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土壤中的有机碳既是碳汇又是碳源。全球土壤圈碳储量约1 500 Gt，约是大气圈碳储量的2倍，植被碳储量的3倍，每年因土地利用变化所释放的二氧化碳(CO2)约占全球CO2释放量的25%[1-4]。不合理的土地利用方式能够引起土壤碳汇功能减弱[5]。一般而言，湿地由于较低的有机质分解速率和较高的生产力而成为重要的碳汇[6]。有研究[7]表明：在过去近200 a中，湿地开垦后土壤碳素损失约4 Gt。水田是蕴含人类文明的人工湿地生态系统，由于其巨大的碳库储存能力而逐渐受到学者的关注。近年来，随着休闲农业的不断发展，中国南方大面积水田改种花卉和果树，水稻Oryza sativa播种面积逐渐减少。相关年鉴统计表明：2017年全国水稻播种面积为3 074.7万hm2，比1978年减少了367.4万hm2；2019年浙江省水稻播种面积为76.1万hm2，比2012年减少7.3万hm2，比1995年减少137.8万hm2。水田(水耕人为土)改旱作后，土体环境由还原过程占优势向氧化过程为主过渡，土壤有机碳矿化速率明显加快。目前，关于土壤碳储量的研究主要集中在同一种土地利用方式碳循环影响因素、碳排放结构特征和区域差异[8]，以及天然湿地转化为农田以后对碳储存的影响等方面[5-7]，针对水田改旱作后土壤有机碳储量变化及其空间分布的研究较少。本研究通过测算水田改旱前后土壤有机碳含量的差异，分析其时空分异特征及影响因素，对提高土壤肥力和土壤固碳潜力，科学评价和保护人工湿地生态系统，减少碳排放有重要意义。
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浙江省(27°02′~31°11′N， 118°01′~123°10′E)处于典型亚热带湿润季风气候区，冬夏季风交替明显，四季分明，气温适中，雨水丰沛，日照充足，平均气温为15.0~18.1 ℃，≥10℃积温为5 200~5 700 ℃，年日照总时数为1 100~2 200 h，历年平均降水量为1 060~2 000 mm，相对湿度为75%~80%。近年来，随着生产生活方式的转变，浙江省很多农业用地被用来发展休闲农业。
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依据中国土壤系统分类检索(第3版)，水耕人为土(水稻土)可分为潜育、铁渗、铁聚和简育水耕人为土等四大类[9]。在浙江省范围内，构建4个水耕人为土改旱序列剖面，每个序列包含1个长期种植水稻的土壤剖面和2个水改旱不同年限(最长为15~20 a)的土壤剖面，共计12个采自独立田块的代表性土壤剖面。土壤剖面样地信息详见表1，所有样地海拔为2.7~5.2 m，成土母质为湖沼、湖海或河海相淤积物。
表 1 土壤样品基本信息
Table 1. Basic information of soil samples
序列类型 采样地点 剖面号 旱作年限/a 纬度(N) 经度(E) 利用方式 经济作物 潜育 嘉兴市南湖区大桥镇江南村 QYP1 0 30°44′50″ 120°51′47″ 水田 水稻 QYP2 7 30°44′52″ 120°52′09″ 果园 葡萄 QYP3 15 30°45′01″ 120°51′56″ 铁渗 绍兴市柯桥区福全镇赵家畈村 TSP1 0 29°58′27″ 120°30′02″ 水田 水稻 TSP2 12 29°58′28″ 120°30′01″ 林地 樟树 TSP3 19 29°58′27″ 120°30′00″ 铁聚 杭州市余杭区瓶窑镇窑北村 TJP1 0 30°24′27″ 119°56′24″ 水田 水稻 TJP2 8 30°24′26″ 119°56′23″ 果园 桃 TJP3 20 30°24′24″ 119°56′18″ 简育 杭州市萧山区新塘街道霞江村 JYP1 0 30°08′43″ 120°19′26″ 水田 水稻 JYP2 8 30°08′42″ 120°19′22″ 林地 樟树 JYP3 15 30°08′30″ 120°19′26″ 说明：葡萄Vitis vinifera，樟树Cinnamomum camphora，桃Amygdalus persica 根据土壤剖面发育状况，确定发生层及其深度，分层采集土壤样品。田间采集的分层土样带回实验室采用常规方法风干处理，依次过2.00和0.15 mm土筛，用于土壤有机质测定，同时用烘干法测定含水率，矫正分析结果。
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土壤含水率测定采用烘干法；土壤pH测定采用电位法；土壤有机碳(SOC)质量分数测定采用重铬酸钾-硫酸外加热法；土壤容重测定采用环刀法[10]。
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依据《中国土壤系统分类检索》[9]和单正军等[11]估算温室气体排放的方法，按照SOC剖面分布特征，分层计算SOC损失量，公式为C0=HBC。C0为SOC密度(kg·m−2)，H为土层厚度(m)，B为土壤容重(kg·cm−3)，C为SOC质量分数(kg·kg−1)；其中C=0.58CM，CM为测定出的土壤有机质，0.58为转换系数。将计算出的各土层SOC叠加，计算水耕人为土改旱(水改旱)作前后1 m土体中SOC总量，计算旱作前后土体中SOC总量的差值，测算SOC的损失量；通过计算损失量与旱作时间的比值，测算SOC年损失率。采用Excel 2003处理数据，Origin 8.0制图。
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湿地CO2释放量与地下水位呈负相关[12-13]。从图1可见：4类水耕人为土改旱作后地下水位均呈现不同程度下降，其中以潜育和铁渗水耕人为土改旱后地下水位下降最为明显。改旱后，土壤田间含水率明显下降，短期旱地表层土壤田间含水率降幅为28.88%~51.42%，长期旱地表层土壤田间含水率降幅为31.41%~56.65% (表2)。
图 1 水田和改旱土壤地下水位
Figure 1. Groundwater level of paddy and upland soils
表 2 土壤剖面样品基本性质
Table 2. Basic properties of soil profile samples
