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定向刨花板(oriented strand board, OSB)是以大片木质刨花为原料，经施胶并定向铺装后热压而成。OSB是一种生物基材料，水分会软化木纤维并影响OSB的力学强度[1-3]。木纤维的干缩湿胀易造成OSB内部结构变化[4-5]。已有研究[6-7]表明：相较于65%相对空气湿度(relative humidity, RH)，85％RH条件下OSB的弹性模量、静曲强度更低，且变异性增加。通过开展循环吸放水实验，LI等[8]发现多次吸放水会导致OSB变形，并降低其弹性模量。HODOUSEK等[9]研究表明：吸水及含水率增加均会降低OSB的透气性。提高OSB的耐水性和力学强度是拓展其应用范围的重要途径。木材材性在很大程度上决定了OSB的物理力学性能[10]，疏水化改性木材刨花可以极大提高OSB的耐水性[11]，石蜡等耐水添加剂的使用也能够改善OSB的尺寸稳定性[12]。吸湿影响OSB物理性能的直观表现是厚度膨胀，尺寸稳定性也是衡量OSB耐水性的重要指标，厚度方向上的尺寸变化会直接影响OSB的抗压强度，理解OSB抗压强度变化的发生机制有助于提高OSB的耐水性。数字散斑相关分析技术是一种动态记录材料面内应变分布的可靠手段[13]。该技术通过分析由高速相机捕捉的一系列照片来获得材料的表面变形，并进一步量化面内应变分布[14]。数字散斑相关分析技术可以有效记录载荷作用下木质材料的破坏过程和探索力学损失的发生机制[15-17]。本研究旨在系统探索水分对OSB抗压强度的影响规律，并基于应变分布分析影响规律的发生机制，研究结果可以为优化OSB加工工艺提供必要的理论支撑。
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2类OSB购自加拿大Norbord公司，分别采用杨木Populus euramericana刨花和异氰酸酯胶黏剂为原料生产，气干条件下厚度和密度分别为13.0 mm、594.4 kg·m−3和19.0 mm、605.1 kg·m−3。每种OSB制备36个截面尺寸为(35.1±0.2) mm×(35.1±0.2) mm的试件，将每种厚度的试件均分为6组，对应不同的水分条件。水分条件包括对照组，(65±3)%相对湿度(RH)；A，(83±3)%RH；B，(95±3)%RH；C，1次吸放水循环；D，2次吸放水循环；E，8次吸放水循环。1次吸放水循环将试件置于(20±1) ℃水中1 h，后取出放在40 ℃的烘箱中干燥2 h，之后在(65±3)％RH和(20±1) ℃条件下陈放2 d。这一干燥条件旨在模拟实际应用环境下的风干条件。每次吸放水循环前后，采集试件质量和厚度信息。将3组试件分别在(20±1) ℃和3种不同空气湿度条件下陈放4周，采集陈放前后试件质量和厚度信息。力学测试完成后，记录所有试件的绝干质量。
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压缩试验对试件质量的影响忽略不计，计算试件含水率: CM=[(m−m0)/m0]×100%。其中：CM是试件的含水率(％)，m是试件的质量(g)，m0是试件的绝干质量(g)。不同水分条件下试件的厚度变化CT=(T−T0)×100%/T0。其中：CT是试件的厚度变化(％)，T是不同水分条件下试件的厚度(mm)，T0是对照条件下试件的厚度(mm)。试件压缩强度SC=F/S。其中：SC是试件的压缩强度(N·mm−2)，F是加载载荷(N)，S是试件的接触面积(mm2)。
试件沿厚度方向变形时，应变正值和负值分别表示拉伸应变和压缩应变。剪切应变是试件发生倾斜滑移产生的变形，剪切应变的正值和负值分别表示顺时针剪切和逆时针剪切。试件沿厚度方向每毫米的应变分布，根据
${{S}}=\left(\displaystyle \sum_{{i}}^{{{i}} + 1} {{{P_{{\rm{S}}i}}}} \right)/{{n}}$ 计算获得。试件沿厚度方向的剪切应变分布，根据${{{{S}}_{{{{{\rm{S}}}}}}}}=\left(\displaystyle \sum_{{i}}^{{{i}} + 1}\left| {{{P_{{\rm{SS}}i}}}} \right| \right)/{{n}}$ 计算得出。其中：S是厚度方向的平均压缩应变，$P_{{\rm{S}}i} $ 是厚度i和 (i+1) 间的压缩应变，SS是厚度i和 (i+1) 间的平均剪切应变，PSSi是厚度i和 (i+1) 间的剪切应变，n是单位厚度间的应变值个数。 -
使用细砂纸轻轻砂光OSB试件一个侧面，后用0.5 mm黑色中性笔绘制散斑。为防止吸放水过程影响散斑质量，C、D、E组试件的散斑是在吸放水过程后绘制。A、B组试件的散斑是在陈放前绘制。
本研究聚焦于试件的压缩强度测试，使用Instron万能力学试验机对试件平面加压。加载过程中压头以0.2 mm·min−1匀速位移，每100 ms记录1次压头高度(±0.001 mm)和载荷(±0.001 N)。加载流程：手动调整压头初始载荷至980.0 N (0.8 N·mm−2)，之后开始匀速自动加载，载荷达到8 575.0 N (7.0 N·mm−2)时加载结束。自动加载过程中，使用数字散斑相关分析技术同步记录试件表面应变分布。具体为使用高速摄像机(M2514-MP2)每100 ms拍摄1张试件表面照片，并使用Correlated Solutions软件计算散斑位置变化和应变分布。
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如图1所示：相较于C组试件，E组试件的厚度变化更大，这说明多次吸放水会引起试件内部结构变化。刨花的干缩湿胀会释放固定在OSB内部的热压应力，并使得刨花间孔隙扩大[4]。吸放水循环8次后，E组试件13.0和19.0 mm的含水率分别升高4.38％和3.81％，这归因于吸湿滞后现象。含水率升高是造成多次吸放水循环后试件厚度增加的另一重要原因。吸放水循环会增加样品的厚度，循环次数与厚度变化正相关。相较于其他试件，B组试件的含水率最高，厚度变化也最大。
图 1 不同水分条件下试件的厚度变化和含水率
