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氮素在森林生态系统的能量流动与物质循环过程中有着非常重要的作用[1-2]。长期氮沉降以及人类活动干扰等，造成全球氮(N)沉降的增加，对自然生态系统产生了一系列影响[2-3]。研究表明：即使在没有物理扰动的情况下，长期氮沉降也会通过降低碳周转率、改变氮的有效性和转化来影响温带森林生态系统的生物地球化学循环[4]。此外，也有研究表明：氮添加会通过改变凋落叶特性(碳、氮、磷变化)对其养分分解速率产生影响[3]。据报道，中国已成为全球第三大氮沉降地区，大气含氮化合物增长迅速[5]。在未来几十年中氮沉降继续增加的背景下，研究氮沉降对森林凋落物养分分解的影响显得尤为重要[6-7]。凋落物在森林生态系统组成中占据重要地位，它的分解也会对森林生态系统的生物地球化学循环产生相当大的影响[8-9]。凋落物分解不仅是林下土壤有机质形成所需碳源以及土壤养分的主要来源，而且对于土壤质地的构建、肥力的维持、微生物代谢的调控都起重大作用，并且通过这一系列作用进而影响微生物的群落结构[10-11]。大果木姜子Cinnamomum migao又名米槁，系樟科Lauraceae樟属Cinnamomum常绿乔木，主要分布于中国广西、云南、贵州三省交界的南北盘江、红水河流域，为中国特有种。其果实常常被苗族作为治疗胃肠道疾病的传统药物，并且疗效卓越。21世纪初，贵州省科学技术厅以及贵州省民族医药研究所确定大果木姜子为贵州省的道地药材[12]。近年来，随着其药用价值的提高，大果木姜子野生资源受到极大破坏，在《中国生物多样性红色名录——高等植物卷》(2013版)已将其列为近危种，野外资源储量极其有限。目前，相关学者对大果木姜子的研究报道还不是很全面，主要集中在果实精油、脂肪油、挥发油化学成分分析[13]、药用成分的药理作用与生物活性[14-15]、栽培技术与病虫害防治[12]、地理分布[15]、生物生理特性[16-17]等方面。大果木姜子凋落叶的分解对氮沉降增加的响应规律还未见报道。本研究通过野外模拟氮沉降的试验，探讨不同施氮处理对大果木姜子凋落叶养分分解的影响，以期探讨大果木姜子凋落叶分解对外源氮添加的响应机制，且为其物质循环机理研究提供理论依据。
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贵州省罗甸县位于云贵高原和丘陵过渡的斜坡地带，四季呈现春早、夏长、秋迟、冬短的特点，因其特殊的地势与优良的自然环境被称为大果木姜子生长的典型生境。试验样地设置于罗甸县逢亭镇西部的祥林村6年生大果木姜子药材种植基地，地处25°15′41′′N，106°31′03′′E，海拔524 m。属于亚热带季风气候，年平均气温20.6 ℃，≥10 ℃年积温为6 125.0 ℃，年降水量1200.0 mm，无霜期335.0~349.5 d，年均日照时数1 448.9 h。试验区土壤为酸性黄壤，土层厚度≥40 cm。于2017年1月初在试验地设置12块大小为3 m×5 m的样地进行试验。
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以2010年中国大气氮沉降特征分析中贵州的氮沉降总和低于15 g·m−2·a−1为依据，本研究从低到高设置4个氮处理，即对照(ck，0 g·m−2·a−1)、低氮(N1，5 g·m−2·a−1)、中氮(N2，15 g·m−2·a−1)和高氮(N3，30 g·m−2·a−1)，每处理重复3次。为消除环境异质性的影响，各样地之间间隔5 m。按照试验设计要求，每个处理设定样方面积为3 m×5 m，将各样方每次所需喷施的NH4NO3溶解于20 L自来水中，采用按压式喷壶来回均匀喷洒至样地，ck组喷洒等量的水。于试验2017年1月进行首次施氮试验，共喷洒3次，分别于1、5、9月取样完成，重新放置尼龙袋后进行等量施氮。
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凋落叶分解试验于2017年1月开始进行，采用尼龙网袋分解方法。准备540个25 cm × 25 cm的分解袋，每个样地放置45袋。试验前于罗甸县大果木姜子林种植基地收集大果木姜子凋落叶带回实验室，清洗风干后装入分解袋中，10.00 g·袋−1。试验期间放置在12个施氮处理样地中(分解袋放置前修整空地表面枯枝落叶层，平铺网袋，使其尽可能接近自然分解状态。每次放置好尼龙袋后立即喷施氮源)。每隔2个月于各样地随机收取3袋分解袋，用刷子清除每次取回分解袋表面的泥垢后，置于75 ℃烘箱烘干至质量恒定，称其质量用于计算凋落叶质量损失率。然后研磨过孔径0.5 mm尼龙筛，保存备用。质量损失率(W)：W=Xt/X0×100%。其中：X0为凋落叶初始质量，Xt为分解t时间后凋落叶质量。
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凋落叶全氮质量分数采用H2SO4-H2O2 靛酚蓝比色法测定，全磷质量分数采用钼锑抗显色法测定，全钾质量分数采用HClO4+HNO3消煮-原子吸收分光光度法测定，碳质量分数采用浓硫酸-重铬酸钾法测定。凋落叶各元素的残留率按照下式计算。元素残留率(R)：R=XtCt/X0C0×100%。其中：X0为凋落叶初始质量，Xt为分解t时间后凋落叶的质量，C0为凋落叶初始养分质量分数，Ct为t采样时间凋落叶养分质量分数。