剖面号 发生层深度/cm 田间含水率/% 容重/(g·cm−3) pH 剖面号 发生层深度/cm 田间含水率/% 容重/(g·cm−3) pH QYP1 0~14 47.12 1.08 6.36 TSP1 0~12 59.20 0.95 5.57 14~30 37.03 1.34 7.13 12~25 56.89 1.07 5.78 30~100 38.61 1.39 7.74 25~47 29.78 1.50 7.37 47~88 31.36 1.42 7.40 88~100 32.24 1.37 6.05 QYP2 0~14 33.51 1.30 6.08 TSP2 0~12 38.87 1.18 5.09 14~30 31.78 1.35 7.10 12~25 43.91 1.20 6.32 30~100 31.43 1.43 7.59 25~47 25.13 1.53 7.50 47~88 28.65 1.41 7.39 88~100 32.20 1.37 6.30 QYP3 0~14 32.32 1.32 5.67 TSP3 0~12 34.78 1.27 4.55 14~30 34.39 1.40 6.33 12~25 35.47 1.29 6.32 30~100 35.23 1.45 7.50 25~47 25.91 1.55 7.34 47~88 32.77 1.40 7.47 88~100 32.04 1.37 6.11 TJP1 0~17 46.57 0.99 5.82 JYP1 0~12 54.40 0.96 6.51 17~30 29.92 1.53 5.71 12~22 27.23 1.26 6.54 30~65 25.80 1.60 6.71 22~67 19.03 1.55 7.97 65~85 29.76 1.58 7.00 67~100 21.20 1.48 8.30 85~100 32.07 1.60 6.97 TJP2 0~17 28.48 1.25 5.63 JYP2 0~12 26.43 1.18 6.08 17~30 29.25 1.58 5.45 12~22 23.44 1.36 6.42 30~65 27.86 1.61 6.66 22~67 21.82 1.58 7.89 65~85 28.67 1.64 6.79 67~100 20.53 1.49 8.26 85~100 29.19 1.61 6.76 TJP3 0~17 26.90 1.28 5.12 JYP3 0~12 23.58 1.29 4.72 17~30 28.36 1.63 5.05 12~22 22.01 1.42 5.75 30~65 21.32 1.64 5.85 22~67 19.09 1.60 7.88 65~85 28.67 1.66 6.34 67~100 23.58 1.48 8.20 85~100 29.19 1.62 6.88 说明：QY、TS、TJ和JY分别代表潜育、铁渗、铁聚和简育水耕人为土。P1为水田土壤，P2为短期旱作土壤，P3为长期旱作土壤 -
容重大小不仅能反映土壤结构状况和有机质质量分数的高低，还是衡量湿地土壤持水性能和蓄水性能的重要指标之一[14]。改旱作后，各序列表层和亚表层土壤容重随旱作时间延长呈现增加趋势，其中表层土壤容重增加最为明显(表2)；这与改旱后土壤翻耕减少，土壤有机质质量分数降低以及进入土壤的植物根系等残体明显减少有关。改旱后，各序列剖面土壤淀积层和底土层(相当于潜育层或母质层)土壤容重变化不明显(表2)。
改旱后，4个改旱序列部分发生层土壤pH明显下降(表2)，可能原因是改旱后土壤中施用大量酸性肥料促进了土壤的酸化(表3)；其次，土壤中铵态氮在硝化细菌的作用下转化为硝态氮，以及土壤中锰离子(Mn2+)、铁离子(Fe2+)等离子被氧化，都释放出大量的质子(H+)，加速了土壤酸化。
表 3 水田及改旱土壤施肥量的差异
Table 3. Differences of fertilization between paddy and upland soils
土壤类型 利用方式 施肥量/(kg·hm−2) 尿素 过磷酸钙 氯化钾 复合肥 鸡粪 蓖麻饼 生石灰 QY 水田 180~300 375~525 150~225 150~300 − − − 果园 525~675 1050~1 200 450~675 1050~1 350 30 000~45 000 6 000~10 500 450~600 TS 水田 180~300 375~525 150~225 150~300 − − − 林地 150~300 525~675 150~225 675~825 12 000~18 000 − − TJ 水田 180~300 375~525 150~225 150~300 − − − 果园 270~375 900~1 050 375~525 900~1 200 19 500~27 000 − − JY 水田 300~525 600~825 300~375 300~525 − − − 林地 375~525 750~900 375~525 900~1 200 27 000~37 500 − − 说明：−表示无施肥。QY、TS、TJ和JY分别代表潜育、铁渗、铁聚和简育水耕人为土 -
随着旱作时间延长，4个改旱序列SOC质量分数都呈现整体降低趋势，并以表层和亚表层SOC降低最为明显(图2)。短期(7~12 a)改旱后，4类水耕人为土表层SOC下降幅度为22.44%~33.03%，亚表层SOC下降幅度为17.26%~27.61%。长期(15~20 a)改旱后，4类水耕人为土表层SOC分别下降34.13%、42.08%、42.08%和36.96%，亚表层SOC分别下降30.58%、57.06%、42.07%和29.25%。从空间分布看，各土壤剖面表层和亚表层SOC质量分数均高于其他发生层；同一剖面中，随着深度增加，SOC质量分数逐渐降低。
图 2 水田和改旱土壤剖面有机碳分布
Figure 2. Distribution of organic carbon in the profiles of paddy and upland soils
水田改旱作后剖面各发生层中SOC质量分数降低的主要原因是：改旱作后人为滞水水分状况消失，土壤通气性增强，微生物对有机质的分解速率加快；同时，改旱后土壤充分暴露在空气中，加速有机碳化学氧化；此外，改旱后植物根系、枝干等植物残体进入土壤的数量减少，使SOC总量下降。改旱后，表下层SOC质量分数略微降低，主要与改旱后随黏粒淋溶并淀积到上述发生层的有机碳减少有关。
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由表4可知：改旱作15~20 a后，潜育、铁渗、铁聚和简育改旱序列，1 m深度土体内SOC分别损失13.90%、34.92%、18.93%和23.89%，年损失率分别为2.06、2.92、1.14和1.54 t·hm−2·a−1。本研究结果与水田改玉米地后表层土壤(0~15 cm)有机碳损失率(1.9 t·hm−2·a−1)的结论基本一致[15]。研究表明：水耕人为土改旱作后SOC减少与地下水位下降有关，供试SOC损失量与地下水下降深度呈极显著正相关(P＜0.01)，相关系数达0.82 (图3)。
表 4 土壤剖面有机碳密度及其年损失率
Table 4. Content and loss rate of soil organic carbon of profile samples
土壤类型 水田土壤有机
碳密度/(t·hm−2)短期旱地 长期旱地 有机碳密度/
(t·hm−2)损失量/
(t·hm−2)年损失率/
(t·hm−2·a−1)有机碳密度/
(t·hm−2)损失量/
(t·hm−2)年损失率/
(t·hm−2·a−1)QY 222.17 200.97 21.20 3.03 191.29 30.88 2.06 TS 158.75 118.75 40.00 3.33 103.32 55.43 2.92 TJ 120.46 111.80 8.66 1.08 97.66 22.80 1.14 JY 96.57 80.83 15.74 1.97 73.50 23.07 1.54 说明：QY、TS、TJ和JY分别代表潜育、铁渗、铁聚和简育水耕人为土 
