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核桃抗逆基因JrGSTU23的克隆及表达分析

高向倩 李忆林 贾彩霞 李大培 杨玉婷 杨桂燕

高向倩, 李忆林, 贾彩霞, 李大培, 杨玉婷, 杨桂燕. 核桃抗逆基因JrGSTU23的克隆及表达分析[J]. 浙江农林大学学报, 2018, 35(4): 589-595. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.04.002
引用本文: 高向倩, 李忆林, 贾彩霞, 李大培, 杨玉婷, 杨桂燕. 核桃抗逆基因JrGSTU23的克隆及表达分析[J]. 浙江农林大学学报, 2018, 35(4): 589-595. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.04.002
GAO Xiangqian, LI Yilin, JIA Caixia, LI Dapei, YANG Yuting, YANG Guiyan. Identification and expression analysis of the stress resistance gene JrGSTU23 from Juglans regia[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2018, 35(4): 589-595. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.04.002
Citation: GAO Xiangqian, LI Yilin, JIA Caixia, LI Dapei, YANG Yuting, YANG Guiyan. Identification and expression analysis of the stress resistance gene JrGSTU23 from Juglans regia[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2018, 35(4): 589-595. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.04.002

核桃抗逆基因JrGSTU23的克隆及表达分析

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.04.002
基金项目: 

西北农林科技大学博士科研启动基金资助项目 2014BSJJ038

中央高校基本科研业务费项目 2452015171

中国博士后科学基金特别资助项目 2017T100782

详细信息
    作者简介: 高向倩, 从事林木遗传育种研究。E-mail:1046655468@qq.com
    通信作者: 杨桂燕, 讲师, 博士, 从事林木遗传育种研究。E-mail:yang861026@163.com
  • 中图分类号: S722.3

Identification and expression analysis of the stress resistance gene JrGSTU23 from Juglans regia

图(4) / 表(2)
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-08-25
  • 修回日期:  2017-10-16
  • 刊出日期:  2018-08-20

核桃抗逆基因JrGSTU23的克隆及表达分析

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.04.002
    基金项目:

    西北农林科技大学博士科研启动基金资助项目 2014BSJJ038

    中央高校基本科研业务费项目 2452015171

    中国博士后科学基金特别资助项目 2017T100782

    作者简介:

    高向倩, 从事林木遗传育种研究。E-mail:1046655468@qq.com

    通信作者: 杨桂燕, 讲师, 博士, 从事林木遗传育种研究。E-mail:yang861026@163.com
  • 中图分类号: S722.3

摘要: 谷胱甘肽转移酶GST基因在植物逆境响应中具有重要作用。核桃Juglans regia是重要的经济林木,其生长和产量受环境因子的影响。为探索核桃抗逆生理机制,筛选抗逆基因,以品种‘香玲’‘Xiangling’为试材,克隆获得核桃JrGSTU23基因,并进行生物信息学和基因表达分析,预测JrGSTU23的基本生物功能。结果显示:JrGSTU23基因的开放阅读框(ORF)为684 bp,编码多肽为25.89 kDa,包含氨基酸227,理论等电点为5.20。与碧桃Prunus persica,毛果杨Populus trichocarpa等同源蛋白进行多序列比对,发现均有GST-Tau保守结构域,且与香蕉Musa acuminata和毛果杨等的Tau家族GST蛋白具有较近的进化关系;其上游2 000 bp启动子中含有多种与逆境响应相关的顺式作用元件。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)发现,JrGSTU23在植物激素脱落酸(ABA),茉莉酸(MeJA),水杨酸(SA)和非生物胁迫氯化钠,聚乙二醇(PEG 6000),6℃等胁迫下能不同程度地被诱导表达,且在根和叶中的表达趋势不同。表明JrGSTU23受不同植物激素和非生物胁迫诱导,且具有组织表达特异性,推测其在核桃逆境响应中起到一定作用。

