选取培养于相同条件下的2年生‘香玲’‘Xiangling’核桃嫁接苗用作研究材料。处理包括非生物胁迫[100 g·kg^-1聚乙二醇（PEG 6000），0.3 mol·L^-1氯化钠、低温6 ℃]和激素处理[0.1 mmol·L^-1脱落酸（ABA）]，100.0 mg·L^-1茉莉酸（MeJA）及2.0 mg·L^-1水杨酸（SA）。分别在0，3，6，12，24，48 h取样，以0 h正常浇水作为对照，重复3次·处理^-1。分别收集各处理后的根和叶，用液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱备用。

以“glutathione transferase”为关键词在‘香玲’核桃转录组数据中查找GST基因，经BLAST比对选取其中1条GST基因（命名为JrGSTU23）进行分析。用ORF finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）确定JrGSTU23基因开放读码框（ORF），再根据ORF两端序列设计引物JrGSTU23-F和JrGSTU23-R（表 1），进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。产物经回收纯化后与pMD-18-T载体连接并转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5ɑ感受态细胞。挑取阳性克隆扩大培养进行菌液PCR验证，对获得目的片段的克隆测序。利用Expasy ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）对确认的JrGSTU23基因序列特征进行分析。利用BLASTP（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）进行序列同源性搜索；利用Clustal 3.0软件对不同物种的GST蛋白进行多序列比对和进化分析。使用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析该基因启动子中含有的顺式作用元件。利用Expasy中Swiss Model程序同源建模，推测该蛋白的三维结构模型。

各样品总核糖核酸（RNA）采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）方法提取^[8]，RNA经DNA消化酶处理后采用PrimeScript^TM RT Reagent Kit（CWBIO，康为世纪，中国）反转录为cDNA，稀释10倍后用作实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的模板。qRT-PCR参照SYBR Green Real time PCR Master mix（CWBIO）进行，内参基因为核桃18S rRNA（HE574850）基因^[10]。JrGSTU23定量引物为DL-F和DL-R（表 1）。定量反应仪器为Applied Biosystems生产的Step One^TM Real-Time PCR System。反应程序为：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性12 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，45个循环；81 ℃读板1 s，重复3次·样品^-1。采用2^-ΔΔCt法对定量结果进行相对分析^[11]，所有表达值均做了以2为底的对数转化。

通过查找核桃转录组数据获得1条GST基因，根据获得的cDNA序列设计引物JrGSTU23-F/R进行PCR验证，经分析发现该基因ORF长684 bp，拟推导的蛋白分子量为25.89 kDa，含有氨基酸数为227，理论等电点为5.20。BLAST分析发现：该基因与核桃转录组中的GST23基因相同。保守结构域分析发现：该蛋白具有GST-Tau保守域（图 1），表明该蛋白属于GST氧硫还蛋白亚家族（thioredoxin-line superfamily，Thi），因此命名为JrGSTU23（GeneBank登录号：MG356784）。经美国生物技术信息中心（NCBI）同源搜索获得相似蛋白，并进行进化分析，发现JrGSTU23蛋白与香蕉Musa accuminata，毛果杨Populus trichocarpa等的进化关系较近（图 2）。通过Swiss Model程序同源建模，推测该蛋白的三维结构如图 3所示。]

图  1  JrGSTU23蛋白与其同源蛋白序列的氨基酸聚类分析

Figure 1.  Amino acid sequence alignment between JrGSTU23 and its homologous proteins from other species

图  2  JrGSTU23蛋白与其他物种相似蛋白氨基酸序列的系统进化树分析

Figure 2.  Phylogenetic tree of JrGSTU23 protein and its homologs from other species

图  3  JrGSTU23蛋白三维结构预测模型

Figure 3.  Predicted 3D structure model of protein JrGSTU23

以JrGSTU23在NCBI数据库中进行同源搜索，发现其与‘强特勒’核桃的GST序列（XM_018974105.1）一致。因此，分析XM_018974105.1序列起始密码子上游2 000 bp的DNA序列作为基因启动子，并对其顺式作用元件进行分析，为预测JrGSTU23基因的功能及可能调控机制提供参考依据。PlantCARE预测结果显示，JrGSTU23启动子包含多个与逆境响应及激素调控相关的顺式作用元件，如热胁迫响应元件（HSE），干旱响应元件（MBS），茉莉酸响应元件（CGTCA-motif），水杨酸响应元件（TCA-element）等（表 2）。

对试材分别进行ABA，MeJA，SA等激素处理。qRT-PCR实验发现：JrGSTU23能被这些激素明显诱导，但在根和叶的表达趋势不同（图 4）。在叶中，ABA处理3~6 h被抑制，24 h达最大表达水平（2.85）；MeJA胁迫下与ABA相反，随着胁迫时间延长，JrGSTU23的表达水平逐渐下降，在24 h被抑制（-0.98）；SA胁迫3~6 h也被抑制，在24 h达最大值4.13，但其最低值出现在3 h，为-0.01。在根中，JrGSTU23在ABA胁迫下的最大和最小转录水平分别出现在12和24 h，分别为4.35和2.74；MeJA处理下，该基因的最大和最小表达量分别为7.24（12 h）和2.73（3 h）；而在SA胁迫下，JrGSTU23的表达随胁迫时间延长而增强，最大值为4.57倍（24 h）。表明JrGSTU23基因能不同程度响应ABA，MeJA，SA的胁迫，并表现出组织特异性，但其具体的响应机制可能不同。