图 3 土壤有机碳损失量与地下水位下降深度关系
Figure 3. Relationship between the loss of organic carbon and the decline of the depth of groundwater level
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水耕人为土(水稻土)可分为潜育、铁渗、铁聚和简育等 4 类，浙江省内4种水耕人为土均有分布，以铁聚和简育水耕人为土分布最为广泛。潜育水耕人为土多分布在低洼区，一般地下水位较高，表层土壤容易受到地下水的影响；铁渗水耕人为土由于强烈还原淋溶和氧化淀积作用，有明显的铁淋失的亚层；铁聚水耕人为土具有明显氧化还原淋溶和氧化铁淀积作用，在水耕氧化还原层的上部具有明显的铁积累亚层；简育水耕人为土是氧化还原作用引起的铁锰淋溶淀积作用较弱的一类水耕人为土。本研究发现：潜育、铁渗和简育改旱系列，旱作前期土壤有机碳损失率高于后期，这主要与改旱后人为滞水水分状况消失，土壤田间水分含量在旱作前期较后期下降更加明显等因素有关。由于潜育水耕人为土改旱系列土壤有机碳含量的绝对值较大，铁聚水耕人为土系列地下水位相对较低，改旱后潜育和铁聚水耕人为土土壤有机碳的年损失率相对较高。水耕人为土改旱序列土壤有机碳损失量与地下水位下降深度呈极显著正相关(P＜0.01)，相关性系数达0.82。
1995—2012年浙江省水田面积减少100.6万hm2，2019年比2012年水稻播种面积减少7.3万hm2，水田面积下降趋势减缓。本研究发现：1 m深度土体内4个系列土壤有机碳年损失率为1.14~2.92 t ·hm−2·a−1；由此推算：同1995年相比，2019年浙江省不同类型水耕人为土改旱作导致1 m深土壤有机碳储量减少了122.96万~314.95万t，平均减少218.96万t。与NISHIMURA等[16]发现的水改旱导致土壤碳素损失的结论是一致的。水耕人为土改旱作后，土壤碳汇功能减弱，温室气体排放增加，对区域碳平衡产生重要影响；有效控制水耕人为土改为旱地的土地面积，是减少第一产业碳排放的重要方法。
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休闲农业旅游背景下，水田改旱作后，进入土壤的植物残体减少，土壤植物碳输入减少；土壤水分含量降低，碳矿化损失增加，是导致土壤有机碳大幅下降的主要原因。水改旱后，地下水位下降导致土壤有机碳损失速率加快；改旱作后人为滞水水分状况的消失，以及较低的地下水位，不利于土壤有机碳储存。保持和提高现有水田面积，有利于土壤有机碳储存和减少农田温室气体排放。随着近年来浙江省水田改旱地面积的有效控制，水改旱引起的温室气体排放问题，有望得到缓和。
Spatiotemporal differentiation of organic carbon in upland soils converted from paddy field under the leisure agriculture tourism background in Zhejiang Province
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摘要:
目的 研究休闲农业旅游背景下，浙江省由水田改种花卉、果树和苗圃的土壤有机碳(SOC)的时空分异，掌握利用方式改变后农田土壤固碳情况。 方法 选择浙江省水田及其改旱作后的土壤为研究对象，采用野外调查和室内分析方法，以“空间换时间”研究水田改旱作后1 m深土体内SOC密度和储量的时空变化，对比不同类型水田土壤改旱作后SOC变化的差异，估测浙江省水改旱土壤SOC储量变化。 结果 水田改旱作15~20 a后，潜育、铁渗、铁聚和简育等4类改旱系列土壤1 m深土体内，SOC分别下降了13.9%、34.9%、18.9%和23.9%，SOC密度损失量分别为2.06、2.92、1.14和1.54 t·hm−2·a−1。改旱后，SOC下降速率与地下水位下降深度呈极显著正相关(P＜0.01)。 结论 水田是有利于SOC储存的土地利用方式，水田改旱作会降低SOC储存量，影响区域碳平衡。图3表4参16 Abstract:Objective This paper, with an exploration of the spatiotemporal differentiation of soil organic carbon (SOC) in such upland as nurseries of flowers and trees as well as orchards, which have been converted from paddy field in Zhejiang Province under the background of leisure agriculture tourism, is aimed to better understand the carbon sequestration in soils after the land-use conversions. Method With soil samples selected from paddy field and the converted upland as the research objects, combined methods of field investigation and laboratory analysis were employed, on the basis of “trading space for time”, to investigate the spatiotemporal changes in the density and storage of SOC in 1 meter depth soil before a comparison was conducted of the differences of SOC among different types of upland converted from paddy fields and an estimation was made of the storage changes of SOC after the land-use conversions in Zhejiang Province. Result Soil organic carbon on four types of stagnic anthrosols (hap-stagnic, Fe-leachi-stagn, iFe-accumuli-stagnic and hapli-stagnic anthrosols) in 1 meter depth upland soils decreased by 13.9%, 34.9%, 18.9% and 23.9% respectively after 15 to 20 years with the loss of SOC density being 2.06, 2.92, 1.14 and 1.54 t·hm−2·a−1, respectively. There was a significant positive correlation (P＜0.01) between the decline rate of SOC and the decline depth of groundwater level in the upland soils. Conclusion Paddy field is a better choice for the storage of SOC whereas the conversion from paddy field to upland decreases the storage of SOC and affects regional carbon balance. [Ch, 3 fig. 4 tab. 16 ref.] -
