下载:
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土地利用是城市发展规划及资源开发利用的关键信息，同时也是区域土地利用变化研究的重要基础[1]。然而高原山区的遥感影像自动分类相比其他地形区而言，传统的遥感分类方法在分类精度上受各方面因素影响，难以满足研究需求[2]。传统的监督分类方法和非监督分类方法，是基于像元的数理统计法，地物分类时考虑的主要为像元的光谱信息，对遥感影像的形状、纹理及空间关系等利用不够充分[3]，容易发生“同物异谱”和“同谱异物”。近年来，国内外许多学者尝试利用不同类型遥感影像来提高土地利用分类精度，在遥感影像的使用上多以Landsat和Modis系列的中低分辨率数据为主，分类精度经常受到影像空间分辨率的限制，在地物破碎的区域提取草地、水塘和小规模村庄等时存在较大的局限性[4]。近年来采用高分辨率卫星作为实验数据的分类研究逐年增多[5-7]，高分辨率影像可利用清晰的地物几何特征和纹理等信息，具有覆盖范围大、重访周期短、定量化探测等优点，但影像成本较高，获取难度较大[8]。哨兵二号遥感卫星最高的空间分辨率可达10 m，与传统遥感数据相比，Sentinel-2A遥感数据新增加的4个红边波段与叶绿素含量关系紧密[9]。在地物提取分类研究领域中，近年来有众多学者运用红边波段进行湿地提取[10]、作物识别[11]、地物类型划分[12]等方面的研究，均取得了较好的效果。随着计算机和3S技术的发展，遥感研究的逐渐深入，新的分类方法不断涌现，如多重滤波[13]、面向对象分类法[14]、模糊分类法[15]、随机森林分类法[16]、神经网络法[17]等。尽管这些分类方法在不同程度上均提高了分类精度，然而在分类结果中依然存在着或多或少的“椒盐效应”[18]。本研究以云南省大理市为研究区域，以Sentinel-2A遥感影像为数据源，提出一种面向对象特征与决策树规则相结合的分类方法，依靠多维遥感信息复合技术，充分利用地物的光谱特征[19]、几何结构和纹理等提高遥感影像在大理市不同土地利用类型的区分效果，可探索提高高原山区分类精度的有效途径。
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云南省大理市地处云贵高原，大理州中部，25°25′~25°58′N，99°58′~100°27′E，总面积为1 815 km2，基础海拔1 000 m以上，地面起伏较大，地形以山地为主，其中山地面积为1 278.8 km2，山区、半山区面积达70.5%。总体特征是西北高，东南低，四周高，中间低。研究区地处盆地，中部是洱海，被四周的高山环抱，西部是苍山，东侧为马尾山，四周山坡均朝向洱海。
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本研究使用的Sentinel-2数据源通过欧空局的哥白尼数据中心下载，辅助数据包括2.5 m天地图影像数据和从地理空间数据云获取的大理市行政边界矢量数据。利用欧洲航天局(ESA)官方提供的SNAP软件和sen2cor插件对下载的原始影像进行大气校正，得到L2A级数据，采用最近邻插值法将波段重采样为10 m分辨率，基于ENVI软件对其进行几何校正。因高原山区云雾较多，为降低影像云覆盖对分类精度影响，将2020年1月1日至12月31日大理市Sentinel-2A影像最小云量进行年度多时相合成，通过大理市行政边界矢量数据对遥感影像数据进行裁剪。
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土地利用分类标准在参照GB/T 21010—2017《土地利用现状分类标准》[20]的基础上结合高原山区各方面特征，将研究区分为七大类，选出准确可靠的7个类型样本，进行样本间的分离度计算，计算结果如表1所示。
表 1 各种类型地物样本组合的Jeffries-Matusita距离
Table 1. Jeffries Matusita distance of various types of feature sample combinations
土地利用类型 分离度 土地利用类型 分离度 林地-农田 1.953 农田-其他 1.994 林地-水体 2.000 水体-草地 1.993 林地-草地 1.895 水体-建设用地 2.000 林地-建设用地 1.998 水体-冰川积雪 1.998 林地-冰川积雪 1.995 水体-其他 1.996 林地-其他 1.994 草地-建设用地 1.996 农田-水体 1.983 草地-冰川积雪 1.997 农田-草地 1.894 草地-其他 1.996 农田-建设用地 1.993 建设用地-冰川积雪 1.992 农田-冰川积雪 1.993 建设用地-其他 1.983 冰川积雪-其他 1.990 -
为能充分利用基于像素和面向对象分类方法优势，组合方法已被广泛应用于土地利用分类领域[21]。QUEST决策树从运算速度和分类精度方面均衡考量，优于其他决策树方法[22]。利用面向对象特征的遥感分类方法，可结合研究对象的光谱、形状、纹理、空间关系等不同属性信息，将相同性质的像元组成为基本处理单元“对象”完成分类[23]。对研究区各地物类型的光谱特征、纹理特征和几何特征分析后，以第3绿光波段、第8近红外波段、第4红波段和第11短波红外为特征波段，再提取农田、草地、冰川积雪和其他等4个不同类别地类的面向对象特征，根据各特征建立分类规则进行建模。构建面向对象特征与QUEST决策树相结合的分类模型，如图1所示。
图 1 分类模型流程图
Figure 1. Flow chart of classification model
①水体区域提取。基于研究区实地情况，本研究采取归一化差异水体指数(NDWI)方法[24]将研究区水体部分划分出来。根据对样本数据的初步分析以及人工判读，先将QUEST决策树分类条件设置为NDWI＞0.4125。②植被区域提取。因为Sentinel-2数据的优势是在红边范围含有3个波段的数据，且研究区是典型的高原山区，全域植被覆盖率较高，所以归一化植被指数(NDVI)能从影像中更加有效地提取植被区域[25]。以此为基础将决策树分类条件设置为NDVI＞0.312 5，可将植被区域与非植被区域分离开，且不与水体区域混淆。再通过设置NDVI指数范围阙值，进一步将植被中的农田、草地分类条件设置为0.312 5＜NDVI＜0.654 3，林地则设置为0.654 3＜NDVI＜1.000 0。③非植被区域提取。将研究区的水体和植被两大类提取成功后，其余部分则为非植被区域。为了进一步将建筑用地从非植被区域提取出来，在前几步的基础上又计算了归一化建筑指数(NDBI)，并将QUEST决策树分类条件设置为NDBI＞0，发现此时可将研究区大部分建设用地从非植被区域提取出来。
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面向对象可充分利用各对象的各类特征信息，本研究使用了面向对象的光谱特征、几何特征和纹理特征，其定义如表2所示。
表 2 面向对象特征定义表
Table 2. Object oriented feature definition
类别 特征 定义和公式 光谱特征 光谱均值 斑块内像素光谱均值 纹理特征 纹理特征 灰度共生矩阵(GLCM，包括5×5卷积模板内的均值、方差、同质性、熵值、对比度、二阶矩、相关性) 几何特征 面积 斑块总面积 延伸率 最大直径与最小直径比值 矩形形状参数 矩形形状度量值(Rect)=面积/(最大直径×最小直径) 本研究采用多尺度分割算法进行影像分割，共设置了一个分割层次，主要目的是将农田与草地、冰川积雪与其他进行区分。在确保影像分类精度的前提下进行多次实验，最终结果表明：分割尺度设置为30较为适宜，此时，各个分类对象均有较好的可分离性，且各个对象内部的同质性较高。再根据相邻对象的纹理特征和内部一致性确定归并尺度，对分割好的原始影像进行迭代归并，进一步完成相邻同类对象的归并。经多次实验，确定的归并尺度为65最为适宜。①草地与农田的面向对象特征。草地与农田相比，具有规则的几何形状，同时，草地与农田的光谱均值也有一定差异。所以，可将农田的对象筛选条件设置为：面积＞3 000 m2，矩形形状参数＞0.3，光谱均值＞3 000 nm，余下不满足设定的农田筛选条件的地区为草地。②冰川积雪与其他的面向对象特征。其他用地类型延伸率较小且形状不规则，光谱均值也有较大差异，而冰川积雪大都分布于苍山高海拔地区，且连续性高，面积较大。所以为将两者区分开来，设定其他用地的筛选条件为：延伸率＜3.5，1 210 nm＜光谱均值(第4波段)＜1 360 nm，1 225 nm＜光谱均值(第3波段)＜1 335 nm，1 400 nm＜光谱均值(第2波段)＜1 465 nm ，符合该条件的区域可判定为其他用地，余下不满足设定条件的则为冰川积雪。
