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谷胱甘肽转移酶（GSTs）是一个多功能的二聚体酶超家族，具有解毒、清除细胞内活性氧等功能[1]。在植物中，GSTs根据其功能和序列等特征被分为8个亚家族：alpha，mu，pi，sigma，theta，kappa，zeta和线粒体（microsomal）GSTs[1-3]。目前，很多植物中的GST基因被陆续克隆[4-5]，并进行功能研究，发现来自不同植物的GST同源基因或相同植株的不同GST基因，其功能具有一定差异。大多数GSTs基因具有响应逆境胁迫的功能。如前期研究发现，柽柳Tamarix hispida的zeta家族基因ThGSTZ1能被氯化钠，聚乙二醇（PEG 6000），脱落酸（ABA）和甲基紫精（MV）等胁迫调控，过量表达情况下能提高转基因株系抵抗盐、旱、MV及ABA等胁迫的能力[6-7]。核桃Juglans regia的JrGSTTau1基因也能响应不同逆境刺激，过量表达能改善植株应对低温胁迫的能力[8]。在羽衣甘蓝Brassica oleracea中分离获得65个GST基因，其中BoGSTU19，BoGSTU24，BoGSTF10能被冷胁迫强诱导，推测它们与冷胁迫响应具有重要关系[9]。水稻Oryza sativa OsGSTl2转基因拟南芥Arabidopsis thaliana表现出较高的重金属耐受力[10]。这些研究表明：GST基因在植物响应逆境应答及调节中具有多方面的作用，因此具有重要的研究价值。GST家族成员众多，目前对GST基因的研究主要集中在草本植物，对木本植物GST基因的研究较少，特别是经济干果核桃鲜见报道。核桃属多年生落叶乔木，是中国主要经济树种之一。近年来全球环境的变化，环境因子特别是西北地区越冬入春出现的“倒春寒”及夏秋核桃成熟期严重的高温干旱等气候现象，严重制约了核桃产业的发展。因此，筛选核桃逆境响应重要基因，研究其逆境响应功能机制，将对了解核桃的逆境适应机制具有指导作用。本研究从核桃中鉴定获得1条GST基因JrGSTU23，通过生物信息及定量表达分析其生物学功能，以期为核桃抗逆响应研究提供候选基因。
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选取培养于相同条件下的2年生‘香玲’‘Xiangling’核桃嫁接苗用作研究材料。处理包括非生物胁迫[100 g·kg-1聚乙二醇（PEG 6000），0.3 mol·L-1氯化钠、低温6 ℃]和激素处理[0.1 mmol·L-1脱落酸（ABA）]，100.0 mg·L-1茉莉酸（MeJA）及2.0 mg·L-1水杨酸（SA）。分别在0，3，6，12，24，48 h取样，以0 h正常浇水作为对照，重复3次·处理-1。分别收集各处理后的根和叶，用液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱备用。
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以“glutathione transferase”为关键词在‘香玲’核桃转录组数据中查找GST基因，经BLAST比对选取其中1条GST基因（命名为JrGSTU23）进行分析。用ORF finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）确定JrGSTU23基因开放读码框（ORF），再根据ORF两端序列设计引物JrGSTU23-F和JrGSTU23-R（表 1），进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。产物经回收纯化后与pMD-18-T载体连接并转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5ɑ感受态细胞。挑取阳性克隆扩大培养进行菌液PCR验证，对获得目的片段的克隆测序。利用Expasy ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）对确认的JrGSTU23基因序列特征进行分析。利用BLASTP（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）进行序列同源性搜索；利用Clustal 3.0软件对不同物种的GST蛋白进行多序列比对和进化分析。使用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析该基因启动子中含有的顺式作用元件。利用Expasy中Swiss Model程序同源建模，推测该蛋白的三维结构模型。
表 1 研究所用引物
Table 1. The used primers
引物名称 正向引物(5′→3′) 反向引物(5′→3′) 18SrRNA GGTCAATCTTCTCGTTCCCTT TCGCATTTCGCTACGTTCTT JrGSTU23-DL-F/JrGSTU23-DL-R GTGAAGCTGATTGCCACT GTCCTTCCATGTCTCCTC JrGSTU23-F/JrGSTU23-R ATGGGGGATAAGGTGAAG TCATGGTGTATTGGCTGC -
