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氧化亚氮(N2O)是一种长效温室气体，其增温潜势约为二氧化碳(CO2)的298倍[1-2]，对全球气候变暖具有较大的推动作用[3-4]。同时，大气中N2O浓度的上升对臭氧层造成显著的破坏，并且对生态环境也产生一系列的负面影响[5]。土壤是N2O的主要排放源，其排放量约占总排放量的70%[6]。因此，在土壤N2O排放日趋严重的背景下，研发土壤N2O减排技术是当前亟待解决的热点问题[7-8]。
生物质炭(biochar)是生物质在限氧或无氧环境中通过高温裂解而成的一类具有强吸附性，化学结构稳定且富含碳素的芳香态化合物[9]。生物质炭施用可以显著改善土壤性质，并在土壤N2O减排方面具有巨大潜力[10-11]。然而，生物质炭所含的矿质养分数量和类型较为匮乏，难以满足植物生长所需的营养需求。传统化肥的施用，可为植物生长提供养分，但却增加了土壤N2O的排放[12]。生物质炭基肥是一种新型肥料，可在改善土壤理化性质的同时，提供充足的养分，有效地弥补生物质炭速效养分不足的问题[11,13]。然而，与传统化肥相比，施用生物质炭基肥到底是促进还是抑制土壤N2O排放，尚不明确。此外，生物质炭基肥的施用会显著影响土壤的理化和微生物学性质，而上述性质的改变对土壤N2O排放的影响机制未有定论。
毛竹Phyllostachys edulis是中国亚热带地区重要的森林资源，其种植面积已超过400万hm2，约占竹类面积的72%[14]。毛竹能在短期内快速增加植被碳储量，因此，在碳汇功能方面具有独特的优势[15-18]。毛竹的生长对氮素养分的需求量较大。尿素的施用，一方面可以促进毛竹的生长，从而增加毛竹林的固碳量，但另一方面却增加了毛竹林土壤的N2O排放[19-22]。生物质炭基肥具有提供有效养分与减少温室气体排放的双重功效，但生物质炭基肥对毛竹林土壤N2O通量的影响机制尚不明确。基于此，本试验以亚热带地区毛竹林为研究对象，比较研究了生物质炭基尿素(以下称炭基尿素)和普通尿素(以下称尿素)施用对毛竹林土壤N2O通量、土壤温度、含水量、不同氮组分以及脲酶活性和蛋白酶活性的影响，分析土壤N2O通量与上述土壤环境因子之间的关系，旨在为研发森林土壤N2O减排的施肥技术提供参考。
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试验样地位于杭州市临安区青山镇亚热带典型毛竹林示范样地(30°13′N, 119°47′E)。该区域的年均气温为15.9 ℃，年均降水量为1420 mm。试验区的土壤类型为红壤，基本理化性质如下：土壤容重为1.14 g·cm−3，砂粒为48.7%，粉粒为33.1%，黏粒为18.2%，pH 为4.87，有机碳为18.2 g·kg−1，全氮为1.76 g·kg−1，碱解氮为106.9 mg·kg−1，有效磷为7.64 mg·kg−1，速效钾为90.5 mg·kg−1。
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试验地毛竹林由常绿阔叶林于2006年转化而来，其平均胸径9.8 cm，密度3 000株·hm−2。在该区域布置试验处理小区。试验包含5个处理：①对照(不施肥，ck)；②低水平尿素(100 kg·hm−2，LU)；③高水平尿素(300 kg·hm−2，HU)；④低水平炭基尿素(100 kg·hm−2，LBU)；⑤高水平炭基尿素(300 kg·hm−2，HBU)。随机区组设计(小区面积为120 m2)，重复3次。本试验中，炭基尿素制备流程为：将水稻Oryza sativa秸秆生物质炭(＜2 mm)以一定比例与尿素进行粉碎处理，放置造粒机中完成造粒，最后烘干至恒量。炭基尿素肥料中氮和碳的质量分数分别为32%和10%；用于制备炭基尿素的生物质炭的碳和氮的质量分数分别为5.8和569 g·kg−2。每个小区中心放置1个静态箱底座，分别在试验处理后的第1、7、28天采样气体和土壤样品，之后每月采样1次。采集的土壤样品用来测定土壤含水量、铵态氮(NH4 +-N)、硝态氮(NO3 –-N)、水溶性有机氮(WSON)、微生物量氮(MBN)、脲酶活性和蛋白酶活性。
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本试验采用静态箱-气相色谱法测定土壤N2O排放通量[23]。采集气体时间为9:00—11:00。使用注射器在0、10、20和30 min进行气体采集，随后注入真空气袋。在采集气体的同时，测定静态箱内温度和土壤表层5 cm处温度。气袋中N2O体积分数使用岛津GC-2014气相色谱仪测定。土壤N2O通量的计算如下[23-24]：
$$ F=\rho\times \frac{V}{A}\times \frac{P}{P_{0}} \times\frac{T_{0}}{T} \times\frac{\mathrm{d} C_{t}}{\mathrm{d} t} 。 $$ (1) 式(1)中：F为N2O(μg·m−2·h−1)的排放通量；ρ为标准状况下N2O气体的密度(mg·m−3)；V为静态箱体积(m3)；A为静态箱底部区域面积(m2)；T0和P0分别为标准状态下的绝对温度和气压；