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本研究还运用了最大似然分类法、ISODATA法与面向对象特征决策树法进行比较。ISODATA法分类与最大似然法均未引入面向对象特征，ISODATA法使用ENVI 5.3软件，选择IsoData分类器，预设22个类别和最大迭代次数为10进行分类计算，最后通过目视识别分类结果合并为本研究的7个类别。最大似然法基于ENVI 5.3软件使用ROIS方法定义7类训练样本进行分类。面向对象特征决策树分类使用IDL8.5结合ENVI 5.3编程实现。
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为了检验研究区影像分类解译结果的可信度，通过野外调查和2.5 m精度的天地图相结合的方式目视判读检验研究区各个样本点的真实土地利用类别，采用误差矩阵方法进行检验。在研究区内利用ArcGIS软件随机生成500个检验样本点，各地类验证点个数如表3所示。
表 3 各地类验证点个数
Table 3. Number of verification points of each class
土地利用类型 天地图验证点个数 野外调查验证点个数 水体 94 5 林地 68 58 建设用地 54 6 农田 67 18 草地 89 8 冰川积雪 13 0 其他 16 4 -
将3个分类结果与同期高分辨率天地图影像进行叠加对比(图2)：ISODATA法相比前2种方法虽然显示结果较差，但具有明显特征的地物基本都能被识别出来，冰川积雪与建筑用地因光谱特征类似，从而产生了部分混淆。最大似然分类和面向对象决策树分类得到的研究区地物分布与天地图影像显示结果基本一致。但是，由于高原山区草地和部分农田分布较为破碎，且研究区地表植被覆盖度较高，所以利用最大似然方法提取的某些林地、草地和面积较小的农田会产生部分混淆。而面向对象决策树分类由于构建特征指数将不同地物差异放大，且引入了面向对象特征，更有利于决策规则的制定，所以提取的结果在空间表现上相比与其他分类方法更合理。
图 2 基于不同分类方法得到的大理市2020年土地利用类型示意图
Figure 2. Land use type map of Dali City in 2020 based on different classification methods
对3种土地利用分类方法各地类的面积进行统计，并与欧空局公布的2020年10 m分辨率土地利用数据进行验证对比。结果如图3所示：面向对象特征的决策树法提取的研究区内林地面积最大，其次是农田、草地、水体、建设用地和冰川积雪，面积最小的为其他用地：3种分类方法中此方法结果与研究区的实际情况最为符合。 ISODATA法基于机器学习，在地物分布较为破碎的区域，机器学习的效果会受样本中噪声的影响，产生过拟合现象。最大似然法是基于统计分析的原理，可减轻样本中噪声的影响，提取结果在空间分布上也更为合理。面向对象特征的决策树法以对象为处理单元，充分利用研究对象的光谱、形状、纹理、空间关系等不同属性信息，所以提取的结果与实际情况最为接近。
图 3 各类地物面积统计
Figure 3. Area statistics of various features
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为进一步比较不同方法下各类地物的提取差异，采用2.5 m天地图的500个样点结合野外调查对3种方法的分类结果进行验证，利用误差矩阵分析得到的分类结果进行精度评价，结果如表4所示。从制图精度角度看，ISODATA法制图精度由高到低依次是其他、建设用地、水体、林地、农田、冰川积雪和草地，其中精度最高的其他为89.37%，最低的草地仅为58.00%。对于用户精度，ISODATA法的水体用户精度最高，为97.44%。余下的地类用户精度由高到低分别为林地、其他、冰川积雪、草地、建设用地和农田。从以上2个精度对比来看，林地和水体的分类精度最高，建设用地、草地、冰川积雪和其他分类精度也较高，农田分类精度较低。分析认为，由于水体的光谱特性相对单一，误分状况较少。而林地、农田和草地三者误分与互相之间光谱特性重合有较大关系。建设用地的误分区域主要分布在洱海周边和建成区周围的裸地，因裸地和房屋具有相似的高反射特性，主要误分为建设用地和草地，草地和冰川积雪误分为建设用地由光谱特性相近导致。
表 4 ISODATA法遥感解译误差矩阵
Table 4. ISODATA remote sensing interpretation error matrix
土地利用类型 林地 建设用地 农田 水体 草地 其他 冰川积雪 参考样本数 用户精度/％ 林地 93 0 3 0 4 0 0 100 93.00 建设用地 0 67 0 7 5 5 3 87 77.01 农田 16 2 47 0 2 1 7 75 62.67 水体 0 0 0 76 2 0 0 78 97.44 草地 3 0 0 3 29 2 0 37 78.38 其他 0 4 2 0 8 71 0 85 83.53 冰川积雪 0 2 6 0 0 0 30 38 78.95 分类样本数 112 75 58 86 50 79 40 500 制图精度/％ 83.04 89.33 81.03 88.37 58.00 89.37 75.00 由表5可得：基于最大似然法的水体制图精度最高，为94.79%，余下6个地类制图精度由高到低分别为林地、草地、其他、农田、冰川积雪和建设用地。用户精度最高的地类是水体，为100.00%，其他地类用户精度由高到低分别是林地、建设用地、草地、农田、其他和冰川积雪。冰川积雪精度最低，仅为66.67%。通过分析认为，水体的光谱特性较为单一，极少出现误分。充分利用不同类型的光谱表现特征和周边地理环境，所以林地和农田区分度较好，但和草地仍有部分混淆。部分建设用地位于山区，受周边地理环境影响较大，加之城区建设用地光谱特征较为复杂。农田误分主要是误分为林地、草地和建设用地，由于前三者均属于绿色植被，在气温湿度均较好的情况下，选择样本时会经常造成3类间的误分。与建设用地的误分由于山区农田与建设用地交错分布，难以分辨。其他地类误分为建设用地由于两者具有相似的高反射特性，极易造成混淆。
表 5 最大似然法遥感解译误差矩阵
Table 5. Maximum likelihood remote sensing interpretation error matrix
土地利用类型 林地 建设用地 农田 水体 草地 其他 冰川积雪 参考样本数 用户精度/％ 林地 119 0 0 0 2 0 0 121 98.35 建设用地 3 51 2 5 1 2 0 64 79.69 农田 6 4 61 0 4 4 1 80 76.25 水体 0 0 0 91 0 0 0 91 100.00 草地 5 4 7 0 55 0 3 74 74.32 其他 0 14 2 0 0 36 0 52 69.23 冰川积雪 1 4 0 0 1 0 12 18 66.67 分类样本数 134 77 72 96 63 42 16 500 制图精度/％ 88.81 66.23 84.72 94.79 87.30 85.71 75.00 由表6可以看出：基于面向对象特征决策树法中的水体制图精度仍是最高，为93.94%，其他地类制图精度由高到低分别是林地、农田、草地、建设用地、其他和冰川积雪。冰川积雪虽然精度最低，但仍达76.92%。面向对象特征决策树法制图精度由高到低分别是水体、其他、林地、冰川积雪、草地、农田和建设用地，其中用户精度最高的水体为95.88%，最低的建设用地精度为83.61%。分析认为，误分情况主要是由于决策树粗分类时3个指数的参数设置原因。农田和草地之间的部分误分也与面向对象特征参数设置有关，此方法分类中冰川积雪和其他2个地类无错分现象，由此看出面向对象特征参数设置较为适合。
表 6 面向对象特征决策树法遥感解译误差矩阵
Table 6. Remote sensing interpretation error matrix of object-oriented feature decision tree method