Key words:
- leisure agriculture /
- paddy field /
- land use /
- soil organic carbon density /
- carbon sink /
- carbon source
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无论是脊椎动物还是无脊椎动物，先天性免疫都是第一线防御机制，对抗着各类病原体的侵染。吞噬作用作为一种高度保守进程的先天性免疫机制，能够为许多细胞用来消化微生物病原体以及凋亡或坏死的细胞残骸[1-3]。在吞噬作用中，外来物质被细胞识别并结合到细胞表面，被吞噬小体吞入，并在被吞入的物质周围形成细胞器[4]。吞噬小体经过裂变以及与核内体、溶酶体，或是两者共同的限制性融合后形成成熟的吞噬溶酶体。进入吞噬溶酶体内部的病原体则被低pH值、水解作用以及自由基所消灭[5]。黑腹果蝇Drosophila melanogaster是最常见的果蝇，因拥有与哺乳动物相近的先天性免疫系统，而被认为是研究宿主与微生物相互作用的最佳基因模式生物[6-7]。近年来，果蝇Schneider细胞株（S2）细胞已被确认是一种非常适合研究细胞感染的宿主模型，在对抗衣原体Chlamydia，单胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes，查菲埃立克体Ehrlichia chaffeensis，白念珠菌Candida albicans，大肠埃希菌Escherichia coli以及金黄葡萄球菌Staphylococcus aureus等病菌[6, 8-14]的体外感染过程中，S2细胞与哺乳动物巨噬细胞的作用机制非常相近。金黄葡萄球菌是一种主要的人类病原体，致病率显著，研究显示金黄葡萄球菌可能是一种兼性胞内病原体[15]，并认为金黄葡萄球菌可以在巨噬细胞中存活数日而不影响细胞的生存情况[16]。笔者就果蝇S2细胞对热灭活大肠埃希菌（heat inactivated Esherichia coli, HIEC）及热灭活金黄葡萄球菌（heat inactivated Staphylococcus aureus, HISA）的吞噬模式展开研究，揭示了在S2细胞对抗革兰氏阳性菌时，吞噬作用在清除该类病原体时所起到的重要作用以及金黄葡萄球菌抑制消化过程从而抵御细胞吞噬的策略。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
黑腹果蝇S2细胞株从初代培养24 h的胚胎中分离获得，在体积分数为10%的小牛血清的果蝇培养基（Ivitrogen, 美国）中28 ℃培养[17]。为了确认脂多糖（LPS，Sigma，美国）或聚肽糖（PG，Sigma，美国）的活化作用是否会增强吞噬作用，将S2细胞以106个·孔-1铺开在6孔板中并粘附30 min，LPS或PG经超声处理1 h后，按1.0 mg·L-1的剂量加入到每个孔中孵育1 h，备用。
大肠埃希菌ATCC 14948菌株在LURIA-BERTANI培养基（LB）37 ℃培养24 h后，10 000 g离心10 min收集细菌。金黄葡萄球菌ATCC 25923菌株在含20.0 g·L-1氯化钠的哥伦比亚培养基中培养过夜，在盐溶液中重悬。热灭活大肠埃希菌（HIEC）或热灭活金黄葡萄球菌（HISA）以5×109个·L-1的密度接种于S2细胞，28 ℃孵育1 h。不同时间段收集S2细胞分析。
1.2 试验方法
1.2.1 样品制备与透射电子显微镜（TEM）分析
收集感染后的果蝇S2细胞（5.0~10.0 μL），在含体积分数2%多聚甲醛与2%戊二醛的0.1 mol·L-1二甲砷酸钠缓冲液（pH 7.4）固定剂中浸泡16 h，室温下不断旋转。以0.1 mol·L-1二钾砷酸钠缓冲液清洗，3次·样品-1，5 min·次-1，保持室温下旋转。随后加入体积分数2%锇（Osmium），并以0.1 mol·L-1二钾砷酸钠缓冲液清洗3次，5 min·次-1，保持室温下旋转。样品固定，20.0 g·L-1醋酸双氧铀缓冲液（pH 5.2）进行染色，室温避光染色1 h，保持旋转，随后以0.1 mol·L-1二钾砷酸钠缓冲液清洗3次，5 min·次-1并不断旋转。通过逐级增加的丙酮溶液（体积分数依次为50%，60%，70%，80%，90%，95%，100%）对样品进行脱水，室温下旋转处理，随后在100%环氧丙烯中毒处理10 min。以EMBED 812或502树脂黏结剂进行最终的渗透处理，V（环氧丙烯）:V（黏合剂）=1:1，室温旋转处理10 min；V（环氧丙烯）:V（黏合剂）=1:2，室温旋转处理20 min；100%黏合剂处理10 min。最终，样品中加入新的100%黏合剂，渗透16 h后，在干燥烘箱中以60 ℃聚合24 ~ 48 h。Hitachi 7650透射电镜（Hitachi, 日本）在70 kV下采集图像[10]。
1.2.2 激光共聚焦显微镜分析
果蝇S2细胞用体积分数10%胎牛血清（FBS）的施耐德培养基12孔板中铺板培养，并将密度为5×109个·L-1异硫氰酸荧光素标记（FITC，Invitrogen, 美国）的热灭活大肠埃希菌（HIEC）/热灭活金黄葡萄球菌（HISA），加入到S2细胞中28 ℃共培养1 h。以磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后，将混合细胞移植到多聚赖氨酸预处理的载玻片（Sigma，美国）上固定。之后，分别使用罗丹明鬼笔环肽（Invitrogen, 美国）和4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Sigma，美国）一同孵育，用以标记肌动蛋白或细胞核DNA[18]。
1.2.3 流式细胞仪检测分析
细胞培养与处理见1.2.2节。果蝇S2细胞接种细菌后，以PBS清洗，将混合细胞收集到流式管中，通过流式细胞仪检测S2细胞内的FITC荧光信号，统计S2细胞对HIEC和HISA的吞噬能力。为了研究细胞的吞噬作用对活细菌和热灭活细菌的敏感度，以胞内有1个以上FITC标记细菌的细胞在所有细胞中所占的百分比为参考值来予以评价。
1.2.4 细胞酸性指示剂（pHrodo）标签检测溶酶体酸化
在果蝇S2细胞（培养方法见1.2.2节）中加入LPS或PG，孵育S2细胞1 h，从而激活S2细胞；激活后的S2细胞以1×109个·L-1在6孔板中铺开，分别接种pHrodo标记的灭活病原菌（5×109个·L-1），28 ℃共孵育1 h。收集混合细胞，立刻在共聚焦显微镜下观察。分别统计不同处理组中，吞入pHrodo标记病原菌的S2细胞在全部细胞中所占百分比[18]。不同处理组间的差异以t检验进行统计学分析，P < 0.05为显著。
