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树节是树木生长中的正常生理现象，往往存在于树干内部，在用材中统称为节子[1]。节子一般可分为健全节和疏松节，健全节是由活树枝形成，它与树干木质部连接较为紧密，因此基本不影响木材抗压强度和质量，在外观上，其颜色与周围正常的木材相似[2]；疏松节是指枝条死亡后被木质部包合起来的部分，这些部分严重破坏了木材内纤维的连续性，导致应力的大量集中，极大地降低木材的强度与抗弯性，影响木材的质量及其加工性能。因此，节子不仅严重影响了木材质量[3-5]和林木产品的利用率[6-7]，还会影响树木的材质[8-9]。对节子内部属性和发育规律的研究将有助于了解节子生长过程中的变化规律。有研究表明：节子的大小随着节子着生高度的增加呈先增加后减小的趋势[10-11]，并与枝条着生角度成反比[12]。WANG等[13]对不同种植密度下西南桦Betula alnoides的节子特征进行研究发现：高密度种植能有效减小节子基径。HEIN等[14]利用人工修枝与自然整枝条件下的白蜡树Fraxinus excelsior和欧洲槭Acer pseudoplatanus的枝条数据进行分析，发现枝条基径和树干径向生长速率对枝条预测模型的建立起重要作用。陈东升等[15]以落叶松Larix gmelinii人工林为研究对象，建立了落叶松人工林节子模型。贾炜玮等[16]采用混合模型对红松Pinus koraiensis人工林树干内部活节、未包藏死节和包藏死节的体积进行了较好地拟合。然而，中国目前对于节子形成规律及特征的研究主要集中在北方针叶树种，对于南方阔叶树种的研究还较少。米老排Mytilaria laosensis为金缕梅科Hamamelidaceae壳菜果属Mytilaria的常绿阔叶乔木，主要分布于中国云南、广西、广东等省份及东南亚越南、老挝等国，是上述地区的优良速生树种[17]，具备材质优良、结构细腻、生长迅速等特点，多用于制造高等家具。但由于其树冠部分枝条较多，自然整枝能力较弱，导致树干上的枯枝无法及时脱落，极大地降低了该树种的质量。若这部分枯枝得不到及时清理，将会逐渐被树干的形成层包裹，形成死节，降低木材可利用率和木材等级[18]。目前，关于米老排的研究主要集中在生物量模型[19]、种苗培育[20]、碳储量[21]、枝条发育规律[22]和凋落物[23]等方面，关于米老排节子分布和发育规律方面研究较为缺乏。据此，本研究通过研究米老排节子时空分布规律，建立节子变色长度预测模型，为米老排无节大径材的培育提供科学依据。
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中国林业科学研究院热带林业实验中心(22°11′N，106°75′E)地处广西最南部，与越南谅山市接壤，试验区下设哨平、青山、伏波和白云4个分场。米老排人工林位于青山分场，海拔约440 m。该地区属于亚热带季风气候，雨量充沛，夏无酷热，冬无严寒，年平均气温为 22.5 ℃，年平均降水量约1 210 mm，雨季集中在4—10月，约占全年降水量的3/4，全年无霜期约345 d，年平均日照约1 620 h。土壤主要为砖红壤，呈酸性(pH 4.5)，土壤有机质质量分数为24.65 g·kg−1，全氮质量分数为1.02 g·kg−1，全磷质量分数为 0.47 g·kg−1，有效氮质量分数为117.20 mg·kg−1，有效磷质量分数为1.20 mg·kg−1，有效钾质量分数为84.20 mg·kg−1。
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米老排人工林建于2008年，采用来源于同一优良母树的种子培育的实生苗进行造林，初始种植密度为1 667 株·hm−2(株行距2 m×3 m)，该样地在培育过程中没有进行间伐和施肥等处理。2019年2月，在该样地中设置了5块20 m×30 m的标准地，对每块样地内的米老排进行编号，并测定每棵树的胸径、树高、枝下高、冠幅等因子。各样地调查数据如表1所示。
表 1 米老排人工林各样地概况
Table 1. Information of different sampled plots of the M. laosensis plantation
样地号 面积/
hm²平均树
高/m平均胸
径/cm平均枝
下高/m平均冠
幅/m坡向 坡度/
(°)M601 0.06 17.8 18.1 5.3 6.8 阳 25 M602 0.06 17.5 17.2 4.9 7.5 半阳 28 M603 0.06 19.4 17.8 4.5 7.9 阳 23 M604 0.06 17.7 18.1 4.5 6.2 半阳 31 M605 0.06 18.4 17.9 4.8 6.4 半阳 22 -
依据每木检尺数据，在每个标准地中分别选出1株优势木、1株亚优势木和2株标准木进行节子解析试验，共计20株。用喷漆标记树干的北方向位置，并用胸径尺测定其胸径后，用油锯将样树伐倒，再次测定其树高、枝下高和冠幅等因子(表2)。以2 m为区分段，用油锯进行切割，分别统计整株节子的数量及其所在高度。随后，将各区分段有节子的部分锯切成 20~30 cm 的圆盘，随后使用油锯沿节子中心部分进行纵切，得到节子剖面(图1)，抛光至清晰，最终得到1101个完整的节子。
表 2 取样树信息
Table 2. Summary sampled tree statistics