土地利用类型 林地 建设用地 农田 水体 草地 其他 冰川积雪 参考样本数 用户精度/％ 林地 118 0 2 0 5 0 0 125 94.40 建设用地 0 51 3 3 1 2 1 61 83.61 农田 4 2 76 0 4 1 2 89 85.39 水体 1 2 0 93 1 0 0 97 95.88 草地 3 3 4 3 86 0 0 99 86.87 其他 0 1 0 0 0 17 0 18 94.44 冰川积雪 0 1 0 0 0 0 10 11 90.91 分类样本数 126 60 85 99 97 20 13 500 制图精度/％ 93.65 85.00 89.41 93.94 88.66 85.00 76.92 以上精度分析可以看出，面向对象特征决策树法相比于其他方法在农田、草地、建设用地和其他这4类分类精度上有了显著提高，且在高原山区特有地类冰川积雪的信息提取上也有较好的适用性。而对于研究区水域和林地的提取来说，最大似然法的适用性更好。
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一般总体精度在80%以上可以认为精度良好，表7表明：3种分类方法分类精度良好。其中，ISODATA法总体分类精度最低，但也满足基本分类需求，总体分类精度为82.60%，Kappa系数为79.40%；其次是最大似然法，总体分类精度较ISODATA法略有提高，总体分类精度为85.00%，Kappa系数为81.90%，但最大似然法基于机器学习的提取方法也可能会带来过拟合效应，导致提取精度偏高；面向对象特征决策树分类方法精度最高，总体分类精度可达90.20%，Kappa系数为87.95%，说明此方法的分类结果与实际情况最为贴近，更加适用于高原山区土地利用分类。
表 7 3种分类方法比较
Table 7. Comparison of three classification methods
分类方法 总体分类精度/% Kappa系数/% ISODATA法分类 82.60 79.40 最大似然法分类 85.00 81.90 面向对象特征决策树法 90.20 87.95 -
本研究结果表明：①从地物空间分布上看，面向对象与决策树相结合的方法得到的最终分类结果与同期高分辨率天地图影像较为一致，表明与地物的实际分布情况更为接近。②从地类方法适用性角度来看，最大似然分类法在水域和林地的提取上适用性较好，面向对象特征决策树法在农田和草地、建设用地和其他这些光谱特征较为相似的地类区分度较好。在高原山地特有的地类冰川积雪提取上也表现出了极大的优越性。③从不同方法总体分类精度角度看，面向对象特征的决策树法在大理市的土地利用信息提取中效果最好，总体分类精度和Kappa系数分别为90.20%和87.95%，较传统的最大似然法和ISODATA法分类精度均有提升，可实现大理市土地利用的高精度提取。
本研究在进行大理市土地利用分类时，利用先粗分类再进一步细分类的思想，将面向对象特征与决策树规则相结合，粗分类先设计决策树分类规则，在决策树基础上进行类别的细分类，此方法可避免区域之间的混淆问题，反映了提高遥感影像分类精度的一个方法，具有良好的应用前景[26]。面向对象特征辅助决策树分类，其分类精度和准确性虽有提高，但与欧空局面积仍存在一定的出入，说明分类过程中仅提取面向对象特征辅助是不够的。因此，在今后的计算机分类过程中，需进一步加强遥感影像计算机自动解译的研究，充分利用地物形状、纹理、空间关系、空间位置等特征，对影像进行综合评判，提高影像的分类精度。
Applicability of land use classification method in Dali City based on Sentinel-2A image
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摘要:
目的 获取更高效、准确的土地利用自动分类方法，为后续的高原山区土地利用分类研究提供理论支撑。 方法 选取中国典型的高原山区云南省大理市为研究区域，以Sentinel-2A影像为对象，提出一种面向对象特征的决策树分类方法，并将此方法分类结果与传统的ISODATA法和最大似然法土地利用分类结果进行对比。 结果 ①面向对象特征的决策树方法分类结果在空间分布和各地类的面积统计方面都优于ISODATA法和最大似然法，与研究区实际土地利用面积数据更为接近；②在大理市，最大似然法在水体和林地的提取上适用性较好，而面向对象特征的决策树分类方法在农田、草地、建设用地和其他这些地类的区分上适用性更强，且在冰川积雪的提取上也有更好的提取效果；③相比与传统的ISODATA法和最大似然法分类结果精度，面向对象特征的决策树分类方法可进一步提高分类精度，总体分类精度可达90.20%，Kappa系数为87.95%。 结论 相较于传统的分类方法，先粗分类再进一步细分类的分类思想，可避免区域之间的混淆问题。面向对象特征与决策树相结合的组合分类方法在高原山区有着更好的适用性，可以有效提高高原山区分类精度。图3表7参26 -
关键词:
- Sentinel-2A影像 /
- 大理市 /
- 土地利用 /
- 遥感分类 /
- 适用性
Abstract:Objective The purpose of this study is to obtain more efficient and accurate automatic land use classification methods, so as to provide theoretical support for the follow-up study of land use classification in plateau mountainous areas. Method Taking Dali City, a typical plateau mountainous area of Yunnan Province in China, as the research area and Sentinel-2A image as the object, an object-oriented decision tree classification method was proposed and compared with traditional ISODATA classification method and maximum likelihood method. Result (1) The classification results of object-oriented decision tree method were better than those of ISODATA classification method and maximum likelihood classification method in terms of spatial distribution and area statistics of various classes, and were closer to the actual land use area data of the study area. (2) In Dali, the maximum likelihood classification method had better applicability in the extraction of water body and forest land, while the object-oriented decision tree classification method had stronger applicability in the extraction of farmland, grassland, construction land and other land types, and had better extraction effect in the extraction of glacier snow. (3) Compared with the traditional ISODATA method and maximum likelihood method, the object-oriented decision tree classification method could further improve the classification accuracy. The overall classification accuracy could reach 90.20% and the Kappa coefficient was 87.95%. Conclusion Compared with the traditional classification methods, the idea of coarse classification before fine classification can avoid the confusion between regions. The combination of object-oriented features and decision tree has better applicability in plateau mountainous areas, and can effectively improve the classification accuracy. [Ch, 3 fig. 7 tab. 26 ref.] -
