布均匀, 散生; 管孔内少见侵填体; 轴向薄壁组织放大镜下可见, 稀疏傍管状; 横切面上木射线在肉眼下可见至不可见, 在放大镜下明显, 比管孔小。在放大镜下弦切面木射线明显, 径切面上射线斑纹明显。波痕及胞间道缺如。
2.2 微观构造特征及其组织比量
如图 1所示:导管横切面为圆形或卵圆形, 部分略具多角形轮廓; 管孔数少[23], 9~13个·mm-2, 平均为11个·mm-2; 管孔组合以单管孔和短径列(2~3个)复管孔为主, 偶见短弦列(2个)复管孔和管孔团; 散孔材; 管孔中[23], 最大弦径≥150 μm, 多数为90~110 μm, 平均为102 μm; 导管分子长255~596 μm, 平均446 μm, 导管长度属于中级别[23]; 导管细胞壁厚, 为7.5 μm; 导管细胞端部的穿孔类型为单穿孔, 穿孔板水平至略倾斜; 相邻导管间细胞壁上纹孔的排列形式为互列纹孔; 导管-射线间纹孔式为同管间纹孔式和大圆形; 纹孔口内含, 卵圆形及圆形; 轴向薄壁组织量少, 傍管形稀疏状为主, 可见环管状; 边材侵填体少见, 心材侵填体较边材多; 横切面上木纤维细胞壁较薄, 壁厚为3.7 μm, 直径多为20~26 μm, 平均23 μm, 长740~1 450 μm, 平均1 110 μm, 与邓恩桉Eucalyptus dunni木材纤维[24]同属中等木纤维[23]; 形状大多呈扁圆形、多角形; 弦向腔径略大于径向; 细胞沿径向排列整齐有序, 弦向上呈交错排列, 较松散; 木射线非叠生, 稀少[23], 5 mm内25~32条, 平均28条; 单列射线极少, 宽15~25 μm, 高36~312 μm(2~7个细胞); 多列射线宽度细至中[23], 宽32~68 μm(2~3个细胞), 高136~864 μm(3~31个细胞); 同一射线内间或出现2次多列部分; 射线组织异型Ⅲ型和Ⅱ型; 油细胞未见; 树胶及晶体未见; 螺纹加厚缺如; 胞间道缺如。
组织比量是衡量木材材性的重要参数, 与木材物理性质、力学性质和化学性质都有着密切的关系[24]。黑壳楠木纤维的组织比量为52.7%, 占整个组织的1/2以上; 木射线的组织比量为24.6%;导管的组织比量为13.2%;轴向薄壁组织的组织比量为9.5%。
2.3 微观形貌与成分分析
由图 2可知:导管上的纹孔为互列纹孔, 射线与导管间纹孔式为同管间纹孔式和大圆形; 木射线细胞中可见球状物和块状物(图 2C), 通过能量色散分析仪(EDS)分析, 块状物的主要成分有钙、碳、氧, 球状物的主要成分为碳、氧(表 1), 初步预测木射线块状物可能是含钙有机物形成的结晶体, 木射线中球状物可能并非无机盐类, 而是树胶类物质, SCURFIELD等[25]将此类物质认定为淀粉颗粒。
表 1 木射线中块状物和球状物成分分析Table 1. Block and globular material composition in wood ray元素 块状物 球状物 质量百分比/% 原子百分比/% 质量百分比/% 原子百分比/% 碳 16.61 32.55 57.26 64.09 氧 20.90 30.75 42.74 35.91 钙 62.49 36.70 2.4 挥发性有机物成分分析
通过GC-MS分析, 得到黑壳楠木材挥发性有机物成分总离子流图(图 3), 共分离出39个峰, 参照质谱的裂解规律, 将质谱数据经计算机检索与质谱库检索和分析, 并以人工解析为辅, 共鉴定出23种化合物(表 2), 占总化学成分的87.11 %, 主要为烃类化合物及其含氧衍生物。
图 3 黑壳楠木材有机挥发性成分总离子流图Figure 3. Total ion chromatogram(TIC) of volatile organic compounds in L.megaphylla wood表 2 黑壳楠木材挥发性有机物成分分析结果Table 2. Volatile organic compounds of Lindera megaphylla wood序号 t/min 化合物 分子式 分子量 相对含量/% 类别 1 8.97 α-荜澄茄油烯 .alpha.-cubebene C15H24 204 0.85 烯烃 alkenes * 2 9.33 δ-榄香烯 .delta.-elemene C15H24 204 0.36 烯烃 alkenes * 3 9.83 α-可巴烯 .alpha.-copaene C15H4 204 0.90 烯烃 alkenes * 4 10.49 (1s，7r)-1，4, 4, 7-四甲基-1，4, 5, 6, 7, 8-六氢-2(3h)-萘酮 (1s，7r)-1，4, 4, 7-tetramethyl-1, 4, 5, 6, 7, 8-hexahydro-2(3h)-naphtalenone C14H22O 206 3.74 酮 ketone 5 10.93 4, 7-二甲基-1-异丙基全氢萘 4, 7-dimethyl-1-isopropyl perhy-dronaphthalene C15H28 208 22.46 环院烃 cycloparaffin 6 11.45 α-柏木烯 .alpha.-cedrene C15H24 204 2.04 烯烃 alkenes * 7 12.44 3, 7愈创木二烯 3, 7-guaiadiene C15H24 204 20.11 烯烃 alkenes * 8 12.74 香树烯 1h-cycloprop [e] azulene, decahydro-1, 1, 7-trimethyl-4-methylene-, [1ar-(1aa, 4ab, 7b, 7ab, 7ba)]- C15H24 204 1.00 烯烃 alkenes * 9 14.21 α-紫穗槐烯 .alpha.