1.2.5 实时荧光定量PCR检测
果蝇S2细胞经过不同实验处理后，以PBS清洗，收集细胞，使用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取总RNA，操作步骤依据产品使用说明书[18]。即刻使用5.0 μg总核糖核酸，以M-MLV反转录酶（Takara，日本）合成为20.0 μL cDNA。实时荧光定量的检测采用基因特异引物与TaqMan探针（表 1），反应体系包括10.0 μL Premix Ex Taq（Takara，日本），1.0 μL cDNA样品，7.2 μL无酶水，各基因对应TaqMan探针0.3 μL，以及各特异性引物0.4 μL。聚合酶链式反应（PCR）程序如下：95 ℃，30 s；90 ℃，5 s，60 ℃，30 s，循环50次。数据分析使用iQTM5软件。
表 1 实时荧光定量PCR反应中引物与TaqMan探针序列Table 1 Primers and TaqMan probe sequences in qRT-PCR寡核苷酸探针 引物与探针序列 RP49-F 5'-CCGCTTCAAGGGACAGTATCTG-3' RP49-R 5'-CACGTTGTGCACCAGGAACTT-3' Rp49-探针 FAM-GGCAGCATGTGGCGGGTGCGCTT-Edipse Rel-F 5'-GCCAGAAAAACCCGTGAGTC-3' Rel-R 5'-AGGTACTTCCCCGATGTTCG-3' Rel-探针 FAM-CGACGTGGCCGCCGCAGA-Edipse Def-F 5'-CCACATGCGACCTACTCTCCA-3' Def-R 5'-AGCCGCCTTTGAACCCCT-3' Def-探针 FAM-ACCACACCGCCTGCGCCG-Eclipse Drs-F 5'-CTGGTGGTCCTGGGAGCC-3' Drs-R 5, -AGCGTCCCTCCTCCTTGC-3' Drs-探针 FAM-CCGATGCCGACTGCCTGTCC-Eclipse 1.2.6 统计学分析
本研究中每组试验均使用3个生物学重复。统计学显著性分析使用t检验，判断对照组与实验组的差异性，P < 0.05为显著，P < 0.01为极显著。
2. 结果与分析
2.1 透射电镜观察黑腹果蝇S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用
透射电镜下观察黑腹果蝇S2细胞对灭活大肠杆菌（HIEC）或灭活金黄葡萄球菌（HISA）的吞噬过程，发现孵育1 h后S2细胞即可顺利吞噬HIEC（图 1A），孵育后第1天S2细胞内HIEC已消失（图 1B）；但共孵育1 h后S2细胞未能吞噬HISA（图 1C），HISA（图 2A）与S2细胞共孵育4 d，仍保持形态完整（图 1D，图 2B，图 2C，图 2D，图 2E）。在PG或LPS激活后，S2细胞也不能有效地吞噬HISA（图 2F，图 2G，图 2H）。与健康的S2细胞相比，在接种后第4天，S2细胞吞入的HISA依然形态完整（图 2E，图 2F，图 2G，图 2H）；吞入HISA的S2细胞没有出现凋亡或破裂，表明细胞内的HISA并没有对S2细胞造成明显的损伤。
图 1 透射电镜观察黑腹果蝇S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用Figure 1 Transmission electron microscopy of phagocytosis of HIEC or HISA by S2 cells
图 2 透射电镜观察黑腹果蝇S2细胞对HISA的吞噬作用Figure 2 Transmission electron microscopy of phagocytosis of HISA by S2 cells2.2 激光共聚焦显微观察黑腹果蝇S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用
激光共聚焦显微观察发现，在S2细胞吞噬热灭活大肠杆菌HIEC 1 h后，胞内可观察到HIEC发出的绿色荧光（图 3A）；吞噬发生1 d后，S2细胞内观察不到绿色荧光粒子（图 3B）；表明HIEC已经被S2细胞清除。同样处理下，热灭活金黄葡萄球菌HISA没有被S2细胞清除。由图 3C和图 3D可知，HISA被吞噬后，被S2细胞内化到细胞内继续存在。由此可知，在S2细胞接种灭活菌后，HIEC与HISA均被S2细胞吞入，但HIEC被S2细胞清除，而HISA则没有被清除。
图 3 激光共聚焦显微镜观察黑腹果蝇S2细胞对FITC标记的HIEC或HISA的吞噬作用Figure 3 Confocal microscopy of phagocytosis of FITC-labeled HIEC or HISA by S2 cells2.3 流式细胞仪检测S2细胞对HIEC或HISA的吞噬作用
流式细胞仪的检测结果由图 4可知：接种1 h后，吞入了至少1个HIEC粒子的S2细胞在所有S2细胞中所占的比例接近40%，与S2细胞吞噬大肠埃希菌的结果相近；吞入至少1个HISA粒子的S2细胞在所有S2细胞中所占的比例接近25%，与S2细胞吞噬金黄葡萄球菌的结果相近。说明S2细胞吞入活细菌和热灭活细菌的敏感度并没有显著差异。
图 4 孵育1 h后黑腹果蝇S2细胞对FITC标记的病原菌的吞噬率Figure 4 Quantification of phagocytosis of FITC-labeled microbes by S2 cells at 1 h post-inoculation2.4 吞噬溶酶体酸化观察和吞噬率检测结果
细胞内的酸性环境可诱导pHrodo标记的病原菌激发出红色荧光，从而指示吞噬溶酶体的形成。激光共聚焦显微镜观察发现，接种HIEC 1 h后，S2细胞内可观察到红色荧光，表明S2细胞对HIEC的消化程序被激活，细胞内形成了酸性环境（图 5A）；图 5B中未能观察到红色荧光，表明HISA未能激活S2细胞的酸化过程。使用LPS或PG激活S2细胞，再进行接种观察，可发现在接种HISA 1 h后，未能观察到红色荧光，说明S2细胞的酸化过程仍未被激活。
图 5 激光共聚焦显微观察孵育1 h后黑腹果蝇S2细胞对pHrodo标记的HIEC及HISA的呑噬作用Figure 5 Confocal microscopy of phagocytosis of pHrodo-labeled HIEC or HISA by S2 cells at 1 h post-inoculation为揭示LPS或PG的刺激对S2细胞吞噬活性的影响，用共聚焦显微镜观察S2细胞吞噬pHrodo标记菌并统计吞噬率。结果表明：共孵育1 h后，只有接种HIEC的S2细胞内呈现酸性环境，其他的处理均不能诱导S2细胞酸化（图 6）。检测吞噬百分比发现，只有HIEC处理组的吞噬率显著高于对照组（P < 0.01）。使用LPS或PG激活S2细胞后再接种，S2细胞对HISA的吞噬率仍没有显著增加。这表明溶酶体酸化过程只发生在S2细胞吞噬HIEC的过程中，而LPS或PG刺激并不能诱导S2细胞吞噬HISA后的酸化过程（图 6）。
