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在自然界中，植物易受到各种病原物的侵害，植物与病原物协同进化，形成了一系列复杂的防御体系。组成型抗性和诱导型抗性是植物应对病原菌侵害和植食者取食的2种典型的防御机制，植物通过协调不同防御机制实现其最佳防御效果[1]。角质蜡质是植物表皮中由超长链脂肪酸(VLCFAs)及其衍生物构成的一类次生代谢产物。角质蜡质组成的角质层是植物在长期的生态适应过程中，为抵御恶劣生态环境、生物/非生物胁迫而形成的重要保护屏障，广泛参与植物逆境抵御、病虫害防卫等诸多抗性生理过程，在抗病、抗虫、耐盐、抗旱等方面具有重要的生态学功能[2]。近年来，角质蜡质的研究受到各国研究者的持续关注，取得了诸多新进展[3-4]。本研究以植物组成型、诱导型抗性防御反应为主线，归纳总结目前有关角质蜡质代谢及其抗病作用机制的研究进展，以期为植物抗病机理的阐明及相关病害的防治提供研究思路。
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角质层是植物地上部分一层重要的疏水性保护膜，对植物适应复杂多变的环境具有重要意义[5]。最新研究证实：植物根冠和胚胎中也存在角质层结构，其中根冠角质层在植物应对渗透胁迫和侧根形成中发挥了重要作用，而胚胎角质层则在成熟种子中起着扩散屏障以及调控种子萌发的作用[6-7]。角质层结构可分为三部分：第1部分是由嵌入细胞壁多糖的角质以及蜡质组成的角质层基层；第2部分是由角质和镶嵌在角质内部的蜡质共同组成的真角质层；第3部分是由蜡质膜/蜡质晶体沉积在植物表面形成的蜡质层[8]。
角质层由角质和蜡质组成，其中蜡质又分为表层蜡质和内部蜡质。角质层蜡质由超过20个碳原子的超长链脂肪酸(VLCFAs)及其衍生物组成，包括醛、烷烃、支链烷烃、烯烃、伯醇、仲醇、不饱和脂肪醇、酮和蜡酯，以及萜类和甾醇类的环状化合物等[9]。利用正向和反向的遗传学手段对拟南芥Arabidopsis thaliana等模式植物开展研究，目前蜡质的生物合成途径已经基本弄清。对拟南芥中大量蜡质合成缺陷突变体ECERIFERUM(CER)的研究，已经分离鉴定出了一大批涉及蜡质生物合成的蜡质突变体基因(CER)。质体合成的C16、C18脂肪酸是蜡质合成的重要前体物，在长链脂酰辅酶A合成酶(LACS)的作用下以脂酰-COA的形式运输到内质网，通过内质网上的脂肪酸延长酶复合体以及BAHD酰基转移酶CER2及其同系物CER2-LIKE1/ CER26和CER2-LIKE2在内的一些辅助因子的协同作用进行碳链延伸[10]，生成C20以上的超长链脂酰-COA；随后通过烷烃合成途径形成醛、烷烃、次级醇和酮等蜡质组分，或通过内质网的醇合成途径形成初级醇和蜡酯等蜡质组分[11]。拟南芥烷烃合成酶CER1和WAX2/CER3基因突变体，其醛、烷烃、次级醇和酮的含量降低，这与烷烃合成通路的代谢产物一致；而CER1、WAX2/CER3和CYTB5共表达引起来自超长链脂酰-CoA的超长链烷烃的氧化还原依赖性合成，表明其可能编码烷烃合成途径中烷烃的合成[12]。作为拟南芥中编码醛脱羧酶的CER1基因家族成员之一的CER1-like1也通过与CER1相同的机制在烷烃的生物合成中起着至关重要的作用，但CER1-like1更偏向于催化短链烷烃的合成[13]。烷烃合成途径的最终反应被认为是由属于细胞色素P450家族的中链烷烃羟化酶1(MAH1/CYP96A15)催化烷烃氧化产生次级醇，并进一步催化次级醇氧化生成酮类[14]。研究表明：在醇合成途径中，编码脂酰辅酶A还原酶的CER4基因负责地上部分组织表皮细胞和根中初级醇的合成，而编码蜡酯合成酶基因的WSD1基因其拟南芥突变体表现出比野生型更低的蜡酯含量，表明WSD1可能负责蜡酯的合成[15-17]。
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成熟角质层中还含有角质，角质是一种主要由ω端和中链羟基化的C16和C18的氧化脂肪酸以及甘油以酯键交联而成的聚合物[18]。角质单体的合成在内质网上进行，内质网对质体产生的C16和C18脂肪酸进一步修饰合成各种以单酰基甘油酯形式存在的角质单体。角质单体的合成涉及许多氧化反应，由细胞色素P450酶催化，其中末端碳链氧化反应涉及细胞色素P450末端羟化酶(CYP86A)家族成员，而中链氧化反应涉及细胞色素P450中链羟化酶(CYP77A)家族成员。拟南芥CYP86A2、CYP86A4、CYP86A7和CYP86A8突变体表现出角质层结构异常和角质组分改变，表明这几个基因与角质生物合成中ω链的羟基化密切相关[19]。ω-羟基脂肪酸则进一步经过脱氢反应生成脂肪醛，脂肪醛再经氧化反应最终生成二羧酸；虽然催化该过程的酶尚不清楚，但是由于CYP86A2和HTH(hothead)这2个基因的拟南芥突变体中缺少二羧酸，因此认为其可能涉及ω-OH脂肪酸氧化生成二羧酸的反应[20-21]。CYP77A6是目前唯一被鉴定为能够进行中链羟化的酶，CYP77A基因在花瓣中强烈表达，但在其拟南芥突变体的花瓣中却完全丢失了二羟基角质单体；其异源表达结果表明：该基因特异性催化ω-OH脂肪酸的中链羟基化，这也表明角质合成的中链羟基化反应发生在末端羟基化之后[22]。此外，CYP77A4异源表达催化环氧化羟基脂肪酸的合成，表明其可能参与环氧化脂肪酸的合成，但目前尚未完全证实。角质单体合成的最终反应由甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)催化完成，脂酰-COA在甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)催化下，酰基转移至甘油-3-磷酸生产单酰基甘油角质单体。拟南芥GPAT1-8基因被报道在细胞外脂质聚酯的合成中起着重要作用，其中GPAT4-8已经被证明有助于角质的合成，并且这几种酶相较于未被取代的脂肪酸表现出对末端羟基或羧基脂肪酸具有更强的催化效率，表明他们在氧化反应之后发挥作用[23]。
质膜ATP结合盒转运蛋白(ABCG)已经被证明可能与角质和蜡质向质外体的转运有关；而脂质转移蛋白(LTPs)被证明很可能有助于角质单体通过细胞壁向角质层的转运[24]。随着番茄Solanum lycopersicum中CD1/GDSL1这第1个角质合酶的发现，长久以来存疑的脂肪酶(GDSL)家族的酶在角质组装中的作用也得到了确证[25-27]，而拟南芥α/β水解酶蛋白基因BODYGUARD (BDG)的发现证明了植物中可能存在一些其他的角质合酶[28]。尽管目前的研究已经在角质蜡质的合成、运输、组装方面取得了一定的进展，但角质层的形成机制仍然未知。
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组成型抗性是植物的固有特性，是植物在遭受侵害前就己存在的抗性，包含植物固有的层和细胞壁的角质、蜡质、木质素等成分。其中，化学抗性主要包括酚类、皂苷、不饱和内酯及有机硫化合物等植保素(phytoalexins)[29]。组成型抗性是植物在长期的系统发育中产生和发展起来的[30]，由植物基因型决定，但其抗性强弱也会受到环境因素的影响。
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诱导型抗性是指植物经病原物刺激后诱导产生的抗性成分或抗性反应，包括物理抗性和化学抗性2类。物理抗性包括细胞壁及角质层加固和修复、乳突的形成、木质化作用及侵填体的形成等[31]。化学抗性则包括过敏性反应的诱导、植保素的产生、水解酶的激活及病程相关蛋白的表达等。诱导型抗性类似于免疫反应，只有在遇到外界因子，如物理损伤、植食者取食和病原菌侵染时才得以表现[32]。因此，诱导型抗性具有“开-关效应”，也称作“兼性抗性”。物理抗性与化学抗性通常协同发挥作用，一些物理屏障和化学因子不仅属于组成型抗性，也会在诱导型抗性中起重要作用，典型的如角质蜡质。
诱导型抗性并非植物的原始性状，而是一种衍生性状。植物长期处于复杂的环境中，容易受到各种病原物的侵害，组成型抗性是一种被动的防御机制，并不能确保植物对病原物的完全防御。为了更好地抵御病原菌的入侵，植物进化出了一系列诱导防御反应，植物的这种抵抗外界病原物刺激所形成的防御反应又被称为植物的先天免疫。植物先天免疫由微生物、病原体和/或损伤相关的分子模式(分别为MAMP，PAMP和/或DAMP)识别相应的化学分子所触发[33]，这些化学分子在植物与微生物相互作用过程中释放，并被模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别。
植物的先天免疫包括两大类，病原物相关分子模式触发型免疫(PAMP-triggered immunity，PTI)和效应因子触发型免疫(effector-triggered immunity，ETI)[34]。植物-病原体互作中植物启动先天免疫的第1步是植物模式识别受体(PRRs)识别病原相关分子模式(PAMPs)的化学分子，引发病原相关分子模式触发的免疫反应(PTI)，激活植物体中促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，从而使植物产生早期应答反应[35]。然而，病原体为了抑制植物的诱导型防御反应便于自身的入侵反应，往往会产生大量抑制PTI激活的效应因子，而植物此时会启动先天免疫的第2步反应，通过特异性的抗性蛋白(R蛋白)识别效应因子，在侵染位点启动快速剧烈的防御反应，这种防御反应即为ETI[36]。ETI诱导的抗性通常表现为入侵位点的细胞凋亡，即过敏反应[37]。
MAMPs/PAMPs或DAMPs都可以诱导PTI[38]，并且相较于特异性的ETI具有更加广谱的抗性反应，如活性氧(ROS)积累，激活MAPK依赖性信号级联反应，植物抗毒素的生物合成，水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)等防御相关激素以及相关抗性基因的诱导表达[33, 39]。植物的这2种免疫反应机制通过启动防御反应诱导植物产生局部和系统抗性，两者协同作用进而抵御病原菌的入侵[40]。植物在侵染位点启动超敏反应特异性抵御病原菌侵染的这种反应被称为植物的局部抗性，而与之相对的，植物活化抗性基因使植物在整株水平上产生抗性或者产生抵御病原菌再次入侵的抗性，这种非专化性的抗性则被称为系统抗性[41]。通常植物的系统抗性包括诱导系统抗性(ISR)和获得性系统抗性(SAR)，ISR主要由非致病菌诱导产生，而SAR则是由植物响应病原菌侵染产生的[42]。这2种系统抗性依赖于SA，JA和ET信号途径的协同效应。SA和JA作为植物中十分重要的2条信号途径，在抗病化学信号的转导中的作用尤为重要。现在也有越来越多的证据表明，角质和蜡质在植物的诱导防御反应中也扮演着重要的角色[43]。
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角质蜡质组成的角质层作为植物地上部分共有的一层保护性屏障，在植物组成型抗性中扮演着重要角色。角质蜡质组成型抗性作用也可分为物理抗性和化学抗性2类[44]。角质层及其组分角质蜡质维持着植物正常生长必需的机械强度，与植物对真菌的物理抗性密切相关；许多真菌需要通过附着胞的物理穿刺刺破植物角质层进而侵染内部细胞[45]，因此，完整的具有一定机械强度的角质层会阻碍真菌对植物的侵染，如许多果腐病病原体只能通过角质层缺陷的方式侵染果实[46]。
