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柿性器官败育及相关基因的表达

王丽媛 孙鹏 李华威 傅建敏 刁松锋 韩卫娟 索玉静 买旖旎

史航, 李兵, 郭建忠. 功能化枝状复合吸附材料的制备及吸附Cr(Ⅵ)的性能[J]. 浙江农林大学学报, 2022, 39(2): 396-404. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200119
引用本文: 王丽媛, 孙鹏, 李华威, 等. 柿性器官败育及相关基因的表达[J]. 浙江农林大学学报, 2019, 36(2): 236-246. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.02.004
SHI Hang, LI Bing, GUO Jianzhong. Preparation of functional dendritic composite adsorbents and their adsorption properties for Cr(Ⅵ)[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2022, 39(2): 396-404. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200119
Citation: WANG Liyuan, SUN Peng, LI Huawei, et al. Expression analysis for abortion of sex organs and related-genes in persimmon (Diospyros kaki)[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2019, 36(2): 236-246. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.02.004

柿性器官败育及相关基因的表达

DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.02.004
基金项目: 

中央级公益性科研院所基本科研业务费资助项目 CAFYBB2016QB017

中央级公益性科研院所基本科研业务费资助项目 CAFYBB2017ZA005

国家自然科学基金青年科学基金资助项目 31500559

详细信息
    作者简介: 王丽媛, 博士研究生, 从事经济林育种栽培研究。E-mail:479011096@qq.com
    通信作者: 傅建敏, 研究员, 从事经济林育种栽培研究。E-mail:fjm371@163.com
  • 中图分类号: S665.2;S718.43

Expression analysis for abortion of sex organs and related-genes in persimmon (Diospyros kaki)

  • 摘要: 为描述柿Diospyros kaki性器官败育现象,以中国林业科学研究院经济林研究开发中心原阳试验基地10年生的雌雄同株柿品种‘禅寺丸’‘Zenjimaru’为研究对象,通过制作石蜡切片结合外部形态变化,同时利用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术对6个性别分化相关基因进行表达模式分析,对柿花芽分化过程中的性器官败育的关键时期及分子调控机制进行了研究。结果表明:柿雌花中的雄蕊原基和雄花中的雌蕊原基均在4月中旬发生败育。此时,顶端着生雌花的枝条长为5.0~6.0 cm,着生雄花的枝条长为6.0~8.0 cm,雌花芽长约1.0 cm,雄花芽长为1.0~2.0 cm。除了4月5日和4月8日外,ANTLYK3基因在其他发育阶段均差异显著(P < 0.05)且在雌花芽中的表达量明显高于雄花芽,而AP2和ABCC10基因则是在雄花芽中的表达水平显著高于雌花芽(P < 0.05)。在4月5日和4月14日(性器官败育关键时期),基因BI-1在雌花芽中的表达量分别是雄花芽的1.5倍和2.0倍,而在其余阶段,其表达量分别是雄花芽的97.5%,89.2%和83.9%,推测BI-1作为一种雄性器官细胞凋亡抑制基因,间接促进柿雄花芽的发育。建议对树体进行正常的修剪、施肥等常规处理的同时,在4月中旬花器官原基败育之前对树体进行相应激素的喷施,以调控柿花性别,培育雄性种质。
  • 随着电镀、制革、冶金、染料等工业的不断发展,重金属对水体污染已严重破坏了生态平衡[1]。中国长江三峡水库区段沉积物中重金属元素含量受上游泥沙及沿江城市和工厂废水、废气和固体废弃物排放影响,已严重超标[2]。因此,如何将排放废水中重金属含量有效降低至排放标准以下,是当前水处理领域需要迫切解决的问题之一。吸附法作为一种有效去除废水中污染物的方法,因其低成本、实用、高效和环境友好性,得到了广泛应用。介孔二氧化硅(如:MCM-41、SBA-15和MCM-48)等材料因其具有均匀的孔结构、孔容、热稳定性等优良特性,常被选作吸附材料而被广泛应用[3-4],但因其表面吸附官能团的数量及类型单一,限制了其在低浓度污水处理中的应用。树枝状大分子是一类具有高度支化结构的分子,具有大量的末端基团,且可形成笼状结构,可与重金属离子配位形成稳定的螯合物,有利于重金属的吸附,且毒性低,安全可靠[5],所以,在介孔二氧化硅上合成树枝状化合物成为一种有效的研究方向。DIALLO等[6]研究了在有序介孔分子筛(SBA)上合成PAMAM树枝状化合物,并应用于重金属离子处理,取得较好吸附效果,因其特殊结构被广泛应用于生物医药、电子传感器、废水处理等领域[7-9]。SUN等[10]报道了在硅胶表面合成低代的枝状化合物(G1),并研究了其对二价汞离子[Hg(Ⅱ)]的吸附性能,吸附容量达260 mg·g−1,表现出良好的吸附性能。BARAKAT等[11]研究了在二氧化钛表面合成枝状化合物并应用于水溶液中Pb2+的吸附及动力学,认为PAMAM枝状化合物是一种非常有前景的吸附剂。本研究将SBA-15接枝改性合成树枝状大分子,引入氨基,并用巯基乙酸改性嫁接巯基,成功合成了功能化枝状复合吸附材料(SBA-15-G3-SH),并通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)、X射线衍射(XRD)、Zeta电位分析和氮气吸附-脱附等温线(BET)等方法对合成材料的结构和物理化学性质进行了表征;研究了SBA-15-G3-SH吸附剂对铬离子[Cr(Ⅵ)]的吸附及环境因素(如pH、吸附时间、浓度等)对吸附性能的影响,对吸附等温线、动力学、热力学等进行了研究,以期为有效去除水中重金属污染物提供理论依据。

    SBA-15介孔分子筛(购于上海卓悦化工科技有限公司,孔容1.178 cm3·g−1,BET比表面积≥600 m2·g−1,孔径7~9 nm);甲苯、氨丙基三乙氧基硅烷、甲醇、丙烯酸甲酯、巯基乙酸、重铬酸钾、乙二胺四乙酸二钠盐等均为分析纯。722型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司),ZJSHA-BA水浴恒温振荡器(常州中捷试验仪器制造有限公司),PHS-2F型酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

    将10 g SBA-15介孔分子筛和300 mL甲苯溶剂加入烧杯,水浴搅拌30 min后放入500 mL圆底烧瓶中;将溶有3 g氨丙基三乙氧基硅烷的甲醇溶液20 mL缓慢滴入上述溶液中,80 ℃反应;6 h后,将经过改性后的SBA-15-G0加入到60 mL丙烯酸甲酯和300 mL甲醇溶剂中,于25 ℃反应24 h得到产物SBA-15-G0.5,经抽滤,用甲醇溶液洗涤,干燥过夜。再将SBA-15-G0.5与150 mL乙二胺,25 ℃在200 mL甲醇溶剂中反应24 h,抽滤,用甲醇溶液洗涤,干燥过夜,产物记为SBA-15-G1(1代)。重复进行上述步骤可得SBA-15-G2(2代)、SBA-15-G3(3代)。将50 mL巯基乙酸改性剂与5 g的SBA-15-G3放入300 mL乙醇水溶液(体积比为1∶1)中,室温磁力搅拌48 h。反应后的混合物经过滤后,分别用乙醇和去离子水洗涤3次,在室温下自然干燥后备用,产品记为SBA-15-G3­-SH。