English Abstract

高向倩, 李忆林, 贾彩霞, 李大培, 杨玉婷, 杨桂燕. 核桃抗逆基因JrGSTU23的克隆及表达分析[J]. 浙江农林大学学报, 2018, 35(4): 589-595. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.04.002
引用本文: 高向倩, 李忆林, 贾彩霞, 李大培, 杨玉婷, 杨桂燕. 核桃抗逆基因JrGSTU23的克隆及表达分析[J]. 浙江农林大学学报, 2018, 35(4): 589-595. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.04.002
GAO Xiangqian, LI Yilin, JIA Caixia, LI Dapei, YANG Yuting, YANG Guiyan. Identification and expression analysis of the stress resistance gene JrGSTU23 from Juglans regia[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2018, 35(4): 589-595. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.04.002
Citation: GAO Xiangqian, LI Yilin, JIA Caixia, LI Dapei, YANG Yuting, YANG Guiyan. Identification and expression analysis of the stress resistance gene JrGSTU23 from Juglans regia[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2018, 35(4): 589-595. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.04.002
  • 谷胱甘肽转移酶(GSTs)是一个多功能的二聚体酶超家族,具有解毒、清除细胞内活性氧等功能[1]。在植物中,GSTs根据其功能和序列等特征被分为8个亚家族:alpha,mu,pi,sigma,theta,kappa,zeta和线粒体(microsomal)GSTs[1-3]。目前,很多植物中的GST基因被陆续克隆[4-5],并进行功能研究,发现来自不同植物的GST同源基因或相同植株的不同GST基因,其功能具有一定差异。大多数GSTs基因具有响应逆境胁迫的功能。如前期研究发现,柽柳Tamarix hispida的zeta家族基因ThGSTZ1能被氯化钠,聚乙二醇(PEG 6000),脱落酸(ABA)和甲基紫精(MV)等胁迫调控,过量表达情况下能提高转基因株系抵抗盐、旱、MV及ABA等胁迫的能力[6-7]。核桃Juglans regiaJrGSTTau1基因也能响应不同逆境刺激,过量表达能改善植株应对低温胁迫的能力[8]。在羽衣甘蓝Brassica oleracea中分离获得65个GST基因,其中BoGSTU19,BoGSTU24,BoGSTF10能被冷胁迫强诱导,推测它们与冷胁迫响应具有重要关系[9]。水稻Oryza sativa OsGSTl2转基因拟南芥Arabidopsis thaliana表现出较高的重金属耐受力[10]。这些研究表明:GST基因在植物响应逆境应答及调节中具有多方面的作用,因此具有重要的研究价值。GST家族成员众多,目前对GST基因的研究主要集中在草本植物,对木本植物GST基因的研究较少,特别是经济干果核桃鲜见报道。核桃属多年生落叶乔木,是中国主要经济树种之一。近年来全球环境的变化,环境因子特别是西北地区越冬入春出现的“倒春寒”及夏秋核桃成熟期严重的高温干旱等气候现象,严重制约了核桃产业的发展。因此,筛选核桃逆境响应重要基因,研究其逆境响应功能机制,将对了解核桃的逆境适应机制具有指导作用。本研究从核桃中鉴定获得1条GST基因JrGSTU23,通过生物信息及定量表达分析其生物学功能,以期为核桃抗逆响应研究提供候选基因。

    • 选取培养于相同条件下的2年生‘香玲’‘Xiangling’核桃嫁接苗用作研究材料。处理包括非生物胁迫[100 g·kg-1聚乙二醇(PEG 6000),0.3 mol·L-1氯化钠、低温6 ℃]和激素处理[0.1 mmol·L-1脱落酸(ABA)],100.0 mg·L-1茉莉酸(MeJA)及2.0 mg·L-1水杨酸(SA)。分别在0,3,6,12,24,48 h取样,以0 h正常浇水作为对照,重复3次·处理-1。分别收集各处理后的根和叶,用液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱备用。