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运用Excel和SPSS 18.0软件进行初步统计分析，采用最小显著差法(LSD)多重方差显著性检验凋落叶质量损失率、残留率和养分质量分数与不同施氮处理间的差异显著性，利用Olson 负指数衰减模型(y=ae−Kt)对质量残留率与时间的关系进行拟合，其中：y为质量残留率(%)，a为拟合参数，K为分解系数，t为时间(a)。利用Origin 2018绘制图表。
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图1显示：1−9月各处理凋落叶质量损失率随着时间的推移表现为迅速递增趋势，其中ck凋落叶质量损失率大于其他处理；9月以后各处理凋落叶分解速率趋于平缓。整个分解试验过程中，N3处理凋落叶质量损失率为0~53.35%，且始终低于其他处理。9月以前，N1、N2处理凋落叶质量损失率显著高于N3处理(P＜0.05)，即凋落叶质量损失率从大到小依次为N2、N1、N3；分解结束时(11月)，各处理凋落叶质量损失率从大到小依次为N2、ck、N1、N3。
图 1 不同处理下大果木姜子凋落叶质量损失率
Figure 1. Change of mass loss rate and residual rate of leaf litter of C. migao under the condition of different treatments
从表1可以看出：4个处理的拟合模型R2均大于0.9000，且达到显著水平(P＜0.05)，其中N3处理Olson模型的拟合效果最佳。ck处理的凋落叶质量分解系数最大(K=0.085)，N3处理最小(K=0.060)。N1、N2、N3处理凋落叶分解95%所需时间分别比ck长0.653、0.312、0.698 a，其中N3处理下凋落叶分解时间所需最长。综合表明：氮添加延缓了大果木姜子凋落叶的分解。
表 1 不同处理大果木姜子凋落叶质量残留率(y)随时间(x)变化的Olson模型
Table 1. Decomposition rate model of litter residue rate (y) with time (x) under different treatments
处理 分解方程 分解系数(K) 决定系数(R2) 相关系数(r) 显著性 凋落叶分解50%所需时间/月 凋落叶分解95%所需时间/a ck y=81.727e−0.085x 0.085 0.970 −0.944 0.005 8.155 2.973 N1 y=81.666e−0.067x 0.067 0.948 −0.940 0.005 10.045 3.626 N2 y=87.461e−0.076x 0.076 0.907 −0.963 0.002 9.120 3.285 N3 y=87.319e−0.068x 0.060 0.977 −0.951 0.004 10.193 3.671 -
由图2可知：各处理凋落叶碳质量数总体均呈下降趋势，且分解前期(1−5月)下降较快，后期(5−11月)下降较慢。各处理凋落叶全氮质量分数变化趋势基本相同，整体上均呈先增加后降低的趋势，其中9月最高。各处理凋落叶全磷与全钾质量分数变化趋势相似，即在分解初期下降，之后整体上升，最后趋于平稳。
图 2 不同处理下大果木姜子凋落叶分解过程中养分的变化
Figure 2. Change of different treatments on nutrient content of C. migao leaves during decomposition
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由图3可以看出：由于碳元素主要以有机形式存在于凋落叶中，受淋溶影响，各处理碳残留率呈降低趋势，其中分解各时段3个施氮处理碳残留率整体上显著高于ck(P＜0.05)。ck的全氮残留率整体上呈先上升后下降再上升后下降趋势，各施氮处理的全氮残留率整体上呈先上升后下降趋势；1−7月，各处理全磷残留率呈先下降后升高再下降的趋势；7月之后，N1、N2、N3处理全磷的残留率趋于稳定，ck处理全磷残留率呈先上升后下降趋势。1−3月，各处理全钾残留率迅速降低，3月之后各处理全钾残留率总体呈增加趋势，整体表现为淋溶—富集—释放模式。
图 3 不同处理下大果木姜子凋落叶分解过程中元素残留率的变化
Figure 3. Change of different treatments on element residual rate of C. migao leaves during decomposition
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从图4可以看出：试验期间各处理C/N为24.60~177.51，整体表现出下降趋势。分解前期(1−7月) C/N下降速度较快，后期(7−11月)变化总体上比较平稳。在分解各时间段，ck的C/N基本高于其他各施氮处理。在试验前期(1−7月) ck处理与各施氮处理间有显著差异(P＜0.05)；试验后期(7−11月) ck组与N1、N2处理差异显著(P＜0.05)，与N3差异不显著(P＞0.05)。总体来看，添加氮降低了大果木姜子凋落叶的C/N。
图 4 不同处理下大果木姜子凋落叶分解过程中C/N的变化
Figure 4. Change of different treatments on C/N during decomposition of C. migao leaves