    用去离子水配置质量浓度为1 000 mg·L−1的Cr(Ⅵ)溶液,实验时再稀释至所需质量浓度。典型的SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)溶液吸附实验:取50 mL质量浓度为200 mg·L−1的Cr(Ⅵ)溶液于250 mL的锥形瓶中,用5 mol·L−1的硫酸调节Cr(Ⅵ)溶液至一定的pH,加入100 mg制备的SBA-15-G3-SH吸附剂,在水浴振荡器中振荡吸附反应一定时间,然后用0.22 μm的滤膜过滤,滤液用紫外可见分光光度计在540 nm处测定Cr(Ⅵ)的吸光度,计算出其质量浓度、吸附量和去除率。

    SBA-5-G3-SH吸附剂对Cr(Ⅵ)的吸附效果用吸附量(qe)和去除率(E)来表示。其计算公式分别如式(1)和式(2)所示[12]

    $$ {q_{\rm{e}}} = \frac{{{{\text{c}}_0} - {c_{\text{e}}}}}{m}V \text{;} $$ (1)
    $$ E = \frac{{{{\text{c}}_0} - {c_{t}}}}{{{{\text{c}}_0}}} \times 100{\text{% }} 。 $$ (2)

    式(1)和式(2)中:qe为在平衡时的吸附量(mg·g−1);c0ce分别为初始和平衡时的Cr(Ⅵ)质量浓度(mg·L−1);ct为在吸附时间t时Cr(Ⅵ)的质量浓度(mg·L−1);V为Cr(Ⅵ)溶液的体积(L);m为吸附剂的质量(g);E为Cr(Ⅵ)的去除效率(%)。

    离子强度的影响实验在Cr(Ⅵ)离子质量浓度为200 mg·L−1,温度为298 K,硫酸钠浓度为 0.02~0.10 mol·L−1的条件下进行。

    吸附动力学实验:取100 mL初始质量浓度为200 mg·L−1的重铬酸钾溶液,加入100 mg的SBA-15-G3-SH吸附剂,设置一系列反应时间梯度(5~1 800 min),测量吸附后的Cr(Ⅵ)质量浓度。分别用准一级和准二级吸附动力学模型分析吸附过程并计算吸附速率。准一级和准二级吸附动力学模型如式(3)和式(4)所示。

    $$ \mathrm{ln}\left({q}_{{\rm{e}}}-{q}_{t}\right)=\mathrm{ln}\left({q}_{{\rm{e}}}\right)-{k}_{1}t\text{;} $$ (3)
    $$ \frac{t}{{{q_t}}} = \frac{1}{{q_{\rm{e}}^2{k_2}}} + \left( {\frac{1}{{{q_{\rm{e}}}}}} \right)t 。 $$ (4)

    式(3)和式(4)中:qt表示t时刻吸附量(mg·g−1);t表示反应时间(min);qe表示平衡吸附量(mg·g−1);k1k2分别表示准一级和准二级动力学方程反应速率常数,单位分别为min−1和g·mg−1·min−1。吸附等温线实验:分别取一系列质量浓度梯度(250~500 mg·L−1)的Cr(Ⅵ)溶液50 mL,加入SBA-15-G3-SH吸附剂100 mg,吸附时间为1 800 min。采用Langmuir和Freundlich方程分别对吸附等温线进行拟合。Langmuir和Freundlich方程分别见式(5)和式(6)所示。

    $$ \frac{{{c_{\rm{e}}}}}{{{q_{\rm{e}}}}} = \frac{1}{{{K_{\rm{L}}}{q_{\rm{m}}}}} + \frac{{{c_{\rm{e}}}}}{{{q_{\rm{m}}}}} \text{;} $$ (5)
    $$ \lg {q_{\rm{e}}} = \lg {K_{\rm{F}}} + \frac{1}{n}\lg {c_{\rm{e}}} 。 $$ (6)

    式(5)和式(6)中:ce表示吸附平衡时Cr(Ⅵ)的质量浓度(mg·L−1);qm表示Langmuir最大吸附量(mg·g−1);KL为Langmuir吸附常数(L·mg−1);KF为Freundlich吸附常数,n是与温度、体系有关的常数。

    吸附热力学:为了研究温度对SBA-15-G3-SH上吸附Cr(Ⅵ)的影响,通过式(7)和式(8)计算不同温度下的焓变(ΔHθ)、熵变(ΔSθ) 和吉布斯自由能变(ΔGθ)值。

    $$ {\Delta G}^{\text{θ}}=-RT\mathit{{\rm{ln}}}{K}_{{\rm{L}}} \text{;} $$ (7)
    $$ \text{}\text{ln}{{K}}_{{\rm{L}}}=\frac{{\Delta S}^{\text{θ} }}{R}-\frac{{\Delta H}^{\text{θ} }}{RT} 。 $$ (8)

    式(7)和式(8)中:R表示热力学常数(8.314 J·mol−1·K−1);T表示热力学温度(K);ΔSθ(J·mol−1·K−1)和ΔHθ(kJ·mol−1)分别从lnKL的截距和斜率计算得到;ΔGθ(kJ·mol−1)根据式(7)计算得到。

    场发射扫描电子显微镜(FESEM)和能量色散X-射线光谱(EDS)表征:采用德国Carl Zeiss公司生产的GeminiSEM 300型场发射扫描电子显微镜进行。样品经喷金处理。红外表征:取1~2 mg样品在玛瑙研钵中研磨成细粉末与干燥的溴化钾混合均匀,装入模具内,在压片机上压制成片测试。采用Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪对催化剂样品进行表征,扫描范围为 400~4 000 cm−1,扫描100次。粉末X射线衍射仪分析:实验在XRD-6000型粉末X射线衍射仪上进行,扫描电压为 40.0 kV,扫描电流为30.0 mA,铜靶,2θ为10°~50°,扫描速率为2°·min−1。BET表征:采用美国康塔仪器公司生产的Novae孔径测试仪测定催化剂的比表面积、孔径分布等,以氩气(Ar)为工作气体,高纯氦(He)为吸附气体。催化剂质量为0.1~0.2 g,从室温以10 ℃·min−1升温到200 ℃,脱气180 min,在液氮(−196 ℃)温度下进行比表面积及孔结构等测试。

    2.1.1   FESEM和EDS表征

    图1A清晰的显示了SBA-15的结构和形貌。与图1A相比,经接枝改性后的样品(图1B)中可以观察到在SBA-15-G3-SH表面有一些小的颗粒物。从图2可看出:硫和氮元素是均匀分布在SBA-15-G3-SH上。可推断,接枝改性基团不仅接枝在SBA-15的表面,同时也接枝在孔道内部。SBA-15样品中主要含有碳(C)、氧(O)、硅(Si)等元素,其摩尔分数分别为 9.35%、64.50%和26.15%;而SBA-15-G3-SH吸附剂中的主要元素为碳、氮、氧、硅、硫(S)等,其摩尔分数分别为38.62%、9.21%、35.04%、15.10%和2.03%。结果表明:在SBA-15上成功地嫁接上了—NH2和—SH基团。