-amorphene C15H24 204 5.89 烯烃 alkenes * 10 15.68 δ-荜澄茄烯 .delta.-cadinene C15H24 204 0.80 烯烃 alkenes * 11 16.06 芳-香姜黄烯 ar-curcumene C15H22 202 2.23 烯烃 alkenes * 12 17.37 1s, 顺去氢白菖烯 1s, cis-calamenene C15H22 202 12.05 烯烃 alkenes * 13 18.76 3-[(3e)-4, 8-二甲基-3, 7-壬二烯]呋喃3-[(3e)-4, 8-dimethylnona-3, 7-dienyl] furan C15H22O 218 0.84 呋喃 furan * 14 19.30 去二氢菖蒲烯 calacorene C15H20 200 1.38 烯烃 alkenes 15 20.32 α-二去氢菖蒲烯 .alpha.-calacorene C15H20 200 0.57 烯烃 alkenes 16 20.87 石竹烯环氧化物 caryophyllene oxide C15H24 220 0.88 氧化物 oxide * 17 23.58 异构吉马酮环氧化物 isogermacrone-epoxide C15H22O2 234 3.09 氧化物 oxide * 18 23.89 γ-按叶醇 .gamma. - eudesmol C15H26O 222 0.53 醇类 alcohols * 19 25.80 沉香螺旋醇 agaruspirol C15H26O 222 1.58 醇类 alcohols * 20 26.79 呋喃，3-甲基-2-[3-甲基-4-(4-甲基-2-呋喃基)-2-丁烯基]-，(e)-furan, 3-methyl-2- [3-methyl-4-(4-methyl-2-furanyl)-2-butenyl] -, (e)- C15H18O2 230 1.39 呋喃 furan * 21 27.04 愈创木奠1, 4-dimethyl-7 - (1 -methylethyl) -azulene C15H18 198 3.26 奠 azulene * 22 31.75 愈创蓝油烃 guaiazulene C15H18 198 0.83 奠 azulene * 23 34.67 亚油酸乙酷 ethyl linoleate C20H36O2 308 0.35 酯 ester 说明:*表示倍半萜化合物 黑壳楠木材挥发性有机物成分中相对含量超过1%的成分共有13种, 占总峰面积的80.22%, 其中相对含量最高的化合物为4, 7-二甲基-1-异丙基全氢萘(22.46%), 其次为3, 7-愈创木二烯(20.11%), 1s, 顺去氢白菖烯(12.05%), α-紫穗槐烯(5.89%), (1s, 7r)-1, 4, 4, 7-四甲基-1, 4, 5, 6, 7, 8-六氢-2(3H)-萘酮(3.74%), 愈创木薁(3.26%), 异构吉马酮环氧化物(3.09%), 芳-香姜黄烯(2.23%), α-柏木烯(2.04%), 沉香螺旋醇(1.58%), 呋喃, 3-甲基-2-[3-甲基-4-(4-甲基-2-呋喃基)-2-丁烯基]-, (E)-(1.39%), 去二氢菖蒲烯(1.38%)和(+)-香橙烯(1.00%)。由表 3可知:黑壳楠木材挥发性成分中相对含量最高的是烯烃类化合物(48.18%), 其化合物种类最多, 共12种。
表 3 黑壳楠木材挥发性有机物成分统计Table 3. Volatile organic compounds of L.megaphylla wood成分类别 数量/种 相对含量/% 烯烃类 12 48.18 环院烃 1 22.46 奠类 2 4.09 酮类 1 3.74 氧化物 2 3.62 呋喃类 2 2.23 醇类 2 2.11 酯类 1 0.35 黑壳楠木材挥发性有机物成分主要含萜类化合物, 有18种萜类化合物, 均为倍半萜化合物, 累计相对含量高达58.63%。其中烯类化合物10种, 累计相对含量高达46.23%;醇类化合物2种, 累计相对含量达2.11%;酮类化合物有1种, 累计相对含量高达3.09%;呋喃类化合物有2种, 累计相对含量达2.23%;薁类衍生物2种, 累计相对含量达4.09%;倍半萜含氧衍生物2种, 累计相对含量达3.97%。相对含量超过1%的倍半萜类成分10种, 累计相对含量为52.64%, 包括3, 7-愈创木二烯(20.11%), 1s, 顺去氢白菖烯(12.05%), α-紫穗槐烯(5.89%), 愈创木薁(3.26%), 异构吉马酮环氧化物(3.09%), 芳-香姜黄烯(2.23%), α-柏木烯(2.04%), 沉香螺旋醇(1.58%), 呋喃, 3-甲基-2-[3-甲基-4-(4-甲基-2-呋喃基)-2-丁烯基]-, (E)-(1.39%)和(+)-香橙烯(1.00%)。
3. 结论