Figure 1. Thickness change and moisture content of samples at different water situations
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表1显示不同水分条件下试件变形的差异性，试件变形(加压头位移)越大代表试件压缩强度越低。其中，B组试件的变形显著增加(P＜0.05)，说明(95±3)%RH条件下OSB的压缩强度下降显著(P＜0.05)。E组试件也发生显著变形，说明多次吸放水循环同样会明显降低OSB的压缩强度。相较于19.0 mm试件，13.0 mm试件更易受环境湿度和吸放水循环影响。试件厚度变化比例大是13.0 mm试件位移显著增加的重要原因。具体表现为(83±3)％RH条件下和1个吸放水循环后，位移已经有显著性增加。较大的原始厚度使得19.0 mm试件厚度变化比例较小，因此仅在(95±3)％RH条件下和8个吸放水循环后位移会有显著性增加。
表 1 各组试件在 7 MPa载荷条件下变形的t检验结果
Table 1. T-test results of the displacement at 7 MPa
厚度/mm P 对照组/A 对照组/B 对照组/C 对照组/D 对照组/E 13.0 7.87E−03* 6.91E−06* 2.56E−02* 7.32E−02 3.05E−04* 19.0 1.26E−01 1.47E−05* 4.53E−01 9.36E−01 9.39E−03* 说明：*表示差异显著(P＜0.05) 图2表明：7 MPa载荷条件下，B组试件的最终厚度最小。这说明含水率增加软化了木材刨花，并造成载荷条件下木材刨花的大幅变形。吸放水循环后，厚度为13.0 mm试件的最终厚度均比对照组低。吸湿会软化刨花纤维，吸放水循环可以引起刨花间孔隙放大和扩散，这均会降低OSB试件的压缩强度[18]。以上理论可以解释13.0 mm试件的最终厚度结果，但并不能完全解释19.0 mm试件的最终厚度变化。与对照试件相比，吸放水循环后，载荷条件下试件的最终厚度甚至小幅增加。该现象的原因是吸放水循环释放了热压时聚集在试件内部的应力，这使得试件压缩变形困难。厚OSB加工成型往往需要更大的压力，因此吸放水循环释放出的内部应力也更大。
图 2 7 MPa载荷时试件的厚度
Figure 2. Thickness of samples at 7 MPa compressive strength
以厚度为19.0 mm试件为例，相较于对照组，B组试件压缩变形增加约70%，E组试件压缩变形增加约30%。为进一步探索试件压缩强度的发生机制，需要分析试件压缩强度与厚度方向变形(加压头位移)之间的关系(图3)。不同水分行为下，试件发生了内部结构变化和刨花软化，这会影响强度与变形关系曲线。吸放水循环和高含水率均弱化了曲线的拐点，这说明试件的弹性形变区间变窄，更多变形是由塑性形变造成。循环吸放水使得刨花间孔隙放大，刨花的完整形态被破坏，刨花在负载条件下的承载能力随之降低。高含水率条件下[(95±3)％RH]，B组试件极易发生变形，变形曲线没有明显拐点，这表明水分使刨花软化，降低了刨花刚度，使刨花更易于压缩变形[19]。
图 3 不同水分条件下试件压缩载荷与变形之间的关系
Figure 3. Relationship between compressive strength and displacement of samples at different water conditions
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2种厚度试件的应变分布相似，以13.0 mm试件为分析对象。图4和图5结果显示：压缩应变主要集中在沿试件厚度方向的中心区域，这归因于OSB中心区域低密度和表层区域高密度[20]。木质复合材料的密度和刚度往往正相关[21]。因此，应变容易发生在试件沿厚度方向上的中心区域。吸放水循环次数增加，试件内应变增加，但应变分布变化较小。含水率升高会使试件内应变增加，同时改变应变分布。木材刨花会因为含水率升高而软化，这会降低木材刚度。OSB中心区域密度低，单位体积内刨花数量少，因此含水率对该区域应变的影响被弱化。此外，胶黏剂分布对试件内的应变分布也有重要影响，胶黏剂往往可以改善木材的力学性能和尺寸稳定性[22]。OSB表层施胶量通常比中心层多，因此试件表层区域力学性能受吸放水或含水率影响较小，具体体现为B组和E组试件表层区域的应变普遍较小。
图 4 不同压缩载荷(1、 3、 5、 7 MPa)下13.0 mm试件沿厚度方向的压缩应变分布
Figure 4. Compression strain distribution along the thickness direction of the 13.0 mm samples under four compression strengths(CS=1, 3, 5, 7 MPa)
图 5 不同压缩载荷下(1、3、 5、 7 MPa)13.0 mm试件沿厚度方向的剪切应变分布
Figure 5. Shear strain distribution along the thickness direction of the 13.0 mm samples under four compression strengths (CS=1, 3, 5, 7 MPa)
为进一步探索试件内应变的动态迁移过程，区分B组和E组试件的应变分布，由图6和图7结果显示：载荷低于3 MPa时，2组试件内均未出现明显应变，且应变均匀分布。载荷增加时，试件内部结构持续变化，部分区域出现明显的应变集中(图6蓝色区域）。结合图3可知：压缩应变随压缩强度的增大而增加，且主要集中在试件的中心区域。B组试件的应变始于中心区域，但E组试件的应变则从下表面开始。自由水易积聚在近OSB试件侧面和上下表面的孔隙中，或者沿着长刨花向试件内部迁移[4]。多次吸放水循环使得E组试件下表面的结构不再密实，载荷作用下，这一区域容易被再次压缩变形，并产生应变集中。该区域密实化后，应变集中则更多发生在试件中心区域。
图 6 不同压缩载荷下13.0 mm试件B(左列)和E(右列)的压缩应变分布