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凋落叶分解速率的大小受到气候、凋落叶分解质量、微生物类型及作用等条件的影响[8]。目前，关于氮添加对凋落物分解速率的影响主要分为促进、抑制和无影响3种，这主要取决于施氮量的高低及施氮时间的长短。O’ CONNELL[18]分析了施加外源氮对桉树Eucalyptus凋落物分解及养分含量变化的影响。研究结果表明：施氮处理下凋落物分解释放速率变慢。郑欣颖等[19]模拟外源氮添加对火力楠Michelia macclurei凋落叶分解影响，结果显示：氮添加会促进凋落叶的分解。樊后保等[20]通过对杉木Cunninghamia lanceo-lata人工林凋落物施加外源氮，结果出现了“低促高抑”现象。文海燕等[21]对长芒草Stipa bungeana和阿尔泰狗娃花Heteropappus altaicus进行凋落叶模拟氮沉降试验。结果发现：氮添加对2种植物凋落叶分解无影响。
本研究结果显示：氮添加对大果木姜子凋落叶分解具有一定的抑制作用。大果木姜子凋落叶质量年损失率表现为ck高于各施氮处理，其中N3处理质量损失率最低。这是因为试验过程中施加外源氮的量超过了试验样地土壤所需氮的阈值，从而使凋落叶分解过程中起主要作用的微生物分解效率降低，进而对凋落叶的分解表现出抑制作用[22-23]。凋落叶分解本身具有的养分特性也会使凋落叶在不同分解阶段表现出不同规律，通常为前期分解较快，后期变慢。这是因为分解初期凋落物自身养分含量较高，可通过养分流失调控分解速率；随着养分的流失，后期则通过难分解的木质素和纤维来调控养分分解，所以分解速率表现为前期大于后期，且随着时间推移逐渐变慢[21-23]。在本研究前期(3−9月)，大果木姜子凋落叶质量损失率迅速增加，主要是因为此时凋落叶的质量大，易分解物质含量高，导致凋落叶分解速率随着易分解物质的分解而加快；试验后期(9−11月)分解速率缓慢且质量损失率趋于平缓，这与后期凋落叶中易分解物质减少，难分解物质含量升高有关[24-25]。
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土壤是植被生长过程中主要矿质营养的来源，而凋落物分解释放的养分归还是土壤肥力的重要来源(植物生长发育过程中从土壤中吸收的养分70%~90%得益于凋落物的分解释放)[26]，因此，在森林生态系统中，凋落物的分解在植被养分循环过程中起着至关重要的作用。碳元素作为地球一切生命的基本单元，既是植物生长发育的基础又是维持植物生活的能量来源，氮和磷元素是氨基酸、核苷酸的重要组成元素，钾元素是调节细胞内外适宜渗透压和体液酸碱平衡，参与胞内糖和蛋白质代谢的重要阳离子。4种元素都是植物生命过程中不可缺少的[27-28]。研究表明：植物生长过程所需的养分分别有70%~80%的氮、65%~80%的磷和30%~40%的钾来自凋落物的分解释放[29]。
本研究中，5−11月各施氮处理碳质量分数显著低于ck(P＜0.05)，而氮质量分数表现相反。这是因为外源氮的添加使凋落叶中碳氮转化酶活性发生改变而影响两者的质量分数，且氮添加抑制了纤维素等物质的降解从而使凋落叶分解过程出现“碳封存”状态。凋落叶分解过程中，外界氮源的输入以及原生质素伴随自身固氮菌的侵入逐渐增加使氮质量分数增加[20]，因此，C/N随着分解时间变长而总体下降。试验期间，凋落叶中全磷、全钾变化不稳定，各处理差异显著。11月凋落叶全磷质量分数表现为N1、N2、N3处理高于ck，且N2、N3差异显著(P＜0.05)，说明氮添加促进了大果木姜子凋落叶中全磷质量分数的积累，且施加氮的量越大表现出的差异越显著(P＜0.05)。这与国内外多数研究结果相同，如BERG等[30]模拟氮沉降对樟子松Pinus sylvestris凋落叶养分分解影响研究表明：氮添加促进了凋落叶中全氮、全磷质量分数的积累。肖银龙等[31]模拟氮沉降对苦竹Pleioblastus amarus林凋落叶养分分解的研究同样表明：氮添加促进全氮、全磷的积累。本研究中，11月N1和N2处钾质量分数高于ck，而N3处理低于ck，说明添加过多的氮对凋落叶中全钾具有抑制作用，这是因为氮添加到土壤后，大量的氮以NO3−的形式淋失，为了达到土壤中养分电荷平衡，必然会带走等量的盐基离子(K+)[32-33]。
凋落物中的C/N一般比较高，不利于微生物的活动，而增施氮肥后有利于微生物数量的增加，从而促进凋落物的分解。本研究中土壤本身氮质量分数较高，再增施氮肥使其超过了“临界值”，打破了土壤中养分平衡，从而氮添加对大果木姜子凋落叶分解表现出抑制作用[22]。
综上所述，在氮添加的情况下，不利于大果木姜子凋落叶分解及养分的释放，其中N3处理作用更显著。凋落物分解后养分归还于土壤，再次作用于植物，但土壤养分输入对氮添加作何响应，还需进一步进行模拟探究。
Effects of nitrogen addition on decomposition and nutrient release of Cinnamomum migao litter leaves
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摘要:
目的 研究不同施氮水平对大果木姜子Cinnamomum migao凋落叶养分分解的影响。 方法 于2017年1月，以药用植物大果木姜子人工林凋落叶为研究对象，将凋落叶清洗风干后装入分解袋中，每袋10.00 g。试验期间放置在不同施氮处理[对照(ck，0 g·m−2·a−1)、N1(5 g·m−2·a−1)、N2(15 g·m−2·a−1)、N3(30 g·m−2·a−1)]样地中，每处理3个重复，分别于试验的3、5、7、9、11月采集凋落叶样品，测定凋落叶质量及养分质量分数的变化，分析氮沉降对大果木姜子凋落叶养分释放动态影响。 结果 凋落叶分解试验结束时，各施氮组凋落叶质量损失率整体小于ck，凋落叶残留率整体大于ck，且N2与ck差异不显著，N2、N3差异显著(P＜0.05)，ck、N1、N2、N3凋落叶分解95%时所需的时间分别为2.973、3.626、3.285、3.671 a；各处理凋落叶碳质量分数总体均呈下降趋势，全氮质量分数整体上均呈先增加后降低的趋势，全磷与全钾质量分数变化趋势相似，为分解初期下降，之后整体上升，最后趋于平稳；各处理凋落叶碳、全磷、全钾残留率总体呈降低趋势，全氮残留率整体上呈先上升后下降趋势。其中分解各时段各施氮处理碳残留率均显著高于ck (P＜0.05)；随着时间推移，ck处理氮的残留率呈先上升后下降趋势，各施氮处理的氮残留率整体上呈先上升后下降趋势；整个分解过程中各施氮组碳氮比均小于ck，且分解前期与ck表现出显著差异(P＜0.05)。 结论 添加氮不利于大果木姜子凋落叶的分解及养分的释放，且施氮越多抑制分解作用更显著。图4表1参33 Abstract:Objective This research aims to examine the effects of different nitrogen application levels on nutrient decomposition of Cinnamomum migao litter leaves. Method In January 2017, the litter leaves of the medicinal plant C. migao were taken as the research object. The leaves were washed, air dried and put into decomposition bags, 10.00 g each. Nitrogen treatments were designed as ck(0 g·m−2·a−1), N1(5 g·m−2·a−1), N2(15 g·m−2·a−1), and N3(30 g·m−2·a−1), and there were three repetitions for each treatment. The samples of litter leaves were collected in March, May, July, September and November, respectively. The quality and nutrient contents of the leaves were measured, and the dynamic effects of nitrogen deposition on nutrient release from the leaves were analyzed. Result At the end of litter decomposition experiment, the mass loss rate of litter leaves in all nitrogen application groups was lower than that of ck, the residue rate of litter was higher than that of ck. The difference between N2 and ck was not significant, but the difference between N2 and N3 was significant (P＜0.05). The time needed for 95% decomposition of ck, N1, N2 and N3 was 2.973, 3.626, 3.285 and 3.671 a, respectively. In the leaves of all treatments, the content of C decreased and the content of total N increased first and then decreased, while the content of total P and total K was similar, which decreased at the initial stage of decomposition, then increased as a whole, and finally stabilized. The residual rates of C, total P, total K in the leaves decreased, while the residue rates of total N increased first and then decreased. The residual rate of C in each nitrogen treatment was significantly higher than that of ck (P＜0.05). With the passage of time, the residue rate of N, which increased first and then decreased in ck treatment, showed an overall upward and then downward trend in each nitrogen application treatment. C/N ratio of each nitrogen application group was lower than that of ck in the whole decomposition process, and there was a significant difference between the early decomposition stage and ck (P＜0.05). Conclusion Nitrogen addition is not conducive to the decomposition and nutrient release of litter leaves. The more nitrogen is applied, the more obvious the inhibition of decomposition is.