$\dfrac{\mathrm{d} C_{t}}{\mathrm{~d} t}$ 为单位时间内取样箱内N2O气体体积分数的变化(m3·m−3·h−1)，t为取样时静态箱密闭时间(h)，Ct为该段时间内N2O气体体积分数变化值(m3·m−3)；T和P分别表示测定箱内的绝对温度(K)和大气压(Pa)。土壤N2O累积排放通量的计算公式如下：$$ M_{\mathrm{g}}=\sum_{i=1}^{{n}}\left(R_{i+1}+R_{i}\right) / 2 \times\left(t_{i+1}-t_{i}\right) \times 24 \times 10^{-5} 。 $$ (2) 式(2)中：Mg为N2O累积排放通量(kg·hm−2·a−1)，R为土壤N2O通量(μg·m−2·h−1)，i为采样次数，t为采样时间，n为总测定次数，ti+1−ti为2次采样的间隔天数[23-24]。
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在试验处理前，对样地表层土壤(0~20 cm)进行取样并测定相关指标。土壤含水量采用烘干法测定，有机碳和全氮质量分数使用元素分析仪测定，有效磷质量分数采用钼锑抗显色法[25]测定，速效钾质量分数采用火焰光度法测定[26]，碱解氮质量分数采用碱解扩散法测定[27]。在气体采样结束后立即采集土壤样品并进行分析测定。土壤WSON质量分数测定采用LI等[28]的方法测定，土壤MBN采用氯仿熏蒸-硫酸钾浸提法测定[29]，NH4 +-N和NO3 –-N质量分数测定参照ZHOU等[30]的方法测定。土壤脲酶活性用靛酚蓝比色法[31]测定，蛋白酶活性的分析参照GREENFIELD等[32]的方法。
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数据处理与统计分析应用SPSS 23.0软件进行。应用重复测量方差分析确定试验处理、时间以及试验处理与时间的交互作用对土壤N2O通量的影响，应用单因素方差分析结合最小显著性差异法，分析试验处理对土壤N2O年均排放速率、年累积排放量以及其他土壤环境因子年均值的影响。应用一元线性回归方程，分析土壤N2O通量与土壤温度、含水量、氮组分、脲酶活性和蛋白酶活性之间的相关性。
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由表1可知：试验处理、处理后时间及两者交互作用对N2O具有极显著影响(P＜0.01)。在ck、LU、HU、LBU、HBU处理下，土壤N2O通量具有相似的季节变化规律(图1)。总体来看，土壤N2O排放通量在7—9月最大，在1—2月最小。毛竹林土壤N2O排放通量在尿素处理下显著增加，且随尿素用量增加而增加。然而，炭基尿素处理使毛竹林土壤N2O排放通量显著降低，其降低幅度随炭基尿素用量增加而增强。与ck相比，LU、HU处理使毛竹林土壤N2O的年均排放通量增加14.6%和31.9%；而LBU、HBU处理使毛竹林土壤N2O的年均排放通量降低了3.51%和14.4%(图2)。
表 1 不同施肥处理对9个响应变量影响的重复测量方差分析
Table 1. Repeated measures ANOVA for the effects of different fertilization treatments on nine response variables
项目 土壤温度 土壤含水量 NH4 +-N NO3 −-N WSON MBN 脲酶 蛋白酶 N2O 处理 ns ns ** ** ** ns ** ** ** 处理后时间 ** ** ** ** ** ** ** ** ** 处理×处理后时间 ** * ** ** ** ** ** ** ** 说明：ns表示影响不显著; *表示影响显著(P＜0.05); **表示影响极显著(P＜0.01) 
图 1 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤N2O通量的影响
Figure 1. Effects of biochar-based urea and common urea on soil N2O fluxes in a Ph. edulis forest
图 2 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤N2O年累积排放量的影响
Figure 2. Biochar-based urea and common urea effects on annual cumulative soil N2O effluxes in a Ph. edulis forest
如图2所示：毛竹林土壤N2O年累积排放量在尿素处理下显著增加，且随尿素用量增加而增加。然而，炭基尿素处理降低了毛竹林土壤N2O年累积排放量。相比于ck，低水平和高水平尿素处理导致土壤N2O年累积排放通量分别提高了17.3%和36.0%，低水平和高水平炭基尿素处理导致土壤N2O年累积排放通量分别减少了3.1%和16.9%。