Figure 6. Compression strain distribution of 13.0 mm sample B (left) and sample E (right) under four compressive strengths
图 7 不同压缩载荷下13.0 mm试件B(左列)和E(右列)的剪切应变分布
Figure 7. Shear strain distribution of 13.0 mm sample B (left) and sample E (right) under different compression strengths
图7所示：剪切应变分布不连续且主要集中于中心区域。剪切应变往往造成试件内部结构变化，具体表现为木材刨花间相对位置滑移。多孔的内部结构使刨花在载荷状态下易发生开胶和错位，并产生剪切应变。由于MDI胶黏剂的耐水性和稳定性，水分吸着很难将胶黏着的木材刨花分离[23]，因此试件上下表面紧凑的内部结构和充分的胶黏剂渗透，可以有效避免水分行为对内部结构的影响，这表现为上下表面区域剪切应变较小。
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本研究结果表明：①含水率的升高和吸放水循环会使OSB厚度增加和压缩强度降低。薄OSB的厚度和压缩强度更容易受含水率和吸放水循环影响。②含水率增加会使木材刨花软化润胀，含水率20%时，较未吸湿试件，OSB试件压缩变形增加约70%。含水率增加使试件厚度方向上的应变增加且应变分布改变，具体表现为试件厚度中心区域的应变集中现象弱化。③较未吸放水试件，8次吸放水后，OSB压缩变形增加约30%。试件厚度方向上的应变增加，但应变分布变化不明显。④压缩载荷作用下，压缩和剪切应变均多始于OSB试件厚度方向上的中心区域。吸放水循环会释放OSB表层内应力，这引起试件表层区域结构疏松和载荷作用下表层压缩应变集中。
Effect of water on the mechanical performance of OSB in compression tests
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摘要:
目的 旨在深入研究水分对定向刨花板(oriented strand board, OSB)力学性能的影响规律。 方法 选取13和19 mm共2种厚度的OSB为研究对象，调整试件含水率及对试件进行吸放水循环处理，使用万能力学试验机压缩试件，同步使用数字散斑相关分析技术记录试件的面内应变分布。 结果 含水率和吸放水循环次数增加，均会增加试件厚度和压缩变形。压缩载荷作用下，压缩和剪切应变均多始于OSB试件厚度方向上的中心区域。吸放水循环会释放OSB表层内应力，造成试件表层区域结构疏松和载荷作用下表层压缩应变集中。含水率为20%时，试件压缩变形增加70%，且面内应变分布规律改变，具体表现为试件中心区域应变集中现象弱化。吸放水循环使试件面内应变增加，但对应变分布规律影响较小。8次吸放水循环后，试件压缩变形增加约30%。 结论 含水率和吸放水循环次数的增加均使OSB的抗压强度下降和厚度方向上的应变增加，含水率增加会造成应变分布改变但吸放水循环对应变分布影响不明显。图7表1参23 Abstract:Objective Oriented strand board (OSB) is an environmental- and eco-friendly material produced with renewable, mainly fresh wood from logs with either small or large diameter logs. Composed of cross-oriented layers consisting of thin and rectangular wooden flakes or strands that are compressed and bonded together with synthetic resins, it is an important engineered wood product widely applied in load bearing situations and its mechanical performance is largely dependent on the moisture content (MC) and water sorption/desorption. Therefore, with an investigation of the compressive strength (CS) of samples at different MC and water sorption/desorption cycles, this study is aimed to research the effect of water on mechanical performances of OSB. Method With samples selected from two types of OSB panels with different thicknesses, conditioned to three different MCs and treated with multiple water sorption/desorption cycles, supervision was conducted of the dimensional changes, CS and strain distribution of samples were monitored. Then the CS was measured using an Instron universal testing machine with the strain distribution recorded using digital image correlation (DIC) simultaneously. Result (1) An increase in both MC and water