Key words:
- Sentinel-2A image /
- Dali City /
- land use /
- remote sensing classification /
- applicability
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密码子是识别和传递生物体遗传信息、联系蛋白质与DNA之间的重要桥梁，在生物体遗传和变异中起着至关重要的作用[1]。编码同一氨基酸的不同密码子被称为同义密码子。由于基因突变和自然选择的影响，某些同义密码子在蛋白质翻译过程中往往被高频使用，被称为密码子的使用偏好性[2−3]。物种的生物学功能与密码子偏好性密切相关，密码子偏好性不仅可以影响生物编码基因的蛋白质合成速率和翻译速率[4]，还会影响蛋白质结构、折叠程度和mRNA的合成[5]。研究表明：同一物种或亲缘关系相近的物种，具有相似的密码子偏好使用模式[6]，通过分析物种的密码子偏好性可以衡量物种之间的基因表达量，进而探究物种之间亲属关系[7]。通过密码子偏好性的研究，能够更好地阐明物种进化过程中基因的表达规律[8]，为利用基因工程技术改良物种目标基因提供参考依据[9]。
梁山慈竹Dendrocalamus farinosus属竹亚科Bambusoideae牡竹属Dendrocalamus，又名大叶竹和瓦灰竹，是中国西南地区重要的经济竹种[10]，生长速度快，适应性强，竹笋效益高，属于优良的笋竹两用竹种，与硬头黄竹Bambusa rigida都属于竹编和制浆造纸的优质原料[11]。针对梁山慈竹叶绿体基因组密码子使用偏好性的研究鲜见报道。为了更好地挖掘和利用梁山慈竹的潜在经济价值，本研究以梁山慈竹叶绿体基因组序列为研究对象，分析其密码子偏好性使用模式，探究并总结其相关表达基因的密码子偏好性，以期分析影响梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性的主要因素，并筛选出最优密码子，为后续梁山慈竹叶绿体基因工程改造等研究提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 叶绿体基因组序列的获取
根据GenBank登录号MZ681865.156在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中搜索并下载梁山慈竹叶绿体基因组序列，共有85条编码序列(CDS)。序列重复或小于300 bp会对密码子偏好性指标的测定产生影响[12]。对基因序列进行筛选，剔除序列长度小于300 bp且重复的序列，获取起始密码子为ATG，终止密码子为TAG、TGA和TAA的序列，最终获得51条CDS序列作为后续分析的样本序列。
1.2 密码子组成分析
运用CodonW1.4.2 (
http://sourceforge.net/projects/codonw )和EMBOSS (http://imed.med.ucm.es/EMBOSS/ )计算有效密码子数(ENC)、适应指数(CAI)、密码子偏性指数(CBI)、最优密码子频率(FOP)以及密码子第3位核苷酸A、T、C、G的含量(分别记为A3、T3、C3、G3)。利用ENC判断密码子偏好性程度，ENC＞35说明密码子偏好性比较弱；反之，说明偏好性强[13]。通过CUSP软件分析并获得密码子鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)所占的比率(GC比率)及GC平均比率(GCall)，使用SPSS 25.0软件对梁山慈竹密码子各位置的GC比率与ENC进行相关分析。1.3 相对同义密码子使用度分析
运用CodonW 1.4.2对同义密码子相对使用度(RSCU)进行分析，即该密码子的实际使用频率与其理论使用频率的比值[14]。当RSCU大于1时，同义密码子中偏好使用该密码子，被称为高频密码子；当RSCU等于1时，密码子无偏好性；当RSCU小于1时，密码子使用偏好性较弱[15]。
1.4 中性绘图分析
中性绘图分析是对影响密码子使用偏好性的关键因素进行分析，X轴为GC3，Y轴为GC1和GC2的平均值，绘制二维散点图对GC3和GC12 (各基因 GC1和GC2的平均值)的相关性进行分析(GC1、GC2、GC3分别代表第1、2、3位密码子的GC比例)。若回归系数接近1，代表GC3和GC12显著相关，碱基组成没有差异，说明突变是决定密码子偏好性的主要因素；若回归系数接近0，则代表自然选择是主要因素。
1.5 ENC-plot绘图分析
ENC-plot绘图分析表现密码子的使用偏好性受到突变和自然选择的影响程度。使用Python 3.7进行ENC-plot绘图分析，构建散点图，横纵坐标分别为GC3、ENC，并绘制ENC的标准曲线。基因位点靠近或在标准曲线上，表明突变是决定密码子偏好性的主要因素，若基因位点和标准曲线距离很大，则说明偏好性主要由自然选择决定。
1.6 PR2-plot偏倚分析
PR2-plot分析表明基因中密码子的第3位碱基的构成情况。计算密码子碱基中第3位上4种碱基A、T、C、G比例，G3/(G3+C3)为X轴，A3/(A3+T3)为Y轴，绘制PR2-plot散点图，中心点为碱基比例A=T、C=G时的值，代表处于此区域的密码子并无使用偏好性[16]。
1.7 最优密码子分析
将51条基因升序排列后的ENC前后两端10％的基因建立高、低表达基因库。通过CodonW软件计算2个表达库中密码子的RSCU和ΔRSCU，同时满足高频密码子(RSCU＞1)和高表达密码子(ΔRSCU≥0.08)的为最优密码子[17]。
1.8 梁山慈竹和其他几种生物密码子偏好性比较分析
在Codon Usage Database (
http://www.kazusa.or.jp/codon/ )下载异源表达宿主和植物代表类群，包括巨龙竹D. farinosus、粉麻竹D. sinicus、小叶龙竹D. pulverulentus、硬头黄竹、大肠埃希菌Escherichia coli、烟草Nicotiana tabacum、拟南芥Arabidopsis thaliana和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae等物种基因组密码子的使用频率，与梁山慈竹基因组密码子使用频率比值进行比较分析，当梁山慈竹密码子使用频率比其他生物的比值≥2.0或≤0.5时，说明该物种与梁山慈竹的同义密码子的使用偏好性差异较大，当比值不在上述范围内时，表明这2个物种对该密码子的偏好性较接近。1.9 对应分析
将叶绿体基因如表1所示进行功能分类，使用CodinW软件，选择对应分析计算样本中各个基因的RSCU，将分析结果分布在59维向量空间中，分析指标间的对应性。