    图 1  SBA-15 (A)和SBA-15-G3-SH (B)样品的FESEM图
    Figure 1  FESEM images of SBA-15 (A) and SBA-15-G­3-SH (B)
    图 2  SBA-15(A)和SBA-15-G3-SH(B)的EDS图
    Figure 2  EDS spectra of SBA-15(A) and SBA-15-G3-SH(B)
    2.1.2   BET表征

    对改性前SBA-15和改性后的SBA-15-G3-SH进行了BET分析。SBA-15的比表面积为668.04 m2·g−1,孔径为6.75 nm,孔容为1.42 cm3·g−1;SBA-15-G3-SH的比表面积降低为109.29 m2·g−1,孔径为3.82 nm,孔容为0.15 cm3·g−1

    在介孔材料SBA-15上嫁接PAMAM树状大分子官能化和巯基基团导致比表面积、孔容和孔径减小,在接枝过程中,多孔材料的结构性能降低[13-14]。在图3可以看出:样品呈现典型的Langmuir Ⅳ型吸附/脱附等温曲线,同时还出现H1型迟滞环(图3),并且具有明显的毛细孔凝聚,说明该样品为典型的二维六方结构,并且该方法制备出的吸附剂的介孔结构均很发达。改性前后吸附剂均存在滞后环,说明改性后吸附剂的孔道结构完好[15]

    图 3  SBA-15和SBA-15-G3-SH的氮气吸附/脱附等温线
    Figure 3  N2 adsorption/desorption isotherms of SBA-15 and SBA-15-G3-SH
    2.1.3   FTIR分析

    图4可以看出:在804 cm−1处强的吸收峰归属于Si—O—Si的SiO4对称伸缩振动吸收峰,1 087 cm−1则归属于Si—O—Si反对称振动吸收峰;966 cm−1的吸收峰归属于Si—OH的弯曲振动吸收峰;在465 cm−1处的峰是Si—O—Si键振动吸收峰;在3 082 cm−1处的峰是由于不对称的—NH2 伸缩振动所致;在2 923~2 958 cm−1处,可观察到SBA-15-G3-SH树状大分子中—CH伸缩振动[16-17]图4 A与图4B相比,SBA-15-G3-SH可以明显看到嫁接了巯基后在2 500~2 600 cm−1处有较大的峰值,对应的是CH2—SH的伸缩振动峰。由此可见,氨基和巯基官能团成功嫁接到SBA-15介孔材料上。

    图 4  SBA-15 (A)和SBA-15-G3-SH (B)的红外光谱图
    Figure 4  Infrared spectra of SBA-15 (A) and SBA-15-G3-SH (B)
    2.1.4   XRD分析

    图5可以看出:改性后的SBA-15-G3-SH衍射峰的强度有一定程度的减弱,但2个样品的衍射峰位置基本一致,说明SBA-15经过改性后与之前有相似的晶体结构,并且六方晶系的(100)、(110)和(200)晶面特征衍射峰强度均出现较大程度的减弱,这可能是由于接枝有机官能团之后,虽然介孔材料的孔道结构特征没出现明显的变化,孔道组成成分变得更加丰富,从而导致其有序性下降[18]。分析发现:SBA-15-G3-SH的衍射峰强度明显比SBA-15要低。有研究表明:氨改性和树状大分子嫁接巯基不影响SBA-15的结构阻隔性[19],且经过改性后表面成功接上了游离氨基和巯基。

    图 5  SBA-15-G3和 SBA-15-G3-SH的 X射线衍射谱图
    Figure 5  X-ray diffraction spectra of SBA-15 and SBA-15-G3-SH      
    2.1.5   Zeta电位分析

    图6可知:在酸性条件下,SBA-15-G3-SH表面大量的伯胺和次氨基团与氢离子(H+)相互作用,易形成阳离子基;在pH较高时SBA-15-G3-SH的电荷较低。这是因为巯基基团在嫁接过程中失去了部分氨基,导致降低较明显。SBA-15-G3-SH吸附剂的Zeta电位随pH增加而降低。当 pH>5时,Cr(Ⅵ)主要以Cr2O7 2−形式存在;而当pH<2时,增加的H+与CrO4 2−相结合,Cr(Ⅵ)主要以HCrO4 的形式存在,影响了SBA-15-G3-SH还原;当pH为2~5时,Cr(Ⅵ)主要以CrO4 2−形式存在,可较好地与巯基发生络合反应。结合Zeta电位数据可以看出:将pH调至2~3可以使Cr(Ⅵ)被更好的吸附。

    图 6  SBA-15-G3-SH样品在不同pH下的Zeta电位测定
    Figure 6  Zeta potential measurement of SBA-15-G3-SH at different pH values
    2.2.1   不同pH的影响

    pH是吸附材料吸附效果的一个重要影响因素,因为其不仅会使吸附材料表面的荷电状态发生改变,甚至还会改变金属离子的存在状态[20]。从图7可看出:当Cr(Ⅵ)溶液的pH<2.3时,SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)吸附量随pH增大而增大,这是因为该pH下 Cr(Ⅵ)以 HCrO4 的形式存在,溶液中H+ 会与Cr(Ⅵ)发生竞争吸附,提高溶液pH,溶液中H+浓度下降,Cr(Ⅵ)与巯基有更多的接触机会,有利于Cr(Ⅵ)的吸附。然而,随着溶液pH继续增大,Cr(Ⅵ)存在形式变为 Cr2O7 2−,该离子空间结构较大,不易进入孔道,减少了与巯基的接触。SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的吸附主要是通过表面的巯基与Cr(Ⅵ)生成稳定的螯合物,所以随着与巯基接触的Cr(Ⅵ)的减少,吸附率也逐渐降低。因此SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的较佳吸附pH为2.3。

    图 7  pH值对SBA-15-G3-SH吸附Cr(Ⅵ)的影响
    Figure 7  Effect of pH on Cr(Ⅵ) adsorption capacity of SBA-15-G3-SH
    2.2.2   Cr(Ⅵ)初始质量浓度对吸附量的影响

    在25 ℃下, Cr(Ⅵ)溶液的pH为2.3,吸附剂SBA-15-G3-SH用量为0.1 g条件下,通过改变Cr(Ⅵ)溶液的质量浓度,研究初始质量浓度对吸附性能的影响。由图8可以看出:随着Cr(Ⅵ)初始质量浓度的增大,平衡吸附量呈增大趋势。这可能是由于随着Cr(Ⅵ)的初始质量浓度的增加,吸附剂上的吸附官能团(如巯基)与Cr(Ⅵ)接触机会更多,更有利于吸附的进行。当Cr(Ⅵ)质量浓度为500 mg·L−1时,吸附量达到最大(190.05 mg·g−1)。

    图 8  Cr(Ⅵ)初始质量浓度对吸附的影响
    Figure 8  Effect of initial concentration of Cr(Ⅵ) adsorption

    图9可以看出:SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的吸附可分为2个阶段,开始阶段(<60 min)吸附速率非常快,第2个阶段吸附速率逐渐变慢,并逐渐达到吸附平衡。这是因为初始阶段吸附剂表面有大量的活性位点,Cr(Ⅵ)易被吸附。随着吸附时间的增加,吸附剂表面活性位点减少,吸附变慢。