各样品总核糖核酸（RNA）采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）方法提取[8]，RNA经DNA消化酶处理后采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit（CWBIO，康为世纪，中国）反转录为cDNA，稀释10倍后用作实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的模板。qRT-PCR参照SYBR Green Real time PCR Master mix（CWBIO）进行，内参基因为核桃18S rRNA（HE574850）基因[10]。JrGSTU23定量引物为DL-F和DL-R（表 1）。定量反应仪器为Applied Biosystems生产的Step OneTM Real-Time PCR System。反应程序为：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性12 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，45个循环；81 ℃读板1 s，重复3次·样品-1。采用2-ΔΔCt法对定量结果进行相对分析[11]，所有表达值均做了以2为底的对数转化。
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通过查找核桃转录组数据获得1条GST基因，根据获得的cDNA序列设计引物JrGSTU23-F/R进行PCR验证，经分析发现该基因ORF长684 bp，拟推导的蛋白分子量为25.89 kDa，含有氨基酸数为227，理论等电点为5.20。BLAST分析发现：该基因与核桃转录组中的GST23基因相同。保守结构域分析发现：该蛋白具有GST-Tau保守域（图 1），表明该蛋白属于GST氧硫还蛋白亚家族（thioredoxin-line superfamily，Thi），因此命名为JrGSTU23（GeneBank登录号：MG356784）。经美国生物技术信息中心（NCBI）同源搜索获得相似蛋白，并进行进化分析，发现JrGSTU23蛋白与香蕉Musa accuminata，毛果杨Populus trichocarpa等的进化关系较近（图 2）。通过Swiss Model程序同源建模，推测该蛋白的三维结构如图 3所示。]
图 1 JrGSTU23蛋白与其同源蛋白序列的氨基酸聚类分析
Figure 1. Amino acid sequence alignment between JrGSTU23 and its homologous proteins from other species
图 2 JrGSTU23蛋白与其他物种相似蛋白氨基酸序列的系统进化树分析
Figure 2. Phylogenetic tree of JrGSTU23 protein and its homologs from other species
图 3 JrGSTU23蛋白三维结构预测模型
Figure 3. Predicted 3D structure model of protein JrGSTU23
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以JrGSTU23在NCBI数据库中进行同源搜索，发现其与‘强特勒’核桃的GST序列（XM_018974105.1）一致。因此，分析XM_018974105.1序列起始密码子上游2 000 bp的DNA序列作为基因启动子，并对其顺式作用元件进行分析，为预测JrGSTU23基因的功能及可能调控机制提供参考依据。PlantCARE预测结果显示，JrGSTU23启动子包含多个与逆境响应及激素调控相关的顺式作用元件，如热胁迫响应元件（HSE），干旱响应元件（MBS），茉莉酸响应元件（CGTCA-motif），水杨酸响应元件（TCA-element）等（表 2）。
表 2 PlantCARE预测JrGSTU23启动子区顺式作用元件
Table 2. Cis-acting regulatory elements in JrGSTU23 promoter predicted by PlantCARE
顺式作用元件 起始位点 方向 序列 特性 AT-rich element 1 436 + ATAGAAATCAA ATBP-1结合位点 ATC-motif 1 125 + AGTAATCT 光响应 Box 4 298/353/302/368 +/+/+/+ ATTAAT Box Ⅰ 344/453 -/+ TTTCAAA GAG-motif 121/157 -/- AGAGATG GATA-motif 1 235 + GATAGGG 1-box 1 235/1 249 +/- GATAGGG/GATATGG Sp1 1 147/1 354 +/+ CC (G/A) CCC chs-CMA2a 580 - GCAATTCC CCGTCC-box 1 157 + CCGTCC 分生组织激活 CGTCA-motif 197 + CGTCA 茉莉酸响应 TGACG-motif 197 - TGACG HSE 126 - AGAAAATTCG 热胁迫响应 MBS 669 - TAACTG 干旱胁迫响应 02-site 1 249 - GATGATATGG 玉米素代谢调控 RY-element 645 + CATGCATG 种子调控 Skn-1 motif 379 - GTCAT 胚乳表达 TC-rich repeats 393 + ATTTTCTTCA 防卫和胁迫响应 TCA-element 316 + CCATCTTTTT 水杨酸响应 TCA-element 192 + AACGAC 激素响应元件 WUN-motif 736 TCATTACGAA 创伤响应元件 -
对试材分别进行ABA，MeJA，SA等激素处理。qRT-PCR实验发现：JrGSTU23能被这些激素明显诱导，但在根和叶的表达趋势不同（图 4）。在叶中，ABA处理3~6 h被抑制，24 h达最大表达水平（2.85）；MeJA胁迫下与ABA相反，随着胁迫时间延长，JrGSTU23的表达水平逐渐下降，在24 h被抑制（-0.98）；SA胁迫3~6 h也被抑制，在24 h达最大值4.13，但其最低值出现在3 h，为-0.01。在根中，JrGSTU23在ABA胁迫下的最大和最小转录水平分别出现在12和24 h，分别为4.35和2.74；MeJA处理下，该基因的最大和最小表达量分别为7.24（12 h）和2.73（3 h）；而在SA胁迫下，JrGSTU23的表达随胁迫时间延长而增强，最大值为4.57倍（24 h）。表明JrGSTU23基因能不同程度响应ABA，MeJA，SA的胁迫，并表现出组织特异性，但其具体的响应机制可能不同。