表 1 梁山慈竹叶绿体基因结构分析Table 1 Structural analysis of the choroplast genome of D. farinosus基因分类 基因分组 基因名称 光合系统基因 光系统Ⅰ基因 psaA、psaB、psbA、psbC、psbD、psbB 光系统Ⅱ基因 petA、petB、petD 细胞色素b/f复合体基因 atpA、atpB、atpE、atpF、atpI 三磷酸腺苷合成酶基因 ndhA、ndhB、ndhC、ndhD、ndhE、ndhF、ndhG、ndhH、ndhI、ndhJ、ndhK 遗传系统基因 烟酰胺腺票吟二核甘酸氧化还原酶基因 rbcL 二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因 rpoA、rpoB、rpoC1、rpoC2 RNA聚合酶亚基基因 rps2、rps3、rps4、rps7、rps8、rps11、rps12、rps14、rps18 核糖体蛋白小亚基基因 rpl2、rpl14、rpl16、rpl20、rpl22 其他基因 成熟酶K基因 matK 膜蛋白基因 cemA 细胞色素合成基因 ccsA 酪蛋白分解蛋白酶基因 clpP 未知功能基因 假定叶绿体阅读框 ycf2、ycf3、infA 2. 结果与分析
2.1 密码子的碱基组成分析
分析梁山慈竹叶绿体基因组CDS序列的碱基组成：梁山慈竹的4种碱基所对应的同义密码子的第3位碱基比例 (T3s、A3s、C3s、G3s)分别为45.28%、42.07%、18.13%、17.96%，T3s和A3s远高于G3s和C3s，表明梁山慈竹叶绿体基因组密码子的第3位碱基以A/U结尾为主。梁山慈竹的ENC为50.40，CAI为16.6%，第3位同义密码子的GC比率 (GC3S)为28.1%，表明其叶绿体基因组密码子偏好性较弱。
梁山慈竹叶绿体基因组密码子的GC平均比率为39.48%，且GC1 (47.69%)＞GC2 (39.70%)＞GC3 (31.05%)。ENC为 39.04~61.00，均值为49.51，GC比率在基因密码子上并没有均匀分布(表2)。ENC和密码子3个位置GC比率的相关分析(表3)结果发现：ENC与GC3比率显著相关，与GC1、GC2不显著相关，说明密码子使用偏好性形成过程中GC3的影响作用大于GC1、GC2。
表 2 梁山慈竹叶绿体基因组各基因密码子相关参数统计Table 2 Statistics of codon related parameters of various genes in the chloroplast genome of D. farinosus基因 GC比率/% ENC CAI FOP 基因 GC比率/% ENC CAI FOP GC GC1 GC2 GC3 GC GC1 GC2 GC3 rps12 41.87 52.00 47.20 26.40 44.85 0.140 0.341 rps18 33.53 34.50 39.77 26.32 39.04 0.147 0.333 psbA 42.56 49.72 42.94 35.03 41.33 0.313 0.532 rpl20 36.11 38.33 40.83 29.17 50.97 0.112 0.298 matK 34.44 40.82 32.42 30.08 49.49 0.166 0.329 clpP 43.01 52.53 38.25 38.25 52.37 0.175 0.337 psbD 44.44 53.39 43.50 36.44 48.99 0.242 0.456 psbB 44.01 54.42 45.97 31.63 50.73 0.190 0.380 psbC 44.66 53.59 44.73 35.63 48.91 0.183 0.386 petB 41.06 48.93 41.20 33.05 47.31 0.191 0.333 rpoB 39.19 49.81 38.01 29.74 49.69 0.153 0.353 petD 40.37 50.93 39.13 31.06 49.46 0.161 0.305 rpoC1 39.87 49.93 38.07 31.63 52.77 0.156 0.347 rpoA 37.06 46.18 35.59 29.41 49.94 0.151 0.311 rpoC2 38.95 49.01 36.64 31.18 52.29 0.154 0.333 rps11 43.52 50.69 56.25 23.61 44.33 0.174 0.396 rps2 38.40 40.51 40.93 33.76 52.55 0.168 0.338 infA 40.35 43.86 35.96 41.23 61.00 0.181 0.409 atpI 38.84 47.58 36.29 32.66 50.55 0.163 0.353 rps8 36.50 41.61 41.61 26.28 46.62 0.122 0.374 atpF 38.27 47.62 35.45 31.75 53.17 0.147 0.353 rpl14 38.71 54.84 37.10 24.19 51.90 0.181 0.392 atpA 42.06 56.01 39.96 30.12 49.96 0.182 0.385 rpl16 44.76 52.14 53.57 28.57 39.41 0.115 0.354 rps14 39.42 39.42 46.15 32.69 41.73 0.135 0.384 rps3 33.47 43.75 31.67 25.00 48.03 0.193 0.402 psaB 41.81 48.71 43.13 33.61 49.34 0.172 0.350 rpl22 37.56 41.33 36.67 34.67 47.48 0.188 0.415 psaA 43.68 51.80 43.28 35.95 52.07 0.198 0.373 rpl2 44.56 51.77 48.58 33.33 53.33 0.143 0.361 ycf3 39.69 47.40 38.15 33.53 55.45 0.156 0.343 ndhB 38.16 42.07 39.33 33.07 46.71 0.156 0.348 rps4 37.13 47.52 37.13 26.73 49.59 0.169 0.386 rps7 39.49 49.68 45.22 23.57 48.31 0.164 0.373 ndhJ 39.38 49.38 36.88 31.88 51.48 0.176 0.356 ndhF 34.19 37.84 38.92 25.81 46.19 0.144 0.321 ndhK 38.60 41.70 43.72 30.36 51.91 0.159 0.329 ccsA 33.64 33.74 41.10 26.07 45.60 0.152 0.307 ndhC 39.67 50.41 36.36 32.33 48.75 0.177 0.345 ndhD 36.19 40.72 36.93 30.94 48.98 0.133 0.314 atpE 42.51 52.17 39.13 36.23 59.51 0.167 0.405 ndhE 33.33 41.18 32.35 26.47 59.06 0.144 0.316 atpB 42.62 53.91 41.68 32.26 47.43 0.192 0.381 ndhG 34.46 44.07 32.77 26.55 45.77 0.125 0.250 rbcL 44.14 57.11 43.93 31.38 50.19 0.271 0.454 ndhI 34.99 37.57 38.67 28.73 52.09 0.171 0.345 ycf4 41.22 48.39 39.78 35.48 47.14 0.162 0.385 ndhA 33.98 42.42 36.36 23.14 44.35 0.140 0.321 cemA 33.62 41.99 27.71 31.17 55.91 0.176 0.342 ndhH 37.82 50.76 34.77 27.92 49.95 0.155 0.322 petA 40.29 53.58 35.2 32.09 51.12 0.155 0.331 表 3 梁山慈竹叶绿体基因组中各基因参数的相关性分析Table 3 Correlation analysis of various gene parameters in the chloroplast genome of D. farinosus参数 GC1 GC2 GC3 ENC CAI CBI FOP GC3s GC GC1 1 GC2 0.300* 1 GC3 0.265 −0.009 1 ENC 0.142 −0.425** 0.389** 1 CAI 0.409** 0.076 0.370** 0.012 1 CBI 0.438** 0.272 0.322* −0.092 0.774** 1 FOP 0.402** 0.312* 0.341* −0.064 0.797** 0.965** 1 GC3s 0.271 −0.029 0.946** 0.445** 0.330* 0.330* 0.370** 1 GC 0.814** 0.673** 0.525** 0.010 0.407** 0.512** 0.518** 0.499** 1 说明： *表示显著相关 (P＜0.05)；**表示极显著相关 (P＜0.01)。 2.2 相对同义密码子使用度分析