    图 9  不同温度25、35、45 ℃条件下Cr(Ⅵ)吸附量与接触时间的关系
    Figure 9  Effect of Cr(Ⅵ) adsorption vs contact time at various temperatures of 25, 35 and 45 ℃

    对吸附数据进行吸附动力学拟合,拟合参数如表1所示。对比拟合曲线可知:SBA-15-G3-SH的吸附更符合准二级吸附动力学模型(R2>0.998 0)。

    表 1  吸附动力学模型的拟合参数
    Table 1  Fitting parameters of the adsorption kinetics models
    T/K准一级吸附准二级吸附
    qe/ (mg·g−1)k1/min−1R2qe/(mg·g−1)k2/(g·mg−1·min−1)R2
    29893.615 90.000 60.760 8164.7450.000 180.999 2
    30895.985 80.000 60.767 2163.3990.000 180.999 2
    318100.133 10.000 60.801 5162.0750.000 160.998 9
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    表2可知:随着平衡质量浓度的增加,SBA-15-G3-SH 对Cr(Ⅵ)的平衡吸附量也呈现增加趋势,并且在质量浓度较低时增加迅速,达到一定质量浓度后增加趋势变缓,符合典型的Langmuir吸附模型规律。SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的吸附更符合Langmuir吸附等温线方程(R2=0.993 8),线性关系很好,吸附过程为化学单层吸附,因此当Cr(Ⅵ)质量浓度较高时,与巯基结合的量也越多。随着Cr(Ⅵ)初始质量浓度增大吸附量逐渐增大,当巯基完全与Cr(Ⅵ)结合后,吸附量达到饱和。

    表 2  吸附等温线模型的拟合参数
    Table 2  Fitting parameters of the adsorption isotherm models
    Langmuir 等温模型Freundlich 等温模型
    qm/(mg·g−1)KL/(L·mg−1)R2KFnR2
    192.310.2940.993 8117.6910.070.960 5
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    ΔGθ、ΔHθ和ΔSθ根据式(7)和式(8)计算得到(表3)。从表3可看出:在298、308和318 K时,ΔGθ分别为−12.99、−13.40和−13.77 kJ·mol−1。ΔGθ均为负值,表明SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)吸附在热力学上是一个自发过程,尤其是在高温条件下。这些结果表明:高温可能更有利于Cr(Ⅵ)吸附过程。此外,ΔHθ为−1.334 kJ·mol−1,说明SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的吸附是放热反应;ΔSθ为39.10 J·mol−1·K−1,表明随着吸附过程的进行,固-液界面的自由度增大,体系混乱度增大[21]

    表 3  SBA-15-G3-SH吸附Cr(Ⅵ)的热力学参数
    Table 3  Thermodynamic parameters of Cr(Ⅵ) adsorption onto SBA-15-G3-SH
    T/KΔGθ /(kJ·mol−1)ΔHθ/(kJ·mol−1)ΔSθ/(J·mol−1·K−1)R2
    298−12.99−1.33439.100.998 7
    308−13.40
    318−13.77
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    为了进一步研究溶液中干扰离子对SBA-15-G3-SH吸附Cr(Ⅵ)过程的影响,并探讨吸附过程中是否存在静电相互作用,在Cr(Ⅵ)溶液中加入一定量的硫酸钠来而考察对Cr(Ⅵ)的吸附的影响。从图10可以看出:随着溶液中硫酸钠浓度逐渐升高0~0.10 mol·L−1,SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的吸附量明显地降低,从163.92 mg·g−1降低到122.89 mg·g−1。离子强度的增加导致吸附剂对Cr(Ⅵ)的吸附量减少,这可能是由于吸附剂表面与溶液中离子间的静电相互作用导致的。溶液中引入的${\rm{SO}}_4^{2-} $可能与Cr(Ⅵ)相互竞争SBA-15-G3-SH的活性中心,从而一定程度上抑制了SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的吸附。

    图 10  离子浓度对Cr(Ⅵ)吸附的影响
    Figure 10  Effect of ionic strength on Cr(Ⅵ) adsorption onto SBA-15-G3-SH

    吸附动力学符合准二级动力学曲线说明:SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的吸附能力与吸附剂上的吸附点位有关,占据主导地位的是化学吸附而非物理吸附,主要通过巯基、氨基与金属离子的络合和静电吸附进行。从等温线更符合Langmuir曲线可得出:吸附过程为化学单层吸附,固体表面是均匀的,即表面上所有部位的吸附能力都相同,被吸附在固体表面上的分子相互之间无作用力。FESEM、EDS、FTIR、XRD的表征结果表明:SBA-15-G3-SH上成功地嫁接了—NH2和—SH官能团,并且这些基团的存在有利于重金属Cr(Ⅵ)的吸附。SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)具有优异的吸附能力归因于其嫁接的巯基与重金属离子间的络合作用,吸附的主要作用是SBA-15-G3-SH表面的—SH基团与重金属离子的表面络合作用,导致形成稳定的化合物,从而达到吸附并去除重金属离子的目的。离子浓度对吸附性能影响的实验表明:吸附剂表面与溶液中Cr(Ⅵ)金属离子之间可能还存在一定的静电相互作用,也有利于Cr(Ⅵ)的吸附。

    本研究通过对介孔材料SBA-15的改性,成功地合成了具有树状大分子结构和巯基基团的复合吸附剂SBA-15-G3-SH。结果表明:合成的SBA-15-G3-SH中—NH2和—SH官能团被成功地嫁接在SBA-15中,且吸附剂对Cr(Ⅵ)具有较强的吸附能力,最大吸附量达192.31 mg·g−1。吸附效果随着温度升高而降低,吸附等温线和吸附动力学分别符合Langmuir方程和准二级动力学方程。热力学参数表明:SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的吸附过程是自发的和吸热的。FESEM、EDS、FTIR、XRD的表征结果表明:SBA-15-G3-SH上成功地嫁接了—NH2和—SH官能团,并且这些基团的存在有利于吸附重金属Cr(Ⅵ)。吸附的主要作用为SBA-15-G3-SH表面的—SH基团的表面络合作用以及金属离子的静电吸引,形成稳定的化合物。循环重复性实验结果表明:枝状复合吸附剂SBA-15-G3-SH能重复利用且具有较好的吸附性能,具有高效、经济、环保等优良特性,是处理含重金属废水很有前景的一种吸附剂。

  • 图  1  柿‘禅寺丸’雌花不同发育时期的内部解剖及外部形态比较

    Figure  1  Comparation between external morphological changes and internal anatomy structure of 'Zenjimaru' on female flower differentiation

    图  2  柿‘禅寺丸’雄花不同发育时期的内部解剖及外部形态比较

    Figure  2  Comparation between external morphological changes and internal anatomy structure of 'Zenjimaru' on male flower differentiation

    图  3  柿‘禅寺丸’花芽分化过程中与性别分化相关基因的表达模式分析

    Figure  3  qRT-PCR analyses for expression levels of sex differentiation-related genes in floral buds of 'Zenjimaru'during different developmental stages

    表  1  性别分化相关基因的引物信息

    Table  1.   Summary of primers used for floral sex differentiation-related genes in this study