黑壳楠木材构造特征为散孔材, 木射线及导管肉眼下可见; 木射线非叠生, 每5 mm内有25~32条, 平均28条; 单列射线极少, 宽15~25 μm, 高36~312 μm(2~7个细胞); 多列射线宽度细至中, 宽32~68 μm(2~3个细胞), 高136~864 μm(3~31个细胞); 同一射线内间或出现2次多列部分; 射线组织异型Ⅲ型和Ⅱ型。导管横切面为圆形或卵圆形, 部分略具多角形轮廓, 单位面积管孔数少, 管孔组合以单管孔和短径列(2~3个)复管孔为主, 偶见短弦列(2个)复管孔和管孔团, 最大弦径≥150 μm, 多数90~110 μm, 平均102 μm; 导管分子长255~596 μm, 平均446 μm; 横切面上木纤维细胞壁较薄, 壁厚为3.7 μm; 直径多为20~26 μm, 平均23 μm; 长740~1 450 μm, 平均1 110 μm; 轴向薄壁组织以傍管形稀疏状为主, 可见环管状; 导管细胞端部的穿孔类型为单穿孔, 穿孔板水平至倾斜; 相邻导管间细胞壁上纹孔的排列形式为互列纹孔, 导管-射线间纹孔式为同管间纹孔; 纹孔口内含, 卵圆形及圆形; 油细胞未见。木射线细胞中的球状物可能是含钙有机物形成的结晶体; 木射线中块状物可能并非无机盐类, 而是树胶类物质。黑壳楠木纤维的组织比量为52.7%, 占整个组织的1/2以上; 木射线的组织比量为24.6%;导管的组织比量为13.2%;轴向薄壁组织的组织比量为9.5%。黑壳楠木材的宏微观特征可作为区分于其他木种的理论依据之一。
黑壳楠木材挥发性有机物成分中鉴定出的23种化合物, 其相对含量之和占总化学成分的87.11%, 主要为烃类化合物及其含氧衍生物; 挥发性有机物成分中相对含量超过1%的成分共有13种, 占总峰面积的80.22%;挥发性有机物成分主含萜类化合物, 有18种萜类化合物, 均为倍半萜化合物, 累计相对含量高达58.63%。
从生源来看, 1s, 顺去氢白菖烯、去二氢菖蒲烯、α-二去氢菖蒲烯属菖蒲烷型来源于没药烷型倍半萜类; 3, 7-愈创木二烯、愈创木薁、愈创蓝油烃属愈创木烷型来源于吉马烷类的倍半萜。通常, 没药烷型倍半萜类衍生物具有显著抗乙肝病毒活性及抗肿瘤的功效[26]。研究表明:萜类化合物多有芳香气味, 通常具有提神、抗菌消炎和镇痛等作用, 具有多种生物活性, 是许多药物的有效成分, 可以治疗疾病, 如调节血糖浓度、降低血脂和血压; 杀虫、杀菌、活血化淤、消炎镇痛消肿、抗肿瘤、抗疟、抗人类免疫缺陷病毒(HIV); 强化免疫; 局部麻醉、止痒; 解热、祛痰、止咳等[27]。例如, 沉香螺旋醇具有镇静催眠作用[28]; 去氢白菖烯被认为是强效的抗菌和抗肿瘤剂[29]; 石竹烯环氧化物具有抗菌消炎和抗真菌等活性, 具有平喘作用, 乙酸己酯不仅能够镇痛抗炎, 还可以愉悦心情, 同时也是食用添加香料[30-31]; 榄香烯是一种广谱、高效的抗肿瘤药物, δ-榄香烯可诱导Hela细胞凋亡[32]; γ-桉叶醇是沉香的主要成分之一, 同时也是蜂胶的主要成分之一[33]; 《抗病毒中药学》提到荔枝核主治行气散结、散寒止痛, 水提物能完全抑制乙型肝炎病毒病毒的复制, 是乙型肝炎病毒复制的高效抑制剂, 其主要成分在黑壳楠木材挥发性有机物成分中有7种, 累计相对含量达22.13%。这表明黑壳楠木材有较高的医药利用价值。
愈创木薁为美国化妆品协会(CTFA)认可的化妆品助剂, 具有抗炎, 抗过敏的作用, 在防晒制品中用于预防或治疗阳光灼伤, 缓解其他物质对皮肤的刺激和过敏反应, 为常见的外用抗过敏剂[34]。α-荜澄茄油烯是目前香料工业的重要原料, 也是柏木精油的3种主要成分之一[35]。这表明黑壳楠木材作为芳香理疗产品具有极大的应用潜力。
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图 2 B1，B2和B3亚家族CO基因外显子和内含子分布
Figure 2 Exon-intron structures of CO genes in B1, B2 and B3 subfamily
图 3 物种内CO家族成员的共线性分析
图中红色连线对应的是CO家族基因，红色箭头为该基因ID；深蓝色箭头是共线区域非CO家族基因
Figure 3 Synteny analysis of CO family genes in species
图 4 物种之间CO家族基因共线性分析
红色连线对应CO基因位置。At为拟南芥, Pv为菜豆, Rc为蓖麻
Figure 4 Synteny analysis of CO family genes among species
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[1] PUTTERILL J, ROBSON F, LEE K, et al. The CONSTANS gene of Arabidopsis promotes flowering and encodes a protein showing similarities to zinc finger transcription factors[J]. Cell, 1995, 80(6):847-857. [2] ONOUCHI H, IGEÑO M I, PÉRILLEUX C, et al. Mutagenesis of plants overexpressing CONSTANS demonstrates novel interactions among Arabidopsis flowering-time genes[J]. Plant Cell, 2000, 12(6):885-900. [3] SUÁREZ-LÓPEZ P, WHEATLEY K, ROBSON F, et al. CONSTANS