梁山慈竹叶绿体基因组中共包含18110个密码子(表4)，总计编码20个氨基酸，密码子数为12~705个，其中密码子UGA共有12个，密码子含量最多的是编码谷氨酸的GAA，共有705个。梁山慈竹叶绿体基因组蛋白编码序列RSCU分析表明：氨基酸含量较高的有亮氨酸(Leu)和精氨酸(Arg)，均为6个密码子编码，编码精氨酸的是UUA、UUG、CUU、CUC、CUA和CUG；编码亮氨酸的有AGA、AGG、CGU、CGC、CGA和CGG；除此之外，蛋氨酸(Met)和色氨酸(Trp)均只有1个密码子编码，分别是AUG和UGG，其余氨基酸密码子编码个数分别为2~4个。
表 4 梁山慈竹叶绿体基因组蛋白编码序列RSCU分析Table 4 RSCU of protein coding region in the chloroplast of D. farinosus氨基酸 密码子 数量 RSCU 氨基酸 密码子 数量 RSCU 氨基酸 密码子 数量 RSCU 氨基酸 密码子 数量 RSCU Phe UUU* 644 1.29 Tyr UAU* 532 1.59 Ser UCU* 343 1.58 Cys UGU* 151 1.53 Phe UUC 351 0.71 Tyr UAC 137 0.41 Ser UCC* 260 1.19 Cys UGC 47 0.47 Leu UUA* 634 1.94 TER UAA* 28 1.56 Ser UCA* 222 1.02 Arg AGA* 322 1.75 Leu UUG* 362 1.11 TER UAG 14 0.78 Ser UCG 119 0.55 Arg AGG 119 0.64 Leu CUU* 420 1.29 TER UGA 12 0.67 Ser AGU* 273 1.25 Arg CGU* 261 1.41 Leu CUC 138 0.42 Trp UGG* 328 1.00 Ser AGC 89 0.41 Arg CGC 95 0.51 Leu CUA 295 0.90 Gln CAA* 477 1.53 Thr ACU* 403 1.68 Arg CGA* 234 1.27 Leu CUG 107 0.33 Gln CAG 148 0.47 Thr ACC 181 0.75 Arg CGG 76 0.41 Ile AUU* 740 1.48 Glu GAA* 705 1.46 Thr ACA* 259 1.08 Gly GGU* 421 1.24 Ile AUC 295 0.59 Glu GAG 263 0.54 Thr ACG 116 0.48 Gly GGC 145 0.43 Ile AUA 461 0.92 Lys AAA* 647 1.44 Ala GCU* 493 1.73 Gly GGA* 538 1.58 Met AUG* 416 1.00 Lys AAG 253 0.56 Ala GCC 172 0.60 Gly GGG 259 0.76 Val GUU* 382 1.47 Asp GAU* 522 1.54 Ala GCA* 343 1.20 Pro CCU* 286 1.48 Val GUC 126 0.49 Asp GAC 155 0.46 Ala GCG 135 0.47 Pro CCC* 196 1.01 Val GUA* 390 1.50 His CAU* 311 1.47 Asn AAU* 528 1.48 Pro CCA* 209 1.08 Val GUG 139 0.54 His CAC 112 0.53 Asn AAC 187 0.52 Pro CCG 84 0.43 说明：*表示RSCU大于1的高频密码子。 梁山慈竹叶绿体基因组RSCU大于1的密码子数目为34个(分别为UUU、UUA、UUG、CUU、AUU、AUG、GUU、GUA、UCU、UCC、UCA、AGU、ACU、ACA、GCU、GCA、AAU、UAU、UAA、UGG、CAA、GAA、AAA、GAU、CAU、UGU、AGA、CGU、CGA、GGU、GGA、CCU、CCC和CCA)，即筛选出了34个高频密码子，其中以A、U、C、G结尾的密码子分别有13、16、2和1个，这说明密码子偏好以A和U结尾，RSCU较高的3个密码子分别为UUU (1.94)、CUA (1.73)和UCU (1.75)。
2.3 中性绘图分析
中性绘图分析量化自然选择和突变压力之间的关系，阐明3个密码子位置之间的联系。结果表明：横坐标GC3的数值为23.14%~41.23%，纵坐标GC12的数值为39.04%~61.00% (图1)。梁山慈竹的Pearson相关系数为0.17，呈正相关关系，数据拟合后的回归系数为0.1868，决定系数(R2)较小，为0.0282，GC12和GC3的相关性不显著，说明其叶绿体基因组密码子偏好性受自然选择影响较大。
2.4 ENC-plot绘图分析
图2显示：ENC分布并不紧密，少量分布在标准曲线附近，还有个别分布在标准曲线上侧，位点的ENC均大于35，与预期ENC值有差距。说明梁山慈竹密码子偏好性较弱且自然选择和突变都对其偏好性有影响。由于落在标准曲线下方的基因点数量比较多，所以梁山慈竹基因组密码子使用偏好性主要受自然选择的影响。
2.5 PR2-plot绘图分析
图3显示：基因位点在平面图4个区域内分布并不均匀，在A3/(A3+T3)＜0.5和G3/(G3+C3)＞0.5区域范围内分布最多。表明第3位碱基使用频率为：T＞A、G＞C，梁山慈竹叶绿体基因组密码子的第3位碱基在选择上具有偏好性，同时说明其密码子使用偏好性主要受自然选择的影响。
2.6 最优密码子的确定
对梁山慈竹的ENC进行升序排列，前10%为高表达基因，即rps18、rpl16、psbA、rps14、rps11，后10%为低表达基因，即 ycf3、cemA、ndhE、atpE、infA。梁山慈竹的RSCU和ΔRSCU表明(表5)：梁山慈竹叶绿体基因组有32个高频密码子，筛选出GCA、GCU等25个高表达密码子，最终确定18个密码子作为梁山慈竹叶绿体基因组的最优密码子，分别为UAA、GCA、GCU、UUC、GGU、AAA、CUU、UUA、CCA、CCU、CAA、AGA、CGU、AGU、UCC、ACU、GUA、GUU。其中16个以A/U结尾，2个以C结尾。
表 5 梁山慈竹叶绿体基因组各氨基酸的RSCU分析及最优密码子分析Table 5 RSCU analysis and optimal codon analysis of amino acids in chloroplast genome of D. farinosus氨基酸 密码子 基因组
RSCU高表达
RSCU低表达
RSCUΔRSCU 氨基酸 密码子 基因组
RSCU高表达
RSCU低表达