    基因名称 引物序列(5′→3′) 退火温度/ ℃ 条带大小/bp
    GAPDH F: AGCTCTTCCACCTCTCCAGT 56.8 157
    R: TGCTAGCTGCACAACCAACT 57.2
    ANT F: TGCCATTATCCGCTCTAC 51.3 121
    R: GACATTCAGCACCCAAGA 51.9
    LYK3 F: CTTCCTCCCGAATCTGTC 51.6 134
    R: TTCATTCTGGTGGGCTCT 52.7
    AP2 F: GCAGTTCCTCCATTTTCA 49.9 153
    R: CATCTATCTTGGGCTATTT 46.3
    ABCC10 F: CCAGCCTAAACAGAGCCC 54.8 191
    R: CAACCGTCCACCAGTCAA 54.6
    BI-1 F: TCCTGTCTTCTGGGCTCT 54.0 188
    R: GGCGTGCTTCACATAGTC 53.4
    RBOHB F: ATGATTATTGGTGGTTTGT 46.9 233
    R: CTTGGAAAGGTAGAGGAA 47.6
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-03-08
  • 修回日期:  2018-04-09
  • 刊出日期:  2019-04-20

柿性器官败育及相关基因的表达

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.02.004
    基金项目:

    中央级公益性科研院所基本科研业务费资助项目 CAFYBB2016QB017

    中央级公益性科研院所基本科研业务费资助项目 CAFYBB2017ZA005

    国家自然科学基金青年科学基金资助项目 31500559

    作者简介:

    王丽媛, 博士研究生, 从事经济林育种栽培研究。E-mail:479011096@qq.com

    通信作者: 傅建敏, 研究员, 从事经济林育种栽培研究。E-mail:fjm371@163.com
  • 中图分类号: S665.2;S718.43

摘要: 为描述柿Diospyros kaki性器官败育现象,以中国林业科学研究院经济林研究开发中心原阳试验基地10年生的雌雄同株柿品种‘禅寺丸’‘Zenjimaru’为研究对象,通过制作石蜡切片结合外部形态变化,同时利用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术对6个性别分化相关基因进行表达模式分析,对柿花芽分化过程中的性器官败育的关键时期及分子调控机制进行了研究。结果表明:柿雌花中的雄蕊原基和雄花中的雌蕊原基均在4月中旬发生败育。此时,顶端着生雌花的枝条长为5.0~6.0 cm,着生雄花的枝条长为6.0~8.0 cm,雌花芽长约1.0 cm,雄花芽长为1.0~2.0 cm。除了4月5日和4月8日外,ANTLYK3基因在其他发育阶段均差异显著(P < 0.05)且在雌花芽中的表达量明显高于雄花芽,而AP2和ABCC10基因则是在雄花芽中的表达水平显著高于雌花芽(P < 0.05)。在4月5日和4月14日(性器官败育关键时期),基因BI-1在雌花芽中的表达量分别是雄花芽的1.5倍和2.0倍,而在其余阶段,其表达量分别是雄花芽的97.5%,89.2%和83.9%,推测BI-1作为一种雄性器官细胞凋亡抑制基因,间接促进柿雄花芽的发育。建议对树体进行正常的修剪、施肥等常规处理的同时,在4月中旬花器官原基败育之前对树体进行相应激素的喷施,以调控柿花性别,培育雄性种质。

English Abstract

史航, 李兵, 郭建忠. 功能化枝状复合吸附材料的制备及吸附Cr(Ⅵ)的性能[J]. 浙江农林大学学报, 2022, 39(2): 396-404. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200119
引用本文: 王丽媛, 孙鹏, 李华威, 等. 柿性器官败育及相关基因的表达[J]. 浙江农林大学学报, 2019, 36(2): 236-246. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.02.004
SHI Hang, LI Bing, GUO Jianzhong. Preparation of functional dendritic composite adsorbents and their adsorption properties for Cr(Ⅵ)[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2022, 39(2): 396-404. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20200119
Citation: WANG Liyuan, SUN Peng, LI Huawei, et al. Expression analysis for abortion of sex organs and related-genes in persimmon (Diospyros kaki)[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2019, 36(2): 236-246. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.02.004
  • Diospyros kaki是柿科Ebenaceae柿属Diospyros落叶乔木,在中国分布范围较广,是一种重要木本粮食树种。柿果实富含黄酮、多酚和维生素C等活性成分,营养丰富,具有活血降压、止血凉血等保健功效及药用价值,可在产品加工、医疗美容等领域发挥重要作用[1]。柿开花特性复杂,大部分品种只开雌花,少数雌雄同株,只开雄花的品种十分罕见[2],雄性资源的严重缺乏限制了柿杂交育种工作的深入开展,这是造成中国柿产业发展缓慢的关键原因之一[3-4]。有研究指出,在花发育早期存在两性花器官原基,随着花芽的分化进程,在雌性或雄性花成熟之前,对应性器官发生了细胞程序性死亡,从而导致单性花的产生[5]。如玉米Zea mays[6],芦笋Asparagus officinalis[7]等单性花的产生都是由于两性花器官在花芽分化过程中,对应性器官的选择性败育导致的。目前,关于柿花芽分化的研究较少,SOBA-JIMA等[8]对柿‘平核无’‘Hiratanenashi’的雌花分化进程、YONEMORI等[9]对‘花御所’‘Hanagosho’等雌、雄花芽分化早期的形态学进行了报道。此外,本课题组对雌雄同株柿‘禅寺丸’ ‘Zenjimaru’的花芽发育进程进行了组织细胞学研究发现,在柿花发育早期同时具有雌、雄蕊原基,随着花芽分化的进行,到4月中旬时,柿雄花中的雌蕊原基有选择性的退化,雌花中的雄蕊原基也选择性的退化,最终形成了雌花或雄花等单性花[10]。本课题组对4月13日发育的柿‘禅寺丸’雌、雄花芽进行了RNA-Seq(转录组测序),从中筛选出了一些与柿花性别分化相关的关键基因,可为揭示柿花芽分化,尤其是对应性器官发生败育现象的分子机制提供一定的参考(此结果尚未发表)。目前,人们主要从激素测定、胚胎发育、显微观察等角度观察测定柿花芽分化的形成和发育过程[10-12],而对柿花芽不同分化时期的外部形态特点却没有比较详尽的描述。本研究以雌雄同株柿‘禅寺丸’为试材,对4月中旬(性器官发生败育)前后雌、雄花芽的显微结构与外部形态的相关性进行比较分析,以建立能够反映内部解剖结构的外部形态指标,同时利用转录组测序得到的与性别分化相关的关键基因进行实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定,以进一步明确柿花芽分化的分子机制,从而为后期柿花性别的调控、柿雄性资源的培育以及杂交育种工作的深入开展提供理论依据。

    • 试验所选材料为10年生的雌雄同株柿品种‘禅寺丸’。试验地点位于中国林业科学研究院经济林研究开发中心原阳试验基地(河南省原阳县)(34°55'30″~34°56'45″N, 113°46'24″~113°47'59″E)。选择树势基本一致、无病虫害并且结果正常的健康树体进行试验,园区进行统一常规管理。