图 4 JrGSTU23基因在不同胁迫处理下的表达水平
Figure 4. Expression level of JrGSTU23 gene under different stresses
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qRT-PCR结果显示：JrGSTU23能被氯化钠，聚乙二醇（PEG 6000），6 ℃等不同胁迫明显诱导，且在大多数时间点下的表达差异显著（图 4）。氯化钠胁迫下，JrGSTU23在根和叶中的表达趋势相似，均随着胁迫时间的延长表达增高，在胁迫24 h达最大表达水平，分别为2.49和4.11。但除3 h外，其他处理点该基因在根中的表达水平高于在叶中的表达。PEG 6000模拟干旱胁迫3~12 h，JrGSTU23在叶中的表达被抑制，24 h被诱导为1.76；在根中的表达趋势与氯化钠胁迫相似，随着胁迫时间延长而增大，且在24 h达最高水平，但表达量低于氯化钠胁迫。表明JrGSTU23应对氯化钠和干旱胁迫的响应机制可能相似，但JrGSTU23对盐胁迫可能更为敏感。低温胁迫下，JrGSTU23在叶中的表达在6 h（1.22）和24 h（2.30）出现2个高峰；在根中，其表达趋势与氯化钠和干旱胁迫相似，随着胁迫时间延长而升高，在24 h达最大值（3.06）。
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GSTs是植物响应逆境的重要基因，在植物解毒等方面具有重要作用。其中，含有Tau保守结构域的GST亚家族基因，参与植物众多的逆境响应。核桃作为中国西北地区扶贫攻坚项目的重要经济树种，在推动区域经济发展上具有重要作用。核桃产业的健康快速发展与核桃产量和质量息息相关。但气候等环境因子严重制约了中国核桃产业的发展，因此，选育抗逆优良核桃品种，掌握核桃抗逆适应机制，对深入了解核桃的适应性具有重要指导作用。本研究从‘香玲’核桃中克隆获得1条Tau家族的GST基因（JrGSTU23），经进化分析发现该基因与来自水稻、香蕉、毛果杨、大豆Glycine max等物种的Tau家族基因具有较近的亲缘关系，推测其可能与这些蛋白具有相似或相近的功能。如，水稻Osgstu4和Osgstu3能迅速被抗氧化剂和过氧化氢诱导，表明Osgstu4和Osgstu3的应答反应涉及氧化还原反应[12]。大豆GmGSTU2-2是严格的渗透胁迫型响应基因，参与植物胁迫反应中的催化和调节功能网络[13]。毛果杨的GSTU16和GSTU45能被三硝基甲苯（2, 4, 6-trinitrotoluene）诱导[14]。因此，推测JrGSTU23与逆境应答具有重要关系。
顺式作用元件一般由5~20个碱基对组成，是同一DNA分子中具有转录调节功能的特异DNA序列[15]。海蓬子Salicornia brachiata的一个Tau类GST基因的上游1 023 bp启动子包含有非生物胁迫响应相关的ABA响应元件（ABRE），干旱响应基因rd22识别位点（MYB），结节特意表达元件（NOD），光响应表达元件（GATA），光调控表达元件（GT1）及激素、病害和损伤等相关的顺式作用元件，参与了该基因响应氯化钠和渗透胁迫的表达调控[16]。玉米Zea mays的ZmCIPK10和ZmZIP71基因启动子序列中含有ABA，SA，赤霉素（GA），低温等相关的顺式作用元件，在氯化钠、干旱、低温胁迫下，ZmCIPK10和ZmZIP71的表达量上升，表明其参与了玉米的逆境响应[17-18]。本研究发现：JrGSTU23基因启动子含有丰富的顺式作用元件，如玉米素代谢、种子调控、分生组织激活、胚乳表达以及干旱胁迫、热胁迫、防卫、MeJA和SA等响应相关的元件（表 2）。由此可推测，JrGSTU23可能参与植物生长发育及逆境响应过程，具有深入研究的价值。
GSTs基因响应逆境具有组织表达特异性。本研究发现的JrGSTU23基因在不同激素（SA，MeJA，ABA）及不同逆境（氯化钠、干旱、低温）下在根和叶中能被不同程度地诱导表达，体现了一定的组织表达特异性和逆境响应特异性。这与其他物种的Tau家族GST基因的逆境响应表达具有一定的相似性。如从香蕉克隆获得的5个GST基因（MaGSTU1，MaGSTU2，MaGSTU3，MaGSTF1，MaGSTL1）的表达具有组织特异性，在盐、干旱、冷等胁迫下Tau亚家族的MaGSTU1，MaGSTU2，MaGSTU3的表达受盐、干旱、冷诱导更为明显，而MaGSTF1和MaGSTL1更受信号分子影响[19]，预测这些GST基因对不同逆境的响应功能具有差异。盐胁迫下，番茄Solanum lycopersicum的SlGSTU23和SlGSTU26基因在叶中被上调表达[20]，推测这些GST基因在不同逆境下的具体功能可能不同。JrGSTTau1在低温胁迫下也表现出根、叶表达差异，过表达提高了植株的抗寒能力[8]。可见，通过分析基因响应不同逆境的转录水平，可以推测其在逆境响应中可能的生物学功能。JrGSTU23能不同程度地响应激素及非生物胁迫，表明其参与了核桃的逆境响应调控。后续研究将通过在植株中过量表达全面分析JrGSTU23基因的抗逆响应功能。
Identification and expression analysis of the stress resistance gene JrGSTU23 from Juglans regia