[Ch, 4 fig. 1 tab. 33 ref.] -
Key words:
- forest ecology /
- nitrogen deposition /
- Cinnamomum migao /
- litter decomposition /
- nutrient release
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无论是脊椎动物还是无脊椎动物，先天性免疫都是第一线防御机制，对抗着各类病原体的侵染。吞噬作用作为一种高度保守进程的先天性免疫机制，能够为许多细胞用来消化微生物病原体以及凋亡或坏死的细胞残骸[1-3]。在吞噬作用中，外来物质被细胞识别并结合到细胞表面，被吞噬小体吞入，并在被吞入的物质周围形成细胞器[4]。吞噬小体经过裂变以及与核内体、溶酶体，或是两者共同的限制性融合后形成成熟的吞噬溶酶体。进入吞噬溶酶体内部的病原体则被低pH值、水解作用以及自由基所消灭[5]。黑腹果蝇Drosophila melanogaster是最常见的果蝇，因拥有与哺乳动物相近的先天性免疫系统，而被认为是研究宿主与微生物相互作用的最佳基因模式生物[6-7]。近年来，果蝇Schneider细胞株（S2）细胞已被确认是一种非常适合研究细胞感染的宿主模型，在对抗衣原体Chlamydia，单胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes，查菲埃立克体Ehrlichia chaffeensis，白念珠菌Candida albicans，大肠埃希菌Escherichia coli以及金黄葡萄球菌Staphylococcus aureus等病菌[6, 8-14]的体外感染过程中，S2细胞与哺乳动物巨噬细胞的作用机制非常相近。金黄葡萄球菌是一种主要的人类病原体，致病率显著，研究显示金黄葡萄球菌可能是一种兼性胞内病原体[15]，并认为金黄葡萄球菌可以在巨噬细胞中存活数日而不影响细胞的生存情况[16]。笔者就果蝇S2细胞对热灭活大肠埃希菌（heat inactivated Esherichia coli, HIEC）及热灭活金黄葡萄球菌（heat inactivated Staphylococcus aureus, HISA）的吞噬模式展开研究，揭示了在S2细胞对抗革兰氏阳性菌时，吞噬作用在清除该类病原体时所起到的重要作用以及金黄葡萄球菌抑制消化过程从而抵御细胞吞噬的策略。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
黑腹果蝇S2细胞株从初代培养24 h的胚胎中分离获得，在体积分数为10%的小牛血清的果蝇培养基（Ivitrogen, 美国）中28 ℃培养[17]。为了确认脂多糖（LPS，Sigma，美国）或聚肽糖（PG，Sigma，美国）的活化作用是否会增强吞噬作用，将S2细胞以106个·孔-1铺开在6孔板中并粘附30 min，LPS或PG经超声处理1 h后，按1.0 mg·L-1的剂量加入到每个孔中孵育1 h，备用。
大肠埃希菌ATCC 14948菌株在LURIA-BERTANI培养基（LB）37 ℃培养24 h后，10 000 g离心10 min收集细菌。金黄葡萄球菌ATCC 25923菌株在含20.0 g·L-1氯化钠的哥伦比亚培养基中培养过夜，在盐溶液中重悬。热灭活大肠埃希菌（HIEC）或热灭活金黄葡萄球菌（HISA）以5×109个·L-1的密度接种于S2细胞，28 ℃孵育1 h。不同时间段收集S2细胞分析。
1.2 试验方法
1.2.1 样品制备与透射电子显微镜（TEM）分析
收集感染后的果蝇S2细胞（5.0~10.0 μL），在含体积分数2%多聚甲醛与2%戊二醛的0.1 mol·L-1二甲砷酸钠缓冲液（pH 7.4）固定剂中浸泡16 h，室温下不断旋转。以0.1 mol·L-1二钾砷酸钠缓冲液清洗，3次·样品-1，5 min·次-1，保持室温下旋转。随后加入体积分数2%锇（Osmium），并以0.1 mol·L-1二钾砷酸钠缓冲液清洗3次，5 min·次-1，保持室温下旋转。样品固定，20.0 g·L-1醋酸双氧铀缓冲液（pH 5.2）进行染色，室温避光染色1 h，保持旋转，随后以0.1 mol·L-1二钾砷酸钠缓冲液清洗3次，5 min·次-1并不断旋转。通过逐级增加的丙酮溶液（体积分数依次为50%，60%，70%，80%，90%，95%，100%）对样品进行脱水，室温下旋转处理，随后在100%环氧丙烯中毒处理10 min。以EMBED 812或502树脂黏结剂进行最终的渗透处理，V（环氧丙烯）:V（黏合剂）=1:1，室温旋转处理10 min；V（环氧丙烯）:V（黏合剂）=1:2，室温旋转处理20 min；100%黏合剂处理10 min。最终，样品中加入新的100%黏合剂，渗透16 h后，在干燥烘箱中以60 ℃聚合24 ~ 48 h。Hitachi 7650透射电镜（Hitachi, 日本）在70 kV下采集图像[10]。