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由表1可知：试验处理与处理后时间的交互作用对土壤含水量有显著影响(P＜0.05)，对土壤温度和MBN均具有极显著影响(P＜0.01)；试验处理、处理后时间及两者交互作用对土壤NH4 +-N、NO3 –-N和WSON质量分数以及脲酶和蛋白酶活性的影响达到极显著水平(P＜0.01)。在本试验5种处理下，毛竹林土壤温度均具有显著的季节性变化特征(图3A)。7—9月土壤温度最高，1—2月最低，但不同处理间土壤温度无显著性差异。由图3B可见：在ck、LU、HU、LBU、HBU处理下，土壤含水量年均值分别为282.2、284.7、286.9、289.9和287.4 g·kg−1。与ck相比，施肥处理对土壤含水量年均值无显著影响(表1)。
图 3 炭基尿素和普通尿素对毛竹林土壤温度和含水量的影响
Figure 3. Biochar-based urea and common urea effects on soil temperature and moisture content in a Ph. edulis forest
与ck相比，LU、HU、LBU和HBU处理下毛竹林土壤NH4 +-N质量分数年均值分别增加了36.9%、70.2%、18.5%和27.3%；使土壤NO3 –-N质量分数年均值分别增加了44.3%、53.6%、26.4%和17.6%(图4，表2)。与ck相比，LU、HU处理使毛竹林土壤WSON质量分数分别增加了3.3%和15.2%，而LBU、HBU处理使毛竹林土壤WSON含量分别降低了6.4%和13.2%(表2)。另外，炭基尿素和尿素处理均对土壤MBN质量分数无显著影响(表2)。
图 4 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤不同形态氮组分的影响
Figure 4. Biochar-based urea and common urea effects on different soil N fractions in a Ph. edulis forest
表 2 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤环境因子年均值的影响
Table 2. Biochar-based urea and common urea effects on annual mean value of soil environmental factors in a Ph. edulis forest
处理 NH4 +-N/
(mg·kg−1)NO3 −-N/
(mg·kg−1)WSON/
(mg·kg−1)MBN/
(mg·kg−1)脲酶/
(μmol·g−1·h−1)蛋白酶/
(μmol·g−1·h−1)ck 6.96 d 2.44 e 15.5 b 42.3 ab 1.15 b 0.88 c LU 9.52 b 3.34 b 16.1 b 43.1 a 1.28 a 0.97 b HU 11.84 a 3.60 a 16.9 a 43.3 a 1.33 a 1.03 a LBU 8.72 c 2.85 d 14.5 c 41.1 b 1.11 b 0.86 d HBU 9.14 bc 3.02 c 13.5 d 42.4 ab 1.00 c 0.77 e 说明：不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05) 由图5可见：脲酶与蛋白酶活性随季节变化呈现夏季高、冬季低的规律特征。相比于ck，LU和HU处理导致脲酶活性年均值分别提高了11.1%和15.6%；LBU和HBU处理使毛竹林土壤脲酶活性年均值分别降低了3.5%和12.9%(表2)。相比于ck，LU和HU处理均导致蛋白酶活性年均值显著增加，增幅分别为10.2%和17.0%；LBU和HBU处理则降低了土壤蛋白酶活性年均值，降幅为2.3%和12.5% (表2)。
图 5 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤脲酶和蛋白酶活性的影响
Figure 5. Biochar-based urea and common urea effects on activities of urease and protease in Ph. edulis forest soil
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由表3可见：在所有处理下，土壤N2O通量与土壤温度、WSON、脲酶和蛋白酶活性均呈极显著相关(P＜0.01)；与NH4 +-N质量分数呈现显著相关性(P＜0.05)；但与土壤含水量均无显著相关性。在ck、HU、LBU和HBU处理下，毛竹林土壤N2O排放通量与土壤NO3 −-N和MBN质量分数均呈显著相关(P＜0.05)，在LU处理下毛竹林土壤N2O排放通量与土壤NO3 −-N和MBN质量分数无显著相关性。