sorption/desorption cycle could lead to an increase in thickness and compressive deformation; (2) The CS of the samples was significantly decreased when they were conditioned with a relative humidity of 95% and a MC of approximately 20%; (3) High MC could reduce the final thickness of OSB after compressing whereas water sorption/desorption cycles could slightly decrease the final thickness of OSB after compressing; (4) High MC and multiple water sorption/desorption cycles were able to change the relationship between CS and displacement from two domains linear to almost linear which attributed to the disappearance of the samples’ plastic deformation domain; (5) High MC can soften wood strands and enlarge internal voids, which could lead to strain increase and the change of strain distribution profile while water sorption/desorption cycles degraded the internal structure of samples and (6) Water sorption/desorption cycles might cause compression strain accumulation in surface layers. Conclusion Water affects the CS of OSB in various aspects including the softening of wood strands, enlargement of voids among wood strands, diminishing of trapped stress from hot-pressing with different MCs. Such findings will help with the generation of effective manufacturing strategies that aim at good mechanical performance of OSB at different water conditions as well as optimizing the application methods and extending the application fields of OSB. [Ch, 7 fig. 1 tab. 23 ref.] -
植物在生长发育过程中会通过不断调整基因的表达来适应各种逆境，而转录因子(TFs)是其调控过程的关键因子[1]。研究表明：锌指同源结构域(ZF-HD)转录因子作为一种同源异形盒(HB)蛋白在调控植物生长发育以及响应多种生物和非生物胁迫方面发挥着重要作用[2-3]。ZF-HD不仅具有同源结构域(HD)，还包括1个高度保守的锌指结构域(ZF)[4]，ZF是由2对保守的半胱氨酸(Cys)和/或组氨酸(His)残基结合单个锌离子组成的指环状结构蛋白，可特异性与DNA/RNA序列结合，并参与蛋白质互作[2, 5]；HD是1个约60个氨基酸的DNA结合域(DBD)，这段序列折叠成一个识别螺旋附着在DNA的大沟上，特异性地结合DNA来激活或抑制靶基因的表达[6]。为了方便研究该家族的进化史，HU等[7]将ZF-HD重新命名为ZHD。
ZHD蛋白可分ZHD和小锌指(MIF)两类，两者都含有ZF结构域，但MIF缺少HD结构域[8]。2001年ZHD首次在黄花菊Flaveria trinervia中被鉴定出来[9]，随后拟南芥Arabidopsis thaliana[10]、水稻Oryza sativa[11]、葡萄Vitis vinifera[8]、大白菜Brassica rapa ssp. pekinensis[2]、番茄Solanum lycopersicum[3]、茶树Camellia sinensis[5]和黄瓜Cucumis sativus[12]等的ZHD被陆续发现。研究表明：ZHD能够调控植物的抗逆性，如过表达AtZHD1可以提高拟南芥的耐旱性[13]；OsZHD1基因过表达导致水稻叶片卷曲下垂，降低水稻的耐旱性[14]；在大豆Glycine max中，过表达GmZF-HD1和GmZF-HD2会与编码钙调蛋白的GmGaM4基因启动子结合增强大豆的抗病能力[15]；TaZFHD1参与小麦Triticum aestivum生长发育过程中茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)和乙烯(ET)信号转导过程，调节小麦对胁迫的抗性[16]；大白菜中的BraZF-HD受光、低温等非生物胁迫诱导表达[2]；此外，水稻ZHDs与OsDREB1B基因的启动子结合调节水稻对低温、干旱和机械损伤的抗性[17]。ZHD广泛存在于植物中，在植物对环境胁迫响应过程中起着重要的作用。
毛果杨Populus trichocarpa是研究木本植物生长发育、材质材性以及抗逆性状的重要模式植物，但是目前毛果杨ZHD (PtrZHD)家族及非生物胁迫响应特性的研究尚无报道。本研究通过生物信息学手段鉴定了毛果杨全基因组内的PtrZHDs基因，并对其编码蛋白特征、系统发育、基因扩张、基因结构与保守基序、启动子顺式作用元件和表达特性进行分析，为研究该家族基因的功能提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