mediates between the circadian clock and the control of flowering in Arabidopsis[J]. Nature, 2001, 410(6832):1116-1120. [4] LEDGER S, STRAYER C, ASHTON F, et al. Analysis of the function of two circadian-regulated CONSTANS-LIKE genes[J]. Plant J, 2001, 26(1):15-22. [5] CHENG Xiaofei, WANG Zengyu. Over expression of COL9, a CONSTANS-LIKE gene, delays flowering by reducing expression of CO and FT in Arabidopsis thaliana[J]. Plant J, 2005, 43(5):758-768. [6] DATTA S, HETTIARACHCHI G H C M, DENG Xingwang, et al. Arabidopsis CONSTANS-LIKE3 is a positive regulator of red light signaling and root growth[J]. Plant Cell, 2006, 18(1):70-84. [7] ROBSON F, COSTA M M R, HEPWORTH S R, et al. Functional importance of conserved domains in the flowering-time gene CONSTANS demonstrated by analysis of mutant alleles and transgenic plants[J]. Plant J, 2001, 28(6):619-631. [8] GRIFFITHS S, DUNFORD R P, COUPLAND G, et al. The evolution of CONSTANS-like gene families in barley, rice, and Arabidopsis[J]. Plant Physiol, 2003, 131(4):1855-1867. [9] ROBERT L S, ROBSON F, SHARPE A, et al. Conserved structure and function of the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS in Brassica napus[J]. Plant Mol Biol, 1998, 37(5):763-772. [10] ALMADA R, CABRERA N, CASARETTO J A, et al. VvCO and VvCOL1, two CONSTANS homologous genes, are regulated during flower induction and dormancy in grapevine buds[J]. Plant Cell Rep, 2009, 28(8):1193-1203. [11] TENORIO G, OREA A, ROMERO J M, et al. Oscillation of mRNA level and activity of granule-bound starch synthase in Arabidopsis leaves during the day/night cycle[J]. Plant Mol Biol, 2003, 51(6):949-958. [12] CAMPOLI C, DROSSE B, SEARLE I, et al. Functional characterisation of HvCO1, the barley (Hordeum vulgare) flowering time ortholog of CONSTANS[J]. Plant J, 2012, 69(5):868-880. [13] HAYAMA R, AGASHE B, LULEY E, et al. A circadian rhythm set by dusk determines the expression of FT homologs and the short-day photoperiodic flowering response in Pharbitis[J]. Plant Cell, 2007, 19(10):2988-3000. [14] MARTIN J, STORGAARD M, ANDERSEN C H, et al. Photoperiodic regulation of flowering in perennial ryegrass involving a CONSTANS-like homolog[J]. Plant Mol Biol, 2004, 56(2):159-169. [15] CHIA T Y P, MÜLLER A, JUNG C, et al. Sugar beet contains a large CONSTANS-LIKE gene family including a CO homologue that is independent of