植物角质蜡质组成对病原菌的物理抗性，不仅影响植物表皮机械强度，还会影响植物表面的疏水性(不渗透性)[44]。真菌孢子的萌发和细菌的繁殖需要高湿环境，疏水的角质层表面则不利于病原菌的停滞，能有效减少病原菌的侵染[47]。拟南芥和番茄角质蜡质合成缺陷的突变体具有强渗透性的角质层，表现出病原体感染的易感性。如拟南芥酰基载体蛋白4(ACP4)和GL1(GLABROUS 1)突变体的角质蜡质含量更低，增加了其表皮渗透性，叶片则表现出对2种病原体的高易感性[48-49]。研究表明：角质蜡质相关SHINE转录因子的突变导致角质层缺陷，进而导致了对灰霉病菌Botrytis cinerea易感性[50]。这些结果也进一步验证了角质蜡质代谢可通过调控角质层的渗透性进而影响植物的抗病性。
此外，角质蜡质组分也具有化学抗性功能。角质蜡质的某些组分可以抑制或者刺激孢子的萌发，如去蜡质处理的大麦Hordeum vulgare叶片有更多的附着胞生成，增加了其对锈菌的敏感性[51]；水稻Oryza sativa叶片角质组分十六烷二醇，可以诱导稻瘟菌Pyricularia oryzae的产生和附着胞的分化形成，并促进灰霉病真菌孢子的萌发和角质酶的表达[52-53]。此外，角质和蜡质的某些组分对某些病原体还具有直接的抑制作用，如C16和C18羟基脂肪酸对丁香假单胞菌Pseudomonas syringae有直接的抑制作用[54]，这些角质蜡质成分对病原菌的抑制作用构成了角质蜡质组成型抗性中的化学抗性。
综上所述，角质蜡质一方面能够通过影响角质层的物理性质(机械强度和疏水性)，实现对病原菌的物理屏蔽作用；另一方面也能通过羟基脂肪酸等抑菌成分直接调控病原菌的增殖分化来实现其化学防御功能。
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传统观点认为，角质层及其角质蜡质组分主要通过组成型抗性发挥其保护性屏障功能。现在更多研究证实：角质蜡质在植物的诱导防御反应中也发挥着重要作用[55]。与组成型抗性类似，角质蜡质的诱导型抗性也可分为物理抗性和化学抗性2类。在病原菌侵染植物的过程中，角质蜡质组分均会对病原菌的刺激作出响应。角质蜡质诱导型物理抗性功能的发挥，一般是响应病原菌的刺激，上调角质蜡质的合成，增强角质层的保护性屏障作用。如受到炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides感染的番茄果实，其角质蜡质的生物合成会显著上调[56]。柑橘Citrus sinensis花瓣感染炭疽病后，其表皮细胞脂质合成上调，角质蜡质相关代谢物沉积，并引起角质层结构的改变进而增强其物理抗性[57]。此外，大麦感染由禾谷镰刀菌Fusarium graminearum引起的赤霉病后，抗性品种小穗会上调角质层的生物合成进而增强其对病原菌的物理抗性[58]。上述这些都表明角质蜡质在植物的诱导防御反应中发挥了重要的物理屏障作用。
角质蜡质也可作为诱导型抗性成分在病原菌侵染过程中发挥化学抗性功能。病原体侵染植物后，植物产生的降解产物和释放的内生肽可作为植物损伤相关分子模式的诱导子(DAMPs)被植物模式识别受体(PRRs)所识别，继而启动下游的免疫反应(PTI)[33]。目前的研究表明：角质层被真菌角质酶降解的产物也可作为DAMPs被损伤相关模式的受体所识别[17, 59]。由此认为角质蜡质可以通过作为诱导子激活下游的诱导防御反应进而实现其化学抗性的功能(图1)。这一观点也得到了许多外施角质单体研究结果的支持，如外施无抑菌活性的角质单体增加了大麦对白粉病菌Erysiphe graminis f.sp. hordei的抗性[60]；组织培养的马铃薯Solanum tuberosum细胞外施角质单体后乙烯的合成积累和相关防御基因的表达均上调[61]；外源施加角质单体增加了番茄病程相关基因的表达水平[62]；水稻叶片外源施加角质单体16-羟基棕榈酸，脂质转运蛋白基因OsLTP5和病程相关基因PR-10的表达也上调[63]。这些都在一定程度上表明角质蜡质可能是通过调控下游抗性基因的表达进而实现其化学抗性(图1)。
图 1 角质蜡质诱导抗性机理图
Figure 1. Inducible resistance mechanism of cutin and wax
进一步的研究表明：除了作为诱导子调控下游抗性相关基因，某些角质蜡质组分也可以作为活性氧的诱导子诱导活性氧的积累。如黄瓜Cucumis sativus下胚轴外施角质蜡质组分的研究表明：某些角质蜡质成分具有良好的活性氧诱导活性[64-65]，而活性氧介导了植物包括超敏反应在内的一系列防御反应。基于这些研究，目前也有一些观点认为：角质蜡质可能通过作为活性氧的诱导子来激活下游的诱导防御反应进而实现其抗性功能[43,66]。除此之外，角质蜡质被认为可能作为信号分子影响植物的系统获得性抗性(SAR)[67]。基于上述研究，可得出角质蜡质作为诱导子激活下游的诱导防御反应时，可能主要是通过调控病原物相关分子模式触发型免疫(PTI)中的包括活性氧爆发，抗病基因表达，系统获得性抗性在内的一系列的抗性反应进而实现其抗性功能(图1)。
大量研究证实：激素信号在植物-病原体互作中发挥了重要作用[68]；激素作为重要的抗病信号可能涉及了植物角质蜡质介导的抗性反应。某些激素被证明可以调控角质蜡质的合成和相关抗性，如JA处理豌豆Vicia sativa幼苗，诱导其角质单体羟基脂肪酸的合成[69]，而羟基脂肪酸作为植物的内源信号分子发挥了重要的抗性作用，这表明JA可以调控角质的生物合成进而介导其抗病性。JA和角质蜡质同属于脂肪酸代谢通路，具有共同的合成前体，因此，也有观点认为JA不仅能够直接调控角质蜡质的生物合成介导其抗病性，还和角质蜡质存在着代谢流的重定向；基于角质蜡质生物合成缺陷突变体的研究也在一定程度上支持了这一观点。如拟南芥突变体RST1角质蜡质生物合成缺陷，JA及其相关抗病基因PDF1.2上调表达，表现出对白粉病的抗性[70]；柑橘自发突变体蜡质合成缺陷，JA和相关抗病基因PDF1.2上调表达，增加了对病原菌的抗性[71]。这些结果均表明：JA和角质蜡质之间可以通过代谢流的重定向进而调控植物的抗病性(图1)。
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角质层作为植物抵御病原菌侵染的第1道防线，在植物-病原互作中具有重要作用。角质蜡质是角质层主要成分，一方面可以作为组成型抗性成分发挥物理抗性(物理屏障)和化学抗性(抑菌)作用；另一方面，也可作为诱导型抗性成分发挥作用，诱导产生的角质蜡质组分可作为信号分子或者诱导子激活下游的抗性反应进而发挥其化学抗性功能。目前，角质蜡质介导的诱导抗性研究受到广泛关注，但其作用机理尚未完全阐明；哪些角质蜡质组分参与了植物的诱导型防御反应，其作为诱导子激活下游抗性反应的具体机制如何？激素信号介导的角质蜡质抗性机制如何？诸多问题均有待深入探讨，角质蜡质抗性机理的阐释为作物抗性育种提供了新的思路。此外，虽然已有相关研究表明角质蜡质具有抑菌活性和植物免疫反应诱导子的作用，但目前尚无角质蜡质类生物农药(植物免疫诱导剂)的报道。因此，角质蜡质作为生物农药(植物免疫诱导剂)具有广阔的开发前景，同时角质蜡质类生物农药(植物免疫诱导剂)的开发也将为病害防控提供新的思路。
Metabolism of the cutin and wax of plants and their disease resistance mechanisms
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摘要: 角质蜡质是植物在长期的生态适应过程中进化形成的一类次生代谢产物，广泛参与了植物抗逆、抵御病虫害侵染等诸多抗性生理过程。角质蜡质在植物-病原互作中发挥了重要作用，是植物抗病机制的重要组成部分。随着分子生物学的发展，人们对植物角质蜡质代谢及其抗病机理的认知不断深入。本研究综述了植物角质蜡质生物合成与其抗病机理的最新研究进展并对未来研究提出展望。目前，植物角质蜡质的抗性机理研究主要集中于组成型抗性和诱导型抗性2类。角质蜡质作为角质层主要成分，一方面可作为组成型抗性成分发挥物理抗性(物理屏障)和化学抗性(抑菌)作用；另一方面，也可作为诱导型抗性成分发挥作用，诱导产生的角质蜡质单体除了作为角质层主要成分发挥物理抗性外，也可作为信号分子或者诱导子激活下游的抗性反应进而发挥其化学抗性功能。未来可侧重于对角质蜡质诱导抗性机理的深入阐释，进一步丰富植物化学生态学研究理论体系。此外，基于角质蜡质的诱导抗性作用，可开发角质蜡质类生物农药(植物免疫诱导剂)，为植物病害防控提供新思路。图1参71Abstract: As a type of secondary metabolites produced by plants during long-term ecological adaptation, cutin and wax are widely involved in many resistance physiological processes including stress defense and resistance to pests and diseases, playing critical roles in the plant-pathogen interaction, thus becoming an important part of plant disease resistance mechanism. With the development of molecular biology, there is an increasing understanding on the cutin and wax metabolism and their mechanisms against fungal disease in plant. With prior researches mainly focused on the constitutive resistance and inducible resistance of plant cutin and wax, the present study, with a review of the research progress achieved on the plant cutin and wax biosynthesis and its disease resistance mechanism, is aimed to put forward prospects for future research. It was concluded that (1) as the main components of the cuticle, the first line of defense for plants against pathogen infection, cutin