RSCUΔRSCU Ter UAA*** 1.560 0 1.800 0 1.200 0 0.600 0 Met AUG 1.000 0 1.000 0 1.000 0 0 UAG 0.780 0 0.600 0 1.200 0 −0.600 0 Asn AAC* 0.520 0 0.893 6 0.625 0 0.268 6 UGA 0.670 0 0.600 0 0.600 0 0 AAU 1.480 0 1.106 4 1.375 0 −0.268 6 Ala GCA** 1.200 0 1.200 0 0.734 7 0.465 3 Pro CCA** 1.080 0 0.800 0 0.500 0 0.300 0 GCC 0.600 0 0.457 1 0.653 1 −0.196 0 CCC 1.010 0 0.800 0 1.166 7 −0.366 7 GCG 0.470 0 0.228 6 0.734 7 −0.506 1 CCG 0.430 0 0.444 4 1.000 0 −0.555 6 GCU* 1.730 0 2.114 3 1.877 6 0.236 7 CCU*** 1.480 0 1.955 6 1.333 3 0.622 3 Cys UGC** 0.470 0 0.400 0 0 0.400 0 Gln CAA* 1.530 0 1.500 0 1.368 4 0.131 6 UGU 1.530 0 1.600 0 2.000 0 −0.400 0 CAG 0.470 0 0.500 0 0.631 6 −0.131 6 Asp GAC* 0.460 0 0.500 0 0.411 8 0.088 2 Arg AGA* 1.750 0 1.723 4 1.534 9 0.188 5 GAU 1.540 0 1.500 0 1.588 2 -0.088 2 AGG 0.640 0 0.319 1 0.837 2 −0.518 1 Glu GAA 1.460 0 1.189 2 1.578 9 −0.389 7 CGA 1.270 0 1.276 6 1.395 3 −0.118 7 GAG** 0.540 0 0.810 8 0.421 1 0.389 7 CGC 0.510 0 0.319 1 0.837 2 −0.518 1 Phe UUC** 1.290 0 1.041 7 0.650 0 0.391 7 CGG 0.410 0 0.319 1 0.279 1 0.040 0 UUU 0.710 0 0.958 3 1.350 0 −0.391 7 CGU*** 1.410 0 2.042 6 1.116 3 0.926 3 Gly GGA 1.580 0 1.253 7 1.818 2 −0.564 5 Ser AGC 0.410 0 0.384 6 0.470 6 −0.086 0 GGC 0.430 0 0.417 9 0.484 8 −0.066 9 AGU** 1.250 0 1.846 2 1.411 8 0.434 4 GGG 0.760 0 0.119 4 0.363 6 −0.244 2 UCA 1.020 0 0.615 4 1.058 8 −0.443 4 GGU*** 1.240 0 2.209 0 1.333 3 0.875 7 UCC*** 1.190 0 1.769 2 0.941 2 0.828 0 His CAC** 0.530 0 0.941 2 0.571 4 0.369 8 UCG 0.550 0 0.153 8 0.705 9 −0.552 1 CAU 1.470 0 1.058 8 1.428 6 −0.369 8 UCU 1.580 0 1.230 8 1.411 8 −0.181 0 Ile AUA 0.920 0 0.850 7 0.949 4 −0.098 7 Thr ACA 1.080 0 1.181 8 1.176 5 0.005 3 AUC* 0.590 0 0.626 9 0.531 6 0.095 3 ACC 0.500 0 0.818 2 1.058 8 −0.240 6 AUU 1.480 0 1.522 4 1.519 0 0.003 4 ACG 0.480 0 0.363 6 0.588 2 −0.224 6 Lys AAA** 1.440 0 1.471 7 1.155 6 0.316 1 ACU** 1.680 0 1.636 4 1.176 5 0.459 9 AAG 0.560 0 0.528 3 0.844 4 −0.316 1 Val GUA*** 1.500 0 1.767 4 1.257 1 0.510 3 Leu CUA 0.900 0 0.833 3 1.295 5 −0.462 2 GUC 0.490 0 0 1.028 6 −1.028 6 CUC 0.420 0 0 0.545 5 −0.545 5 GUG 0.540 0 0.372 1 0.342 9 0.029 2 CUG 0.330 0 0.250 0 0.477 3 −0.227 3 GUU** 1.470 0 1.860 5 1.371 4 0.489 1 CUU* 1.290 0 1.333 3 1.227 3 0.106 0 Trp UGG 1.000 0 1.000 0 1.000 0 0 UUA*** 1.940 0 2.166 7 1.022 7 1.144 0 Tyr UAC** 0.410 0 0.521 7 0.166 7 0.355 0 UUG 1.110 0 1.416 7 1.431 8 −0.015 1 UAU 1.590 0 1.478 3 1.833 3 −0.355 0 说明: 高频密码子(RSCU＞1.00)带下划线；*. ΔRSCU≥0.08；**. ΔRSCU≥0.3；***. ΔRSCU≥0.5; 加粗的密码子表示最优密码子。 2.7 梁山慈竹和其他几种生物密码子偏好性比较分析
将梁山慈竹基因组密码子使用频率与巨龙竹、粉麻竹、小叶龙竹、硬头黄竹、大肠埃希菌、烟草、拟南芥和酿酒酵母等物种的基因组密码子使用频率进行比较(图4)。结果显示：梁山慈竹与巨龙竹、粉麻竹、小叶龙竹和硬头黄竹的密码子使用频率为0.5~2.0，说明它们的密码子使用偏好性相似，推测具有亲缘关系的禾本科Gramineae牡竹属植物叶绿体基因组密码子偏好性相似；在大肠埃希菌、烟草、拟南芥和酿酒酵母的密码子使用比值中筛选≥2.0或≤0.5的密码子，分别有28和15、15、14个，表明梁山慈竹与这些物种在同义密码子的偏好性上有一定差异。
图 4 梁山慈竹与其他物种密码子偏好性比较Figure 4 Comparison of codon preference between D. farinosus and other species2.8 对应分析
将梁山慈竹的51个叶绿体基因的基因功能分为光合系统基因、遗传系统基因、其他基因和未知功能基因四大类，在计算RSCU的基础上将各个基因分布到59维的向量空间。对应分析结果(图5)显示：前4个向量轴分别存在18.3%、16.8%、15.6%和15.4%的差异，前4向量轴累计差异为66.1%，4个轴对密码子均有不同程度的影响；第1轴的值大于其他轴，说明第1轴对梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性的影响较大。对第1轴与CAI、CBI、FOP、ENC和GC3s等指数进行进一步的相关分析发现：梁山慈竹基因在第1轴上的坐标值与CAI (r=−0.001 7，P＜0.01)、CBI (r=0.099 0，P＜0.01)、FOP (r=0.083 0，P＜0.01)、ENC (r=0.112 0，P＜0.01)、GC3s (r=−0.145 0，P＜0.01)间具有极显著的相关关系，其中CAI和GC3s第1轴具有负相关关系，表明基因组密码子的偏好性不止受单一因素的影响，自然选择、基因突变均有可能影响梁山慈竹基因组密码子使用偏好性[18]。
3. 讨论
本研究对梁山慈竹叶绿体基因组密码子进行使用偏好性分析，筛选出51条CDS序列，分析表明：GC1＞GC2＞GC3，密码子在3个位置上的分布并不均匀，密码子偏好使用以A或U结尾的碱基，且梁山慈竹叶绿体基因组的ENC均值为49.51，表明其叶绿体基因组密码子使用偏好性较弱。这与乳油木Vitellaria paradoxa[19]和二乔玉兰Magnolia soulangeana[20]等植物叶绿体基因组密码子偏好性相似。
对梁山慈竹叶绿体基因组密码子进行中性绘图、ENC-plot分析、PR2-plot分析和对应分析。在中性绘图分析中，回归系数为0.412 8，说明密码子偏好性更多受到自然选择的影响；在ENC-plot分析中，多数基因离标准曲线距离较远，实际ENC和预期ENC有差距，表明该部分基因的密码子偏好性主要受自然选择的影响；在PR2-plot绘图分析中，大部分基因位于平面图的右下方，即T＞A、G＞C，表明其密码子的使用更多受自然选择的影响。综上所述，影响梁山慈竹叶绿体基因组密码子偏好性的主要原因是自然选择。该研究结果与巨桉Eucalyptus grandi[21]、灰毛浆果楝Cipadessa cinerascens、酸枣Ziziphus jujuba var. spinosa[22]和云南油杉Keteleeria evelyniana[23]等叶绿体基因组密码子偏好性研究结果基本一致；但在对4种蔷薇科 Rosaceae果树[24]和银白杨Populus alba[25]的研究中发现：突变是影响密码子偏好性的主要因素。这说明密码子的使用偏好性受自然选择或基因突变因素影响。基于RSCU的对应分析表明：梁山慈竹的密码子使用变异原因除了突变和自然选择之外，还有其他的因素，这其中光合系统基因和遗传系统基因分布相对集中，各类基因密码子使用偏好性较为接近。该结论与木薯Manihot esculenta[26]和高山松Pinus densata[27]的研究结果一致。密码子使用频率比较结果显示：梁山慈竹与禾本科牡竹属的植物密码子偏好性相似，在基因选择外源系统表达时，可以选择密码子偏好性差异相对较小的酿酒酵母，在选择大肠埃希菌、烟草和拟南芥作为外源表达宿主时，需要根据密码子使用偏好性进行碱基优化，从而使基因在宿主体内更好地表达。