项目 树高/m 胸径/cm 枝下高/m 冠幅/m 数值范围 17.1~22.8 17.7~25.3 4.5~8.8 6.5~10.4 平均值 19.5 21.4 6.9 8.6 标准差 3.9 4.2 1.2 2.3 -
将所测定的节子指标作为自变量(x1~x4)，节子变色长度为因变量(y)。进行逐步回归分析，筛选出影响节子变色长度的关键因素。并构建多元线性归回模型：y=a0+a1x1+a2x2+a3x3+a4x4，其中a0、a1、a2、a3、a4为参数。
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采用SPSS 25.0对数据进行统计分析，使用最小显著性差异法(LSD)进行多重比较，显著性水平为α=0.05，用Excel制表，利用Origin软件制图。
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图2显示：米老排大多数枝条在第1~2年开始生长；大量枝条在第3~4年死亡，较少会在第5~8年死亡；第5~8年是节子愈合的高峰期，约占所有节子的87.2%，少部分节子会在第9年痊愈。在枝条死亡脱落后，枝条周围的形成层逐渐将树干内部的枯枝残留包围形成节子，76.7%的节子需要3~6 a的时间才能完全包裹，而能在1~2 a被完全包裹的节子数量较少，仅为10.4%，12.9%的节子需要7 a以上的时间才能完成包裹。
图 2 米老排节子数量的时间分布
Figure 2. Temporal distribution of branch occlusion of M. laosensis
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如图3所示：在垂直水平上，米老排节子数量随树干高度增加呈先上升后下降的趋势。以2.0 m为区分段，在树干高度为2.0~4.0 m内节子数量百分比最高，约占整株节子总数的17.8%。在2.0~4.0 m之后，随着高度的增加，节子数量开始逐渐减少。从节子数量累计百分比看，61.9%节子集中在0~8.0 m。
图 3 米老排节子的垂直分布
Figure 3. Vertical distribution of M. laosensis knots
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由表3可知：节子的平均变色长度达102.5 mm。由图4可知：节子的变色长度与节子直径呈正比。除直径40.0~50.0 mm与直径50.0~60.0 mm间的节子变色长度无显著差异外，其他不同节子直径间变色长度均存在显著差异(P＜0.05)。节子直径为0~10.0 mm时节子平均变色长度最小，仅为58.4 mm，而当节子直径为50.0~60.0 mm时，节子平均变色长度最大，为136.0 mm。
表 3 节子信息表
Table 3. Sample branch description for M. laosensis
项目 分枝角度/(°) 枝条死亡
年龄/a节子愈合所
需时间/a节子着生
高度/m节子直径/mm 变色长度/mm 枝条出现
年龄/a节子愈合
年龄/a死节长度/mm 范围 12.9~88.5 2~8 1~10 0.1~18.4 4.7~59.1 17.2~189.6 1~7 3~11 1.4~148.5 平均值 54.1 2.6 4.6 6.8 23.7 102.5 1.1 7.3 51.1 标准差 10.0 0.8 1.6 4.6 8.1 21.1 0.4 1.5 26.1 
图 4 节子直径对变色长度的影响
Figure 4. Effects of knot diameter on discoloration length
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由图5可见：米老排节子变色长度随着分枝角度的增加，呈先增大而后减小的趋势，其中节子分枝角区间在80.0°~100.0°的节子变色长度显著小于其他分支角区间(P＜0.05)。当节子的分枝角度在80.0°~100.0°内时，节子平均变色长度最小，仅为60.0 mm；当分枝角度在20.0°~40.0°内时，节子平均变色长度最大，达110.2 mm。
图 5 分枝角度对变色长度的影响
Figure 5. Effects of branch insertion angle on discoloration length
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由图6可见：米老排节子变色长度与愈合时间呈正相关，且当节子愈合时间不超过6 a时，变色长度随愈合时间的增加而缓慢增大，而当愈合时间超过6 a，变色长度随愈合时间的增加增速变快。
图 6 节子愈合时间对变色长度的影响
Figure 6. Effects of knot occlusion time on discoloration length
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将枝条出现年龄、枝条死亡年龄、节子愈合时间、分枝角度、死节长度、节子着生高度以及节子直径等7个指标作为自变量，与节子变色长度进行逐步回归分析，得到描述节子变色长度(yDL)的最优模型：yDL=24.388+1.729xKD+0.350xDBL−6.635xYB+5.451xOT。其中：xKD为节子直径，xDBL为死节长度，xYB为枝条出现年龄，xOT为节子愈合时间。模型中各参数均具有统计学意义，模型的R2为0.649(表4)。模型的残差分布均匀，表明方程模拟效果较好(图7)。