图 6 共孵育1 h后S2细胞对pHrodo标记的HIEC及HISA的吞噬率Figure 6 Phagocytic percentages of the pHrodo-labeled HIEC or HISA2.5 实时荧光定量PCR检测基因表达
实时荧光定量PCR反应中引物与TaqMan探针序列如表 1所示。通过实时荧光定量PCR检测不同处理条件下S2细胞内的防御素（defensin），抗真菌肽（drosomycin）和Relish的表达量变化。结果发现：防御素的表达量在HISA，HISA+LPS和HISA+PG等3个处理组中，均发生显著上调（P < 0.01）；抗真菌肽的表达量仅在HISA+PG处理组中发生显著上调（P < 0.01）（图 7）；Relish的表达量在HIEC处理组中发生显著上调（P < 0.01），但在HISA处理组中无显著变化。
图 7 黑腹果蝇S2细胞呑噬HISA作用中防御素，抗真菌肽及Relish的表达谱Figure 7 Expression profiles of drosomycin, defensin and relish in phagocytosis of HISA3. 讨论与结论
吞噬作用是动物对抗微生物病原体的一种重要免疫防御机制，由吞噬细胞来执行具体的功能[19-20]。本研究对黑腹果蝇S2细胞吞噬热灭活大肠埃希菌（HIEC）和金黄葡萄球菌（HISA）的异同进行了研究。结果表明：S2细胞能够在接种后1 d有效吞噬并清除HIEC，但却无法清除HISA；即使到了接种后4 d，S2细胞仍不能有效地清除HISA，而是任由它存在于细胞内。经PG或LPS诱导激活的S2细胞同样不能有效地清除HISA。与健康的S2细胞相比，存在于细胞内的HISA在接种4 d后并没有明显破坏S2细胞。许多研究证明在细胞培养模式下，金黄葡萄球菌能够逃逸宿主细胞的免疫系统，具有隐藏的潜能[21]，可在胞内坚持存活一段时间[22-23]。在本研究中，热灭活金黄葡萄球菌存在于S2细胞中达4 d以上，说明灭活后的金黄葡萄球菌仍存在抗吞噬的成分，这与金黄葡萄球菌存在多个抗吞噬因子有关[24-26]。统计细胞吞噬率发现，热灭活并不会影响吞噬作用对灭活细菌的敏感性，这一点已被另一项研究所证实[11]。
在消化进程中，吞噬溶酶体的pH值降低，细胞内环境酸化，可帮助吞噬作用的进行，并能够通过pHrodo染料的使用进行检测[27]。LPS是革兰氏阴性菌的主要的细胞膜成分，可以通过Imd（immune deficiency）免疫信号通路激活巨噬细胞；PG是革兰氏阳性菌细胞壁上的主要成分，可以通过Toll信号通路激活巨噬细胞。使用LPS或PG刺激接种HISA的S2细胞，细胞并未形成酸化环境。通过透射电镜与激光共聚焦显微镜的观察，明确了即使S2细胞经过LPS或PG的激活也不能有效地吞噬HISA的结果；检测S2细胞对pHrodo标记的病原菌的吞噬百分比也表明，吞噬溶酶体的酸化只发生在S2细胞对HIEC的吞噬过程中，其他处理并不能引起S2细胞的酸化。
黑腹果蝇S2细胞的吞噬作用中包括了Toll与Imd等2条信号通路，其中Toll通路参与到抗革兰氏阳性菌的免疫作用中，该免疫应答机制中包含Defensin基因[28-29]的表达，而已知的防御素（defensin）是一类由小胱甘酸富集而成，可被诱导的抗微生物肽，有利于宿主对真菌的防御应答[30]；Drosomycin基因表达的Drosomycin是一类可诱导的抗真菌肽，同样由Toll通路调节，并在全身脂肪体中均有表达[31-32]。观察发现防御素的表达量在HISA，HISA+LPS以及HISA+PG处理中，均发生显著上调；抗真菌肽的表达量在HISA+PG处理中显著上调；由此可以推断，Toll通路在HISA+PG的刺激下被激活。但是也看到PG虽然能激活S2细胞的Toll通路，但却无法有效清除HISA，同样，胞内的HISA也不会诱导S2细胞凋亡。由此可知，金黄葡萄球菌作为一种人类病原体，对黑腹果蝇来说也是高致病的病原，与其他革兰氏阳性菌相比，它表现出了更强的对防御素的抵御能力[36]。在黑腹果蝇中，Imd通路调节着对革兰氏阴性菌的免疫应答，Relish作为NF-κB通路的转录因子，是Imd通路的终极目标[28]。本研究结果发现：Relish在HIEC处理中显著上调（P < 0.01），说明Imd通路在HIEC处理中被激活，而激活的Imd通路最终诱导S2细胞吞噬HIEC，说明Relish的表达量与S2细胞吞噬HIEC的百分率呈正相关。
有研究表明：金黄葡萄球菌能够迅速地逃避溶酶体/吞噬体的捕获，在细胞液泡内存活可长达4 d，之后逃入细胞质中[16, 37-38]。有趣的是，我们发现灭活金黄葡萄球菌同样能够在S2细胞内存活4 d，其细胞表面物质具有抗吞噬消化的活性。该结果同时暗示着无脊椎动物吞噬细胞对清除部分革兰氏阴性及革兰氏阳性菌均有所帮助，但细胞免疫对这些胞内细菌的清除效力胜于体液免疫。
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图 2 水田和改旱土壤剖面有机碳分布
Figure 2 Distribution of organic carbon in the profiles of paddy and upland soils
图 3 土壤有机碳损失量与地下水位下降深度关系
Figure 3 Relationship between the loss of organic carbon and the decline of the depth of groundwater level
表 1 土壤样品基本信息
Table 1. Basic information of soil samples
序列类型 采样地点 剖面号 旱作年限/a 纬度(N) 经度(E) 利用方式 经济作物 潜育 嘉兴市南湖区大桥镇江南村 QYP1 0 30°44′50″ 120°51′47″ 水田 水稻 QYP2 7 30°44′52″ 120°52′09″ 果园 葡萄 QYP3 15 30°45′01″ 120°51′56″ 铁渗 绍兴市柯桥区福全镇赵家畈村 TSP1 0 29°58′27″ 120°30′02″ 水田 水稻 TSP2 12 29°58′28″ 120°30′01″ 林地 樟树 TSP3 19 29°58′27″ 120°30′00″ 铁聚 杭州市余杭区瓶窑镇窑北村 TJP1 0 30°24′27″ 119°56′24″ 水田 水稻 TJP2 8 30°24′26″ 119°56′23″ 果园 桃 TJP3 20 30°24′24″ 119°56′18″ 简育 杭州市萧山区新塘街道霞江村 JYP1 0 30°08′43″ 120°19′26″ 水田 水稻 JYP2 8 30°08′42″ 120°19′22″ 林地 樟树 JYP3 15 30°08′30″ 120°19′26″ 说明：葡萄Vitis vinifera，樟树Cinnamomum camphora，桃Amygdalus persica 
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表 2 土壤剖面样品基本性质
Table 2. Basic properties of soil profile samples