最优密码子分析表明：梁山慈竹叶绿体基因组有GCU、GAU以及GGU等18个最优密码子，最优密码子大部分以A或U结尾。该结果与抽筒竹Gelidocalamus tessellatus[28]和毛竹Phyllostachys edulis[29]叶绿体基因组最优密码子分析结果一致，这可能与亲缘关系相近，但不同物种之间叶绿体基因组进化过程中的相对保守性有关系[21]。通过筛选获取梁山慈竹偏好使用密码子，可进一步对目标基因进行密码子优化，提高梁山慈竹的竹笋产量和造纸纤维含量，以及利用新一代精准基因编辑工具CRISPR/Cas9优化梁山慈竹密码子，从而改造梁山慈竹基因组编辑的Cas9基因，提高该基因在梁山慈竹中的表达水平[30]。
4. 结论
本研究通过分析梁山慈竹叶绿体基因组的CDS序列，对梁山慈竹的叶绿体基因组进行生物信息学分析，筛选出梁山慈竹叶绿体基因组有GCU、GAU以及GGU等18个最优密码子。研究结果表明：影响梁山慈竹密码子偏好性的主要因素是自然选择。研究结果为后续在分子层面上利用基因工程开发梁山慈竹优良资源提供参考。
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图 2 基于不同分类方法得到的大理市2020年土地利用类型示意图
Figure 2 Land use type map of Dali City in 2020 based on different classification methods
表 1 各种类型地物样本组合的Jeffries-Matusita距离
Table 1. Jeffries Matusita distance of various types of feature sample combinations
土地利用类型 分离度 土地利用类型 分离度 林地-农田 1.953 农田-其他 1.994 林地-水体 2.000 水体-草地 1.993 林地-草地 1.895 水体-建设用地 2.000 林地-建设用地 1.998 水体-冰川积雪 1.998 林地-冰川积雪 1.995 水体-其他 1.996 林地-其他 1.994 草地-建设用地 1.996 农田-水体 1.983 草地-冰川积雪 1.997 农田-草地 1.894 草地-其他 1.996 农田-建设用地 1.993 建设用地-冰川积雪 1.992 农田-冰川积雪 1.993 建设用地-其他 1.983 冰川积雪-其他 1.990 
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表 2 面向对象特征定义表
Table 2. Object oriented feature definition
类别 特征 定义和公式 光谱特征 光谱均值 斑块内像素光谱均值 纹理特征 纹理特征 灰度共生矩阵(GLCM，包括5×5卷积模板内的均值、方差、同质性、熵值、对比度、二阶矩、相关性) 几何特征 面积 斑块总面积 延伸率 最大直径与最小直径比值 矩形形状参数 矩形形状度量值(Rect)=面积/(最大直径×最小直径)
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表 3 各地类验证点个数
Table 3. Number of verification points of each class
土地利用类型 天地图验证点个数 野外调查验证点个数 水体 94 5 林地 68 58 建设用地 54 6 农田 67 18 草地 89 8 冰川积雪 13 0 其他 16 4
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表 4 ISODATA法遥感解译误差矩阵
Table 4. ISODATA remote sensing interpretation error matrix
土地利用类型 林地 建设用地 农田 水体 草地 其他 冰川积雪 参考样本数 用户精度/％ 林地 93 0 3 0 4 0 0 100 93.00 建设用地 0 67 0 7 5 5 3 87 77.01 农田 16 2 47 0 2 1 7 75 62.67 水体 0 0 0 76 2 0 0 78 97.44 草地 3 0 0 3 29 2 0 37 78.38 其他 0 4 2 0 8 71 0 85 83.53 冰川积雪 0 2 6 0 0 0 30 38 78.95 分类样本数 112 75 58 86 50 79 40 500 制图精度/％ 83.04 89.33 81.03 88.37 58.00 89.37 75.00
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表 5 最大似然法遥感解译误差矩阵
Table 5. Maximum likelihood remote sensing interpretation error matrix
土地利用类型 林地 建设用地 农田 水体 草地 其他 冰川积雪 参考样本数 用户精度/％ 林地 119 0 0 0 2 0 0 121 98.35 建设用地 3 51 2 5 1 2 0 64 79.69 农田 6 4 61 0 4 4 1 80 76.25 水体 0 0 0 91 0 0 0 91 100.00 草地 5 4 7 0 55 0 3 74 74.32 其他 0 14 2 0 0 36 0 52 69.23 冰川积雪 1 4 0 0 1 0 12 18 66.67 分类样本数 134 77 72 96 63 42 16 500 制图精度/％ 88.81 66.23 84.72 94.79 87.30 85.71 75.00
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表 6 面向对象特征决策树法遥感解译误差矩阵
Table 6. Remote sensing interpretation error matrix of object-oriented feature decision tree method
土地利用类型 林地 建设用地 农田 水体 草地 其他 冰川积雪 参考样本数 用户精度/％ 林地 118 0 2 0 5 0 0 125 94.40 建设用地 0 51 3 3 1 2 1 61 83.61 农田 4 2 76 0 4 1 2 89 85.39 水体 1 2 0 93 1 0 0 97 95.88 草地 3 3 4 3 86 0 0 99 86.87 其他 0 1 0 0 0 17 0 18 94.44 冰川积雪 0 1 0 0 0 0 10 11 90.91 分类样本数 126 60 85 99 97 20 13 500 制图精度/％ 93.65 85.00 89.41 93.94 88.66 85.00 76.92
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表 7 3种分类方法比较
Table 7. Comparison of three classification methods
分类方法 总体分类精度/% Kappa系数/% ISODATA法分类 82.60 79.40 最大似然法分类 85.00 81.90 面向对象特征决策树法 90.20 87.95
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20220134
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