表 4 节子变色长度模型参数估计值和拟合统计量
Table 4. Estimated parameter values and fitted statistics values of discoloration length model
参数 估计值 标准差 t P 残差平方和 R² a0 24.388 2.830 8.619 0.057 371 405.423 0.649 a1 1.729 0.064 26.968 0.000 a2 0.350 0.023 14.927 0.000 a3 −6.635 1.485 −4.467 0.000 a4 5.451 0.395 13.805 0.000 说明：a0是常数，a1、a2、a3和a4分别是模型中节子直径、 死节长度、枝条出现年龄和节子愈合时间的参数 
图 7 变色长度预测模型的残差分布
Figure 7. Residual distribution of discoloration length model
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本研究发现：米老排枝条在第2~4年达到死亡的高峰期，树木上枯枝残留在后期被树干完全包裹形成节子。而水曲柳Fraxinus mandshurica节子形成高峰期在第6~15年[24]，格木Erythrophleum fordii在第11~20年是控制节子的关键时期[25]。这些差异主要来源于以下几个原因：一是树种差异，不同树种之间树干径向生长速率不同[13]；二是生长立地条件不同，在高密度种植情况下，不同个体之间竞争有限的周围环境资源，会导致个体分配到枝条生长的能量受到影响[26]。本研究将枝条死亡年龄作为米老排修枝的判断依据，在米老排人工林生长第2~4年可对其进行首次修枝。
树干上的枝条死亡后，死枝残桩有时会残留在树干内，阻止树干外部的愈合，延长了枝条愈合所需时间，增大树干内部与外界水分和真菌等接触的时间，从而增加了木材内部受到侵染而发生腐坏的概率[27]。本研究发现：米老排人工林多数节子愈合需要3~6 a，甚至更长的时间。有研究表明：节子愈合时间与节子的直径呈正比[28]，与树干径向生长速率呈反比[12]，因此，可适当对林木进行间伐或者施肥等措施，以促进树干的径向生长速率，缩短节子愈合所需时间。在米老排垂直分布上，其半数以上节子主要集中在树高8.0 m以下部分，这一结果与楸树Catalpa bungei[29]、水曲柳[24]的研究结果相似，据此可以将8.0 m作为米老排修枝的参考高度。
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在本研究中：节子变色长度随节子直径的增大而增大，当节子直径不超过50.0 mm时，节子变色长度会随着节子直径的增加而显著增大。关追追等[30]研究发现：当水曲柳节子直径超过15.0 mm时，节子变色长度会随着节子直径的增加而明显增大。而DǍNESCU等[31]认为：欧亚槭Acer pseudoplatanus节子直径超过50.0~60.0 mm时，木材变色率才会明显提高。说明米老排人工林节子在真菌等微生物侵染的情况下更容易发生变色。节子变色长度随分枝角度的增加而减小，且在本研究中当分枝角度大于60.0°时，节子变色长度随分枝角度的增加而显著降低。这与对西南桦[32]的研究结果一致，而与水曲柳[24]的研究结果相反。在本研究中，米老排节子愈合时间超过6 a时，变色长度明显增大。本研究运用逐步回归分析，筛选出节子直径(xKD)、死节长度 (xDBL)、枝条出现年龄(xYB)和节子愈合时间(xOT) 4个关键因子，得到描述节子变色长度(yDL)的最优模型：yDL=24.388+1.729xKD+0.350xDBL−6.635xYB+5.451xOT，相关性达到了极显著水平(P＜0.01)。计算结果与实际测量结果之间差异极小，因此可以利用该模型预测米老排枝条形成节子后对木材的影响状况。下一步研究可以对不同年龄、密度和立地条件的林分进行取样分析。
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米老排人工林在自然整枝条件下，大多数枝条的死亡时间在第2~4年，节子愈合年龄主要集中在第5~8年。节子直径、节子愈合时间、死节长度和枝条出现年龄是决定节子变色长度的关键因子。当节子直径在不超过50.0 mm和愈合时间不超过10 a时，节子变色长度均随直径和年龄的增加显著增加。因此，为了减少节子变色长度，提高米老排木材的质量和出材率，可以在米老排生长的第2~4年，对树干8.0 m以下的米老排人工林进行首次修枝。
Spatial and temporal distribution characteristics and discoloration law of knots in the Mytilaria laosensis plantation
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摘要:
目的 探明米老排Mytilaria laosensis人工林节子的时空分布特征及变色规律，为培育米老排无节材提供理论参考。 方法 以位于广西凭祥市的中国林业科学研究院热带林业实验中心11年生米老排人工林为研究对象，选取20株米老排样木，利用节子解析的方法，对获得的1 101个完整节子进行研究。 结果 从节子发育年龄上，米老排的枝条主要从第1~2年开始生长，第2~4年是其死亡高峰期(91.9%)，这些枝条(87.2%)死亡后在第5~8年内完全愈合并形成节子，其中大部分节子(76.7%)的愈合时间为3~6 a；在第2~4年米老排枝条死亡数量较多，该时段是控制节子形成的关键时期。在节子垂直分布上，节子的数量呈现随树高的增加先上升后急剧下降的趋势，且主要集中在高度为0~8.0 m的树干上。节子变色长度与节子的直径和愈合时间呈显著正相关(P＜0.05)，但与分枝角度呈显著负相关(P＜0.05)。通过逐步回归，得出节子直径、死节长度、节子出现年龄以及愈合时间是影响米老排节子变色长度的关键因子，相关性达极显著水平(P＜0.01)。 结论 在米老排种植后的2~4 a，对树干8.0 m以下进行首次修枝，有助于该树种无节材的培育。采取相应的森林培育措施减小枝条基径和缩短节子愈合所需时间，有助于减少节子对木材带来的影响。图7表4参32 Abstract:Objective The objective is to explore the spatial and temporal distribution characteristics and discoloration law of knots in the Mytilaria laosensis plantation, so as to provide theoretical reference for the cultivation of clear wood. Method A total of 1 101 complete knots were obtained by knot analysis from 20 trees of 11-year old M. laosensis plantation in Experimental Center of Tropical Forestry in Pingxiang City of Guangxi. Result In the development age of the knots, the branches of M. laosensis mainly began to grow in the 1st and 2nd year, and the death peak came in the 2nd to 4th year (91.9%). These branches (87.2%) completely healed and formed knots in the 5th to 8th year after death, and the healing time of most of them (76.7%) was 3 to 6 years. More branches of M. laosensis died in the 2nd to 4th year, which was a critical period to control the formation of knots. In the vertical distribution, the number of knots increased first and then decreased sharply with the increase of tree height and they were mainly concentrated on the trunk with a height of 0−8.0 m. The discoloration length of knots was positively correlated with knot diameter and healing time (P＜0.05), but negatively correlated with branch angle (P＜0.05). Through stepwise regression, it was concluded that knot diameter, dead knot length, knot age and knot healing time were the key factors affecting knot discoloration length, and their correlation was very significant (P＜0.01). Conclusion Pruning the trunk below 8.0 m for the first time 2−4 years after planting is beneficial to the cultivation of clear wood. Taking corresponding forest cultivation measures to reduce the base diameter of branches and the time required for knot healing will help ease the impact of knots on wood. [Ch, 7 fig. 4 tab. 32 ref.] -