and wax play a critical role in physical resistance (physical barrier) and chemical resistance (bacteriostasis) as constitutive resistance components, (2) They can also play the role of inducible resistance components and (3) in addition to being the main component of the cuticle to exert physical resistance, the inducible cutin and wax component can also act as a signal molecule or inducer to activate downstream resistance reactions and exert its chemical resistance function. In the future, the research concerning cutin and wax can be focused on an in-depth explanation of the mechanism of cutin and wax inducible resistance, so as to further enrich the theoretical system of plant chemical ecology. In addition, cutin and wax biopesticides (plant immunity inducers) can be developed based on the inducible resistance of cutin and wax to provide new insight for the plant diseases control. [Ch, 1 fig. 71 ref.]
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Key words:
- cutin /
- wax /
- constitutive resistance /
- inducible resistance /
- review
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湿地是地球上物种最丰富、生产力最高、生态系统服务功能最强的生态系统，被誉为“地球之肾”，在维持物种多样性、净化水质、调节生态系统平衡等方面发挥重要作用[1−2]。近年来，全球变化及人为干扰导致湿地大面积退化[3]，引起湿地结构、功能及生态过程的一系列变化，并影响土壤质地、结构、养分状况、酸碱性及溶氧量，最终对土壤微生物群落组成、结构及多样性产生一系列的调控作用[4]。
细菌作为湿地生态系统中的重要组成部分，主要参与土壤形成、凋落物分解、养分供应及生态系统养分循环[5]，能够作为土壤生态系统变化的预警指标[6]，对湿地生态系统结构及功能的维持与稳定起着不容忽视的作用。前人研究表明：高寒湿地和鄱阳湖湿地退化，导致土壤蓄水保肥能力降低、养分流失、碳氮转化速率减慢，显著抑制土壤细菌群落多样性[7−8]。但也有一些研究表明：人为干扰引起湿地排干、水分流失、土壤酸化及土壤养分供给改变，能够导致湿地土壤细菌多样性增加[9−10]。另外，三江平原湿地退化引起的土壤酸碱度及含水量变化仅影响土壤细菌群落组成，而对细菌多样性无显著影响[11]。可见，土壤细菌群落对湿地土壤理化性质变化的响应，存在不确定性。这种不确定性可能与全球变化、区域气候、湿地类型及人为活动干扰密切相关。因此，探明“不同退化阶段—土壤理化环境—细菌群落结构和多样性”之间的耦合关系，对于理解全球气候变化和人为干扰引起的湿地退化对土壤细菌群落的影响机制，具有十分重要的科学意义。
纳帕海高原湿地地处青藏高原香格里拉县内，其特殊的闭合—半闭合地形孕育着丰富的生物多样性，是全球生物多样性保护的重点区域[12]。近20多年来，在喀斯特作用和人为干扰的叠加影响下，该区湖水外泄，湖面面积大幅度减小，沼泽湿地逐渐旱化为沼泽化草甸和草甸，导致湿地水文和理化环境发生改变，进而影响土壤细菌群落结构及多样性[13]。本研究选取纳帕海不同退化阶段高原湿地类型(沼泽湿地、沼泽化草甸和草甸)为研究对象，运用Illumina高通量测序技术，揭示不同退化阶段湿地的土壤细菌群落结构及多样性干湿季变化特征，并分析细菌群落结构及多样性与土壤理化性质变化之间的关系，从而阐明土壤细菌群落对纳帕海高原湿地退化过程的响应规律，以期为理解人为干扰及全球气候变化加剧背景下高原退化湿地的土壤微生物多样性保育提供关键数据支撑。
1. 材料与方法
1.1 样地设置
纳帕海湿地(27°49′~27°55′N，99°37′~99°43′E)地处滇西北横断山区香格里拉县，面积为3100 hm2，海拔为3260 m[12]，是中国典型的高原季节性湿地，属于冷凉湿润的高原气候[14]。该区域年平均气温为5.4 ℃，最热月平均气温为13.2 ℃，最冷月平均气温为−3.8 ℃；干湿季节分明，雨季(5—10月)降雨量高达495.9 mm；干季(11月至翌年4月)降雨量仅占全年的20%[13]。在人为和自然因素的共同作用下，沼泽湿地(常年淹水)逐步向沼泽化草甸(季节性淹水)和草甸(无积水)退化。
1.2 样品采集
于2015年1月(干季)和8月(湿季)，在每种退化湿地样带中分别随机布设3个10 m×10 m样地(表1)，每个样地内按对角线法布设5个采样点(4个顶角和1个中心)，分别采集各点样品并混合为1个土样，共采集18份土壤样品。去除各样点地表2 cm厚的覆盖物，然后用土钻钻取0~20 cm土层土样，去除石砾、残根后混合，并用四分法取适量土壤装入无菌自封袋，贴好标签装入便携式冰箱尽快带回实验室(沼泽湿地常年淹水，用特质采样器采样[15])。将带回的土样约100 g用于测定土壤自然含水率，约1 kg经自然风干、磨细过100目和10目筛后用于测定土壤基本性质，约200 g于−70 ℃下冷冻保存，用于土壤DNA提取和细菌高通量测序。
表 1 样地基本信息Table 1 Basic information of the sampling sites湿地类型 经度(N) 纬度(E) 积水深度/cm 优势植物 沼泽湿地(SW) 27°50′43.46″ 99°39′07.86″ 8.5~23.0 杉叶藻Hippuris vulgaris、狐尾藻Myripophyllum spicatum、篦齿眼子菜
Potamogeton pectinatus沼泽化草甸(SM) 27°50′43.46″ 99°38′34.60″ −19.3~5.5 矮地榆Sanguisorba filiformis、发草Deschampsia caespitosa、无翅薹草
Carex pleistoguna、斑唇马先蒿Pedicularis longiflora var. tubiformis草甸(M) 27°49′56.13″ 99°38′55.26″ −154.0~−123.0 大狼毒Euphorbia jolkinii、剪股颖Agrostis matsumurae 1.3 土壤理化性质测定
土壤理化性质测定参照鲍士旦[16]方法，其中：土壤自然含水率采用烘干法；pH采用电位法(水土比为1.0∶2.5)；有机质采用重铬酸钾氧化-外加热法；全氮采用硫酸-高氯酸消化开氏定氮法；全磷采用硫酸-高氯酸消煮-钼锑抗比色法；全钾采用氢氧化钠熔融-火焰光度法；速效氮采用碱解扩散吸收法；速效磷采用0.030 mol·L−1氟化铵-0.025 mol·L−1盐酸浸提钼蓝比色法；速效钾采用1.000 mol·L−1中性醋酸铵浸提火焰光度法。
1.4 土壤细菌高通量测序
用Soil DNA KIT试剂盒提取土壤总DNA，操作步骤参照试剂盒说明书。每份混合土样各提取3个DNA，充分混合后送往上海生工生物有限公司完成细菌高通量测序。利用引物341F[CCCTACA2CGACGCTCTTCCGATTG(barcode)CCTACGGGGGAG]和805R[GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTATATC]对细菌V3~V4区进行扩增，扩增过程分2轮。第1轮：10×PCR缓冲液5.0 μL，10 mmol·L−1dNTPs 0.5 μL，DNA模板10 ng，上游、下游引物各0.5 μL，Plantium Taq (5×16.67 mkat·L−1) 0.5 μL；扩增条件为：94 ℃预变性3 min，5个循环(94 ℃变性30 s、45 ℃退火20 s、65 ℃延伸30 s)，20个循环(94 ℃变性20 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸5 min。第2轮：DNA模板为20 ng，其他反应体系与第1轮一致；扩增条件为：95 ℃预变性30 s，5个循环(95 ℃变性15 s、55 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸5 min。PCR扩增结束后，将纯化质检合格的扩增产物按1∶1等量混合，利用Miseq台式测序仪2×300 bp双端测序(paired-end)[13]。
1.5 数据分析
实验数据用Excel 2007整理。数据分析前用SPSS 26进行正态分析和方差齐性检验(P＜0.05)。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各样地变量之间的差异显著性，成对样本t检验比较干湿季之间的差异显著性。利用Mothur软件将相似性大于97%的序列归为同一种可操作分类单元(OTU)，并计算Alpha多样性指数：丰富度指数(Richness)、香农指数 (Shannon)、艾斯指数(ACE)、赵氏指数(Chao1)、辛普森指数(Simpson)[13]。以理化因子为环境变量，细菌群落相对丰度为物种数据，采用Mantel分析理化因子对细菌群落结构的影响。
2. 结果与分析
2.1 不同退化阶段高原湿地土壤细菌门属水平群落组成的干湿季变化
2.1.1 土壤细菌门水平群落组成
高通量测序结果显示：在干季和湿季共检测到相对丰度＞1% 的细菌门主要有变形菌门Proteobacteria、酸杆菌门Acidobacteria、厚壁菌门Firmicutes、绿弯菌门Chloroflexi、放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、疣微菌门Verrucomicrobia、浮霉菌门Planctomycetes和未分类细菌门。其中，变形菌门是纳帕海高原湿地优势菌门，相对丰度高达35.92%，芽单胞菌门Gemmatimonadetes为干季特有菌门(图1)。