表 3 毛竹林土壤N2O通量与土壤因子的相关性
Table 3. Relationships between soil N2O efflux and environmental factors in a Ph. edulis forest
土壤因子 各处理土壤N2O与土壤因子的相关性 ck LU HU LBU HBU R2 P R2 P R2 P R2 P R2 P 土壤温度 0.75 ＜0.01 0.68 ＜0.01 0.77 ＜0.01 0.78 ＜0.01 0.62 ＜0.01 土壤含水量 0.18 ＞0.05 0.13 ＞0.05 0.16 ＞0.05 0.24 ＞0.05 0.20 ＞0.05 土壤NH4 +-N 0.73 ＜0.01 0.32 ＜0.05 0.30 ＜0.05 0.51 ＜0.01 0.46 ＜0.01 土壤NO3 −-N 0.47 ＜0.01 0.23 ＞0.05 0.31 ＜0.05 0.51 ＜0.01 0.52 ＜0.01 土壤WSON 0.46 ＜0.01 0.71 ＜0.01 0.68 ＜0.01 0.59 ＜0.01 0.48 ＜0.01 土壤MBN 0.51 ＜0.01 0.23 ＞0.05 0.35 ＜0.05 0.66 ＜0.01 0.76 ＜0.01 土壤脲酶 0.77 ＜0.01 0.52 ＜0.01 0.69 ＜0.01 0.90 ＜0.01 0.89 ＜0.01 土壤蛋白酶 0.78 ＜0.01 0.50 ＜0.01 0.62 ＜0.01 0.82 ＜0.01 0.75 ＜0.01 -
本研究发现，不同水平尿素处理均显著提高了毛竹林土壤N2O年累积排放量；高水平炭基尿素处理显著减少了土壤N2O年累积排放量。CORRÊA等[33]研究发现：尿素施用显著增加了暖季牧场土壤N2O的排放，李正东等[34]对小麦Triticum aestivum田土壤添加不同类型的炭基肥，发现与常规施肥相比，炭基复合肥显著降低了土壤N2O的排放通量，减排幅度为56.0%~65.4%，这与本研究结果相似。施用炭基尿素减少土壤N2O排放的原因可能是炭基尿素中的生物质炭增加了土壤孔隙结构，改善了土壤通气性，吸附了大量活性氮组分，从而显著降低了土壤反硝化速率，在一定程度上降低了N2O的排放速率[35-36]。
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本研究中，在ck、LU、HU、LBU和HBU处理下，土壤温度与毛竹林土壤N2O通量均呈现极显著相关性。该结果与DENG等[37]的研究结果相一致。DUAN等[38]研究温室菜地土壤发现：土壤N2O排放通量与土壤温度也具有十分密切的关系。因此，土壤温度是驱动土壤N2O排放变化的重要环境因子。但是，本研究结果发现不同处理之间的土壤温度没有显著差异，说明炭基尿素和尿素并不是通过改变土壤温度来影响土壤N2O排放。这一发现与BAYER等[39]的结果一致，其研究表明土壤N2O排放受不同管理措施影响，但这种影响不是通过改变土壤温度所致。
另外，本研究中，在ck、LU、HU、LBU和HBU处理下，土壤N2O通量与含水量之间的相关性均未达到显著水平。以往的研究结果也表明：人为管理的草甸草原土壤N2O排放与土壤含水量之间也无相关性[40]；而ADELEKUN等[41]的研究结果表明：尿素处理下，土壤水分与N2O通量存在显著相关性。不同研究结果的差异可能是由土壤类型、植被类型、集约管理措施和气候条件的差异所致[42-43]。在本研究中，土壤N2O排放与含水量之间无相关性可能是因为在亚热带地区降雨量充足，大部分季节土壤含水量均较高[44-45]，因此，土壤含水量可能不是驱动土壤N2O排放变化的关键因子。
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本研究发现，相比于ck，炭基尿素和尿素处理下的土壤NH4 +-N和NO3 –-N质量分数均显著增加，其原因可能是炭基尿素和尿素中的氮素成分可以显著增加土壤有机氮库[46]。另外，本研究结果表明：在ck、HU、LBU和HBU处理中，土壤NH4 +-N和NO3 –-N质量分数与N2O通量存在显著相关；在LU处理中，土壤NH4 +-N质量分数与N2O通量也存在显著相关。但尿素处理增加了N2O通量，炭基尿素处理降低了N2O通量。上述结果表明：尿素处理通过增加NH4 +-N和NO3 –-N质量分数来增加土壤N2O排放[43]；而炭基尿素处理并不是通过影响NH4 +-N和NO3 –-N质量分数来降低土壤N2O排放。
与ck相比，HU处理显著增加了土壤WSON质量分数，而炭基尿素处理显著降低了土壤WSON质量分数，并且土壤N2O通量与WSON质量分数极显著相关。WSON质量分数降低的可能原因可能是：①炭基尿素减少了土壤中有机氮化合物的降解[47]；②炭基尿素中生物质炭成分具有很高的比表面积，可以吸附可溶性的有机氮，从而降低WSON质量分数[28]。这些结果表明：炭基尿素处理可能是通过减少土壤WSON质量分数从而降低土壤N2O通量。