    • 根据李加茹等[10]关于‘禅寺丸’性别分化的石蜡切片观察可知,4月17日是柿花芽分化的第2个形态学关键时期,此时雌、雄花芽从外观上清晰可辨,并且雌、雄蕊原基已经发生败育。基于此,我们于2017年4月初(花芽处于萌动状态)至2017年4月中下旬(雌、雄蕊原基败育)进行试验材料的采集,隔3 d取样1次。具体采集日期为4月5日(阶段A),4月8日(阶段B),4月11日(阶段C),4月14日(阶段D)和4月17日(阶段E)。从每株树树冠外围中部东、南、西、北4个方向各随机抽取生长中庸的当年生枝条(分为开雄花的枝条和开雌花的枝条)各5个,采集每个枝条形态学上端的前3个饱满芽(分为雄花芽和雌花芽),用游标卡尺测量花芽和叶片的长度,用解剖针剥去芽外面的鳞片并拍照。每份样品采集后分成2部分,一部分投入甲醛冰醋酸乙醇(FAA)固定液中进行固定,另一部分于-80 ℃保存。

    • 试验材料首先经过一系列梯度的乙醇(体积分数为70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇)进行脱水处理。材料彻底脱水后于二甲苯和无水乙醇配制的混合液以及纯二甲苯中进行透明。透明后的材料在1/2二甲苯+1/2石蜡中于38 ℃恒温箱中存放36 h后,15 min调高2~3 ℃进行变温处理,直至温度升为62 ℃,然后保持在此温度下对样品进行浸蜡处理。之后,对蜡块进行修整,并在切片机上制成纵切片,切片厚度为8~10 μm;将粘贴在载玻片上的蜡带置于烘箱中在38 ℃的条件下除去残余的黏贴剂,进行常规脱蜡(纯二甲苯和1/2二甲苯+1/2石蜡混合液),不同梯度乙醇复水,用苏木精伊红双重染色后,不同梯度乙醇脱水,1/2二甲苯+1/2石蜡配制的混合液和二甲苯透明,最后用中性树胶进行封片,烘干后在Olympus BX-51型光学显微镜下观察、拍照。

    • 采用EZ-10 DNAaway RNA Mini-Preps试剂盒(Sangon)提取不同发育阶段各类型花芽的总核糖核酸(RNA),用Implen P330超微量分光光度计检测RNA的纯度和浓度,利用质量分数为1.0 %琼脂糖凝胶电泳法检测总RNA的完整性,样品检测合格后置于-80 ℃冰箱保存备用。采用TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Kemix)将总RNA反转录成互补脱氧核糖核酸(cDNA)。之后用BIO-RAD CFX 96荧光定量聚合酶链式反应仪对各基因进行qRT-PCR测定。反应体系包括:1.0 μL primer mix(包括5 μmol·L-1上游forward引物和下游reverse引物),2.0 μL cDNA,10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTM(2×)mix和7.0 μL水。反应条件为:94 ℃ 2 min(1个循环);94 ℃ 20 s,55~60 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s(40个循环)。

      从本课题组已有的转录组数据中选取6个与花芽性别分化相关的关键基因,分别为ANTAINTEGUMENTA),LYK3(LysM containing receptor-like kinase 3),AP2(APETALA 2),ABCC10(ATP binding cassette subfamily C member 10),BI-1(Bax inhibiter 1)和RBOHBRespiratory burst oxidase homolog B),通过对这些基因在花芽分化不同时期的表达模式进行分析,从而探索关键基因调控柿花芽分化的分子机制。用GAPDH作为内参以校正上样量,所用引物见表 1

      表 1  性别分化相关基因的引物信息

      Table 1.  Summary of primers used for floral sex differentiation-related genes in this study

      基因名称 引物序列(5′→3′) 退火温度/ ℃ 条带大小/bp
      GAPDH F: AGCTCTTCCACCTCTCCAGT 56.8 157
      R: TGCTAGCTGCACAACCAACT 57.2
      ANT F: TGCCATTATCCGCTCTAC 51.3 121
      R: GACATTCAGCACCCAAGA 51.9
      LYK3 F: CTTCCTCCCGAATCTGTC 51.6 134
      R: TTCATTCTGGTGGGCTCT 52.7
      AP2 F: GCAGTTCCTCCATTTTCA 49.9 153
      R: CATCTATCTTGGGCTATTT 46.3
      ABCC10 F: CCAGCCTAAACAGAGCCC 54.8 191
      R: CAACCGTCCACCAGTCAA 54.6
      BI-1 F: TCCTGTCTTCTGGGCTCT 54.0 188
      R: GGCGTGCTTCACATAGTC 53.4
      RBOHB F: ATGATTATTGGTGGTTTGT 46.9 233
      R: CTTGGAAAGGTAGAGGAA 47.6
    • 相对基因表达量的计算采用2-△△Ct法,使用SPSS 20.0和Excel 2007等软件对试验数据进行处理,用Origin 6.0软件进行图表绘制等工作。

    • 对柿雌、雄花芽不同分化时期外部形态变化和内部解剖特点进行比较,可以发现两者关系较为密切。随着温度的逐渐升高,树体在3月底开始萌动,顶芽露白并有所膨大,芽体外部包裹的鳞片由休眠期的锈黄色转变为嫩绿色,此时花芽开始进入分化前期。到阶段A,顶芽抽生出长为2.0~4.0 cm的嫩梢,肉眼能看到嫩梢上着生的不同类型的花芽,即能观察到雌花芽1朵单生花序,雄花芽3朵合生花序的形态变化,其中,雌花芽长度小于0.5 cm,雄花芽长度小于1.0 cm,幼叶数目不断增加,颜色由嫩绿色变为黄绿色(图 1a图 2a);对切片进行显微观察发现,此时期雌、雄花芽表现一致,顶端均分化出了花瓣原基、雄蕊原基和心皮原基(图 1A图 2A)。

      图  1  柿‘禅寺丸’雌花不同发育时期的内部解剖及外部形态比较

      Figure 1.  Comparation between external morphological changes and internal anatomy structure of 'Zenjimaru' on female flower differentiation

      图  2  柿‘禅寺丸’雄花不同发育时期的内部解剖及外部形态比较

      Figure 2.  Comparation between external morphological changes and internal anatomy structure of 'Zenjimaru' on male flower differentiation

      在阶段B,由于降雨的原因致使温度有所降低,柿树发育进程相对较慢,此时前1年生的枝条上所有的绿芽逐渐开始抽生成新梢,芽体继续增大,其中,顶端嫩梢长至4.0~5.0 cm,雄花芽长约1.0 cm,雌花芽长为0.4~0.6 cm,叶片和花芽颜色仍为黄绿色(图 1b图 2b);同时,各花器官原基进一步分化。观察发现,与雄花芽相比,雌花芽中的心皮原基发育速度较快,基部开始膨大(图 1B),而雄花芽中的雄蕊原基发育较雌花芽更加明显,雄蕊原基内部细胞分裂速度加快,顶端分生组织间或有幼嫩花药的生成(图 2B)。