将来自中国科学院分子植物科学卓越创新中心的野生型毛果杨‘Nisqually-1’通过组织培养扩繁后，选取长势一致的4周龄组培苗随机分成6组，用质量分数为8%的聚乙二醇(PEG 6000，来自邢台鑫蓝星科技有限公司)水溶液处理0、3、12、24、48和72 h，分别采集各处理组植株的根、茎和叶部组织，经液氮速冻后保存于−80 ℃冰箱，每组处理重复3次。
1.2 PtrZHD家族成员鉴定及理化性质分析
利用拟南芥ZHD家族成员的氨基酸序列比对Phytozome (
https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html )网站中毛果杨基因组数据库获得候选序列，将得到的序列上传到Pfam (http://pfam.xfam.org/ )和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/ )数据库，去除不含ZF-HD_dimer (PF04770)结构域的序列得到全部的PtrZHDs[12]。从Phytozome数据库中获取PtrZHD家族基因的染色体位置、基因序列以及开放阅读框长度等信息，并根据基因所在染色体号及位置对其进行命名。在ExPasy (https://web.expasy.org/protparam/ )网站预测PtrZHD家族分子质量、等电点和氨基酸序列长度。1.3 PtrZHD家族系统发育分析
将鉴定出的毛果杨ZHD氨基酸序列与已知的拟南芥[10]、水稻[11]和大白菜[2]的ZHD氨基酸序列在MEGA X软件的ClustaW程序中进行多重序列比对，采用邻近法(NJ)构建系统进化树，步长设为10000次，得到系统发育进化树数据[18]，经EvolView(
https://www.evolgenius.info/ evolview/ )网站可视化。1.4 PtrZHD家族同源基因的同义替换率(Ks)和非同义替换率(Ka)分析
将PtrZHD家族基因的蛋白质编码序列(CDs)在美国国家生物信息中心(NCBI)网站(
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi )进行BLAST比对，以超过300 bp且同源性超过80%为标准鉴定同源基因对[19]，同源关系经TBtools[20]软件可视化。利用TBtools计算同源基因的Ks、Ka以及Ka/Ks[20-21]。1.5 PtrZHD家族结构及保守型基序分析
从毛果杨数据库(
https://genome.jgi.doe.gov/portal/pages/dynamicOrganismDownload.jsf?organism= Ptrichocarpa )获得PtrZHD外显子和内含子长度及位置信息，并通过TBtools软件可视化。使用MEME (https://meme-suite.org/meme/tools/meme )网站对PtrZHD家族进行保守基序分析，保守域数目设置为15，结果由TBtools软件可视化。1.6 PtrZHD家族启动子区顺式作用元件分析
利用TBtools软件从毛果杨基因组数据中提取PtrZHD家族起始密码子前2 000 bp的序列作为启动子区域，上传至PlantCARE(
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html )网站进行顺式作用元件分析[22]，获得的数据通过TBtools软件可视化。1.7 PtrZHD家族表达特性分析
1.7.1 组织表达特异性
将野生型毛果杨通过组织培养扩繁后，挑选长势一致的4周龄组培苗，分别采集根、茎和叶组织，提取RNA后反转录成cDNA，用于实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析。每组处理重复3次，采用2−∆∆CT法计算相对表达量，并通过TBtools软件可视化。
1.7.2 干旱胁迫下的响应特性
将长势一致的1月龄组培苗随机分成6组。用质量分数为8%的PEG 6000处理0、6、12、24、48和72 h。分别采集各处理组植株的根、茎和叶组织，提取RNA后反转录成cDNA进行qRT-PCR分析。每组处理重复3次，采用
$2^{-\Delta\Delta{\rm{C}}_{\rm{t}}} $ 法计算相对表达量，并通过TBtools软件可视化。1.7.3 RNA提取、反转录及qRT-PCR分析
利用植物总RNA试剂盒(TSP412，北京擎科生物科技有限公司)提取总RNA，然后采用PrimeScriptTMRT reagent Kit [Perfect Real Time，宝生物工程(大连)有限公司 ] 试剂盒反转录RNA，获得cDNA后进行qRT-PCR分析。将PtrZHD家族蛋白质编码区序列上传至上海生工定量引物设计网站(
https://www.sangon.com/new PrimerDesign )设计定量引物，以PtrActin为内参基因[19]。在赛默飞ABI 7500荧光定量PCR仪上进行试验，体系如下：2×TransStart TOP/Tip Green qPCR Super mix 10 μL、定量引物上下游混合引物(10 μmol·L−1) 0.4 μL、cDNA 1.5 μL，Passive Reference DyeⅡ(50×) 0.4 μL，加去离子水补充至20 μL体系。反应程序：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸35 s，40次循环。2. 结果与分析
2.1 PtrZHD家族成员的鉴定及编码蛋白的基本特征
将所有含ZF-HD_dimer (PF04770)结构域的序列上传到Pfam和SMART数据库，去除冗余序列后从毛果杨基因组中鉴定出21个PtrZHD (表1)，根据基因所在染色体及染色体上的位置信息，将它们分别命名为PtrZHD1~PtrZHD21。PtrZHD家族基因编码蛋白的基本特征分析表明：各PtrZHD所编码蛋白的长度为73~339个、分子量为8.28~37.98 kDa、等电点为6.39~9.31、编码序列长度为222~1 020 bp，蛋白长度、分子量、等电点和编码序列长度差异明显。表明PtrZHD家族基因及其编码蛋白特征存在较大差异，即该家族各个成员的生物学功能发生了分化。