无论是脊椎动物还是无脊椎动物，先天性免疫都是第一线防御机制，对抗着各类病原体的侵染。吞噬作用作为一种高度保守进程的先天性免疫机制，能够为许多细胞用来消化微生物病原体以及凋亡或坏死的细胞残骸[1-3]。在吞噬作用中，外来物质被细胞识别并结合到细胞表面，被吞噬小体吞入，并在被吞入的物质周围形成细胞器[4]。吞噬小体经过裂变以及与核内体、溶酶体，或是两者共同的限制性融合后形成成熟的吞噬溶酶体。进入吞噬溶酶体内部的病原体则被低pH值、水解作用以及自由基所消灭[5]。黑腹果蝇Drosophila melanogaster是最常见的果蝇，因拥有与哺乳动物相近的先天性免疫系统，而被认为是研究宿主与微生物相互作用的最佳基因模式生物[6-7]。近年来，果蝇Schneider细胞株（S2）细胞已被确认是一种非常适合研究细胞感染的宿主模型，在对抗衣原体Chlamydia，单胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes，查菲埃立克体Ehrlichia chaffeensis，白念珠菌Candida albicans，大肠埃希菌Escherichia coli以及金黄葡萄球菌Staphylococcus aureus等病菌[6, 8-14]的体外感染过程中，S2细胞与哺乳动物巨噬细胞的作用机制非常相近。金黄葡萄球菌是一种主要的人类病原体，致病率显著，研究显示金黄葡萄球菌可能是一种兼性胞内病原体[15]，并认为金黄葡萄球菌可以在巨噬细胞中存活数日而不影响细胞的生存情况[16]。笔者就果蝇S2细胞对热灭活大肠埃希菌（heat inactivated Esherichia coli, HIEC）及热灭活金黄葡萄球菌（heat inactivated Staphylococcus aureus, HISA）的吞噬模式展开研究，揭示了在S2细胞对抗革兰氏阳性菌时，吞噬作用在清除该类病原体时所起到的重要作用以及金黄葡萄球菌抑制消化过程从而抵御细胞吞噬的策略。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
黑腹果蝇S2细胞株从初代培养24 h的胚胎中分离获得，在体积分数为10%的小牛血清的果蝇培养基（Ivitrogen, 美国）中28 ℃培养[17]。为了确认脂多糖（LPS，Sigma，美国）或聚肽糖（PG，Sigma，美国）的活化作用是否会增强吞噬作用，将S2细胞以106个·孔-1铺开在6孔板中并粘附30 min，LPS或PG经超声处理1 h后，按1.0 mg·L-1的剂量加入到每个孔中孵育1 h，备用。
大肠埃希菌ATCC 14948菌株在LURIA-BERTANI培养基（LB）37 ℃培养24 h后，10 000 g离心10 min收集细菌。金黄葡萄球菌ATCC 25923菌株在含20.0 g·L-1氯化钠的哥伦比亚培养基中培养过夜，在盐溶液中重悬。热灭活大肠埃希菌（HIEC）或热灭活金黄葡萄球菌（HISA）以5×109个·L-1的密度接种于S2细胞，28 ℃孵育1 h。不同时间段收集S2细胞分析。
1.2 试验方法
1.2.1 样品制备与透射电子显微镜（TEM）分析
收集感染后的果蝇S2细胞（5.0~10.0 μL），在含体积分数2%多聚甲醛与2%戊二醛的0.1 mol·L-1二甲砷酸钠缓冲液（pH 7.4）固定剂中浸泡16 h，室温下不断旋转。以0.1 mol·L-1二钾砷酸钠缓冲液清洗，3次·样品-1，5 min·次-1，保持室温下旋转。随后加入体积分数2%锇（Osmium），并以0.1 mol·L-1二钾砷酸钠缓冲液清洗3次，5 min·次-1，保持室温下旋转。样品固定，20.0 g·L-1醋酸双氧铀缓冲液（pH 5.2）进行染色，室温避光染色1 h，保持旋转，随后以0.1 mol·L-1二钾砷酸钠缓冲液清洗3次，5 min·次-1并不断旋转。通过逐级增加的丙酮溶液（体积分数依次为50%，60%，70%，80%，90%，95%，100%）对样品进行脱水，室温下旋转处理，随后在100%环氧丙烯中毒处理10 min。以EMBED 812或502树脂黏结剂进行最终的渗透处理，V（环氧丙烯）:V（黏合剂）=1:1，室温旋转处理10 min；V（环氧丙烯）:V（黏合剂）=1:2，室温旋转处理20 min；100%黏合剂处理10 min。最终，样品中加入新的100%黏合剂，渗透16 h后，在干燥烘箱中以60 ℃聚合24 ~ 48 h。Hitachi 7650透射电镜（Hitachi, 日本）在70 kV下采集图像[10]。
1.2.2 激光共聚焦显微镜分析
果蝇S2细胞用体积分数10%胎牛血清（FBS）的施耐德培养基12孔板中铺板培养，并将密度为5×109个·L-1异硫氰酸荧光素标记（FITC，Invitrogen, 美国）的热灭活大肠埃希菌（HIEC）/热灭活金黄葡萄球菌（HISA），加入到S2细胞中28 ℃共培养1 h。以磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后，将混合细胞移植到多聚赖氨酸预处理的载玻片（Sigma，美国）上固定。之后，分别使用罗丹明鬼笔环肽（Invitrogen, 美国）和4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Sigma，美国）一同孵育，用以标记肌动蛋白或细胞核DNA[18]。
1.2.3 流式细胞仪检测分析