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摘要: 谷胱甘肽转移酶GST基因在植物逆境响应中具有重要作用。核桃Juglans regia是重要的经济林木，其生长和产量受环境因子的影响。为探索核桃抗逆生理机制，筛选抗逆基因，以品种‘香玲’‘Xiangling’为试材，克隆获得核桃JrGSTU23基因，并进行生物信息学和基因表达分析，预测JrGSTU23的基本生物功能。结果显示：JrGSTU23基因的开放阅读框（ORF）为684 bp，编码多肽为25.89 kDa，包含氨基酸227，理论等电点为5.20。与碧桃Prunus persica，毛果杨Populus trichocarpa等同源蛋白进行多序列比对，发现均有GST-Tau保守结构域，且与香蕉Musa acuminata和毛果杨等的Tau家族GST蛋白具有较近的进化关系；其上游2 000 bp启动子中含有多种与逆境响应相关的顺式作用元件。实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）发现，JrGSTU23在植物激素脱落酸（ABA），茉莉酸（MeJA），水杨酸（SA）和非生物胁迫氯化钠，聚乙二醇（PEG 6000），6℃等胁迫下能不同程度地被诱导表达，且在根和叶中的表达趋势不同。表明JrGSTU23受不同植物激素和非生物胁迫诱导，且具有组织表达特异性，推测其在核桃逆境响应中起到一定作用。Abstract: The glutathione S-transferase (GST) gene, an important player in plant stress response, could benefit Juglans regia, a widely planted walnut tree with important economic value that has been affected by adverse environmental factors. To better explore the resistance of walnut trees and to screen the genes related to stress resistance, a Tau subfamily GST gene from Juglans regia 'Xiangling' (JrGSTU23) was cloned, and its biological function was analyzed through bioinformatics and gene expression analysis. A qRT-PCR was applied to analyze expression profiles of JrGSTU23. Results showed that the open reading frame (ORF) of the JrGSTU23 gene was 684 bp, the coding polypeptide was 25.89 kDa, the amino acid was 227, and the theoretical isoelectric point was 5.20. The JrGSTU23 protein contained GST-Tau conserved domain as other homologous, such as the GSTs from Prunus persica, Populus trichocarpa, Ipomoea batatas, and Medicago truncatula, and shared close evolution with the Tau subfamily GST proteins from Musa acuminata and P. trichocarpa. The up-stream 2 000 bp promoter of JrGSTU23 was identified from the genome of J. regia; cis-elements included abiotic stress and hormone regulation relating motifs, such as the heat response element (HSE) and the drought response element(MBS). The qRT-PCR showed that the JrGSTU23 gene could be induced by plant hormone sabscisic acid (ABA), methyl jasmonate (MeJA), and salicylic acid (SA), and abiotic stresses of NaCl, PEG 6000, and 6℃. Also, expression profiles of the JrGSTU23 gene were specific in roots and leaves. Thus, the walnut JrGSTU23 gene which could be induced by different plant hormones and abiotic stresses and showed tissue specificity, could provide a potentially positive response to adverse environmental factors and hormone stresses in walnut.
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Key words:
- forest tree breeding /
- Juglans regia /
- GST gene /
- gene expression /