表 1 毛果杨ZHD家族基因概况Table 1 Overview of ZHD gene family in P. trichocarpa登录号 基因名 基因位置 蛋白长度/个 分子量/kDa 等电点 编码序列长度/bp Potri.002G035200.1 PtrZHD1 Chr02: 2259632..2261632 293 32.84 8.22 882 Potri.002G102900.1 PtrZHD2 Chr02: 7442579..7444098 262 27.92 7.28 789 Potri.003G000400.1 PtrZHD3 Chr03: 70322..71164 253 28.01 7.71 762 Potri.003G146700.1 PtrZHD4 Chr03: 16229434..16229655 73 8.28 7.73 222 Potri.004G11.300.1 PtrZHD5 Chr04: 12287585..12289662 334 36.77 8.70 1005 Potri.004G126600.1 PtrZHD6 Chr04: 12337842..12338677 130 14.17 6.81 393 Potri.004G135100.1 PtrZHD7 Chr04: 15528323..15529129 268 29.44 8.83 807 Potri.004G229600.1 PtrZHD8 Chr04: 23480758..23482600 271 30.06 8.39 816 Potri.005G11.300.1 PtrZHD9 Chr05: 9522291..9525287 339 37.98 9.19 1020 Potri.005G158800.1 PtrZHD10 Chr05: 16017482..16019310 257 27.73 6.43 774 Potri.005G227900.1 PtrZHD11 Chr05: 23746838..23749246 290 32.32 8.88 873 Potri.007G024100.1 PtrZHD12 Chr07: 1814109..1816426 331 36.75 9.31 996 Potri.008G086000.1 PtrZHD13 Chr08: 5402319..5403293 324 35.57 8.83 975 Potri.010G169400.1 PtrZHD14 Chr10: 17139193..17140688 332 36.41 9.21 999 Potri.012G040900.1 PtrZHD15 Chr12: 3680805..3681724 182 20.66 6.39 549 Potri.013G108900.1 PtrZHD16 Chr13: 12226035..12227366 281 31.74 7.71 846 Potri.015G032700.1 PtrZHD17 Chr15: 2637644..2638216 190 21.44 6.17 573 Potri.017G082700.1 PtrZHD18 Chr17: 9830334..9831749 161 17.36 5.93 486 Potri.017G082900.1 PtrZHD19 Chr17: 9903467..9905775 337 37.23 8.23 1014 Potri.019G021400.1 PtrZHD20 Chr19: 2418959..2419646 132 14.83 8.83 399 Potri.019G081300.1 PtrZHD21 Chr19: 11464924..11465688 184 20.87 9.91 555 表 2 同源基因的Ka/Ks及同源性Table 2 Ka/Ks values and homologous status of homologous genes同源基因 非同义替换率(Ka) 同义替换率(Ks) Ka/Ks 同源片段长度/bp 同源性 基因1 基因2 PtrZHD1 PtrZHD11 0.06 0.32 0.19 787 0.90 PtrZHD2 PtrZHD10 0.04 0.19 0.21 711 0.92 PtrZHD3 PtrZHD8 0.08 0.36 0.22 682 0.86 PtrZHD5 PtrZHD19 0.08 0.35 0.23 779 0.88 PtrZHD6 PtrZHD18 0.07 0.18 0.39 357 0.91 PtrZHD9 PtrZHD12 0.08 0.29 0.28 875 0.85 PtrZHD13 PtrZHD14 0.09 0.36 0.25 838 0.85 PtrZHD15 PtrZHD17 0.05 0.27 0.19 496 0.90 2.2 PtrZHD家族的进化
利用双子叶植物(拟南芥、毛果杨和大白菜)与单子叶植物(水稻)的ZHD蛋白序列构建系统进化树(图1)，PtrZHD家族分为2个种类(ZHD和MIF)，这2个种类可以分成7个亚族(Ⅰ~Ⅶ)[5, 8, 12]，PtrZHD不同亚族中即包括单子叶植物又包括双子叶植物，表明该基因家族的分化早于单双子叶植物的分化。
图 1 毛果杨、拟南芥、水稻和大白菜ZHD家族系统进化树Figure 1 Phylogenetic tree of ZHD protein family in P. trichocarpa, A. thaliana , O. sativa and B. rapa ssp. pekinensis2.3 PtrZHD家族的扩张