图 1 不同退化阶段土壤细菌门干季(A)、湿季(B)相对丰度Figure 1 Composition of dry (A) and wet (B) season bacteria phylum in soil at different degradation stages不同退化阶段土壤细菌门相对丰度差异显著(P＜0.05)。与沼泽湿地相比较，在干季，沼泽化草甸的变形菌门、酸杆菌门和厚壁菌门相对丰度显著增加(P＜0.05)，分别增加11.04%、49.10%和72.31%，绿弯菌门和拟杆菌门相对丰度分别减少40.89%和55.50%；草甸的酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门、浮霉菌门和芽单胞菌门相对丰度分别增加205.38%、260.76%、188.17%、135.31%和182.18%，变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度分别减少30.34%、46.55%和67.16%。在湿季，沼泽化草甸的变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门相对丰度分别增加17.98%、45.84%和223.54%，厚壁菌门和绿弯菌门相对丰度分别减少73.17%和35.39% (P＜0.05)；草甸的酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门和浮霉菌门相对丰度分别增加216.33%、194.30%、294.56%和624.73%，厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度分别减少88.63%和52.65%。
不同退化阶段土壤细菌门相对丰度干湿季节存在显著差异(P＜0.05)。沼泽湿地的变形菌门、酸杆菌门和绿弯菌门相对丰度为干季大于湿季，湿季分别减少了23.15%、23.89%和24.53%；厚壁菌门为湿季大于干季，是干季的3.70倍。沼泽化草甸的变形菌门、酸杆菌门、厚壁菌门和放线菌门相对丰度在湿季分别减少了18.35%、25.56%、42.39%和54.50%；拟杆菌门相对丰度在湿季显著增加(P＜0.05)，是干季的7.46倍。草甸的酸杆菌门相对丰度在湿季减少了21.17%；浮霉菌门相对丰度在湿季增加了1.79倍。
2.1.2 土壤细菌属水平群落组成
在属水平上，共检测到相对丰度＞0.01%的细菌属有酸杆菌属(Gp4、Gp6、Gp7)、假单胞菌属Pseudomonas、芽单胞菌属Gemmatimonas、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、Povalibacter、Subdivision、Spartobacteria和未分类菌属。除此之外，酸杆菌属(Gp1、Gp16)、Paenisporosarcina、芽孢杆菌属Bacillus和放线菌属Gaiella为干季特有菌属；梭菌属Clostridium、尼龙菌属Flavobacterium、溶杆菌属Lysobacter、地杆菌属Pedobacter、马塞菌属Massilia和出芽菌属Gemmata为湿季特有菌属。未分类菌属为纳帕海高原湿地优势菌属，相对丰度高达20.64% (图2)。
图 2 不同退化阶段土壤细菌属干、湿季群落组成Figure 2 Composition of dry and wet season bacteria phylum in soil at different degradation stages湿地退化显著影响土壤细菌属相对丰度(P＜0.05)。与沼泽湿地相比较，在干季，沼泽化草甸的假单胞菌属、Paenisporosarcina属相对丰度显著增加(P＜0.05)，分别增加9.34、455.50倍，Povalibacter属相对丰度显著减少77.29% (P＜0.05)；草甸的酸杆菌属(GP16)、假单胞菌属、Spartobacteria属相对丰度分别增加409.35、9.54和30.86倍，Povalibacter属和未分类菌属相对丰度分别减少80.06%和41.25%。在湿季，沼泽化草甸的尼龙菌属、溶杆菌属、地杆菌属相对丰度分别增加5.87、228.50和197.98倍，梭菌属相对丰度显著减少76.28% (P＜0.05)；草甸的出芽菌属相对丰度显著增加116.75倍(P＜0.05)，未分类菌属和梭菌属相对丰度分别减少33.49%和99.34%。
不同退化阶段的共有菌属因干湿季节变化而存在差异。沼泽湿地和沼泽化草甸的未分类菌属相对丰度均为干季大于湿季，在湿季分别减少21.59%和26.61%。沼泽化草甸中的假单胞菌属相对丰度在湿季减少79.75%；鞘氨醇单胞菌属相对丰度在湿季增加了95.78%。
2.2 不同退化阶段高原湿地土壤细菌群落多样性的干湿季动态
由表2可见：湿地退化显著影响土壤细菌群落多样性(P＜0.05)。在干季，沼泽化草甸和草甸的丰富度指数、香农指数、艾斯指数和Chao1指数较沼泽湿地显著增加(P＜0.05)，沼泽化草甸与草甸间差异不显著(P＞0.05)；在湿季，沼泽化草甸和草甸的丰富度指数、香农指数、艾斯指数和Chao1指数较沼泽湿地也显著增加，且沼泽化草甸显著高于草甸(P＜0.05)。不同退化阶段土壤细菌群落多样性指数在季节变化上存在差异。沼泽湿地和沼泽化草甸的丰富度指数、艾斯指数和Chao1指数均为湿季大于干季；草甸的丰富度指数、香农指数、艾斯指数均为干季大于湿季，辛普森指数相反，且差异显著(P＜0.05)。
表 2 不同退化阶段土壤细菌群落多样性指数Table 2 Diversity index of soil bacterial community at different degradation stages湿地
类型季节 丰富度
指数香农
指数艾斯
指数Chao1
指数辛普森
指数沼泽
湿地干季 4056 Bc 6.16 Ab 5668.94 Bb 5368.14 Bb 0.0135 Aa 湿季 4201 Ac 6.20 Ac 6095.66 Ac 5789.86 Ac 0.0118 Aa 沼泽化
草甸干季 5352 Bb 6.68 Aa 7046.88 Ba 6631.88 Ba 0.0061 Ab 湿季 5697 Aa 7.14 Aa 8095.30 Aa 8121.55 Aa 0.0049 Ab 草甸 干季 5451 Aa 6.83 Aa 7059.57 Aa 6655.28 Aa 0.0041 Bc 湿季 4915 Bb 6.27 Bb 6673.81 Bb 6398.10 Ab 0.0130 Aa 说明：表中数据为平均值。不同大写字母表示同一退化阶段不同季节差异显著(P＜0.05)；不同小写字母表示同一季节不同退化阶段差异显著(P＜0.05)。 2.3 不同退化阶段高原湿地土壤理化性质的干湿季变化
由表3可知：湿地退化显著改变土壤理化性质(P＜0.05)。湿地退化使土壤含水量以及有机质、全氮和速效氮质量分数显著减少(P＜0.05)。干季的沼泽化草甸分别减少77.77%、41.16%、46.53%和33.91%，草甸分别减少80.93%、64.81%、87.31%和50.79%；湿季的沼泽化草甸分别减少32.30%、25.01%、51.34%和7.32%，草甸分别减少78.31%、61.99%、70.62%和39.18%，且土壤逐渐酸化。土壤磷、钾养分及碳氮比的变化趋势有所差异。较沼泽湿地，在干季，沼泽化草甸土壤全磷、全钾、速效磷、速效钾质量分数分别增加46.88%、9.39%、15.34%和27.38%；草甸土壤全磷质量分数及碳氮比分别增加14.06%和176.80%，全钾、速效磷及速效钾质量分数分别减少31.41%、42.92%和40.97%。在湿季，沼泽化草甸土壤全钾质量分数和碳氮比分别减少14.35%和63.88%，速效磷及速效钾质量分数分别增加66.15%和108.66%；草甸土壤全磷、速效磷、速效钾质量分数及碳氮比分别减少30.09%、33.57%、49.88%和37.97%，全钾质量分数显著增加51.48% (P＜0.05)。
表 3 不同退化阶段土壤理化性质Table 3 Soil physical and chemical characteristics at different degradation stages湿地类型 干湿季 含水量/% 有机质/(g·kg−1) 全氮/(g·kg−1) 全磷/(g·kg−1) 全钾/(g·kg−1) 沼泽湿地 干季 106.15±0.47 Ba 138.20±4.29 Aa 9.22±0.20 Ba 0.64±0.01 Ac 10.76±0.36 Ab 湿季 117.15±0.60 Aa 144.40±2.52 Aa 11.98±0.29 Aa 0.57±0.01 Aa 9.13±0.20 Ab 沼泽化草甸 干季 23.60±1.52 Bb 81.31±1.45 Bb 4.93±0.31 Ab 0.94±0.02 Aa 11.77±0.29 Aa 湿季 79.31±0.91 Ab 108.28±1.37 Ab 5.83±0.31 Ab 0.56±0.02 Ba 7.82±0.15 Bc 草甸 干季 20.24±1.04 Bb 48.63±6.60 Bc 1.17±0.04 Bc 0.73±0.01 Ab 7.38±0.18 Ac 湿季 25.41±0.50 Ac 54.89±2.13 Ac 3.52±0.05 Ac 0.37±0.02 Bb 13.83±0.13 Aa 湿地类型 干湿季 碳氮比 pH 速效氮/(mg·kg−1) 速效磷/(mg·kg−1) 速效钾/(mg·kg−1) 沼泽湿地 干季 8.75±0.37 Bb 7.92±0.01 Aa 627.75±2.29 Aa 6.78±0.16 Ab 176.76±0.93 Bb 湿季 14.59±0.55 Aa 7.87±0.02 Aa 494.61±7.02 Ba 7.15±0.20 Ab 297.36±9.03 Ab 沼泽化草甸 干季 9.81±0.47 Ab 6.97±0.04 Bb 414.85±1.37 Bb 7.82±0.14 Ba 225.16±1.29 Ba 湿季 5.27±0.13 Bc 7.82±0.11 Aa 458.39±3.36 Ab 11.88±1.21 Aa 620.46±4.70 Aa 草甸 干季 24.22±3.30 Aa 5.92±0.12 Ac 308.92±1.36 Ac 3.87±0.14 Bc 104.35±1.44 Ac 湿季 9.05±0.35 Bb 5.65±0.08 Ab 300.84±3.44 Ac 4.75±0.05 Ac 149.04±8.64 Ac 说明：表中数据为平均值±标准误。不同大写字母表示同一退化阶段不同季节差异显著(P＜0.05)；不同小写字母表示同一季节不同退化阶段差异显著(P＜0.05)。 干湿季节变化显著影响土壤理化性质的变化规律(P＜0.05)。沼泽湿地土壤含水量以及全氮、碳氮比、速效钾质量分数均为湿季大于干季，湿季分别增加10.36%、29.93%、40.03%和68.23%；速效氮在湿季显著减少21.21%(P＜0.05)。沼泽化草甸土壤含水量以及有机质、速效氮、速效磷和速效钾质量分数在湿季比干季分别增加236.06%、33.17%、10.50%、51.92%和175.56%；全磷、全钾质量分数和碳氮比在湿季分别减少40.43%、33.56%和46.28%；湿季pH升高，土壤偏碱性。草甸土壤含水量以及有机质、全氮、速效磷质量分数在湿季比干季分别增加25.54%、12.87%、200.85%和22.74%；全磷质量分数和碳氮比分别减少49.32%和62.63%。