- stresses /
- promoter
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近年来，全球气候的持续变化加剧了干旱对森林的威胁[1]。以往研究表明：水力安全阈值(导水率损失50%时的水势与最小水势差)与年均降水量无关，这意味着干旱引发的森林衰退存在全球趋同现象[2]。在严重干旱后的数年内，植物普遍存在生长缓慢和恢复不完全的遗留效应，植物生长强弱根据水力安全阈值而异[2-3]，生长在湿润地区的植物受遗留效应的影响，恢复能力较弱，难以在未来更为频繁的干旱威胁下正常生长，从而导致湿润区生态系统的永久损伤，并进一步造成森林碳汇的普遍退化[4]。通过对湿润区不同水分环境植物的研究，有助于理解水分有效性对湿润区植物生存策略的影响。
水力失效是干旱期间植物生产力下降和死亡的主要原因[5]。水分供需矛盾的加剧迫使更多空气进入木质部管道，由此产生的栓塞阻碍了植物的水分运输，最终导致水力失效。植物的输水效率常通过植物茎的比导率(Ks)来衡量[6]，湿润生境下的植物倾向于最大化输水效率而非增加木质部对栓塞的抵抗力以满足生长需求[7]。栓塞抗性(植物导水率损失50%的水势，P50)常用来表征植物应对干旱的能力[6]。研究表明：植物的栓塞抗性与干旱胁迫强度呈正相关[2, 8]。当水势降至P50以下时，木质部栓塞加速，水力运输功能明显受阻。通过对水力性状的研究，有助于描述不同植物水力策略的范围，进而深入理解植物的驱动因素[9]。
裸子植物和被子植物的木质部结构差异较大[10-11]，管胞在运输和支撑方面发挥作用，导管则仅具有运输功能。依赖纤维提供木材强度[12-13]，厚度跨度比及纹孔形态作为管壁的重要特征，与栓塞抗性密切相关[14]。输水效率由管腔面积及管道密度决定。根据Hagen-Poiseuill定律[15]，木质部管腔面积分数的减少可以通过增大管道尺寸弥补。相比由管胞构成的裸子植物木质部，被子植物复杂的木质部结构可独立改变导管结构以优化运输，为机械强度或储存功能提供更大的木质部空间[16]。
环境水分有效性对植物的水力策略具有选择性，从而驱动植物群落的分布[17]。本研究通过比较7种裸子植物和7种被子植物在不同生境下的栓塞抗性、输水效率和解剖结构的性状差异，探究植物水力性状与木质部解剖结构的关系，以期为研究湿润区亚热带植物在不同水分条件下的水力适应策略提供参考。
1. 研究区概况
研究区位于浙江省杭州市临安区，该区地处中亚热带向北亚热带过渡区域，四季分明，区内年平均气温为8.8~14.8 ℃，年降水量为1 390~1 870 mm，无霜期为209~235 d，相对湿度为76%~81%。在研究区内选择自然和人工生境进行植物样本采集(表1)。自然生境位于西天目山景区，除自然降水外无额外灌溉。植被类型以常绿-落叶阔叶混交林为主，除研究树种外(表2)，其他常见树种有北美香柏Thuja occidentalis、短尾柯Lithocarpus brevicaudatus、榧树Torreya grandis和榉树Zelkova serrata等。人工生境为浙江农林大学植物园，相比自然生境土壤水分有效性高，人工灌溉充分。除研究树种外(表2)，其他常见树种有枫香Liquidambar formosana、桂花Osmanthus fragrans、冬青Ilex chinensis、垂柳Salix babylonica和竹柏Podocarpus nagi等。
表 1 自然和人工生境的基本特征Table 1 Basic characteristics for study sites in natural and artificial habitats生境 经纬度 海拔/m 坡向 坡度/(°) pH 生长季土壤含水量/% 自然生境 30°26′N, 119°73′E 400~450 西南 9~12 4.85±0.16 29.53±1.21 人工生境 30°15′N, 119°43′E 51~74 西南 15~20 5.23±0.12 35.98±1.22 说明：pH和生长季土壤含水量数值为平均值±标准误(n=3) 表 2 7种裸子植物和7种被子植物基本概况Table 2 Basic overview of 7 species of gymnosperms and 7 species of angiospermae植物 科 植物 生长习性 生活型 裸子植物 杉科 Taxodiaceae 柳杉 Cryptomeria japonica 落叶 乔木 松科 Pinaceae 金钱松 Pseudolarix amabilis 落叶 乔木 杉科 Taxodiaceae 落羽杉 Taxodium distichum 落叶 乔木 杉科 Taxodiaceae 杉木 Cunninghamia lanceolata 常绿 乔木 松科 Pinaceae 雪松 Cedrus deodara 常绿 乔木 柏科 Cupressaceae 日本扁柏 Chamaecyparis obtusa 常绿 乔木 杉科 Taxodiaceae 北美红杉 Sequoia sempervirens 常绿 乔木 被子植物 槭树科 Aceraceae 三角槭 Acer buergerianum 落叶 乔木 大戟科 Euphorbiaceae 重阳木 Bischofia polycarpa 落叶 乔木 胡桃科 Juglandacea 青钱柳 Cyclocarya paliurus 落叶 乔木 壳斗科 Fagaceae 青冈 Cyclobalanopsis glauca 常绿 乔木 木犀科 Oleaceae 女贞 Ligustrum lucidum 常绿 乔木 木兰科 Magnoliaceae 广玉兰 Magnolia grandiflora 常绿 乔木 樟科 Lauraceae 樟树 Cinnamomum bodinieri 常绿 乔木 2. 材料与方法
2.1 材料