图  4  JrGSTU23基因在不同胁迫处理下的表达水平

Figure 4.  Expression level of JrGSTU23 gene under different stresses

qRT-PCR结果显示：JrGSTU23能被氯化钠，聚乙二醇（PEG 6000），6 ℃等不同胁迫明显诱导，且在大多数时间点下的表达差异显著（图 4）。氯化钠胁迫下，JrGSTU23在根和叶中的表达趋势相似，均随着胁迫时间的延长表达增高，在胁迫24 h达最大表达水平，分别为2.49和4.11。但除3 h外，其他处理点该基因在根中的表达水平高于在叶中的表达。PEG 6000模拟干旱胁迫3~12 h，JrGSTU23在叶中的表达被抑制，24 h被诱导为1.76；在根中的表达趋势与氯化钠胁迫相似，随着胁迫时间延长而增大，且在24 h达最高水平，但表达量低于氯化钠胁迫。表明JrGSTU23应对氯化钠和干旱胁迫的响应机制可能相似，但JrGSTU23对盐胁迫可能更为敏感。低温胁迫下，JrGSTU23在叶中的表达在6 h（1.22）和24 h（2.30）出现2个高峰；在根中，其表达趋势与氯化钠和干旱胁迫相似，随着胁迫时间延长而升高，在24 h达最大值（3.06）。

GSTs是植物响应逆境的重要基因，在植物解毒等方面具有重要作用。其中，含有Tau保守结构域的GST亚家族基因，参与植物众多的逆境响应。核桃作为中国西北地区扶贫攻坚项目的重要经济树种，在推动区域经济发展上具有重要作用。核桃产业的健康快速发展与核桃产量和质量息息相关。但气候等环境因子严重制约了中国核桃产业的发展，因此，选育抗逆优良核桃品种，掌握核桃抗逆适应机制，对深入了解核桃的适应性具有重要指导作用。本研究从‘香玲’核桃中克隆获得1条Tau家族的GST基因（JrGSTU23），经进化分析发现该基因与来自水稻、香蕉、毛果杨、大豆Glycine max等物种的Tau家族基因具有较近的亲缘关系，推测其可能与这些蛋白具有相似或相近的功能。如，水稻Osgstu4和Osgstu3能迅速被抗氧化剂和过氧化氢诱导，表明Osgstu4和Osgstu3的应答反应涉及氧化还原反应^[12]。大豆GmGSTU2-2是严格的渗透胁迫型响应基因，参与植物胁迫反应中的催化和调节功能网络^[13]。毛果杨的GSTU16和GSTU45能被三硝基甲苯（2, 4, 6-trinitrotoluene）诱导^[14]。因此，推测JrGSTU23与逆境应答具有重要关系。

顺式作用元件一般由5~20个碱基对组成，是同一DNA分子中具有转录调节功能的特异DNA序列^[15]。海蓬子Salicornia brachiata的一个Tau类GST基因的上游1 023 bp启动子包含有非生物胁迫响应相关的ABA响应元件（ABRE），干旱响应基因rd22识别位点（MYB），结节特意表达元件（NOD），光响应表达元件（GATA），光调控表达元件（GT1）及激素、病害和损伤等相关的顺式作用元件，参与了该基因响应氯化钠和渗透胁迫的表达调控^[16]。玉米Zea mays的ZmCIPK10和ZmZIP71基因启动子序列中含有ABA，SA，赤霉素（GA），低温等相关的顺式作用元件，在氯化钠、干旱、低温胁迫下，ZmCIPK10和ZmZIP71的表达量上升，表明其参与了玉米的逆境响应^[17-18]。本研究发现：JrGSTU23基因启动子含有丰富的顺式作用元件，如玉米素代谢、种子调控、分生组织激活、胚乳表达以及干旱胁迫、热胁迫、防卫、MeJA和SA等响应相关的元件（表 2）。由此可推测，JrGSTU23可能参与植物生长发育及逆境响应过程，具有深入研究的价值。

GSTs基因响应逆境具有组织表达特异性。本研究发现的JrGSTU23基因在不同激素（SA，MeJA，ABA）及不同逆境（氯化钠、干旱、低温）下在根和叶中能被不同程度地诱导表达，体现了一定的组织表达特异性和逆境响应特异性。这与其他物种的Tau家族GST基因的逆境响应表达具有一定的相似性。如从香蕉克隆获得的5个GST基因（MaGSTU1，MaGSTU2，MaGSTU3，MaGSTF1，MaGSTL1）的表达具有组织特异性，在盐、干旱、冷等胁迫下Tau亚家族的MaGSTU1，MaGSTU2，MaGSTU3的表达受盐、干旱、冷诱导更为明显，而MaGSTF1和MaGSTL1更受信号分子影响^[19]，预测这些GST基因对不同逆境的响应功能具有差异。盐胁迫下，番茄Solanum lycopersicum的SlGSTU23和SlGSTU26基因在叶中被上调表达^[20]，推测这些GST基因在不同逆境下的具体功能可能不同。JrGSTTau1在低温胁迫下也表现出根、叶表达差异，过表达提高了植株的抗寒能力^[8]。可见，通过分析基因响应不同逆境的转录水平，可以推测其在逆境响应中可能的生物学功能。JrGSTU23能不同程度地响应激素及非生物胁迫，表明其参与了核桃的逆境响应调控。后续研究将通过在植株中过量表达全面分析JrGSTU23基因的抗逆响应功能。