剖面号 发生层深度/cm 田间含水率/% 容重/(g·cm−3) pH 剖面号 发生层深度/cm 田间含水率/% 容重/(g·cm−3) pH QYP1 0~14 47.12 1.08 6.36 TSP1 0~12 59.20 0.95 5.57 14~30 37.03 1.34 7.13 12~25 56.89 1.07 5.78 30~100 38.61 1.39 7.74 25~47 29.78 1.50 7.37 47~88 31.36 1.42 7.40 88~100 32.24 1.37 6.05 QYP2 0~14 33.51 1.30 6.08 TSP2 0~12 38.87 1.18 5.09 14~30 31.78 1.35 7.10 12~25 43.91 1.20 6.32 30~100 31.43 1.43 7.59 25~47 25.13 1.53 7.50 47~88 28.65 1.41 7.39 88~100 32.20 1.37 6.30 QYP3 0~14 32.32 1.32 5.67 TSP3 0~12 34.78 1.27 4.55 14~30 34.39 1.40 6.33 12~25 35.47 1.29 6.32 30~100 35.23 1.45 7.50 25~47 25.91 1.55 7.34 47~88 32.77 1.40 7.47 88~100 32.04 1.37 6.11 TJP1 0~17 46.57 0.99 5.82 JYP1 0~12 54.40 0.96 6.51 17~30 29.92 1.53 5.71 12~22 27.23 1.26 6.54 30~65 25.80 1.60 6.71 22~67 19.03 1.55 7.97 65~85 29.76 1.58 7.00 67~100 21.20 1.48 8.30 85~100 32.07 1.60 6.97 TJP2 0~17 28.48 1.25 5.63 JYP2 0~12 26.43 1.18 6.08 17~30 29.25 1.58 5.45 12~22 23.44 1.36 6.42 30~65 27.86 1.61 6.66 22~67 21.82 1.58 7.89 65~85 28.67 1.64 6.79 67~100 20.53 1.49 8.26 85~100 29.19 1.61 6.76 TJP3 0~17 26.90 1.28 5.12 JYP3 0~12 23.58 1.29 4.72 17~30 28.36 1.63 5.05 12~22 22.01 1.42 5.75 30~65 21.32 1.64 5.85 22~67 19.09 1.60 7.88 65~85 28.67 1.66 6.34 67~100 23.58 1.48 8.20 85~100 29.19 1.62 6.88 说明：QY、TS、TJ和JY分别代表潜育、铁渗、铁聚和简育水耕人为土。P1为水田土壤，P2为短期旱作土壤，P3为长期旱作土壤
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表 3 水田及改旱土壤施肥量的差异
Table 3. Differences of fertilization between paddy and upland soils
土壤类型 利用方式 施肥量/(kg·hm−2) 尿素 过磷酸钙 氯化钾 复合肥 鸡粪 蓖麻饼 生石灰 QY 水田 180~300 375~525 150~225 150~300 − − − 果园 525~675 1050~1 200 450~675 1050~1 350 30 000~45 000 6 000~10 500 450~600 TS 水田 180~300 375~525 150~225 150~300 − − − 林地 150~300 525~675 150~225 675~825 12 000~18 000 − − TJ 水田 180~300 375~525 150~225 150~300 − − − 果园 270~375 900~1 050 375~525 900~1 200 19 500~27 000 − − JY 水田 300~525 600~825 300~375 300~525 − − − 林地 375~525 750~900 375~525 900~1 200 27 000~37 500 − − 说明：−表示无施肥。QY、TS、TJ和JY分别代表潜育、铁渗、铁聚和简育水耕人为土
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表 4 土壤剖面有机碳密度及其年损失率
Table 4. Content and loss rate of soil organic carbon of profile samples
土壤类型 水田土壤有机
碳密度/(t·hm−2)短期旱地 长期旱地 有机碳密度/
(t·hm−2)损失量/
(t·hm−2)年损失率/
(t·hm−2·a−1)有机碳密度/
(t·hm−2)损失量/
(t·hm−2)年损失率/
(t·hm−2·a−1)QY 222.17 200.97 21.20 3.03 191.29 30.88 2.06 TS 158.75 118.75 40.00 3.33 103.32 55.43 2.92 TJ 120.46 111.80 8.66 1.08 97.66 22.80 1.14 JY 96.57 80.83 15.74 1.97 73.50 23.07 1.54 说明：QY、TS、TJ和JY分别代表潜育、铁渗、铁聚和简育水耕人为土
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[1] 潘根兴, 李恋卿, 张旭辉, 等. 中国土壤有机碳库量与农业土壤碳固定动态的若干问题[J]. 地球科学进展, 2003, 18(4): 609 − 618. PAN Genxing, LI Lianqing, ZHANG Xuhui, et al. Soil organic carbon storage of China and the sequestration dynamics in agricultural lands [J]. Adv Earth Sci, 2003, 18(4): 609 − 618. [2] 张国盛, 黄高宝, YIN Chan. 农田土壤有机碳固定潜力研究进展[J]. 生态学报, 2005, 25(2): 351 − 357. ZHANG Guosheng, HUANG Gaobao, YIN Chan. Soil organic carbon sequestration potential in cropland [J]. Acta Ecol Sin, 2005, 25(2): 351 − 357. [3] 毛艳玲, 杨玉盛, 邹双全, 等. 土地利用变化对亚热带山地红壤团聚体有机碳的影响[J]. 山地学报, 2007, 25(6): 706 − 713. MAO Yanling, YANG Yusheng, ZOU Shuangquan, et al. Effects of land use on soil organic carbon in aggregates of hilly red soil in subtropical China [J]. J Mt Sci, 2007, 25(6): 706 − 713. [4] 邓万刚, 吴蔚东, 陈明智, 等. 