1.2.2 激光共聚焦显微镜分析
果蝇S2细胞用体积分数10%胎牛血清（FBS）的施耐德培养基12孔板中铺板培养，并将密度为5×109个·L-1异硫氰酸荧光素标记（FITC，Invitrogen, 美国）的热灭活大肠埃希菌（HIEC）/热灭活金黄葡萄球菌（HISA），加入到S2细胞中28 ℃共培养1 h。以磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后，将混合细胞移植到多聚赖氨酸预处理的载玻片（Sigma，美国）上固定。之后，分别使用罗丹明鬼笔环肽（Invitrogen, 美国）和4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Sigma，美国）一同孵育，用以标记肌动蛋白或细胞核DNA[18]。
1.2.3 流式细胞仪检测分析
细胞培养与处理见1.2.2节。果蝇S2细胞接种细菌后，以PBS清洗，将混合细胞收集到流式管中，通过流式细胞仪检测S2细胞内的FITC荧光信号，统计S2细胞对HIEC和HISA的吞噬能力。为了研究细胞的吞噬作用对活细菌和热灭活细菌的敏感度，以胞内有1个以上FITC标记细菌的细胞在所有细胞中所占的百分比为参考值来予以评价。
1.2.4 细胞酸性指示剂（pHrodo）标签检测溶酶体酸化
在果蝇S2细胞（培养方法见1.2.2节）中加入LPS或PG，孵育S2细胞1 h，从而激活S2细胞；激活后的S2细胞以1×109个·L-1在6孔板中铺开，分别接种pHrodo标记的灭活病原菌（5×109个·L-1），28 ℃共孵育1 h。收集混合细胞，立刻在共聚焦显微镜下观察。分别统计不同处理组中，吞入pHrodo标记病原菌的S2细胞在全部细胞中所占百分比[18]。不同处理组间的差异以t检验进行统计学分析，P < 0.05为显著。
1.2.5 实时荧光定量PCR检测
果蝇S2细胞经过不同实验处理后，以PBS清洗，收集细胞，使用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取总RNA，操作步骤依据产品使用说明书[18]。即刻使用5.0 μg总核糖核酸，以M-MLV反转录酶（Takara，日本）合成为20.0 μL cDNA。实时荧光定量的检测采用基因特异引物与TaqMan探针（表 1），反应体系包括10.0 μL Premix Ex Taq（Takara，日本），1.0 μL cDNA样品，7.2 μL无酶水，各基因对应TaqMan探针0.3 μL，以及各特异性引物0.4 μL。聚合酶链式反应（PCR）程序如下：95 ℃，30 s；90 ℃，5 s，60 ℃，30 s，循环50次。数据分析使用iQTM5软件。
表 1 实时荧光定量PCR反应中引物与TaqMan探针序列Table 1 Primers and TaqMan probe sequences in qRT-PCR寡核苷酸探针 引物与探针序列 RP49-F 5'-CCGCTTCAAGGGACAGTATCTG-3' RP49-R 5'-CACGTTGTGCACCAGGAACTT-3' Rp49-探针 FAM-GGCAGCATGTGGCGGGTGCGCTT-Edipse Rel-F 5'-GCCAGAAAAACCCGTGAGTC-3' Rel-R 5'-AGGTACTTCCCCGATGTTCG-3' Rel-探针 FAM-CGACGTGGCCGCCGCAGA-Edipse Def-F 5'-CCACATGCGACCTACTCTCCA-3' Def-R 5'-AGCCGCCTTTGAACCCCT-3' Def-探针 FAM-ACCACACCGCCTGCGCCG-Eclipse Drs-F 5'-CTGGTGGTCCTGGGAGCC-3' Drs-R 5, -AGCGTCCCTCCTCCTTGC-3' Drs-探针 FAM-CCGATGCCGACTGCCTGTCC-Eclipse 1.2.6 统计学分析
本研究中每组试验均使用3个生物学重复。统计学显著性分析使用t检验，判断对照组与实验组的差异性，P < 0.05为显著，P < 0.01为极显著。
2. 结果与分析
2.1 透射电镜观察黑腹果蝇S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用
透射电镜下观察黑腹果蝇S2细胞对灭活大肠杆菌（HIEC）或灭活金黄葡萄球菌（HISA）的吞噬过程，发现孵育1 h后S2细胞即可顺利吞噬HIEC（图 1A），孵育后第1天S2细胞内HIEC已消失（图 1B）；但共孵育1 h后S2细胞未能吞噬HISA（图 1C），HISA（图 2A）与S2细胞共孵育4 d，仍保持形态完整（图 1D，图 2B，图 2C，图 2D，图 2E）。在PG或LPS激活后，S2细胞也不能有效地吞噬HISA（图 2F，图 2G，图 2H）。与健康的S2细胞相比，在接种后第4天，S2细胞吞入的HISA依然形态完整（图 2E，图 2F，图 2G，图 2H）；吞入HISA的S2细胞没有出现凋亡或破裂，表明细胞内的HISA并没有对S2细胞造成明显的损伤。
图 1 透射电镜观察黑腹果蝇S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用Figure 1 Transmission electron microscopy of phagocytosis of HIEC or HISA by S2 cells