PtrZHD家族成员在毛果杨染色体上的分布(图2)显示：21个PtrZHD不均匀地分布在毛果杨12条染色体上；4、5号染色体上分别分布4和3个ZHD，2、3、17和19号染色体上各分布2个ZHD，7、8、10、12、13和15号染色体上只分布1个ZHD，1、6、9、11、14、16和18号染色体上无ZHD分布。PtrZHD家族编码序列Blast结果表明：PtrZHD1和PtrZHD11、PtrZHD2和PtrZHD10、PtrZHD3和PtrZHD8、PtrZHD5和PtrZHD19、PtrZHD6和PtrZHD18、PtrZHD9和PtrZHD12、PtrZHD13和PtrZHD14以及PtrZHD15和PtrZHD17有共线性关系(图2和表2)，同源片段长度大于300 bp且同源性超过80%，是进化过程中由于全基因组复制和串联复制而形成的同源基因[3, 22]，表明PtrZHD可能通过全基因组复制和串联复制进行家族扩张。8对同源基因的Ka/Ks均小于1(表2)，说明PtrZHD家族在进化过程中经历了纯化选择，留存的基因较为保守[3]。
图 2 PtrZHD家族基因染色体定位及同源性分析Figure 2 Chromosome localization and homology analysis of PtrZHD gene2.4 PtrZHD家族基因结构及其编码蛋白保守基序
PtrZHD家族21个成员中有11个成员含有内含子(图3B)，这与之前报道的其他物种ZHD家族中有内含子的成员数量较少的研究结果稍有不同[5, 12]。PtrZHD蛋白具有2个保守性较高的基序：同源结构域序列(Motif 1)和锌指结构域序列(Motif 2)(图3C)。Motif 2与DNA的特异性结合有关；Motif 1与蛋白二聚体的形成有关[7]。所有的PtrZHD蛋白都具有Motif 1，而且除了PtrZHD4和亚族Ⅴ(MIF)的成员之外，其他家族成员都含Motif 2，说明该家族成员在进化过程中比较保守。
图 3 PtrZHD家族基因结构和蛋白保守基序分析Figure 3 Analysis of gene structure and protein conserved motif of PtrZHD gene2.5 PtrZHD家族启动子区顺式作用元件
PtrZHD家族启动子区顺式作用元件可分为2个大类(图4)：第一大类为植物激素响应元件，共有5种，分别为生长素响应元件(AuxRR-core、TGA-element)，水杨酸响应元件(TCA-element)，茉莉酸甲酯响应元件(CGTC-motif、TGACG-motif)，脱落酸响应元件(ABRE)和赤霉素响应元件(P-box、GARE-motif)；第二大类为非生物胁迫响应元件，共有4种，分别为厌氧诱导元件(ARE)、干旱诱导性结合位点(MBS)、抗病和胁迫诱导元件(TC-rich repeats)和低温响应元件(LTR)。PtrZHD家族各基因启动子区存在不同类型的作用元件，但处于同一亚族的各基因含有相似的作用元件(图4)，亚族Ⅰ主要包含茉莉酸甲酯响应元件、脱落酸响应元件、赤霉素响应元件和厌氧诱导元件；亚族Ⅱ主要包含水杨酸响应元件和茉莉酸甲酯响应元件；亚族Ⅲ主要包含厌氧诱导元件、MYB干旱诱导性结合位点以及抗病和胁迫诱导元件；亚族Ⅳ主要包含生长素响应元件，水杨酸响应元件，茉莉酸甲酯响应元件，脱落酸响应元件和厌氧诱导元件；亚族Ⅴ主要包含水杨酸响应元件、赤霉素响应元件、厌氧诱导元件和MYB干旱诱导性结合位点；亚族Ⅵ主要包含茉莉酸甲酯响应元件、厌氧诱导元件、MYB干旱诱导性结合位点和低温响应元件；亚族Ⅶ主要包含水杨酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件和厌氧诱导元件。以上结果说明：PtrZHD家族可能对植物激素和逆境胁迫有响应能力，虽然不同基因之间响应元件种类存在差异，但是同一亚族基因启动子区顺式作用元件种类基本相同。
图 4 PtrZHD家族基因启动子区顺式作用元件分析Figure 4 Analysis of cis-acting elements in promoter region of PtrZHD gene2.6 PtrZHD家族组织表达与干旱胁迫响应特征
为了了解ZHD在毛果杨生长发育和环境响应中的潜在功能，利用qRT-PCR对毛果杨ZHD家族成员在根、茎和叶组织中的表达模式进行分析。结果(图5)表明：毛果杨21个PtrZHDs中有1、7和13个分别在根、茎和叶部组织偏好表达。亚族Ⅰ和Ⅲ的成员主要在叶中高表达；亚族Ⅱ和Ⅳ的成员全都在叶中高表达；亚族Ⅴ成员主要在茎中高表达；亚族Ⅵ成员主要在茎和叶中高表达；亚族Ⅶ成员在茎中高表达。毛果杨ZHD家族成员在根、茎和叶中有不同的表达特性，但同一亚族各成员偏好表达部位基本相同，说明ZHD在毛果杨根、茎和叶部组织中的生物学功能产生了分化，但同一亚族各成员功能相似。
图 5 PtrZHDs组织表达特异性分析Figure 5 Analysis of tissue expression specificity of PtrZHDs gene从图6可知：在根中，随着干旱胁迫时间的增加，部分PtrZHD的表达量显著上调，达到峰值后逐渐降低，PtrZHD3、PtrZHD8、PtrZHD9、PtrZHD10、PtrZHD11、PtrZHD5、PtrZHD13和PtrZHD14在干旱胁迫下表达量呈持续上升趋势，PtrZHD1、PtrZHD6在干旱胁迫下表达量下降；在茎中，大部分PtrZHD在干旱胁迫后显著上调表达，达到峰值后逐渐降低，而PtrZHD2、PtrZHD3、PtrZHD5、PtrZHD6和PtrZHD7在干旱胁迫下表达量呈持续上升趋势；在叶中，大部分PtrZHD在干旱胁迫后表达量同样呈先升后降的趋势，PtrZHD5、PtrZHD7和PtrZHD20在干旱胁迫下表达量持续下降，而PtrZHD1和PtrZHD18在干旱胁迫下表达量呈持续上升趋势。从响应速度来看，根中大部分PtrZHD基因响应干旱胁迫的快速上升期发生在6、12或72 h，而在茎和叶中的快速上升期发生在6或12 h。表明毛果杨ZHD家族各成员响应干旱胁迫且在胁迫中发挥不同的作用。
图 6 不同组织中PtrZHDs在干旱胁迫下的表达谱分析Figure 6 Expression profile analysis of PtrZHDs gene in different tissues under drought stress3. 讨论