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本研究发现：炭基尿素处理显著降低了蛋白酶活性，HBU处理显著降低了土壤脲酶活性。这与ZHOU等[43]的结果相一致。炭基尿素处理下脲酶和蛋白酶活性降低的原因可能是：①炭基尿素处理中生物质炭成分具有较高的比表面积和阳离子交换量，可以吸附活性有机碳和有机氮，从而降低其对土壤微生物的生物有效性[48-50]；②炭基尿素处理中生物质炭成分对有机物的吸附作用，降低了参与氮循环过程中的土壤酶活性[50-53]。另外，本研究发现：在炭基尿素处理中土壤N2O通量与脲酶和蛋白酶活性极显著相关。这表明炭基尿素处理抑制脲酶和蛋白酶活性可能是其减少土壤N2O通量的机制之一。
尿素处理显著增加了土壤蛋白酶和脲酶活性，这与LIU等[54]的结果相一致。LIU等[54]的研究表明：化肥处理显著提高了玉米Zea mays土壤脲酶活性。SAHA等[55]也发现：在旱作大豆Glycine max-小麦轮作体系中，施用化肥显著提高了土壤蛋白酶活性。尿素处理下土壤脲酶和蛋白酶活性升高的机制可能是由于尿素施入提高了土壤氮素的有效性，从而增加了氮循环过程中相关酶的底物，提高了酶的活性[5,10]。此外，尿素处理下，土壤N2O通量与脲酶和蛋白酶活性极显著相关。上述结果说明：尿素处理刺激脲酶和蛋白酶活性可能是其提高土壤N2O通量的机制之一。
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尿素处理显著增加了毛竹林土壤N2O的年累积排放量，而炭基尿素处理显著降低了毛竹林土壤N2O的年累积排放量。这表明：相比于尿素，施用炭基尿素可以减缓毛竹林土壤N2O的排放。此外，本研究结果表明：炭基尿素减少土壤WSON质量分数以及抑制脲酶和蛋白酶活性可能是其降低土壤N2O排放的重要机制；尿素处理增加土壤N2O排放的重要机制是其提高了土壤WSON和NH4 +-N质量分数以及脲酶和蛋白酶活性。综上所述，在人工林经营管理实践中，采取施用炭基尿素来代替施用尿素的措施，在给植物提供充足氮素养分并改善土壤理化性质的同时，可以减少土壤温室气体的排放。
Effects of biochar-based urea and common urea on soil N2O flux in Phyllostachys edulis forest soil
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摘要:
目的 探索生物质炭基尿素和普通尿素的施用对毛竹Phyllostachys edulis林土壤氧化亚氮(N2O)通量与环境因子的影响效应与作用机制，为研发减缓土壤N2O排放的施肥技术提供科学依据。 方法 2018年9月至2019年9月，在杭州市临安区青山镇亚热带典型毛竹林样地布置野外控制试验。试验设5个处理：对照(不施肥)、低水平尿素(100 kg·hm−2)、高水平尿素(300 kg·hm−2)、低水平炭基尿素(100 kg·hm−2)和高水平炭基尿素(300 kg·hm−2)。采用静态箱—气相色谱法测定毛竹林土壤N2O排放速率，分析在上述施肥处理下土壤N2O通量、温度、含水量、氮素形态及相关酶活性的动态变化规律。 结果 低水平尿素和高水平尿素处理使毛竹林土壤N2O的年累积排放通量增加了17.3%和36.0%，而低水平炭基尿素和高水平炭基尿素处理分别使其降低了3.1%和16.9%。尿素和炭基尿素处理均显著提高土壤铵态氮(NH4 +-N)和硝态氮(NO3 –-N)质量分数(P＜0.05)；尿素处理显著增加了土壤水溶性有机氮质量分数以及脲酶和蛋白酶活性，而炭基尿素处理显著降低了上述3个指标(P＜0.05)。另外，在上述5个处理下，毛竹林土壤N2O排放速率与土壤温度、NH4 +-N、水溶性有机氮、脲酶活性和蛋白酶活性均存在显著相关性(P＜0.05)。 结论 与尿素相比，炭基尿素对毛竹林土壤N2O具有显著的减排效应，主要机制是其降低了土壤水溶性有机氮质量分数和氮循环相关酶活性。图5表3参55 Abstract:Objective The aim of this study is to explore the effect and mechanism of the application of biochar-based urea and common urea on soil N2O flux and environmental factors in Phyllostachys edulis forest, so as to provide scientific basis for the development of fertilization technology to reduce soil N2O emissions. Method A field control experiment was carried out in a typical subtropical Ph. edulis forest in Qingshan Town, Lin’an District of Hangzhou from September 2018 to September 2019. 