图 2 透射电镜观察黑腹果蝇S2细胞对HISA的吞噬作用Figure 2 Transmission electron microscopy of phagocytosis of HISA by S2 cells2.2 激光共聚焦显微观察黑腹果蝇S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用
激光共聚焦显微观察发现，在S2细胞吞噬热灭活大肠杆菌HIEC 1 h后，胞内可观察到HIEC发出的绿色荧光（图 3A）；吞噬发生1 d后，S2细胞内观察不到绿色荧光粒子（图 3B）；表明HIEC已经被S2细胞清除。同样处理下，热灭活金黄葡萄球菌HISA没有被S2细胞清除。由图 3C和图 3D可知，HISA被吞噬后，被S2细胞内化到细胞内继续存在。由此可知，在S2细胞接种灭活菌后，HIEC与HISA均被S2细胞吞入，但HIEC被S2细胞清除，而HISA则没有被清除。
图 3 激光共聚焦显微镜观察黑腹果蝇S2细胞对FITC标记的HIEC或HISA的吞噬作用Figure 3 Confocal microscopy of phagocytosis of FITC-labeled HIEC or HISA by S2 cells2.3 流式细胞仪检测S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用
流式细胞仪的检测结果由图 4可知：接种1 h后，吞入了至少1个HIEC粒子的S2细胞在所有S2细胞中所占的比例接近40%，与S2细胞吞噬大肠埃希菌的结果相近；吞入至少1个HISA粒子的S2细胞在所有S2细胞中所占的比例接近25%，与S2细胞吞噬金黄葡萄球菌的结果相近。说明S2细胞吞入活细菌和热灭活细菌的敏感度并没有显著差异。
图 4 孵育1 h后黑腹果蝇S2细胞对FITC标记的病原菌的吞噬率Figure 4 Quantification of phagocytosis of FITC-labeled microbes by S2 cells at 1 h post-inoculation2.4 吞噬溶酶体酸化观察和吞噬率检测结果
细胞内的酸性环境可诱导pHrodo标记的病原菌激发出红色荧光，从而指示吞噬溶酶体的形成。激光共聚焦显微镜观察发现，接种HIEC 1 h后，S2细胞内可观察到红色荧光，表明S2细胞对HIEC的消化程序被激活，细胞内形成了酸性环境（图 5A）；图 5B中未能观察到红色荧光，表明HISA未能激活S2细胞的酸化过程。使用LPS或PG激活S2细胞，再进行接种观察，可发现在接种HISA 1 h后，未能观察到红色荧光，说明S2细胞的酸化过程仍未被激活。
图 5 激光共聚焦显微观察孵育1 h后黑腹果蝇S2细胞对pHrodo标记的HIEC及HISA的呑噬作用Figure 5 Confocal microscopy of phagocytosis of pHrodo-labeled HIEC or HISA by S2 cells at 1 h post-inoculation为揭示LPS或PG的刺激对S2细胞吞噬活性的影响，用共聚焦显微镜观察S2细胞吞噬pHrodo标记菌并统计吞噬率。结果表明：共孵育1 h后，只有接种HIEC的S2细胞内呈现酸性环境，其他的处理均不能诱导S2细胞酸化（图 6）。检测吞噬百分比发现，只有HIEC处理组的吞噬率显著高于对照组（P < 0.01）。使用LPS或PG激活S2细胞后再接种，S2细胞对HISA的吞噬率仍没有显著增加。这表明溶酶体酸化过程只发生在S2细胞吞噬HIEC的过程中，而LPS或PG刺激并不能诱导S2细胞吞噬HISA后的酸化过程（图 6）。
图 6 共孵育1 h后S2细胞对pHrodo标记的HIEC及HISA的吞噬率Figure 6 Phagocytic percentages of the pHrodo-labeled HIEC or HISA2.5 实时荧光定量PCR检测基因表达
实时荧光定量PCR反应中引物与TaqMan探针序列如表 1所示。通过实时荧光定量PCR检测不同处理条件下S2细胞内的防御素（defensin），抗真菌肽（drosomycin）和Relish的表达量变化。结果发现：防御素的表达量在HISA，HISA+LPS和HISA+PG等3个处理组中，均发生显著上调（P < 0.01）；抗真菌肽的表达量仅在HISA+PG处理组中发生显著上调（P < 0.01）（图 7）；Relish的表达量在HIEC处理组中发生显著上调（P < 0.01），但在HISA处理组中无显著变化。
图 7 黑腹果蝇S2细胞呑噬HISA作用中防御素，抗真菌肽及Relish的表达谱Figure 7 Expression profiles of drosomycin, defensin and relish in phagocytosis of HISA3. 讨论与结论
吞噬作用是动物对抗微生物病原体的一种重要免疫防御机制，由吞噬细胞来执行具体的功能[19-20]。本研究对黑腹果蝇S2细胞吞噬热灭活大肠埃希菌（HIEC）和金黄葡萄球菌（HISA）的异同进行了研究。结果表明：S2细胞能够在接种后1 d有效吞噬并清除HIEC，但却无法清除HISA；即使到了接种后4 d，S2细胞仍不能有效地清除HISA，而是任由它存在于细胞内。经PG或LPS诱导激活的S2细胞同样不能有效地清除HISA。与健康的S2细胞相比，存在于细胞内的HISA在接种4 d后并没有明显破坏S2细胞。许多研究证明在细胞培养模式下，金黄葡萄球菌能够逃逸宿主细胞的免疫系统，具有隐藏的潜能[21]，可在胞内坚持存活一段时间[22-23]。在本研究中，热灭活金黄葡萄球菌存在于S2细胞中达4 d以上，说明灭活后的金黄葡萄球菌仍存在抗吞噬的成分，这与金黄葡萄球菌存在多个抗吞噬因子有关[24-26]。统计细胞吞噬率发现，热灭活并不会影响吞噬作用对灭活细菌的敏感性，这一点已被另一项研究所证实[11]。