ZHD是植物特有的转录因子，在植物生长发育和逆境胁迫响应中起着重要作用[6, 15]。本研究从全基因水平鉴定出21个PtrZHDs家族成员，进化分析表明(图1)：21个PtrZHDs可以分为2个不同的种类(ZHD和MIF)、7个亚族(Ⅰ~Ⅶ)，这与葡萄[8]、茶树[5]和黄瓜[12]中的分类基本一致。
PtrZHD家族有76%的成员涉及全基因组复制和串联复制现象，说明该基因家族扩张的主要方式是全基因组复制和串联复制[22-23]，基因复制可以提供丰富的遗传物质有助于毛果杨适应外界环境。PtrZHD家族同源基因的Ka/Ks均小于1，表明纯化作用在该基因家族进化过程中存在一定的选择压力[3]，说明PtrZHD家族基因具有较强的保守性。同时，PtrZHD家族基因编码蛋白保守基序分析发现：21个PtrZHD蛋白具有2个保守性较高的基序Motif 1和Motif 2，进一步说明PtrZHD家族在进化过程中较为保守。
启动子分析发现：虽然PtrZHD家族启动子区顺式作用元件的种类不同，但处于同一亚族基因启动子区顺式作用元件类型基本相同，同时，同一亚族基因编码蛋白的保守基序也基本相同，表明PtrZHD家族不同亚族的生物学功能产生了分化，但同一亚族各基因的生物学功能基本相同；PtrZHD家族成员在毛果杨根、茎和叶部组织中具有偏好性表达特征，但同一亚族基因的偏好表达部位基本相同。
毛果杨中具有内含子的ZHD占比(52%)多于拟南芥(0%)[2]、水稻(33%)[24]、玉米Zea mays(13%)[24]、黄瓜(38%)[14]、苦荞麦Fagopyrum tataricum (20%)[25]、大白菜(3%)[2]和番茄(4%)[3]等草本植物，内含子增多可以加大转录本的多样性，提高生物的抗逆能力[26]。因此，毛果杨ZHD的内含子比草本植物多的原因可能是毛果杨生命周期长、生存空间大，需要应对更为复杂的环境挑战，所以进化出了更多含有内含子的基因以保证其正常生长发育。
ZHD能够调控植物的生长发育和对干旱胁迫的抗性，如过表达AtZHD1可以提高拟南芥的耐旱性[13]，OsZHD1基因过表达导致水稻叶片卷曲下垂，降低水稻的耐旱性[14]；毛果杨亚族Ⅱ中的PtrZHD2、PtrZHD10与AtZHD1、OsZHD1聚类在一起，且同时在叶部组织中高表达，表明PtrZHD2和PtrZHD10可能通过调控毛果杨叶片的生长发育来响应干旱胁迫的。生物在遭受胁迫时，基因的相关顺势作用元件会影响其自身的转录以响应胁迫[27]，PtrZHD家族基因启动子区含有MYB干旱诱导性结合位点，而且PtrZHD家族基因在干旱胁迫下的表达量会随着胁迫时间的增加而发生变化，进一步说明在毛果杨干旱胁迫的响应中，PtrZHD家族基因发挥着重要的调控作用。
4. 结论
本研究在全基因组水平上鉴定出21个PtrZHDs，通过系统发育将其分为7个亚族；同源性及Ka、Ks分析表明：PtrZHD通过全基因组复制和串联复制进行家族扩张且在进化过程中经历了纯化选择；启动子顺式作用元件分析表明：PtrZHD家族基因能够响应干旱胁迫信号；基因结构和基序分析表明：PtrZHD家族基因功能发生了分化但同一亚族基因生物学功能基本相同；组织表达特异性和干旱胁迫下的表达模式表明：毛果杨ZHD在不同组织中行使特定的生物学功能且能够响应干旱胁迫。
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图 1 不同水分条件下试件的厚度变化和含水率
Figure 1 Thickness change and moisture content of samples at different water situations
图 3 不同水分条件下试件压缩载荷与变形之间的关系
Figure 3 Relationship between compressive strength and displacement of samples at different water conditions
图 4 不同压缩载荷(1、 3、 5、 7 MPa)下13.0 mm试件沿厚度方向的压缩应变分布
Figure 4 Compression strain distribution along the thickness direction of the 13.0 mm samples under four compression strengths(CS=1, 3, 5, 7 MPa)
图 5 不同压缩载荷下(1、3、 5、 7 MPa)13.0 mm试件沿厚度方向的剪切应变分布
Figure 5 Shear strain distribution along the thickness direction of the 13.0 mm samples under four compression strengths (CS=1, 3, 5, 7 MPa)
图 6 不同压缩载荷下13.0 mm试件B(左列)和E(右列)的压缩应变分布
Figure 6 Compression strain distribution of 13.0 mm sample B (left) and sample E (right) under four compressive strengths
图 7 不同压缩载荷下13.0 mm试件B(左列)和E(右列)的剪切应变分布
Figure 7 Shear strain distribution of 13.0 mm sample B (left) and sample E (right) under different compression strengths
表 1 各组试件在 7 MPa载荷条件下变形的t检验结果
Table 1. T-test results of the displacement at 7 MPa
厚度/mm P 对照组/A 对照组/B 对照组/C 对照组/D 对照组/E 13.0 7.87E−03* 6.91E−06* 2.56E−02* 7.32E−02 3.05E−04* 19.0 1.26E−01 1.47E−05* 4.53E−01 9.36E−01 9.39E−03* 说明：*表示差异显著(P＜0.05) 
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