5 treatments were set up: control (ck), low-level urea (100 kg·hm−2), high-level urea (300 kg·hm−2), low-level biochar-based urea (100 kg·hm−2) and high-level biochar-based urea (300 kg·hm−2). Soil N2O flux of Ph. edulis forest was determined by static chamber-gas chromatography, and the dynamic changes of soil N2O flux, temperature and water content, nitrogen forms and related enzyme activities were analyzed under the above fertilization treatments. Result Low-level urea and high-level urea treatments increased the annual cumulative N2O emission by 17.3% and 36.0%, while low-level biochar-based urea and high-level biochar-based urea treatments reduced it by 3.1% and 16.9%, respectively. Both urea and biochar-based urea treatments significantly increased soil NH4 +-N and NO3 –-N concentrations (P＜0.05). Urea treatment significantly increased the concentration of soil water-soluble organic nitrogen and activities of urease and protease, while biochar-based urea treatment significantly decreased the values of these 3 indicators (P＜0.05). In addition, under the above 5 treatments, there was a significant correlation between soil N2O emission rate and soil temperature, NH4 +-N, water-soluble organic nitrogen, urease and protease activities. Conclusion Compared with urea, biochar-based urea has a significant reduction effect on soil N2O flux in Ph. edulis forest, and the key mechanism lies in that biochar-based urea reduces concentration of soil water-soluble organic nitrogen and activities of N-cycling enzymes. [Ch, 5 fig. 3 tab. 55 ref.] -
Key words:
- Phyllostachys edulis forest /
- N2O /
- biochar-based urea /
- N form /
- fertilization
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林产品生长具有一定的地域特征。一些特定地区的林产品因具备某些优秀品质，更受消费者的青睐，然而普通消费者难以通过产品外观或其他物理特性区分特定产地和其他产地的产品。受经济利益的驱使，有些商家伪造产品产地或掺假蒙骗消费者，损害了消费者和原产地的利益，因此，需要一种分析技术能识别林产品的产地，鉴定产品的真伪。稳定同位素技术在溯源和掺假鉴别方面有着较好的优势，目前已应被用于农产品[1]和食品领域[2]。为推动这项技术在林产品领域中的应用，在广泛查阅国内外文献的基础上，对稳定同位素技术在林产品中的溯源和鉴别应用研究进行综述及展望。
1. 稳定同位素技术的基本原理
具有相同质子数，不同中子数的同一元素的不同核素互为同位素。其中不具有放射性的同位素称为稳定同位素，其来源有2种：一部分是由放射性同位素衰变之后的稳定产物，例如206Pb和87Sr等；另一部分是自然界本身存在的天然稳定同位素，例如12C和13C，18O和16O等。