    • 以“glutathione transferase”为关键词在‘香玲’核桃转录组数据中查找GST基因,经BLAST比对选取其中1条GST基因(命名为JrGSTU23)进行分析。用ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)确定JrGSTU23基因开放读码框(ORF),再根据ORF两端序列设计引物JrGSTU23-F和JrGSTU23-R(表 1),进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。产物经回收纯化后与pMD-18-T载体连接并转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5ɑ感受态细胞。挑取阳性克隆扩大培养进行菌液PCR验证,对获得目的片段的克隆测序。利用Expasy ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)对确认的JrGSTU23基因序列特征进行分析。利用BLASTP(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)进行序列同源性搜索;利用Clustal 3.0软件对不同物种的GST蛋白进行多序列比对和进化分析。使用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析该基因启动子中含有的顺式作用元件。利用Expasy中Swiss Model程序同源建模,推测该蛋白的三维结构模型。

      表 1  研究所用引物

      Table 1.  The used primers

      引物名称 正向引物(5′→3′) 反向引物(5′→3′)
      18SrRNA GGTCAATCTTCTCGTTCCCTT TCGCATTTCGCTACGTTCTT
      JrGSTU23-DL-F/JrGSTU23-DL-R GTGAAGCTGATTGCCACT GTCCTTCCATGTCTCCTC
      JrGSTU23-F/JrGSTU23-R ATGGGGGATAAGGTGAAG TCATGGTGTATTGGCTGC
    • 各样品总核糖核酸(RNA)采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方法提取[8],RNA经DNA消化酶处理后采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit(CWBIO,康为世纪,中国)反转录为cDNA,稀释10倍后用作实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的模板。qRT-PCR参照SYBR Green Real time PCR Master mix(CWBIO)进行,内参基因为核桃18S rRNAHE574850)基因[10]JrGSTU23定量引物为DL-F和DL-R(表 1)。定量反应仪器为Applied Biosystems生产的Step OneTM Real-Time PCR System。反应程序为:94 ℃预变性30 s;94 ℃变性12 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,45个循环;81 ℃读板1 s,重复3次·样品-1。采用2-ΔΔCt法对定量结果进行相对分析[11],所有表达值均做了以2为底的对数转化。

    • 通过查找核桃转录组数据获得1条GST基因,根据获得的cDNA序列设计引物JrGSTU23-F/R进行PCR验证,经分析发现该基因ORF长684 bp,拟推导的蛋白分子量为25.89 kDa,含有氨基酸数为227,理论等电点为5.20。BLAST分析发现:该基因与核桃转录组中的GST23基因相同。保守结构域分析发现:该蛋白具有GST-Tau保守域(图 1),表明该蛋白属于GST氧硫还蛋白亚家族(thioredoxin-line superfamily,Thi),因此命名为JrGSTU23(GeneBank登录号:MG356784)。经美国生物技术信息中心(NCBI)同源搜索获得相似蛋白,并进行进化分析,发现JrGSTU23蛋白与香蕉Musa accuminata,毛果杨Populus trichocarpa等的进化关系较近(图 2)。通过Swiss Model程序同源建模,推测该蛋白的三维结构如图 3所示。]

      图  1  JrGSTU23蛋白与其同源蛋白序列的氨基酸聚类分析

      Figure 1.  Amino acid sequence alignment between JrGSTU23 and its homologous proteins from other species

      图  2  JrGSTU23蛋白与其他物种相似蛋白氨基酸序列的系统进化树分析

      Figure 2.  Phylogenetic tree of JrGSTU23 protein and its homologs from other species

      图  3  JrGSTU23蛋白三维结构预测模型

      Figure 3.  Predicted 3D structure model of protein JrGSTU23

    • JrGSTU23在NCBI数据库中进行同源搜索,发现其与‘强特勒’核桃的GST序列(XM_018974105.1)一致。因此,分析XM_018974105.1序列起始密码子上游2 000 bp的DNA序列作为基因启动子,并对其顺式作用元件进行分析,为预测JrGSTU23基因的功能及可能调控机制提供参考依据。PlantCARE预测结果显示,JrGSTU23启动子包含多个与逆境响应及激素调控相关的顺式作用元件,如热胁迫响应元件(HSE),干旱响应元件(MBS),茉莉酸响应元件(CGTCA-motif),水杨酸响应元件(TCA-element)等(表 2)。