2021年4—6月，在不同生境下选取生长状况良好的7种裸子植物和7种被子植物作为目标物种(表2)。选择同一生境下立地条件基本一致，且胸径、树高、树龄、冠幅等相近的同一植物15~21株。在天气晴朗的8:00—11:00采集枝条，所选枝条均位于树体南部外层和树冠中部。每株随机截取3~5个枝条，所剪枝条基部直径为6~8 mm，长为15~30 cm。剪取后迅速放入装有水的黑色收纳箱中(防止水分散失和外界空气等进入被切开的导管内)，立即带回实验室，进行水力功能性状和结构性状的测定。
2.2 研究方法
2.2.1 导水率与栓塞抗性
采回样品在水中暗适应30~60 min后，在水下再次剪短样品，并修平切口。裸子植物剪取枝段平均长度为134.23 mm，平均直径为4.95 mm，被子植物剪取枝段平均长度为160.04 mm，平均直径为5.47 mm。本研究采用空气注入法构建枝段脆弱性曲线，具体如下：将枝段放入压力腔，并将枝段近轴端连接到木质部导水率与栓塞测量系统XYL’EM-Plus (Bronkhorst, Montigny-les-Cormeilles, 法国)。使用测量溶液20 mmol·L−1 氯化钾+1 mmol·L−1 氯化钙[18]，在高压(120 kPa)下反复冲刷枝段10 min至最大导水率不再变化，以确保潜在栓塞被去除。在低压(6 kPa)下测量枝段的最大导水率(Kmax，kg·m·s−1·MPa−1)[19]。在确定Kmax后，对枝段施加压力2 min，用测量Kmax的方法测量相应的导水率(Kh，kg·m·s−1·MPa−1)。该过程以0.2~0.3 MPa的增量重复进行(取决于植物)，直到导水率损失(PLC)至少达到90%[20]。采用XylWin 3.2软件(Bronkhorst, Montigny-les-Cormeilles, 法国)对其导水数据进行分析。比导率(Ks，kg·s−1·m−1·MPa−1)作为输水效率指标，通过Kmax除以无髓和树皮的基部边材横截面积得到[19]。导水率损失百分比计算如下：PLC=(1−Kh/Kmax)×100%[21]。导水率损失50%时的水势(P50)作为本研究的栓塞抗性指标。
2.2.2 木质部解剖结构
从测定导水率的枝段上截取0.5 cm长小段样品，固定软化后，采用石蜡切片法制成永久切片，所用样品的横切面用Leica DM 3000显微镜在50和400倍镜下摄像，所有样品的纵切面在400倍镜下摄像。用Image J图像处理软件分析照片，测量管胞壁厚度(μm)及导管壁厚度(μm)，并计算管胞水力直径(μm)、导管水力直径(μm)、管胞密度(个·mm−2)、导管密度(个·mm−2)、厚度跨度比。根据文献[22]计算管胞水力直径和导管水力直径。管胞密度和导管密度分别通过横截面管胞数量和导管数量除以横截面面积得到。管胞壁和导管壁厚度跨度比具体测量方法可参考相关文献[14, 23]。
2.2.3 木质部密度
从测定导水率的枝段上截取3根3~5 cm的小枝段，用于木质部密度(WD, g·cm−3)测量。参考文献[24]方法：用刀片除去枝段样品树皮，利用阿基米德原理确定样品的新鲜体积(V，cm3)；测得体积后，将样品置于75 ℃烘箱烘48 h，测得干质量(W，g)，则WD=W/V。
2.2.4 数据分析
图表制作与统计分析利用R软件(version 3.5.3)。同一植物在不同生境下各水力性状和解剖结构性状的差异，在除去异常值后，在种内进行t检验。植物枝水力性状与解剖结构性状间的关系采用Pearson相关性分析。文中所有数值为平均值±标准误。
3. 结果与分析
3.1 植物水力功能性状
在植物输水效率方面，自然生境下6种被子植物的Ks显著大于人工生境(P＜0.05，图1A)，且被子植物Ks的均值显著大于人工生境(P＜0.05，图1B)。在栓塞抗性方面，自然生境下7种被子植物的P50均显著小于人工生境(P＜0.05，图1C)，且被子植物P50的均值显著小于人工生境(P＜0.05，图1D)。
图 1 自然与人工生境下7种被子植物的水力功能性状Figure 1 Hydraulic functional characteristics of 7 species of angiosperms in natural and artificial habitats在植物输水效率方面，自然生境下5种裸子植物的Ks显著大于人工生境(P＜0.05，图2A)，但裸子植物Ks的均值在不同生境间差异不显著(P＞0.05，图2B)。在栓塞抗性方面，自然生境下6种裸子植物的P50显著小于人工生境(P＜0.05，图2C)，且裸子植物P50的均值显著小于人工生境(P＜0.05，图2D)。
图 2 自然与人工生境下7种裸子植物的水力功能性状Figure 2 Hydraulic functional characteristics of 7 species of gymnosperms in natural and artificial habitats对14种被子植物和裸子植物的输水效率和栓塞抗性比较发现：自然生境植物的Ks均值显著大于人工生境(P＜0.05，图3A)，自然生境植物的P50显著小于人工生境(P＜0.05，图3B)。
图 3 不同生境下14种植物的水力功能性状Figure 3 Hydraulic functional characteristics of 14 studied plants in different habitats3.2 木质部解剖结构
从被子植物的解剖结构可以看出：自然生境下5种被子植物的水力直径显著大于人工生境(P＜0.05，图4A)；5种被子植物的导管壁厚度显著小于人工生境(P＜0.05，图4B)；5种被子植物的厚度跨度比显著小于人工生境(P＜0.05，图4C)；樟树、青钱柳、女贞的导管密度显著小于人工生境，其余4种被子植物则相反(P＜0.05，图4D)；不同生境下，三角槭、青钱柳、女贞的木质部密度无显著差异，重阳木、樟树、广玉兰的木质部密度显著小于人工生境，青冈的木质部密度显著大于人工生境(P＜0.05，图4E)。