2.4 土壤理化性质与细菌群落组成之间的关系
2.4.1 干季
干季土壤理化因子与土壤细菌群落组成的Mantel分析结果如图3所示。门水平上，土壤全氮、全钾、速效钾质量分数及pH和土壤细菌门的曼特尔显著值最小(P＜0.01)，说明土壤pH以及氮和钾质量分数的高低是调控干季纳帕海不同退化阶段湿地土壤细菌群落结构的主要理化因子。其中，全氮质量分数和pH与酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门、浮霉菌门、芽单胞菌门呈显著负相关(r=−0.93~−0.70，P＜0.05)，与变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门呈显著正相关(r=0.67~0.90，P＜0.05)。全钾和速效钾质量分数与变形菌门、厚壁菌门呈极显著正相关(r=0.85~0.98，P＜0.01)，与酸杆菌门、疣微菌门、浮霉菌门呈显著负相关(r=−0.97~−0.79，P＜0.05)。
图 3 干季土壤理化因子与细菌群落结构关系的Mantel分析Figure 3 Mantel test analysis of the relationship between soil physical and chemical factors and bacterial community structure in dry season属水平上，土壤氮、磷、钾质量分数以及pH的高低是调控干季纳帕海不同退化阶段湿地土壤细菌群落组成的主要理化因子。其中，全氮、速效氮质量分数以及pH与酸杆菌属(Gp1、Gp4、Gp6、Gp7)、假单胞菌属、芽单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、芽孢杆菌属、Spartobacteria、出芽菌属呈显著负相关(r=−0.93~−0.67，P＜0.05)，与Gp16属、Povalibacter、未分类菌属呈显著正相关(r=0.72~0.91，P＜0.05)。速效磷、速效钾质量分数与酸杆菌属(Gp1、Gp4)、鞘氨醇单胞菌属、Spartobacteria、出芽菌属呈极显著负相关(r=−0.97~−0.80)，与未分类菌属呈极显著正相关(r=0.81~0.96，P＜0.01)。
2.4.2 湿季
湿季土壤理化因子与土壤细菌群落组成的Mentel分析结果如图4所示。门水平上，有机质、氮和磷质量分数及含水量、pH的高低是调控纳帕海不同退化阶段湿地土壤细菌群落结构的主要理化因子。其中，含水量、pH以及有机质、全氮、全磷、速效氮质量分数与酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门和浮霉菌门呈显著负相关(r=−0.98~−0.74，P＜0.05)，有机质、全氮、速效氮质量分数以及含水量与厚壁菌门、绿弯菌门呈显著正相关(r=0.75~0.96，P＜0.05)。
图 4 湿季土壤理化因子与细菌群落结构关系的Mantel分析Figure 4 Mantel test analysis of the relationship between soil physical and chemical factors and bacterial community structure in wet season属水平上，有机质、氮、磷质量分数以及pH、含水量、碳氮比是调控纳帕海不同退化阶段湿地土壤细菌群落组成的主要理化因子。其中，有机质、全氮、全磷、速效氮质量分数以及含水量、pH 与假单胞菌属、芽单胞菌属、Gp4属、Gp7属、Spartobacteria、出芽菌属呈显著负相关(r=−0.97~−0.71，P＜0.05)，与梭菌属、Povalibacter、未分类菌属呈显著正相关(r=0.79~0.96，P＜0.05)；碳氮比与尼龙菌属、Subdivision、溶杆菌属、地杆菌属、马塞菌属呈显著负相关(r=−0.90~−0.68，P＜0.05)，与梭菌属和Povalibacter呈显著正相关(r=0.76~0.78，P＜0.05)。
2.5 土壤理化性质与细菌多样性之间的关系
对土壤理化因子与细菌多样性指数进行Pearson相关性分析，结果如表4所示。在干季，丰富度指数、香农指数、艾斯指数、Chao1指数与有机质、全氮、速效氮质量分数以及pH、含水量呈极显著负相关(r=−0.99~−0.83，P＜0.01)。可见：土壤有机质、全氮、速效氮质量分数以及pH、含水量是影响干季土壤细菌多样性的主控因子，且对细菌多样性起抑制作用。
表 4 土壤主要理化因子与细菌群落多样性的相关性分析Table 4 Correlation analysis between main soil physical and chemical factors and bacterial community diversity项目 干季 湿季 丰富度指数 香农指数 艾斯指数 Chao1指数 辛普森指数 丰富度指数 香农指数 艾斯指数 Chao1指数 辛普森指数 含水量 −0.99** −0.92** −0.99** −0.99** 0.98** − − − − − 有机质 −0.87** −0.89** −0.85** −0.85** 0.93** − − − − − 全氮 −0.91** −0.90** −0.89** −0.89** 0.96** −0.67* − − − − 全磷 − − 0.71* 0.70* − − − − − − 全钾 − − − − − 0.72* 0.88** 0.83** 0.85** −0.84** 碳氮比 − − − − −0.70* −0.96** −0.79* −0.91** −0.90** − pH −0.86** −0.83** −0.83** −0.83** 0.91** − − − − − 速效氮 −0.96** −0.93** −0.95** −0.94** 0.99** − − − − − 速效磷 − − − − − − 0.88** 0.79* 0.81** −0.90** 速效钾 − − − − − 0.68* 0.91** 0.82** 0.84** −0.91** 说明：*表示显著相关(P＜0. 05)；**表示极显著相关(P＜0. 01)；−表示不相关(P＞0.05)。 在湿季，香农指数、艾斯指数、Chao1指数与土壤全钾、速效钾、速效磷质量分数呈显著正相关(r=0.79~0.91，P＜0.05)，与碳氮比呈显著负相关(r=−0.91~−0.79，P＜0.05)，是影响湿季土壤细菌多样性的主控因子。其中，全钾、速效钾、速效磷质量分数对细菌多样性起促进作用，而碳氮比起抑制作用。
3. 讨论
3.1 纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤细菌群落结构的干湿季变化
土壤细菌作为微生物群落中数量最丰富、种类最多、生物量最大的功能类群，能够对高原湿地退化引起的土壤微域环境变化产生敏感响应[17]。变形菌门是纳帕海湿地的主要优势类群，与李金业等[18]、李玉倩等[19]研究结果一致。变形菌门的生态幅广、适宜能力强，能在不同退化湿地环境中形成较为稳定的生态位，但其喜弱碱特性会影响其相对丰度的变化[20]。本研究中，在轻度退化的弱碱沼泽化草甸土壤中变形菌门相对丰度显著增加。酸杆菌门、放线菌门、疣微菌门、浮霉菌门和芽单胞菌门相对丰度均随湿地退化程度的加深而增加。酸杆菌属嗜酸菌、寡营养类群，其胞外多糖与补偿溶质的产生与积累使其更适应于含水量低、酸性较强、养分较低的退化草甸土壤[21]；放线菌门、疣微菌门Spartobacteria属和浮霉菌门等属好气性细菌，喜欢通气良好的环境，湿地退化导致土壤含水量减少，土壤孔隙度、通气状况得到改善，促进其相对丰度的显著增加[22]；疣微菌门是高寒沙化草甸的特有菌群，主要通过磷来维持其群落机制和养分平衡[23]，故在磷分较丰富的退化草甸土壤中相对丰度较高。本研究发现：湿地退化会抑制绿弯菌门的生长繁殖，这是因为该菌门属兼性厌氧菌，在养分匮乏的条件下进行光能自养，但仍以无光或有光且缺氧条件下的化学能或光能异养生长为主[24]，湿地退化导致土壤水分减少而抑制其相对丰度增加。综上所述，湿地退化过程中土壤含水量减少，使得土壤通气透水性得到改善，促进好气性细菌类群大量繁殖。
干湿季节交替通过调节水分、温度以及细菌对土壤养分的利用关系从而改变土壤细菌群落组成[25]。本研究发现：厚壁菌门在沼泽湿地中为湿季大于干季，而在沼泽化草甸中为干季大于湿季。厚壁菌属厌氧快速生长型菌群，具有固碳作用，大多存在于动物肠道中[26]。湿季雨水冲刷，厚壁菌门随动物粪便流入沼泽湿地，相对丰度增加，同时动物粪便的输入可直接刺激其相对丰度的增加；而沼泽化草甸的有机底物相对较低，干季丰富的凋落物为厚壁菌门提供充足碳源，相对丰度较湿季增加。梭菌属为湿季特有菌属，在沼泽湿地中占优势，相对丰度高达22.60%。该菌属是来自厚壁菌门的专性厌氧铁还原菌，在严格厌氧条件下才能生存，主要通过还原铁获取生长能量[27]，沼泽湿地常年淹水，湿季适宜的温度和充足的有机底物可促进其快速生长；而在干季，养分较少、温度相对较低，有利于厌氧寡营养绿弯菌门聚集[28]。拟杆菌门(尼龙菌属)在湿季沼泽化草甸显著增加，这主要与其需氧特性和水生环境的生物学特性有关[29]。酸杆菌门具有降解植物残体多聚物的能力[21]，干季植物枯死，凋落物的分解为酸杆菌的繁殖及降解提供更好的养分条件[30]，故相对丰度呈现干季大于湿季的变化趋势。芽单胞菌门在干季相对丰度较低，在湿季则未检测到，进一步表明了芽单胞菌属好氧菌，适宜生存于较为干燥的环境中[31−32]。因此，干湿季更替显著影响好养厌养、需氧厌氧细菌群落分布格局。
3.2 纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤细菌群落多样性的干湿季变化
高原湿地退化通过影响水热条件、土壤结构、土壤养分，进而影响土壤细菌群落多样性[33]。本研究中，沼泽化草甸和草甸土壤的丰富度指数、香农指数、艾斯指数和Chao1指数显著高于沼泽湿地，说明湿地退化会促进细菌多样性的增加。这可能是沼泽湿地有机底物常年积累，但由于其土壤处于厌氧状况，不利于微生物对养分的矿化，难为大多数细菌提供直接能量来源[34]，因此，细菌多样性较沼泽化草甸和草甸细菌低。另一方面，湿地在退化过程中，土壤孔隙度、通气状况得到改善，碱性减弱、凋落物分解加快，农药化肥的残留以及牛粪的输入为细菌生命活动提供物质源泉[35]，有利于好氧喜酸细菌大量繁殖，从而导致细菌多样性较沼泽湿地高。另外，湿地退化导致植被类型呈现挺水植物—湿中生植物—旱生植物的演替格局[12]，地上凋落物、根系分泌物的增加直接为土壤细菌提供可利用的碳氮及其他养分，细菌多样性增加[13]。