      表 2  PlantCARE预测JrGSTU23启动子区顺式作用元件

      Table 2.  Cis-acting regulatory elements in JrGSTU23 promoter predicted by PlantCARE

      顺式作用元件 起始位点 方向 序列 特性
      AT-rich element 1 436 + ATAGAAATCAA ATBP-1结合位点
      ATC-motif 1 125 + AGTAATCT 光响应
      Box 4 298/353/302/368 +/+/+/+ ATTAAT
      Box Ⅰ 344/453 -/+ TTTCAAA
      GAG-motif 121/157 -/- AGAGATG
      GATA-motif 1 235 + GATAGGG
      1-box 1 235/1 249 +/- GATAGGG/GATATGG
      Sp1 1 147/1 354 +/+ CC (G/A) CCC
      chs-CMA2a 580 - GCAATTCC
      CCGTCC-box 1 157 + CCGTCC 分生组织激活
      CGTCA-motif 197 + CGTCA 茉莉酸响应
      TGACG-motif 197 - TGACG
      HSE 126 - AGAAAATTCG 热胁迫响应
      MBS 669 - TAACTG 干旱胁迫响应
      02-site 1 249 - GATGATATGG 玉米素代谢调控
      RY-element 645 + CATGCATG 种子调控
      Skn-1 motif 379 - GTCAT 胚乳表达
      TC-rich repeats 393 + ATTTTCTTCA 防卫和胁迫响应
      TCA-element 316 + CCATCTTTTT 水杨酸响应
      TCA-element 192 + AACGAC 激素响应元件
      WUN-motif 736 TCATTACGAA 创伤响应元件
    • 对试材分别进行ABA,MeJA,SA等激素处理。qRT-PCR实验发现:JrGSTU23能被这些激素明显诱导,但在根和叶的表达趋势不同(图 4)。在叶中,ABA处理3~6 h被抑制,24 h达最大表达水平(2.85);MeJA胁迫下与ABA相反,随着胁迫时间延长,JrGSTU23的表达水平逐渐下降,在24 h被抑制(-0.98);SA胁迫3~6 h也被抑制,在24 h达最大值4.13,但其最低值出现在3 h,为-0.01。在根中,JrGSTU23在ABA胁迫下的最大和最小转录水平分别出现在12和24 h,分别为4.35和2.74;MeJA处理下,该基因的最大和最小表达量分别为7.24(12 h)和2.73(3 h);而在SA胁迫下,JrGSTU23的表达随胁迫时间延长而增强,最大值为4.57倍(24 h)。表明JrGSTU23基因能不同程度响应ABA,MeJA,SA的胁迫,并表现出组织特异性,但其具体的响应机制可能不同。

      图  4  JrGSTU23基因在不同胁迫处理下的表达水平

      Figure 4.  Expression level of JrGSTU23 gene under different stresses

    • qRT-PCR结果显示:JrGSTU23能被氯化钠,聚乙二醇(PEG 6000),6 ℃等不同胁迫明显诱导,且在大多数时间点下的表达差异显著(图 4)。氯化钠胁迫下,JrGSTU23在根和叶中的表达趋势相似,均随着胁迫时间的延长表达增高,在胁迫24 h达最大表达水平,分别为2.49和4.11。但除3 h外,其他处理点该基因在根中的表达水平高于在叶中的表达。PEG 6000模拟干旱胁迫3~12 h,JrGSTU23在叶中的表达被抑制,24 h被诱导为1.76;在根中的表达趋势与氯化钠胁迫相似,随着胁迫时间延长而增大,且在24 h达最高水平,但表达量低于氯化钠胁迫。表明JrGSTU23应对氯化钠和干旱胁迫的响应机制可能相似,但JrGSTU23对盐胁迫可能更为敏感。低温胁迫下,JrGSTU23在叶中的表达在6 h(1.22)和24 h(2.30)出现2个高峰;在根中,其表达趋势与氯化钠和干旱胁迫相似,随着胁迫时间延长而升高,在24 h达最大值(3.06)。