      由于春天温度快速升高,柿花各时期的分化进程也较快,在阶段C,嫩梢生长迅速,其中,顶端着生雌花的枝条长为4.0~5.0 cm,着生雄花的枝条生长相对较快,长为5.0~6.0 cm,叶片颜色逐渐加深。此时,雌花芽长为0.5~1.0 cm,雄花芽长为1.0~1.5 cm(图 1c图 2c);随着各原基细胞的分裂分化,雌花芽内的心皮细胞上部逐渐融合形成子房,分化出花柱和柱头组织,雄蕊原基分化则相对缓慢,变化并不明显(图 1C),而雄花芽内的心皮细胞也开始融合,并有类似花柱和柱头组织的结构形成,雄蕊原基细胞分裂旺盛,基部缢缩形成花丝,花药数量逐渐增加,此时期雌、雄花芽内花柱基部两侧各长出小凸起,即为蜜腺组织(图 2C)。

      阶段D顶端着生雌花的枝条长为5.0~6.0 cm,着生雄花的枝条长为6.0~8.0 cm,叶片颜色进一步加深。此时,雌花芽长约1.0 cm,雄花芽长为1.0~2.0 cm(图 1d图 2d);石蜡切片观察可知,雌花芽子房内部已有胚珠的形成,并产生大孢子母细胞,雄蕊原基的生长停滞不前,发生败育(图 1D),而雄花芽内的心皮原基生长相对滞缓,雄蕊原基变化明显,整体不断伸长和膨大,其内部的花药数量显著增多,并有小孢子母细胞的产生(图 2D)。

      在阶段E,枝条与花芽迅速伸长生长,枝条长10.0 cm左右,雌花芽长为1.0~1.5 cm,雄花芽长约2.0 cm,叶片颜色逐渐变为深绿色,枝条接近木质化(图 1e图 2e);对不同花芽的内部解剖构造研究发现,雌花芽内子房形状已初步形成,大孢子母细胞之后将经过减数分裂形成功能大孢子(图 1E),而雄花芽内的心皮原基彻底发生败育,体积减小,雄蕊内的小孢子母细胞则开始经过减数分裂,逐渐形成花粉粒(图 2E)。

    • 柿花花芽分化过程中与性别分化相关基因的表达模式分析见图 3。由图 3可以看出:除在阶段C处略有下降外,基因ANT的表达量在雌花中整体呈现上升的趋势,并且在阶段E处出现最高值。该阶段的基因表达量是阶段A的1.7倍;基因ANT在雄花中的表达模式与雌花完全相反,即除在阶段C处有显著提高(为阶段B的1.5倍)外,该基因在雄花中整体呈现下降的趋势,并且在阶段E处出现最低值,该阶段的基因表达量是阶段A的39.6%。对比ANT基因在雌、雄花中的表达模式发现,该基因的表达水平除在最初的阶段A无显著差异外,其他发育阶段均差异显著且在雌花芽中的表达明显高于雄花芽(P<0.05)(图 3A)。

      图  3  柿‘禅寺丸’花芽分化过程中与性别分化相关基因的表达模式分析

      Figure 3.  qRT-PCR analyses for expression levels of sex differentiation-related genes in floral buds of 'Zenjimaru'during different developmental stages

      柿雌花发育过程中,LYK3和ANT的表达模式基本一致,均从阶段B明显下降至阶段C后,急剧上升到阶段E。与ANT相似,虽然LYK3的表达量在阶段C略有下降,但该阶段的基因含量仍然较阶段A有所上升。整体来看,从阶段A到阶段E,该基因表达量增加了4.4倍。LYK3基因在整个雄花芽的发育过程中出现了2个峰值,即阶段B和阶段D。虽然在阶段D处有个峰值,但其值却明显低于阶段B,甚至是阶段A。由此可知,基因LYK3在阶段B处表达水平最高,为阶段A的1.2倍。此外,雄花芽中LYK3基因的表达水平在前2个发育阶段略高于雌花芽,其余各发育阶段在雌、雄花芽中的差异变化明显(P<0.05),并且在雌花芽中的表达量分别是雄花芽的1.2,1.5和2.1倍(图 3B)。

      基因AP2在雌花不同发育过程中,从阶段A上升到阶段B(表达量是阶段A的2.1倍)后,其表达量呈直线下降趋势,并且该基因在阶段E(雌、雄花外部形态特征已完全呈现)的相对表达量略低于阶段A,是阶段A的92.6%;基因AP2在雌、雄花芽中的表达模式完全相反,该基因在雄花芽中的表达量从阶段A缓慢下降到阶段B,又开始大幅度上升至阶段E,最终该基因的表达量是阶段A的3.8倍。对比AP2基因在雌、雄花中的表达模式发现,除了阶段B雌花中的表达量显著高于雄花(P<0.05)(是雄花中的2.3倍)外,各发育阶段雄花芽中的表达水平总是高于雌花芽,且在阶段E处差异最大,该阶段内雄花芽的表达量是雌花芽的6.5倍(图 3C)。

      基因ABCC10在雌花发育前期表达直线上升,到阶段D处达到最高点(是阶段A的1.5倍)后,又显著下降到阶段E。与阶段A相比,ABCC10的表达量在阶段E处降低了13.6%;ABCC10在雄花发育过程中的表达模式整体呈上升趋势,到阶段E时,该基因是阶段A的2.3倍。此外,雌、雄花芽中的ABCC10基因在阶段A处的差异不显著,而其余阶段在雄花芽中的表达量总是显著高于雌花芽(P<0.05),分别是雌花芽的1.3,1.2,1.2和2.5倍(图 3D)。

      柿雌花发育过程中,基因BI-1的表达量从阶段A缓慢下降到阶段B后,又开始小幅上升至阶段D,最后下降到与阶段A表达量基本持平的阶段E(为阶段A的1.0倍)。总体来看,整个雌花性别分化的过程中,该基因在阶段D的表达量最高,与阶段A相比,提高了98.1%;在雄花中,BI-1基因的表达水平总体呈上升趋势,与阶段A相比,其余各阶段的基因相对表达量基本处在0.9~1.4的水平,其中以阶段B的表达量最低,阶段E的表达量最高。此外,从图 3中我们可以看出:在阶段A和阶段D处,BI-1基因在雌花芽中的表达量分别是雄花芽的1.5倍和2.0倍,而在阶段B,阶段C和阶段E处,BI-1基因在雌花芽中的表达量分别是雄花芽的97.5%,89.2%和83.9%(图 3E)。

      RBOHB在雌、雄花芽整个发育过程中的表达模式基本相同,均为先下降后上升的状态。该基因分别在雌、雄花芽中的阶段B和阶段C处表达量最低,分别为阶段A的43.8%和52.5%。之后,随着花器官的建成,RBOHB的表达呈现出整体的上升趋势,到阶段E处其值达到最大,分别为阶段A的4.1倍和6.2倍。整体来看,除在阶段C处雌花芽的表达量是雄花芽的2.0倍外,其余各阶段均为雄花芽高于雌花芽(图 3F)。