干湿季节更替引起的降雨量和温湿度变化，可能影响土壤理化性质及酶活性变化，进而调控土壤细菌群落多样性的干湿季变化[36]。本研究中，沼泽湿地和沼泽化草甸土壤细菌的丰富度指数、艾斯指数湿季显著高于干季，而草甸则为干季显著高于湿季。原因可能是沼泽湿地和沼泽化草甸淹水较多导致通气透水性差，抑制了需氧细菌对有机质的降解[24]。但在湿季，由于温度升高，细菌酶活性增强，溶解氧降低[37]，刺激细菌大量繁殖，导致湿季细菌多样性高于干季。相较于沼泽湿地和沼泽化草甸，草甸土壤含水量低，通气透水性好，为需氧细菌提供良好的微氧环境[34]。特别是湿季放牧和旅游增加，土壤细菌多样性会因牲畜和游客践踏引起的土壤板结和理化性质变化，而导致细菌多样性湿季低于干季[38]。因此，干湿季节更替使得纳帕海不同退化阶段土壤细菌群落多样性存在差异。
3.3 土壤理化环境变化对细菌群落及多样性的影响
湿地退化过程中土壤水分状况变化，直接或间接导致土壤环境厌氧-需氧界面通气性、酸碱性和养分状况的改变，进而显著影响土壤细菌群落结构及多样性[39−40]。纳帕海高原湿地不同退化阶段土壤含水量是影响干季土壤细菌群落结构和多样性变化的主要因子，由于沼泽湿地—沼泽化草甸—草甸演替过程中，土壤含水量减少，土壤质地疏松和溶解氧增加，有利于土壤养分分解，从而促进需氧菌的繁殖，细菌多样性增加。牛佳等[41]指出：水分是影响土壤细菌群落结构的主要因子，通过调节土壤酸碱度及养分分布格局，进而影响细菌群落结构组成。本研究中，土壤含水量与全氮、有机质、速效氮质量分数以及pH呈显著正相关，并随湿地退化而显著减少。pH高低决定整个湿地生态系统元素循环反应体系的酸碱度[42]，显著影响细菌群落组成。湿地退化过程中，土壤酸化使得土壤碳氮磷养分有效性发生改变[43]，从而影响土壤细菌群落分布格局。Mantel分析结果显示：pH同土壤有机质、全氮、速效氮质量分数以及含水量显著促进酸杆菌门、放线菌门、浮霉菌门和疣微菌门相对丰度增加，而抑制变形菌门、绿弯菌门和拟杆菌门相对丰度增加。原因是变形菌门、绿弯菌门和拟杆菌门属于固碳微生物，具有好氧喜弱碱特性[44]，湿地退化，碳氮质量分数降低不利于细菌生长繁殖。这与林春英等[7]在高寒沼泽湿地退化研究中得出的结论相似。
不同退化阶段土壤碳氮比增加对湿季细菌多样性增加起抑制作用。李杰[45]研究得出：碳氮比通过调节微生物分解进程进而调节土壤养分有效性，高碳氮比抑制土壤微生物活性从而缓解有机质分解，而低碳氮比加快微生物对有机质的分解、转化。本研究中，高原湿地退化过程中，土壤碳氮比降低，细菌可利用养分转化速率加快[46]，细菌多样性增加；但湿地退化引起的土壤有机质减少也会导致土壤细菌可利用碳源减少，使得绝大部分共养厌氧细菌相对丰度下降(厚壁菌门、变形菌门)。Mantel分析结果显示：土壤含水量及碳、氮质量分数减少，显著抑制厚壁菌门、绿弯菌门和梭菌属相对丰度的增加；磷促进变形菌门、拟杆菌门(尼龙菌属)和地杆菌属相对丰度的增加。原因是湿地退化，土壤碳氮质量分数及含水量减少，厌氧需养菌受到抑制[47]；同时，湿地退化引起的土壤酸化可刺激铁铝氧化物释放磷元素，进而促进喜磷细菌(变形菌门、拟杆菌门以及尼龙菌属和地杆菌属)大量繁殖。综上所述，湿地退化引起土壤养分状况、含水量及酸碱度改变，通过影响土壤细菌的养分需求和代谢过程，进而调控纳帕海高原湿地土壤细菌多样性。
4. 结论
纳帕海高原湿地退化显著影响土壤理化环境的时空异质性，进而调控土壤细菌群落结构及多样性。湿地退化引起土壤有机质、氮质量分数以及水分、pH减小，导致酸杆菌门、放线菌门、浮霉菌门、疣微菌门相对丰度显著增加，绿弯菌门相对丰度显著减少及变形菌门、厚壁菌门(梭菌属)和拟杆菌门(尼龙菌属)干湿季差异，进而导致退化湿地土壤细菌多样性较沼泽湿地显著增加。因此，湿地退化导致土壤水分、酸碱度及土壤养分供给状况发生改变，从而显著影响土壤细菌群落结构及多样性。
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[1] FRANCESCHI V R, PAAL K, ERIK C, et al. Anatomical and chemical defenses of conifer bark against bark beetles and other pests [J]. New Phytol, 2010, 167(2): 353 − 376. [2] RIEDERER M, MÜLLER C. Annual Plant Reviews Volume 23: Biology of the Plant Cuticle[M]. [s.l.]: Blackwell Publishing Ltd, 2006: 1 − 10. [3] ARAG N W, REINA-PINTO J J, SERRANO M. The intimate talk between plants and microorganisms at the leaf surface [J]. J Exp Bot, 2017, 68(19): 5339 − 5350. [4] ZIV C, ZHAO Zhenzhen, GAO Yug, et al. Multifunctional roles of plant cuticle during plant-pathogen interactions [J]. Front Plant Sci, 2018, 9(1): 1088. [5] LEE S B, SUH M C. Advances in the understanding of cuticular waxes in Arabidopsis thaliana and crop species [J]. Plant Cell Rep, 2015, 34(4): 557 − 572. [6] BERHIN A, DE BELLIS D, FRANKE R B, et al. The root cap cuticle: a cell wall structure for seedling establishment and lateral root formation [J]. Cell, 2019, 176(6): 1367 − 1378. [7] INGRAM G, NAWRATH C. The roles of the cuticle in plant development: organ adhesions and beyond [J]. J Exp Bot, 2017, 68(19): 5307 − 5321. [8] COHEN H, SZYMANSKI J, AHARONI A. Assimilation of ‘omics’ strategies to study the cuticle layer and suberin lamellae in plants [J]. J Exp Bot, 2017, 68(19): 5389 − 5400. [9] JETTER R, KUNST L, SAMUELS A L. Composition of Plant Cuticular Waxes[M]. [s.l.]: Blackwell Publishing Ltd, 2006: 145﹣181. [10] WANG Tianya, XING Jiewen, LIU Xinye, et al. GCN5 contributes to stem cuticular wax biosynthesis by histone acetylation of CER3 in Arabidopsis [J]. J Exp Bot, 2018, 69(12): 2911 − 2922. [11] KUNST L, SAMUELS L. Plant cuticles shine: advances in wax biosynthesis and export [J]. Curr Opin Plant Biol, 2009, 12(6): 721 − 727. [12] BERNARD A, DOMERGUE F, PASCAL S, et al. Reconstitution of plant alkane biosynthesis in yeast demonstrates that Arabidopsis ECERIFERUM1 and ECERIFERUM3 are core components of a very-long-chain alkane synthesis complex [J]. Plant Cell, 2012, 24(7): 3106 − 3118. [13] PASCAL S, BERNARD A, DESLOUS P, et al. Arabidopsis CER1-LIKE1 functions in a cuticular very-long-chain Alkane-forming complex [J]. Plant Physiol, 2019, 179(2): 415 − 432. [14] GREER S, WEN Miao, BIRD D, et al. The cytochrome P450 enzyme CYP96A15 is the midchain alkane hydroxylase responsible for formation of secondary alcohols and ketones in stem cuticular wax of Arabidopsis [J]. Plant Physiol, 2007, 145(3): 653 − 667. [15] ROWLAND O, ZHENG H, HEPWORTH S R, et al. CER4 encodes an alcohol-forming fatty acyl-coenzyme A reductase involved in cuticular wax production in Arabidopsis [J]. Plant Physiol, 2006, 142(3): 866 − 877. [16] LI Fengling, WU Xuemin, LAM P, et al. Identification of the wax ester synthase/acyl-coenzyme A: diacylglycerol acyltransferase WSD1 required for stem wax ester biosynthesis in Arabidopsis [J]. Plant Physiol, 2008, 148(1): 97 − 107. [17] YEATS T H, ROSE J K C. The formation and function of plant cuticles [J]. Plant Physiol, 2013, 163(1): 5 − 20. [18] SAMUELS L, KUNST L, JETTER R. Sealing plant surfaces: cuticular wax formation by epidermal cells [J]. Annu Rev Plant Biol, 2008, 59(1): 683 − 707. [19] FICH E A, SEGERSON N A, ROSE J K C. The plant