    • GSTs是植物响应逆境的重要基因,在植物解毒等方面具有重要作用。其中,含有Tau保守结构域的GST亚家族基因,参与植物众多的逆境响应。核桃作为中国西北地区扶贫攻坚项目的重要经济树种,在推动区域经济发展上具有重要作用。核桃产业的健康快速发展与核桃产量和质量息息相关。但气候等环境因子严重制约了中国核桃产业的发展,因此,选育抗逆优良核桃品种,掌握核桃抗逆适应机制,对深入了解核桃的适应性具有重要指导作用。本研究从‘香玲’核桃中克隆获得1条Tau家族的GST基因(JrGSTU23),经进化分析发现该基因与来自水稻、香蕉、毛果杨、大豆Glycine max等物种的Tau家族基因具有较近的亲缘关系,推测其可能与这些蛋白具有相似或相近的功能。如,水稻Osgstu4和Osgstu3能迅速被抗氧化剂和过氧化氢诱导,表明Osgstu4和Osgstu3的应答反应涉及氧化还原反应[12]。大豆GmGSTU2-2是严格的渗透胁迫型响应基因,参与植物胁迫反应中的催化和调节功能网络[13]。毛果杨的GSTU16和GSTU45能被三硝基甲苯(2, 4, 6-trinitrotoluene)诱导[14]。因此,推测JrGSTU23与逆境应答具有重要关系。

      顺式作用元件一般由5~20个碱基对组成,是同一DNA分子中具有转录调节功能的特异DNA序列[15]。海蓬子Salicornia brachiata的一个Tau类GST基因的上游1 023 bp启动子包含有非生物胁迫响应相关的ABA响应元件(ABRE),干旱响应基因rd22识别位点(MYB),结节特意表达元件(NOD),光响应表达元件(GATA),光调控表达元件(GT1)及激素、病害和损伤等相关的顺式作用元件,参与了该基因响应氯化钠和渗透胁迫的表达调控[16]。玉米Zea maysZmCIPK10和ZmZIP71基因启动子序列中含有ABA,SA,赤霉素(GA),低温等相关的顺式作用元件,在氯化钠、干旱、低温胁迫下,ZmCIPK10和ZmZIP71的表达量上升,表明其参与了玉米的逆境响应[17-18]。本研究发现:JrGSTU23基因启动子含有丰富的顺式作用元件,如玉米素代谢、种子调控、分生组织激活、胚乳表达以及干旱胁迫、热胁迫、防卫、MeJA和SA等响应相关的元件(表 2)。由此可推测,JrGSTU23可能参与植物生长发育及逆境响应过程,具有深入研究的价值。

      GSTs基因响应逆境具有组织表达特异性。本研究发现的JrGSTU23基因在不同激素(SA,MeJA,ABA)及不同逆境(氯化钠、干旱、低温)下在根和叶中能被不同程度地诱导表达,体现了一定的组织表达特异性和逆境响应特异性。这与其他物种的Tau家族GST基因的逆境响应表达具有一定的相似性。如从香蕉克隆获得的5个GST基因(MaGSTU1,MaGSTU2,MaGSTU3,MaGSTF1,MaGSTL1)的表达具有组织特异性,在盐、干旱、冷等胁迫下Tau亚家族的MaGSTU1,MaGSTU2,MaGSTU3的表达受盐、干旱、冷诱导更为明显,而MaGSTF1和MaGSTL1更受信号分子影响[19],预测这些GST基因对不同逆境的响应功能具有差异。盐胁迫下,番茄Solanum lycopersicumSlGSTU23和SlGSTU26基因在叶中被上调表达[20],推测这些GST基因在不同逆境下的具体功能可能不同。JrGSTTau1在低温胁迫下也表现出根、叶表达差异,过表达提高了植株的抗寒能力[8]。可见,通过分析基因响应不同逆境的转录水平,可以推测其在逆境响应中可能的生物学功能。JrGSTU23能不同程度地响应激素及非生物胁迫,表明其参与了核桃的逆境响应调控。后续研究将通过在植株中过量表达全面分析JrGSTU23基因的抗逆响应功能。

参考文献 (20)

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