细胞培养与处理见1.2.2节。果蝇S2细胞接种细菌后，以PBS清洗，将混合细胞收集到流式管中，通过流式细胞仪检测S2细胞内的FITC荧光信号，统计S2细胞对HIEC和HISA的吞噬能力。为了研究细胞的吞噬作用对活细菌和热灭活细菌的敏感度，以胞内有1个以上FITC标记细菌的细胞在所有细胞中所占的百分比为参考值来予以评价。
1.2.4 细胞酸性指示剂（pHrodo）标签检测溶酶体酸化
在果蝇S2细胞（培养方法见1.2.2节）中加入LPS或PG，孵育S2细胞1 h，从而激活S2细胞；激活后的S2细胞以1×109个·L-1在6孔板中铺开，分别接种pHrodo标记的灭活病原菌（5×109个·L-1），28 ℃共孵育1 h。收集混合细胞，立刻在共聚焦显微镜下观察。分别统计不同处理组中，吞入pHrodo标记病原菌的S2细胞在全部细胞中所占百分比[18]。不同处理组间的差异以t检验进行统计学分析，P < 0.05为显著。
1.2.5 实时荧光定量PCR检测
果蝇S2细胞经过不同实验处理后，以PBS清洗，收集细胞，使用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取总RNA，操作步骤依据产品使用说明书[18]。即刻使用5.0 μg总核糖核酸，以M-MLV反转录酶（Takara，日本）合成为20.0 μL cDNA。实时荧光定量的检测采用基因特异引物与TaqMan探针（表 1），反应体系包括10.0 μL Premix Ex Taq（Takara，日本），1.0 μL cDNA样品，7.2 μL无酶水，各基因对应TaqMan探针0.3 μL，以及各特异性引物0.4 μL。聚合酶链式反应（PCR）程序如下：95 ℃，30 s；90 ℃，5 s，60 ℃，30 s，循环50次。数据分析使用iQTM5软件。
表 1 实时荧光定量PCR反应中引物与TaqMan探针序列Table 1 Primers and TaqMan probe sequences in qRT-PCR寡核苷酸探针 引物与探针序列 RP49-F 5'-CCGCTTCAAGGGACAGTATCTG-3' RP49-R 5'-CACGTTGTGCACCAGGAACTT-3' Rp49-探针 FAM-GGCAGCATGTGGCGGGTGCGCTT-Edipse Rel-F 5'-GCCAGAAAAACCCGTGAGTC-3' Rel-R 5'-AGGTACTTCCCCGATGTTCG-3' Rel-探针 FAM-CGACGTGGCCGCCGCAGA-Edipse Def-F 5'-CCACATGCGACCTACTCTCCA-3' Def-R 5'-AGCCGCCTTTGAACCCCT-3' Def-探针 FAM-ACCACACCGCCTGCGCCG-Eclipse Drs-F 5'-CTGGTGGTCCTGGGAGCC-3' Drs-R 5, -AGCGTCCCTCCTCCTTGC-3' Drs-探针 FAM-CCGATGCCGACTGCCTGTCC-Eclipse 1.2.6 统计学分析
本研究中每组试验均使用3个生物学重复。统计学显著性分析使用t检验，判断对照组与实验组的差异性，P < 0.05为显著，P < 0.01为极显著。
2. 结果与分析
2.1 透射电镜观察黑腹果蝇S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用
透射电镜下观察黑腹果蝇S2细胞对灭活大肠杆菌（HIEC）或灭活金黄葡萄球菌（HISA）的吞噬过程，发现孵育1 h后S2细胞即可顺利吞噬HIEC（图 1A），孵育后第1天S2细胞内HIEC已消失（图 1B）；但共孵育1 h后S2细胞未能吞噬HISA（图 1C），HISA（图 2A）与S2细胞共孵育4 d，仍保持形态完整（图 1D，图 2B，图 2C，图 2D，图 2E）。在PG或LPS激活后，S2细胞也不能有效地吞噬HISA（图 2F，图 2G，图 2H）。与健康的S2细胞相比，在接种后第4天，S2细胞吞入的HISA依然形态完整（图 2E，图 2F，图 2G，图 2H）；吞入HISA的S2细胞没有出现凋亡或破裂，表明细胞内的HISA并没有对S2细胞造成明显的损伤。
图 1 透射电镜观察黑腹果蝇S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用Figure 1 Transmission electron microscopy of phagocytosis of HIEC or HISA by S2 cells
图 2 透射电镜观察黑腹果蝇S2细胞对HISA的吞噬作用Figure 2 Transmission electron microscopy of phagocytosis of HISA by S2 cells2.2 激光共聚焦显微观察黑腹果蝇S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用
激光共聚焦显微观察发现，在S2细胞吞噬热灭活大肠杆菌HIEC 1 h后，胞内可观察到HIEC发出的绿色荧光（图 3A）；吞噬发生1 d后，S2细胞内观察不到绿色荧光粒子（图 3B）；表明HIEC已经被S2细胞清除。同样处理下，热灭活金黄葡萄球菌HISA没有被S2细胞清除。由图 3C和图 3D可知，HISA被吞噬后，被S2细胞内化到细胞内继续存在。由此可知，在S2细胞接种灭活菌后，HIEC与HISA均被S2细胞吞入，但HIEC被S2细胞清除，而HISA则没有被清除。