利用稳定同位素可以鉴别不同种类的产品以及追溯产地来源的原理：①自然界中的植物因其固碳方式不同，可分为C3植物(如小麦Triticum aestivum，水稻Oryza sativa，大豆Glycine max，棉花Gossypium spp.等)，C4植物(如玉米Zea mays，甘蔗Saccharum officinarum，高粱Sorghum bicolor，苋菜Amaranthus tricolor等)和CAM植物(如仙人球Echinopsis tubiflora，芦荟Aloe vera，龙舌兰Agave americana以及景天Sedum erythrostictum等)，不同种类的植物碳同位素比值(δ13C)分布不同，其中C4植物为-14‰~-10‰，CAM植物为-30‰~-10‰，C3植物为-35‰~-22‰[3]。②同一种生物体因受气候、环境和生物代谢的影响，导致同位素在生物体内产生分馏，使得不同地区的生物体体内的碳、氢、氧、氮等同位素的丰度不同[4]。
由于稳定同位素在自然界中的含量很低，很难用绝对值来表达同位素的差异，同时人们更加关心的是同位素组成的微小变化，因此国际上常用同位素比值δ表示。公式为：
$ \delta = ({R_{样品}}/{R_{标准}} - 1) \times 1\;000{\rm{‰ }}。 $
(1) 式(1)中：R样品为所测样品中的重同位素与轻同位素丰度之比，即：13C/12C，D/H，18O/16O和15N/14N。R标准为国际标准样中，δ13C以维也纳-PeeDee箭石标准(V-PDB)为基准，δ18O和δD以平均海洋水(SMOW)为基准，δ15N以大气中的氮气(N2-atm)为基准。通过同位素质谱仪(IRMS)可以精确地测定同位素比值。
2. 稳定同位素技术在林产品溯源研究中的应用
某些林产品出自不同的产地会存在品质和性能上的差异。另外，随着人们生活水平的提高，道地性产品得到推崇，消费市场对某些产品的原产地有所要求。普通消费者很难通过外观判别特定产地和普通产地的商品，容易买到冒牌产地的产品[5]。建立林产品的溯源体系既能够保护原产地的利益，也能够确保产品质量，保护消费者的利益。目前，稳定同位素技术已用于经济林产品，如水果、林产饮料、木本油料等的产地溯源。
2.1 水果
猕猴桃有很强的地域特征，马奕颜等[6]采集了陕西省(周至县、眉县)，四川省和湖南省的中华猕猴桃Actinidia chinensis样品，检测其δ13C，δD和δ15N以及维生素C、维生素E和总糖。结果发现：单个元素的判别率较低，其中δD和δ15N对产地的判别略优于δ13C，而δ13C，δD和δ15N三者结合，对3个省总体的判别率也仅为57.8%，对周至县、眉县亚地区的判别率为80%。利用线性判别-主成分分析(LDA-PCA)，δ13C，δD和δ15N结合维生素C、维生素E和总糖含量，3个省的总体判别率提高至88.9%，对亚地区的判别率提升至93.3%。
LONGOBARDI等[7]采集了阿普利亚地区(40°47′N，17°06′E)和艾米利亚罗马涅(44°35′N，11°13′E)的樱桃Cerasus pseudocerasus样品，艾米利亚罗马涅地区的δ13C，δ18O和δD的平均值分别为-26.5‰，33.2‰和-38.5‰；阿普利亚地区的δ13C，δ18O和δD的平均值分别为-26.4‰，35.4‰和-30.7‰。从艾米利亚罗马涅到阿普利亚，δ13C，δ18O和δD都有不同程度的增加，由于北方(艾米利亚罗马涅)到南方(阿普利亚)气候、环境改变导致同位素分馏。利用δ13C，δ18O和δD三者的线性判别分析，对2个地区的判别率为94.9%；此外，通过电子鼻检测技术，采用3个不同的分析模型(VES1，VES2和VES3)，得到最高的判别率只有89.7%。这说明稳定同位素技术相比于其他检测手段在溯源领域确实有着较好的优势。
胡桂仙等[8]研究了浙江、福建、云南、贵州和江苏等地区杨梅Myrica rubra的稳定同位素和多元素的特征，采用LDA-PCA方法对不同地区的杨梅进行判别，其中浙江省杨梅的准确判别率为99.6%，福建省为90.3%，云南、贵州、江苏省样品归为一类，其准确判别率为98.4%。陈历水等[9]研究了黑加仑Ribes nigrum果实的碳氮同位素，发现两者联合对黑加仑产地溯源的准确率达86.9%。
2.2 木本油料
橄榄Canarium album油有着极佳的天然保健、美容功效以及理想的烹调用途，其物理特性和化学成分因不同的品种和地理环境而有所不同。CAMIN等[10]利用δ13C，δ18O，δD以及镁、钾、钙、钒、锰、锌、铅、锶、铯、镧、铈、钐、铕及铀这14种元素对橄榄油的产地进行线性判别，准确率达95.0%。PORTARENA等[11]测定了意大利沿海岸7个产地的38个初榨橄榄油样品，由于都是沿海地区，气候环境条件相似，7个产地δ13C和δ18O变化范围较小，分别为-30.2‰~-27.5‰和21.7‰~26.5‰，发现单独用δ13C和δ18O很难判别不同的产地，采用与拉曼光谱相结合，线性判别分析7个产地初榨橄榄油样品的准确判别率为82.0%，对于其中5个产地的判别率为100%。FRANCESCA等[12]连续追踪了3 a意大利9个产地初榨橄榄油的δ13C和δ18O值，由此建立的地理模型能够清晰地判别意大利北方、中南部的第勒尼安、中央亚得里亚海、西西里岛和撒丁岛初榨橄榄油。