polyester cutin: biosynthesis, structure, and biological roles [J]. Annu Rev Plant Biol, 2016, 67(1): 207 − 233. [20] KURDYUKOV S, FAUST A, TRENKAMP S, et al. Genetic and biochemical evidence for involvement of HOTHEAD in the biosynthesis of long-chain α-,ω-dicarboxylic fatty acids and formation of extracellular matrix [J]. Planta, 2006, 224(2): 315 − 329. [21] MOLINA I, B OHLROGGE J, POLLARD M. Deposition and localization of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and Arabidopsis thaliana [J]. Plant J, 2008, 53(1): 437 − 449. [22] LIBEISSON Y, POLLARD M, SAUVEPLANE V, et al. Nanoridges that characterize the surface morphology of flowers require the synthesis of cutin polyester [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(51): 22008 − 22013. [23] SINGER S D, CHEN G, MIETKIEWSKA E, et al. Arabidopsis GPAT9 contributes to synthesis of intracellular glycerolipids but not surface lipids[J]. J Exp Bot, 67(15): 4627 − 4638. [24] LI Nannan, XU Changcheng, LI-BEISSON Yonghua, et al. Fatty acid and lipid transport in plant cells [J]. Trends Plant Sci, 2016, 21(2): 145 − 158. [25] YEATS T H., HUANG Wenlin, CHATTERJEE S, et al. Tomato cutin deficient 1 (CD1) and putative orthologs comprise an ancient family of cutin synthase-like (CUS) proteins that are conserved among land plants [J]. Plant J Cell Mol Biol, 2014, 77(5): 667 − 675. [26] YEATS T H, MARTIN L B B, VIART H M-F, et al. The identification of cutin synthase: formation of the plant polyester cutin [J]. Nat Chem Biol, 2012, 8(7): 609 − 611. [27] GIRARD A L, MOUNET F, LEMAIRE-CLEMAIRE M, et al. Tomato GDSL1 is required for cutin deposition in the fruit cuticle [J]. Plant Cell, 2012, 24(7): 3119 − 3134. [28] GIRARD A L, MOUNET F, LEMAIRE-CHAMLEY M L J, et al. BODYGUARD is required for the biosynthesis of cutin in Arabidopsis [J]. New Phytol, 2016, 211(2): 614 − 626. [29] 宗兆峰, 康振生. 植物病理学原理[M]. 北京: 中国农业出版社, 2002. [30] ANNE K, MARTIN S D, THOMAS C, et al. Tradeoffs associated with constitutive and induced plant resistance against herbivory [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(14): 5685 − 5689. [31] ALIETA E, PIERLUIGI B, REBECCA G, et al. Induced resistance to pests and pathogens in trees [J]. New Phytol, 2010, 185(4): 893 − 908. [32] AGRAWAL A A. Induced responses to herbivory and increased plant performance [J]. Science, 1998, 279(5354): 1201 − 1202. [33] BOLLER T, FELIX G. A renaissance of elicitors: perception of microbe-associated molecular patterns and danger signals by pattern-recognition receptors [J]. Annu Rev Plant Biol, 2009, 60(1): 379 − 406. [34] ZIPFEL C. Plant pattern-recognition receptors [J]. Trends Immunol, 2014, 35(7): 345 − 351. [35] CONRATH U, BECKERS G J, LANGENBACH C J, et al. Priming for enhanced defense [J]. Annu Rev Phytopathol, 2015, 53(1): 97 − 119. [36] SPOEL S H, DONG Xinnian. How do plants achieve immunity? defence without specialized immune cells [J]. Nat Rev Immunol, 2012, 12(2): 89 − 100. [37] GRAY W M. Plant defence: a new weapon in the arsenal [J]. Curr Biol, 2002, 12(10): R352 − R354. [38] YU Xiao, FENG Baomin, HE Ping, et al. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition [J]. Annu Rev Phytopathol, 2017, 55(1): 109 − 137. [39] HETMANN A, KOWALCZYK S. Membrane receptors recognizing MAMP/PAMP and DAMP molecules that activate first line of defence in plant immune system [J]. Postepy Biochem, 2018, 64(1): 29 − 45. [40] TSUDA K, SOMSSICH I E. Transcriptional networks in plant immunity [J]. New Phytol, 2015, 206(3): 932 − 947. [41] DURRANT W E, X D. Systemic acquired resistance [J]. Annu Rev Phytopathol, 2006, 1(4): 179 − 184. [42] KACHROO A, ROBIN G P. Systemic signaling during plant defense [J]. Curr Opin Plant Biol, 2013, 16(4): 527 − 533. [43] REINA-PINTO J J, YEPHREMOV A. Surface lipids and plant defenses [J]. Plant Physiol Biochem, 2009, 47(6): 540 − 549. [44] KHANAL B P, KNOCHE M. Mechanical properties of cuticles and their primary determinants [J]. J Exp Bot, 2017, 68(19): 5351 − 5367. [45] RYDER L S, TALBOT N J. Regulation of appressorium development in pathogenic fungi [J]. Curr Opin Plant Biol, 2015, 26(1): 8 − 13. [46] GUAN Yeqing, CHANG Ruifeng, LIU Guojian. Role of lenticels and microcracks on susceptibility of apple fruit to Botryosphaeria dothidea [J]. Eur J Plant Pathol, 2015, 143(2): 317 − 330. [47] 李婧婧, 黄俊华, 谢树成. 植物蜡质及其与环境的关系[J]. 