图 4 自然与人工生境下7种被子植物的木质部解剖结构特征Figure 4 Characteristics of xylem anatomical structure of 7 species of angiosperms in natural and artificial habitats从裸子植物的解剖结构可以看出：自然生境雪松、落羽杉、北美红杉的水力直径显著小于人工生境，柳杉、杉木、金钱松的水力直径显著大于人工生境(P＜0.05，图5A)；柳杉、杉木、北美红杉的管胞壁厚度显著大于人工生境，日本扁柏、金钱松、落羽杉的管胞壁厚度显著小于人工生境(P＜0.05，图5B)；柳杉、杉木、北美红杉的厚度跨度比显著大于人工生境，日本扁柏、金钱松、落羽杉的厚度跨度比显著小于人工生境(P＜0.05，图5C)；雪松、柳杉、日本扁柏的导管密度显著大于人工生境，杉木、金钱柳、北美红杉的导管密度显著小于人工生境(P＜0.05，图5D)；雪松、金钱松的木质部密度均显著大于人工生境，杉木、日本扁柏、落羽杉的木质部密度均显著小于人工生境(P＜0.05，图5E)。
图 5 自然与人工生境下7种裸子植物的木质部解剖结构特征Figure 5 Characteristics of xylem anatomical structure of 7 species of gymnosperms in natural and artificial habitats3.3 水力功能性状与解剖结构性状的相关性
被子植物水力功能性状与木质部解剖结构性状相关性分析表明(图6A和图6B)：自然生境下，导管密度、厚度跨度比与Ks和P50均呈正相关，其中导管密度与Ks、P50相关极显著(P＜0.01)。水力直径、导管壁厚度、木质部密度与Ks和P50均呈负相关，其中水力直径与Ks、P50相关极显著(P＜0.01)；人工生境下，水力直径、导管壁厚度与Ks和P50均呈正相关关系，且相关极显著(P＜0.01)，厚度跨度比、导管密度、木质部密度与Ks及P50均呈负相关，除厚度跨度比外，其他指标间相关性均极显著(P＜0.01)。此外，被子植物的水力直径与Ks和P50在自然生境均为负相关，在人工生境则均为正相关，导管密度与Ks和P50在自然生境均为正相关，在人工生境则均为负相关。
图 6 被子植物和裸子植物水力功能性状与解剖结构性状的相关性Figure 6 Correlation analysis between hydraulic function and anatomical structure traits of angiosperms and gymnosperms.裸子植物水力功能性状与木质部解剖结构性状相关性分析表明(图6C和图6D)：自然生境下，水力直径与Ks呈显著正相关(P＜0.01)，与P50呈显著负相关(P＜0.01)。管胞密度与Ks呈显著负相关(P＜0.01)，与P50则呈显著正相关(P＜0.01)；人工生境下，水力直径与Ks正相关，与P50负相关，且与Ks、P50相关性均极显著(P＜0.01)，其余性状与Ks均呈负相关(P＜0.05)，与P50均正相关，其中厚度跨度比、导管密度、木质部密度与P50相关显著(P＜0.05)。此外，裸子植物水力直径、管胞密度在不同生境下均与Ks、P50保持一致相关性，其中水力直径与Ks呈显著正相关(P＜0.05)，与P50呈显著负相关(P＜0.05)。管胞密度与Ks呈极显著负相关(P＜0.01)，与P50呈极显著正相关(P＜0.01)。
4. 讨论
4.1 不同生境植物水力性状与解剖结构的差异
以往研究表明：相比于干燥环境，水分充足环境下的同一植物的Ks通常较高[2, 7]。本研究中，除被子植物青钱柳及裸子植物落羽杉、北美红杉外，自然生境中植物的Ks显著大于人工生境，表明自然生境的植物拥有更高的输水效率，这与上述研究结果一致。MAHERALI等[25]指出：相比于高山环境，西黄松Pinus ponderosa在沙漠环境的Ks较高；MAHERALI等[26]研究表明：落叶被子植物Ks随生境降水量的降低而增加，因此植物通过增加输水效率以适应相对干旱环境的生存策略可能较为普遍。Hagen-Poiseuill定律表明：更高的输水效率需要较大的导管直径以满足功能需求[15]，然而本研究植物较大的水力直径并未与更高的输水效率一一对应，与上述定律存在一定的偏差[27]。
植物的栓塞抗性受环境控制的假设已被证实[20, 28]。通常认为，植物的栓塞抗性随栖息地干旱程度的加剧而增加[2, 8]。本研究中除裸子植物落羽杉外，植物的栓塞抗性在自然生境显著较低，表明人工生境植物的栓塞抗性更强，这与HAJEK等[29]研究结果一致。不同生境同一植物的栓塞抗性差异显著[2]，这与先前报道植物的栓塞抗性可塑性较低不符[30-31]，生境干旱水平对植物栓塞抗性的预测亦存在偏差[32]，栓塞抗性可能与生境水分差异无关[33]。通常植物栓塞抗性的强弱与木质部机械强度息息相关，厚度跨度比可独立于导管直径而变化，因此相比于木质部密度，厚度跨度比对植物栓塞抗性的预测效果更好[14, 23]。本研究结果与上述观点一致，厚度跨度比能更好指示栓塞抗性在不同生境的强弱。
水分条件的差异促使植物采取不同的水力策略。本研究中，自然生境下的植物通过提高输水效率以满足蒸发需求的加剧[25-26]，减轻对栓塞抗性的依赖[34]。表明栓塞抗性并非唯一的抗旱手段，植物亦可通过有效的性状组合应对干旱胁迫[33, 35]，尽管这将迫使植物更接近其自身的功能极限[2]。落羽杉、北美红杉均为杉科植物，两者在应对持续水分胁迫后脱落酸(ABA)含量较低[36]。先前研究表明[37]：当植物处于轻度水分胁迫且脱落酸水平较低时，导水效率会相应提升，这可能意味着湿润区人工生境同样面临着干旱威胁。
4.2 水力性状与解剖结构的关系