图 3 激光共聚焦显微镜观察黑腹果蝇S2细胞对FITC标记的HIEC或HISA的吞噬作用Figure 3 Confocal microscopy of phagocytosis of FITC-labeled HIEC or HISA by S2 cells2.3 流式细胞仪检测S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用
流式细胞仪的检测结果由图 4可知：接种1 h后，吞入了至少1个HIEC粒子的S2细胞在所有S2细胞中所占的比例接近40%，与S2细胞吞噬大肠埃希菌的结果相近；吞入至少1个HISA粒子的S2细胞在所有S2细胞中所占的比例接近25%，与S2细胞吞噬金黄葡萄球菌的结果相近。说明S2细胞吞入活细菌和热灭活细菌的敏感度并没有显著差异。
图 4 孵育1 h后黑腹果蝇S2细胞对FITC标记的病原菌的吞噬率Figure 4 Quantification of phagocytosis of FITC-labeled microbes by S2 cells at 1 h post-inoculation2.4 吞噬溶酶体酸化观察和吞噬率检测结果
细胞内的酸性环境可诱导pHrodo标记的病原菌激发出红色荧光，从而指示吞噬溶酶体的形成。激光共聚焦显微镜观察发现，接种HIEC 1 h后，S2细胞内可观察到红色荧光，表明S2细胞对HIEC的消化程序被激活，细胞内形成了酸性环境（图 5A）；图 5B中未能观察到红色荧光，表明HISA未能激活S2细胞的酸化过程。使用LPS或PG激活S2细胞，再进行接种观察，可发现在接种HISA 1 h后，未能观察到红色荧光，说明S2细胞的酸化过程仍未被激活。
图 5 激光共聚焦显微观察孵育1 h后黑腹果蝇S2细胞对pHrodo标记的HIEC及HISA的呑噬作用Figure 5 Confocal microscopy of phagocytosis of pHrodo-labeled HIEC or HISA by S2 cells at 1 h post-inoculation为揭示LPS或PG的刺激对S2细胞吞噬活性的影响，用共聚焦显微镜观察S2细胞吞噬pHrodo标记菌并统计吞噬率。结果表明：共孵育1 h后，只有接种HIEC的S2细胞内呈现酸性环境，其他的处理均不能诱导S2细胞酸化（图 6）。检测吞噬百分比发现，只有HIEC处理组的吞噬率显著高于对照组（P < 0.01）。使用LPS或PG激活S2细胞后再接种，S2细胞对HISA的吞噬率仍没有显著增加。这表明溶酶体酸化过程只发生在S2细胞吞噬HIEC的过程中，而LPS或PG刺激并不能诱导S2细胞吞噬HISA后的酸化过程（图 6）。
图 6 共孵育1 h后S2细胞对pHrodo标记的HIEC及HISA的吞噬率Figure 6 Phagocytic percentages of the pHrodo-labeled HIEC or HISA2.5 实时荧光定量PCR检测基因表达
实时荧光定量PCR反应中引物与TaqMan探针序列如表 1所示。通过实时荧光定量PCR检测不同处理条件下S2细胞内的防御素（defensin），抗真菌肽（drosomycin）和Relish的表达量变化。结果发现：防御素的表达量在HISA，HISA+LPS和HISA+PG等3个处理组中，均发生显著上调（P < 0.01）；抗真菌肽的表达量仅在HISA+PG处理组中发生显著上调（P < 0.01）（图 7）；Relish的表达量在HIEC处理组中发生显著上调（P < 0.01），但在HISA处理组中无显著变化。
图 7 黑腹果蝇S2细胞呑噬HISA作用中防御素，抗真菌肽及Relish的表达谱Figure 7 Expression profiles of drosomycin, defensin and relish in phagocytosis of HISA3. 讨论与结论
吞噬作用是动物对抗微生物病原体的一种重要免疫防御机制，由吞噬细胞来执行具体的功能[19-20]。本研究对黑腹果蝇S2细胞吞噬热灭活大肠埃希菌（HIEC）和金黄葡萄球菌（HISA）的异同进行了研究。结果表明：S2细胞能够在接种后1 d有效吞噬并清除HIEC，但却无法清除HISA；即使到了接种后4 d，S2细胞仍不能有效地清除HISA，而是任由它存在于细胞内。经PG或LPS诱导激活的S2细胞同样不能有效地清除HISA。与健康的S2细胞相比，存在于细胞内的HISA在接种4 d后并没有明显破坏S2细胞。许多研究证明在细胞培养模式下，金黄葡萄球菌能够逃逸宿主细胞的免疫系统，具有隐藏的潜能[21]，可在胞内坚持存活一段时间[22-23]。在本研究中，热灭活金黄葡萄球菌存在于S2细胞中达4 d以上，说明灭活后的金黄葡萄球菌仍存在抗吞噬的成分，这与金黄葡萄球菌存在多个抗吞噬因子有关[24-26]。统计细胞吞噬率发现，热灭活并不会影响吞噬作用对灭活细菌的敏感性，这一点已被另一项研究所证实[11]。
在消化进程中，吞噬溶酶体的pH值降低，细胞内环境酸化，可帮助吞噬作用的进行，并能够通过pHrodo染料的使用进行检测[27]。LPS是革兰氏阴性菌的主要的细胞膜成分，可以通过Imd（immune deficiency）免疫信号通路激活巨噬细胞；PG是革兰氏阳性菌细胞壁上的主要成分，可以通过Toll信号通路激活巨噬细胞。使用LPS或PG刺激接种HISA的S2细胞，细胞并未形成酸化环境。通过透射电镜与激光共聚焦显微镜的观察，明确了即使S2细胞经过LPS或PG的激活也不能有效地吞噬HISA的结果；检测S2细胞对pHrodo标记的病原菌的吞噬百分比也表明，吞噬溶酶体的酸化只发生在S2细胞对HIEC的吞噬过程中，其他处理并不能引起S2细胞的酸化。