生态学报, 2011, 31(2): 565 − 574. LI Jingjing, HUANG Junhua, XIE Shucheng. Plant wax and its response to environmental conditions: an overview [J]. Acta Ecol Sin, 2011, 31(2): 565 − 574. [48] YE Xia, YU Keshun, GAO Qingming, et al. Acyl CoA binding proteins are required for cuticle formation and plant responses to microbes [J]. Front Plant Sci, 2012, 3: 224. [49] YE Xia, YU Keshun, NAVARRE D, et al. The glabra1 mutation affects cuticle formation and plant responses to microbes [J]. Plant Physiol, 2010, 154(2): 833 − 846. [50] SELA D, BUXDORF K, SHI J X, et al. Overexpression of AtSHN1/WIN1 provokes unique defense responses[J]. Plos One, 2013, 8(7): e70146. doi: 10.1371/journal.pone.0070146. [51] RUBIALES D, NIKS R E. Avoidance of rust infection by some genotypes of Hordeum chilense due to their relative inability to induce the formation of appressoria [J]. Physiol Mol Plant Pathol, 1996, 49(2): 89 − 101. [52] GILBERT R D, JOHNSON A M, DEAN R A. Chemical signals responsible for appressorium formation in the rice blast fungus Magnaporthe grisea [J]. Physiol Mol Plant Pathol, 1996, 48(5): 335 − 346. [53] LEROCH M, KLEBER A, SILVA E, et al. Transcriptome profiling of Botrytis cinerea conidial germination reveals upregulation of infection-related genes during the prepenetration stage [J]. Eukaryotic Cell, 2013, 12(4): 614 − 626. [54] XIAO Fangming, GOODWIN S M, XIAO Yanmei, et al. Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type Ⅲgenes and is required for cuticle development [J]. Embo J, 2014, 23(14): 2903 − 2913. [55] KACHROO A, KACHROO P. Fatty acid-derived signals in plant defense [J]. Annu Rev Phytopathol, 2009, 47: 153 − 176. [56] NOAM A, GILGI F, DANA M, et al. Simultaneous transcriptome analysis of Colletotrichum gloeosporioides and tomato fruit pathosystem reveals novel fungal pathogenicity and fruit defense strategies [J]. New Phytol, 2015, 205(2): 801 − 815. [57] MARQUES J P R, AMORIM L, SP SITO M B, et al. Ultrastructural changes in the epidermis of petals of the sweet orange infected by Colletotrichum acutatum [J]. Protoplasma, 2015, 253(5): 1 − 10. [58] KUMAR A, YOGENDRA K N, KARRE S, et al. WAX INDUCER1 (HvWIN1) transcription factor regulates free fatty acid biosynthetic genes to reinforce cuticle to resist Fusarium head blight in barley spikelets [J]. J Exp Bot, 2016, 67(14): 4127 − 4139. [59] ZHAO Chunzhao, NIE Haozhen, SHEN Qiujing, et al. EDR1 physically interacts with MKK4/MKK5 and negatively regulates a MAP kinase cascade to modulate plant innate immunity [J]. PLoS Genet, 2014, 10(5): e1004389. [60] SCHWEIZER P, JEANGUENAT A, WHITACRE D, et al. Induction of resistance in barley against Erysiphe graminis f.sp. hordei by free cutin monomers [J]. Physiol Mol Plant Pathol, 1996, 49(2): 103 − 120. [61] SCHWEIZER P, FELIX G, BUCHALA A, et al. Perception of free cutin monomers by plant cells [J]. Plant J, 2010, 10(2): 331 − 341. [62] BUXDORF K, RUBINSKY G, BARDA O, et al. The transcription factor SlSHINE3 modulates defense responses in tomato plants [J]. Plant Mol Biol, 2014, 84(1/2): 37 − 47. [63] KIM T H, PARK J H, KIM M C, et al. Cutin monomer induces expression of the rice OsLTP5 lipid transfer protein gene [J]. J Plant Physiol, 2008, 165(3): 345 − 349. [64] KAUSS H, FAUTH M, JEBLICK M W. Cucumber hypocotyls respond to cutin monomers via both an inducible and a constitutive H2O2-generating system [J]. Plant Physiol, 1999, 120(4): 1175 − 1182. [65] FAUTH M, SCHWEIZER P, BUCHALA A, et al. Cutin monomers and surface wax constituents elicit H2O2 in conditioned cucumber hypocotyl segments and enhance the activity of other H2O2 elicitors [J]. Plant Physiol, 1998, 117(4): 1373 − 1380. [66] SERRANO M, COLUCCIA F, TORRES M, et al. The cuticle and plant defense to pathogens [J]. Front Plant Sci, 2014, 5: 274. [67] XIA Ye, GAO Qingming, YU Keshun, et al. An intact cuticle in distal tissues is essential for the induction of systemic acquired resistance in plants [J]. Cell Host Microbe, 2009, 5(2): 151 − 165. [68] DENANC N S, NCHEZ-VALLET A, GOFFNER D, et al. Disease resistance or growth: the role of plant hormones in balancing immune responses and fitness costs [J]. Front Plant Sci, 2013, 4: 155. [69] PINOT F, BENVENISTE I, SALAN J P, et al. Methyl jasmonate induces lauric acid omega-hydroxylase activity and accumulation of CYP94A1 transcripts but does not affect epoxide hydrolase activities in Vicia sativa seedlings [J]. Plant Physiol, 1998, 118(4): 1481 − 1486. [70] MANG H G, LALUK K A, PARSONS E P, et al. The Arabidopsis RESURRECTION1 gene regulates a novel antagonistic interaction in plant defense to biotrophs and necrotrophs [J]. Plant Physiol, 2009, 151(1): 290 − 305. [71] HE Yizhong, HAN Jingwen, LIU Runsheng, et al. Integrated transcriptomic and metabolomic analyses of a wax deficient citrus mutant exhibiting jasmonic acid-mediated defense against fungal pathogens [J]. Hortic Res, 2018, 5(1): 43 − 43. 期刊类型引用(3)
1. 道日娜，张英，李希来，李强，马林雄，铁晓龙. 高寒湿地演替过程对土壤细菌多样性的影响. 环境科学. 2025(03): 1897-1904 . 
百度学术2. 彭鵾，靳红梅，孙恩惠，陈国强，雍宬，GUEGUIM KANA E B，吴增游，刘歆颖，程洁红，曲萍，黄红英. 秸秆纤维毯覆盖对葡萄园土壤理化性质、杂草防控及果实品质的影响. 农业资源与环境学报. 2025(02): 430-438 . 百度学术3. 刘秀花，孙钰涵，卢杰，刘小康，马延东，贺屹，胡安焱. 黄土-古土壤原核生物群落对古气候变化的响应. 微生物学报. 2024(06): 1800-1823 . 百度学术其他类型引用(1)
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