人工生境被子植物的水力直径、导管密度与Ks、P50间存在显著相关性，这可能是纤维对木质部机械强度的驱动所造成[38]，纤维与导管的功能差异可能导致输水效率与机械支持解隅[39]，使植物在提升输水效率的同时最大化木质部安全投资。裸子植物木质部多达90%由管胞构成，管胞具有水力运输和机械支持的功能[12, 16]，本研究中裸子植物的水力直径、管胞密度在不同生境下的相关性均与Ks、P50保持一致，可能与裸子植物的稳定组织结构有关。其中管胞水力直径与Ks的关系符合Hagen-Poiseuill定律[15]，且更宽的管胞往往更长，管胞的输水效率随管胞直径和长度的增加而增加[40]。此外，不同生境下裸子植物的厚度跨度比与管胞水力直径呈显著负相关，与管胞壁厚度呈显著正相关，表明裸子植物是通过缩小管胞直径而非管胞壁厚度以实现机械强度的增加[41]。本研究中裸子植物的管胞密度均与不同生境Ks呈显著负相关，与P50呈显著正相关，这与上述观点一致。拥有较小管胞直径、较大管胞密度的裸子植物，其栓塞抗性可能更强[28]。具有较高机械强度的植物其栓塞抗性通常较强[14]。本研究中自然生境下植物的P50变异范围较小，这可能导致P50变异与解剖特征无关[31]。此外，被子植物木材结构属性在一定程度决定了P50的变异[42]，针对木质部不同组织结构的投资亦会对P50的变异产生影响[14, 35]，这些因素在一定程度上解释了人工生境下被子植物的厚度跨度比与P50的负相关关系。本研究中除自然生境被子植物外，不同物种、生境下的水力直径均与Ks呈显著正相关。尽管植物平均导管直径和导管密度存在显著差异，但导管横截面积差异可能较小[38]，自然生境下被子植物导管腔面积分数的差异可能导致输水效率并未与水力直径相对应[43]。
5. 结论
湿润区裸子植物和被子植物在同一生境的水分利用策略相似，自然生境水分有效性较低，植物通过提高输水效率以避免水势的下降，从而降低潜在栓塞风险。裸子植物与被子植物木质部结构与功能的差异可能是同一生境下植物水分策略存在差异的主要原因，导致不同水分环境对植物的驱动差异。植物性状对植物水分策略具有一定指示作用，厚度跨度比在本研究中能较好预测植物栓塞抗性在不同生境的强弱，对植物性状更为深入的研究将有助于提升对植物群落分布的理解。
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图 1 JrGSTU23蛋白与其同源蛋白序列的氨基酸聚类分析
Figure 1 Amino acid sequence alignment between JrGSTU23 and its homologous proteins from other species
图 2 JrGSTU23蛋白与其他物种相似蛋白氨基酸序列的系统进化树分析
Figure 2 Phylogenetic tree of JrGSTU23 protein and its homologs from other species
图 4 JrGSTU23基因在不同胁迫处理下的表达水平
Figure 4 Expression level of JrGSTU23 gene under different stresses
表 1 研究所用引物
Table 1. The used primers
引物名称 正向引物(5′→3′) 反向引物(5′→3′) 18SrRNA GGTCAATCTTCTCGTTCCCTT TCGCATTTCGCTACGTTCTT JrGSTU23-DL-F/JrGSTU23-DL-R GTGAAGCTGATTGCCACT GTCCTTCCATGTCTCCTC JrGSTU23-F/JrGSTU23-R ATGGGGGATAAGGTGAAG TCATGGTGTATTGGCTGC 
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表 2 PlantCARE预测JrGSTU23启动子区顺式作用元件
Table 2. Cis-acting regulatory elements in JrGSTU23 promoter predicted by PlantCARE
顺式作用元件 起始位点 方向 序列 特性 AT-rich element 1 436 + ATAGAAATCAA ATBP-1结合位点 ATC-motif 1 125 + AGTAATCT 光响应 Box 4 298/353/302/368 +/+/+/+ ATTAAT Box Ⅰ 344/453 -/+ TTTCAAA GAG-motif 121/157 -/- AGAGATG GATA-motif 1 235 + GATAGGG 1-box 1 235/1 249 +/- GATAGGG/GATATGG Sp1 1 147/1 354 +/+ CC (G/A) CCC chs-CMA2a 580 - GCAATTCC CCGTCC-box 1 157 + CCGTCC 分生组织激活 CGTCA-motif 197 + CGTCA 茉莉酸响应 TGACG-motif 197 - TGACG HSE 126 - AGAAAATTCG 热胁迫响应 MBS 669 - TAACTG 干旱胁迫响应 02-site 1 249 - GATGATATGG 玉米素代谢调控 RY-element 645 + CATGCATG 种子调控 Skn-1 motif 379 - GTCAT 胚乳表达 TC-rich repeats 393 + ATTTTCTTCA 防卫和胁迫响应 TCA-element 316 + CCATCTTTTT 水杨酸响应 TCA-element 192 + AACGAC 激素响应元件 WUN-motif 736 TCATTACGAA 创伤响应元件
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2018.04.002
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