    • 目前,人们主要通过制作石蜡切片后,利用光学显微镜观察植物花芽分化过程中各个发育阶段的特征从而确定形态分化的关键时期[13]。然而,植物的花芽分化受到试验地的立地条件、温度等气候因素、品种自身遗传性能、果树生长中普遍存在的大小年现象以及树体生长发育过程中营养物质的积累等影响[14-16],致使不同研究中花芽分化关键时期的确定有所差异。此外,果农在果园进行栽培管理的过程中,如果只是通过显微观察花芽分化的内部解剖特点,则往往缺少相应的技术及设备条件,从而不能准确地确定花芽分化进程的具体时期,进一步阻碍了柿产业的发展。本研究针对以上问题,通过制作石蜡切片观察柿花芽分化进程中内部解剖特点的同时,测量观察不同分化时期柿花芽外部的形态变化,以建立柿花芽的外部形态特征与内部解剖特点之间的对应关系,根据外部形态指标来判断柿花花芽的分化程度,有利于生产实践中在花器官败育之前,采取人为手段调控柿花性别,具有一定的科学性和实用性。

      已有研究表明:植物单性花的形成与对应性器官的败育有关,例如,在石榴Punica granatum[17],玉米[18],文冠果Xanthoceras sorbifolium[19]等植物中均发现了雌蕊败育现象,在白花蝇子草Silene pratensis[20],中华猕猴桃Actinidia chinensis[21]中发现了雄蕊败育现象。此外,山葡萄Vitis amurensis雄花中的雌蕊败育与珠心组织细胞程序性死亡有关[22],白花山碧桃Prunus davidiana ‘Albo-plena’雄花中的雌蕊败育发生在子房室形成后,与胚珠退化有关[23],黄瓜Cucumis sativus在发育成雌花和雄花的过程中,对应性器官原基的败育发生在大孢子母细胞时期和小孢子母细胞时期[24]。在柿花芽分化早期,‘禅寺丸’雌、雄花芽内对应的雄蕊原基和雌蕊原基发育正常,在阶段D,即大、小孢子发生期,雌花芽产生大孢子母细胞,对应的雄蕊原基生长停滞不前,发生败育,而雄花芽内有小孢子母细胞的产生,对应的雌蕊原基生长相对缓慢。到阶段E时,雌蕊原基和雄蕊原基彻底败育,发生退化。此外,对柿雌、雄花芽的外部形态观察发现,在大、小孢子发生期,顶端着生雌花的枝条长为5.0~6.0 cm,着生雄花的枝条长为6.0~8.0 cm,雌花芽长约1.0 cm,雄花芽长为1.0~2.0 cm。因此,在生产实践中,果农可通过观察花芽的外部生长发育情况,在大、小孢子发生期,即雌、雄花原基发生败育之前,采取相应措施人为调控柿树的花芽分化,有目的地诱导雄花的产生,从而培育优良雄性种质资源。

      ANT是一种类AP2乙烯响应转录因子,它在生殖器官发育过程中占据着重要地位。该基因的强突变体能够使雌配子体缺失,而弱突变体虽然能产生雌配子体,但该配子体无活力[25]。WILSON等[26]发现,ANT基因在拟南芥Arabidopsis thaliana心皮发育过程中的相关植物激素运输方面起到重要作用。LYK3是一种LysM类受体蛋白激酶,在植物的生长发育和抗病抗逆等方面具有非常重要的作用[27]。一般在逆境条件下,植物体内的脱落酸(ABA)含量增加,而拟南芥中AtLYK3基因的表达受到ABA的正调控[28],这表明LYK3可能是一种胁迫诱导基因。对雌、雄花芽中不同阶段性别相关基因的表达模式进行分析发现,ANT基因与LYK3基因具有相同的功能,即均与雌性花器官的产生关系密切。

      AP2基因属于植物花器官发育的分子机制ABCDE模型中的A类功能基因,其在植物萼片和花瓣形成过程中起着重要的调控作用[29-30]。对拟南芥突变体的研究表明,弱AP2突变体可使花瓣转化成雄蕊的结构[31-32]。ABCC蛋白家族是ABC转运蛋白超级家族中的一个亚家族,其在植物生长发育中发挥重要作用,该基因家族成员的主要功能是参与重金属的转运过程以及色素在液泡中的积累过程等[33-34]。本研究结果表明,AP2基因和ABCC10基因在雄花芽中一直保持较高的表达水平,表明该基因可能促进雄性花器官的发育。

      作为一种细胞凋亡抑制因子,BI-1基因广泛存在于动物、植物以及微生物中,其在细胞程序性死亡信号转导下游发挥作用[35]。西红柿Lycopersicon esculentum感染黄瓜花叶病病毒(CMV)以及大麦Hordeum vulgare感染白粉霉菌所致的细胞程序性死亡与感染部位的BI-1基因的高表达密切相关,表明该基因很可能对植物细胞死亡起抑制作用[36-37]BI-1基因在雄花芽发育的整个阶段呈直线上升状态,表明该基因的积累有利于雄花芽的产生。此外,雌花芽中的BI-1基因仅仅在性器官败育关键时期(阶段D)的表达量最高,而其余阶段间该基因的表达基本一致。可以看出:该基因与雄性器官的细胞程序性死亡密切相关。结合BI-1基因在雌、雄花器官中的表达模式及其解剖结果,推测该基因作为一种雄性器官细胞凋亡抑制基因,间接促进柿雄花芽的发育。然而,关于BI-1基因抑制凋亡的作用机制还不是很清楚,因此,在以后的研究中可利用转基因等分子生物学手段,着重于该基因在植物细胞程序性死亡,尤其是花芽分化过程中的作用进行深一步的探讨。

      RBOHB是一种呼吸爆发氧化酶(NADPH氧化酶)基因,这种酶又是活性氧(ROS)的主要来源之一,而ROS可引起细胞凋亡[38]。有报道指出,水稻中的RBOHB基因主要在绒毡层和小孢子中表达,通过产生ROS使生物体内出现细胞程序性死亡现象,进而影响花药的发育[39]。整个花芽发育过程中,除在阶段B和阶段C处略有下降外,花发育后期RBOHB表达量快速上升。此外,根据本研究解剖学观察结果,雌花芽在阶段E处子房形状已初步形成,而雄花芽内的心皮原基彻底发生败育,推测该基因诱导的细胞程序性死亡主要发生在花发育后期雌花芽雄蕊的败育和雄花芽雌蕊的败育,具体仍需进一步的试验验证。

    • 本研究将柿雌、雄花芽分化过程中花芽的外部形态特征和内部解剖构造进行比较分析,外部形态(花芽、叶片和枝条等的变化)可以间接反映其内部结构的变化,通过建立能够反映内部显微变化的外部形态指标来判断柿雌、雄花芽的分化时期,具有一定的科学性和实用性。柿花器官在大、小孢子发生期已经发生败育,此时顶端着生雌花的枝条长为5.0~6.0 cm,着生雄花的枝条长为6.0~8.0 cm,雌花芽长约1.0 cm,雄花芽长为1.0~2.0 cm,可根据柿花外部形态等指标在花器官败育之前人为调控柿花的性别。性别分化相关基因的表达模式分析中,高表达量的ANTLYK3基因对雌花的分化具有一定的促进作用,高表达量的AP2和ABCC10基因有利于雄花的分化。此外,我们推测BI-1基因作为一种雄性器官细胞凋亡抑制基因,间接促进柿雄花芽的发育。因此,建议对树体进行正常的修剪、施肥等常规处理的同时,在4月中旬花器官原基发生败育之前对树体进行相应激素的喷施,以调控柿花性别、培育雄性种质。

参考文献 (39)

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