在消化进程中，吞噬溶酶体的pH值降低，细胞内环境酸化，可帮助吞噬作用的进行，并能够通过pHrodo染料的使用进行检测[27]。LPS是革兰氏阴性菌的主要的细胞膜成分，可以通过Imd（immune deficiency）免疫信号通路激活巨噬细胞；PG是革兰氏阳性菌细胞壁上的主要成分，可以通过Toll信号通路激活巨噬细胞。使用LPS或PG刺激接种HISA的S2细胞，细胞并未形成酸化环境。通过透射电镜与激光共聚焦显微镜的观察，明确了即使S2细胞经过LPS或PG的激活也不能有效地吞噬HISA的结果；检测S2细胞对pHrodo标记的病原菌的吞噬百分比也表明，吞噬溶酶体的酸化只发生在S2细胞对HIEC的吞噬过程中，其他处理并不能引起S2细胞的酸化。
黑腹果蝇S2细胞的吞噬作用中包括了Toll与Imd等2条信号通路，其中Toll通路参与到抗革兰氏阳性菌的免疫作用中，该免疫应答机制中包含Defensin基因[28-29]的表达，而已知的防御素（defensin）是一类由小胱甘酸富集而成，可被诱导的抗微生物肽，有利于宿主对真菌的防御应答[30]；Drosomycin基因表达的Drosomycin是一类可诱导的抗真菌肽，同样由Toll通路调节，并在全身脂肪体中均有表达[31-32]。观察发现防御素的表达量在HISA，HISA+LPS以及HISA+PG处理中，均发生显著上调；抗真菌肽的表达量在HISA+PG处理中显著上调；由此可以推断，Toll通路在HISA+PG的刺激下被激活。但是也看到PG虽然能激活S2细胞的Toll通路，但却无法有效清除HISA，同样，胞内的HISA也不会诱导S2细胞凋亡。由此可知，金黄葡萄球菌作为一种人类病原体，对黑腹果蝇来说也是高致病的病原，与其他革兰氏阳性菌相比，它表现出了更强的对防御素的抵御能力[36]。在黑腹果蝇中，Imd通路调节着对革兰氏阴性菌的免疫应答，Relish作为NF-κB通路的转录因子，是Imd通路的终极目标[28]。本研究结果发现：Relish在HIEC处理中显著上调（P < 0.01），说明Imd通路在HIEC处理中被激活，而激活的Imd通路最终诱导S2细胞吞噬HIEC，说明Relish的表达量与S2细胞吞噬HIEC的百分率呈正相关。
有研究表明：金黄葡萄球菌能够迅速地逃避溶酶体/吞噬体的捕获，在细胞液泡内存活可长达4 d，之后逃入细胞质中[16, 37-38]。有趣的是，我们发现灭活金黄葡萄球菌同样能够在S2细胞内存活4 d，其细胞表面物质具有抗吞噬消化的活性。该结果同时暗示着无脊椎动物吞噬细胞对清除部分革兰氏阴性及革兰氏阳性菌均有所帮助，但细胞免疫对这些胞内细菌的清除效力胜于体液免疫。
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图 1 不同处理下大果木姜子凋落叶质量损失率
Figure 1 Change of mass loss rate and residual rate of leaf litter of C. migao under the condition of different treatments
图 2 不同处理下大果木姜子凋落叶分解过程中养分的变化
Figure 2 Change of different treatments on nutrient content of C. migao leaves during decomposition
图 3 不同处理下大果木姜子凋落叶分解过程中元素残留率的变化
Figure 3 Change of different treatments on element residual rate of C. migao leaves during decomposition
图 4 不同处理下大果木姜子凋落叶分解过程中C/N的变化
不同小写字母表示同一时间不同处理间差异显著(P＜0.05)
Figure 4 Change of different treatments on C/N during decomposition of C. migao leaves
表 1 不同处理大果木姜子凋落叶质量残留率(y)随时间(x)变化的Olson模型
Table 1. Decomposition rate model of litter residue rate (y) with time (x) under different treatments
处理 分解方程 分解系数(K) 决定系数(R2) 相关系数(r) 显著性 凋落叶分解50%所需时间/月 凋落叶分解95%所需时间/a ck y=81.727e−0.085x 0.085 0.970 −0.944 0.005 8.155 2.973 N1 y=81.666e−0.067x 0.067 0.948 −0.940 0.005 10.045 3.626 N2 y=87.461e−0.076x 0.076 0.907 −0.963 0.002 9.120 3.285 N3 y=87.319e−0.068x 0.060 0.977 −0.951 0.004 10.193 3.671 
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20200106
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