黑腹果蝇S2细胞的吞噬作用中包括了Toll与Imd等2条信号通路，其中Toll通路参与到抗革兰氏阳性菌的免疫作用中，该免疫应答机制中包含Defensin基因[28-29]的表达，而已知的防御素（defensin）是一类由小胱甘酸富集而成，可被诱导的抗微生物肽，有利于宿主对真菌的防御应答[30]；Drosomycin基因表达的Drosomycin是一类可诱导的抗真菌肽，同样由Toll通路调节，并在全身脂肪体中均有表达[31-32]。观察发现防御素的表达量在HISA，HISA+LPS以及HISA+PG处理中，均发生显著上调；抗真菌肽的表达量在HISA+PG处理中显著上调；由此可以推断，Toll通路在HISA+PG的刺激下被激活。但是也看到PG虽然能激活S2细胞的Toll通路，但却无法有效清除HISA，同样，胞内的HISA也不会诱导S2细胞凋亡。由此可知，金黄葡萄球菌作为一种人类病原体，对黑腹果蝇来说也是高致病的病原，与其他革兰氏阳性菌相比，它表现出了更强的对防御素的抵御能力[36]。在黑腹果蝇中，Imd通路调节着对革兰氏阴性菌的免疫应答，Relish作为NF-κB通路的转录因子，是Imd通路的终极目标[28]。本研究结果发现：Relish在HIEC处理中显著上调（P < 0.01），说明Imd通路在HIEC处理中被激活，而激活的Imd通路最终诱导S2细胞吞噬HIEC，说明Relish的表达量与S2细胞吞噬HIEC的百分率呈正相关。
有研究表明：金黄葡萄球菌能够迅速地逃避溶酶体/吞噬体的捕获，在细胞液泡内存活可长达4 d，之后逃入细胞质中[16, 37-38]。有趣的是，我们发现灭活金黄葡萄球菌同样能够在S2细胞内存活4 d，其细胞表面物质具有抗吞噬消化的活性。该结果同时暗示着无脊椎动物吞噬细胞对清除部分革兰氏阴性及革兰氏阳性菌均有所帮助，但细胞免疫对这些胞内细菌的清除效力胜于体液免疫。
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表 1 米老排人工林各样地概况
Table 1. Information of different sampled plots of the M. laosensis plantation
样地号 面积/
hm²平均树
高/m平均胸
径/cm平均枝
下高/m平均冠
幅/m坡向 坡度/
(°)M601 0.06 17.8 18.1 5.3 6.8 阳 25 M602 0.06 17.5 17.2 4.9 7.5 半阳 28 M603 0.06 19.4 17.8 4.5 7.9 阳 23 M604 0.06 17.7 18.1 4.5 6.2 半阳 31 M605 0.06 18.4 17.9 4.8 6.4 半阳 22 
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表 2 取样树信息
Table 2. Summary sampled tree statistics
项目 树高/m 胸径/cm 枝下高/m 冠幅/m 数值范围 17.1~22.8 17.7~25.3 4.5~8.8 6.5~10.4 平均值 19.5 21.4 6.9 8.6 标准差 3.9 4.2 1.2 2.3
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表 3 节子信息表
Table 3. Sample branch description for M. laosensis
项目 分枝角度/(°) 枝条死亡
年龄/a节子愈合所
需时间/a节子着生
高度/m节子直径/mm 变色长度/mm 枝条出现
年龄/a节子愈合
年龄/a死节长度/mm 范围 12.9~88.5 2~8 1~10 0.1~18.4 4.7~59.1 17.2~189.6 1~7 3~11 1.4~148.5 平均值 54.1 2.6 4.6 6.8 23.7 102.5 1.1 7.3 51.1 标准差 10.0 0.8 1.6 4.6 8.1 21.1 0.4 1.5 26.1
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表 4 节子变色长度模型参数估计值和拟合统计量
Table 4. Estimated parameter values and fitted statistics values of discoloration length model
参数 估计值 标准差 t P 残差平方和 R² a0 24.388 2.830 8.619 0.057 371 405.423 0.649 a1 1.729 0.064 26.968 0.000 a2 0.350 0.023 14.927 0.000 a3 −6.635 1.485 −4.467 0.000 a4 5.451 0.395 13.805 0.000 说明：a0是常数，a1、a2、a3和a4分别是模型中节子直径、 死节长度、枝条出现年龄和节子愈合时间的参数
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20210517
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