the early-bolting (B) gene locus[J]. J Exp Bot, 2008, 59(10):2735-2748. [16] HUANG Guowen, MA Jinghua, HAN Yuzhen, et al. Cloning and expression analysis of the soybean CO-Like gene GmCOL9[J]. Plant Mol Biol Rep, 2011, 29:352-359. [17] BÖHLENIUS H, HUANG Tao, CHARBONNEL-CAMPAA L, et al. CO/FT regulatory module controls timing of flowering and seasonal growth cessation in trees[J]. Science, 2006, 312(5776):1040-1043. [18] PAZHOUHANDEH M, MOLINIER J, BERR A, et al. MSI4/FVE interacts with CUL4-DDB1 and a PRC2-like complex to control epigenetic regulation of flowering time in Arabidopsis[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 2011, 108(8):3430-3435. [19] AHN J H, MILLER D, WINTER V J, et al. A divergent external loop confers antagonistic activity on floral regulators FT and TFL1[J]. EMBO J, 2006, 25(3):605-614. [20] LAGERCRANTZ U, AXELSSON T. Rapid evolution of the family of CONSTANS LIKE genes in plants[J]. Mol Biol Evol, 2000, 17(10):1499-1507. [21] TANG Haibao, BOWERS J E, WANG Xiyin, et al. Angiosperm genome comparisons reveal early polyploidy in the monocot lineage[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 2010, 107(1):472-477. [22] YU Jun, WANG Jun, LIN Wei, et al. The genomes of Oryza sativa:a history of duplications[J]. PLoS Biol, 2005, 3(2):266-281. [23] KIM S K, YUN C H, LEE J H, et al. Os-CO3, a CONSTANS-LIKE gene, controls flowering by negatively regulating the expression of FT-LIKE genes under SD conditions in rice[J]. Planta, 2008, 228(2):355-365. [24] XUE Weiya, XING Yongzhong, WENG Xiaoyu, et al. Natural variation in Ghd7 in an important regulator of heading date and yield potential in rice[J]. Nat Genet, 2008, 40(6):761-767. [25] KOJIMA S, TAKAHASHI Y, KOBAYASHI Y, et al. Hd3a, a rice ortholog of the Arabidopsis FT gene, promotes transition to flowering downstream of Hd1 under short-day conditions[J]. Plant Cell Physiol, 2002, 43(10):1096-1105. 期刊类型引用(5)
1. 李素欣，姜清彬，张晖，李永泉，郭微，王涛，郭朗. 醉香含笑不同树高处心边材挥发性成分的差异. 东北林业大学学报. 2024(01): 128-136 . 
百度学术2. 刘柯珍，何诚. 微观视角下防火树种特征研究动态. 西南林业大学学报(自然科学). 2024(03): 212-220 . 百度学术3. 詹施施，王世彤，周本庚，杨腾，周刚，江明喜. 湖北竹溪黑壳楠的种群结构与群落特征. 长江流域资源与环境. 2023(01): 113-122 . 百度学术4. 逯久幸，刘燕，许朵朵，陈鹏，李永华，刘红利. 黑壳楠染色体核型分析及基因组Survey预测. 河南农业大学学报. 2023(06): 967-974 . 百度学术5. 董姬秀，朱舒翼，赵辉，王晶. 黑壳楠研究进展. 河南林业科技. 2021(04): 12-15 . 百度学术其他类型引用(6)
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