土地利用方式及母质对土壤有机碳的影响[J]. 生态环境, 2008, 17(3): 1130 − 1134. DENG Wangang, WU Weidong, CHEN Mingzhi, et al. Effects of land use change and soil parent material on soil organic carbon [J]. Ecol Environ, 2008, 17(3): 1130 − 1134. [5] 张婷, 蔡海生, 王晓明. 土地利用变化的碳排放机理及效应研究综述[J]. 江西师范大学学报(自然科学版), 2013, 37(1): 93 − 100. ZHANG Ting, CAI Haisheng, WANG Xiaoming. Summarization of the effects of land use changes on carbon emission [J]. J Jiangxi Norm Univ Nat Sci Ed, 2013, 37(1): 93 − 100. [6] GORHAM E. Northern peatlands: role in the carbon cycle and prob-able responses to climatic warming [J]. Ecol Appl, 1991, 1(2): 182 − 195. [7] BRIX H, SORRELL B K, LORENZEN B. Are Phragmites-dominated wetlands a net source or net sink of greenhouse gases? [J]. Aquatic Bot, 2001, 69(2/4): 313 − 324. [8] 赵明松, 李德成, 张甘霖, 等. 1980—2010年安徽省土壤有机碳密度及储量时空变化分析[J]. 地理研究, 2018, 37(11): 84 − 95. ZHAO Mingsong, LI Decheng, ZHANG Ganlin, et al. Spatial-temporal change of soil organic carbon density and storage in Anhui Province from 1980 to 2010 [J]. Geogr Res, 2018, 37(11): 84 − 95. [9] 中国科学院南京土壤研究所土壤分类课题组, 中国土壤系统分类课题研究协作组. 中国土壤系统分类检索[M]. 3版. 合肥: 中国科学技术大学出版社, 2001: 22 − 191. Soil Classification Research Group of Nanjing Institute of Soil Research, Chinese Academy of Sciences, China Research Collaborative Group on Soil System Classification. Soil System Classification Search in China [M]. 3rd ed. Hefei: Chinese Science and Technology University Press, 2001: 22 − 191. [10] 鲁如坤. 土壤农业化学分析方法[M]. 北京: 中国农业科技出版社, 2000. LU Rukun. Analysis Methods of Soil Agricultural Chemistry [M]. Beijing: China Agricultural Science Press, 2000. [11] 单正军, 蔡道基, 任阵海. 土壤有机质矿化与温室气体释放初探[J]. 环境科学学报, 1996, 16(2): 150 − 154. SHAN ZhengJun, CAI Daoji, REN Zhenhai. A preliminary assessment of CO2, CH4 and N2O emission from soils in China [J]. Acta Sci Circumst, 1996, 16(2): 150 − 154. [12] OECHEL W C, VOURLITIS G L, HASTINGS S J, et al. The effect of water table manipulation and elevated temperature on the net CO2 flux of wet sedge tundra ecosystem [J]. Glob Change Biol, 1998, 4(1): 77 − 90. [13] ALM J, SCHULMAN L, WALDEN J, et al. Carbon balance of a Boreal Bog during a year with an exceptionally dry summer [J]. Ecology, 1999, 80(1): 161 − 174. [14] 张文菊, 彭佩钦, 童成立, 等. 洞庭湖湿地有机碳垂直分布与组成特征[J]. 环境科学, 2005, 26(3): 56 − 60. ZHANG Wenju, PENG Peiqin, TONG Chengli, et al. Characteristics of distribution and composition of organic carbon in Dongting Lake Floodplain [J]. Environ Sci, 2005, 26(3): 56 − 60. [15] 李志鹏, 潘根兴, 张旭辉. 改种玉米连续3年后稻田土壤有机碳分布和13C自然丰度变化[J]. 土壤学报, 2007, 44(2): 244 − 251. LI Zhipeng, PAN Genxing, ZHANG Xuhui. Topsoil organic carbon pool and 13C natural abundance changes from a paddy after 3 years corn cultivation [J]. Acta Pedol Sin, 2007, 44(2): 244 − 251. [16] NISHIMURA S, YONEMURA S, SAWAMOTO T, et al. Effect of land use change from paddy rice cultivation to upland crop cultivation on soil carbon budget of a cropland in Japan [J]. Agric Ecosyst Environ, 2008, 125(1/4): 9 − 20. -
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20210607
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