2.3 其他林产品
MAGGI等[13]研究了来自希腊、伊朗、意大利、西班牙藏红花Crocus sativus香料中的16种特征参数(着色程度、藏红花苦甙、藏红花醛等)以及碳氢氮同位素比值，发现若只通过16种特征参数对4个产地的判别率为60.7%，而结合δ13C，δD和δ15N值，采用后交叉验证得到100%的判别率。
西洋参Panax quinquefolius是一种地域性的药材，制成的西洋参片同样具有地域特征。TIAN等[14]首先测定了中国山东、北京、吉林，加拿大，美国的西洋参δ13C，δD，δ18O和δ15N，分别为-28.52‰~22.19‰，-43.41‰~90.6‰，18.3‰~30.5‰以及-2.46‰~3.97‰。由于δD，δ18O和δ15N与地域的相关性较大，因此利用δD，δ18O和δ15N建立模型，对4个产地的判别率为88%。此外，西洋参制成药片前后δD，δ18O和δ15N没有变化，表明上述模型同样适用于判别西洋参药片的产地。利用该模型对药店购买的10盒西洋参药片进行产地判别，成功地区分了来自美国的7盒产品和来自中国北京的3盒产品。
李国琛[15]采集了辽宁、吉林、黑龙江、陕西、湖北、湖南和广西7个产地的五味子Schisandra chinensis样品，发现δ13C和δ15N是追溯五味子产地的良好指标，同时进一步发现五味子中的δ15N与相应地区土壤样品中的δ15N和氮含量呈正相关性。
在追溯产品的体系时，首先要保证收集样品的产地准确无误。通过测定样品的δ13C，δD，δ18O和δ15N，或者其中的几种同位素比值，采用线性判别方法对数据进行判别分析。如果采用单个同位素指标判别，则需达显著差异(P＜0.05)时才能判别。有时，还需结合其他的分析检测，将产品的同位素比值测定结果与其他有效成分(如维生素C，维生素E和总糖)的指标结合，同时用线性判别方法，以提高产地的判别率。
3. 稳定同位素技术在林产品鉴别研究中的应用
目前，市场销售产品的掺假有2种：一种是C4植物某些成分对C3植物产品的掺杂，如果汁中加入玉米糖浆、C4植物油对C3植物油的掺杂；另一种是外源的水分、乙醇等的掺杂，如苹果醋中加入人工合成的乙酸、天然来源的香精香料中添加工业用料、植物与动物源产品的掺杂等。这些掺杂行为会损害消费者的利益，甚至影响消费者健康，也使企业在不公平的竞争中受到侵害。为了稳定市场，避免消费者购买到假冒产品，打假鉴别势在必行[5]。稳定同位素技术适用于对林产品的鉴别掺假。目前大多集中在林产饮料、木本草本油料以及某些香精香料方面。
3.1 林产饮料
在林产饮料方面主要是一些水果汁的掺假鉴别。MAGDAS等[16]研究发现：往纯正果汁中加入不同比例的自来水，果汁中的δ18O和δD随着自来水比例的增加而减小，自来水体积分数从9%增加到41%，δ18O和δD分别从-5.5‰和-51.4‰减小到-7.5‰和-59.7‰。δ18O所占的比例与自来水添加的百分比很接近。在往苹果汁(C3)中添加蔗糖(C4)后，发现δ13C的变化与蔗糖的含量存在着线性变化。以此对8种市售水果汁检测，结果发现：其中4种的δ18O和δD异常高，分别大于-6.5‰和-50.0‰，认为这4种添加了自来水；而这4种中的3种，其δ13C也异常的高，大于-14.6‰，认为添加了蔗糖或者玉米糖浆。
GUYON等[17]采用高效液相质谱联用同位素比例质谱(HPLC-IRMS)，分离并检测了25个真实柑橘Citrus reticulata类果汁的有机酸、葡萄糖、果糖的δ13C。将葡萄糖的δ13C值分别与有机酸、果糖的δ13C值建立散点图，发现样品呈现一定的分布区间。对30个市售的果汁样品(6个浓缩果汁、24个“纯果汁”)检测发现某些市售果汁中的有机酸葡、萄糖、果糖δ13C远大于真实果汁的δ13C，认为添加了外源性C4类的有机酸、外源性糖；利用散点图模型验证发现：有10个市售“纯果汁”其有机酸的δ13C值超出了模型中的置信区间，说明“纯果汁”并不纯。
在国内，牛丽影等[18]利用稳定同位素技术对非浓缩果汁和浓缩果汁进行鉴别，发现非浓缩果汁中的δ18O和δD要高于浓缩果汁。李鑫等[19]采用液相色谱联用同位素比例质谱(LC-IRMS)研究发现橙汁中的多种糖组分(葡萄糖、果糖等)的δ13C能用于橙汁掺假鉴别。徐生坚等[20]发现：外源性糖浆的δ18O要比果汁中的δ18O低，且小于25.0‰，根据果汁的δ18O也能鉴别果汁掺假。除了普通的橙汁饮料掺假，水果醋类饮料也有掺假现象，此类饮料的掺假主要是添加了玉米来源的冰乙酸。钟其顶等[21]研究发现：苹果醋中乙酸的δ13C与玉米来源冰乙酸的掺入量具有线性正相关关系。利用该研究检测了20个市售苹果醋饮料的δ13C，发现其中6个δ13C明显高于正常范围，认为有玉米来源的冰乙酸添加。此外研究还扩展到石榴Punica granatum汁[22]、苹果Malus domestica汁[23]等。
3.2 木本油料
角鲨烯和角鲨烷是常用的保健品，能从橄榄油和深海鲨鱼中提炼而出。欧盟禁止从鲨鱼中提炼角鲨烯、角鲨烷，但是从鲨鱼中提炼产量高，成本低，导致很多不法厂家依然掺杂从鱼类中提炼的角鲨烯、角鲨烷。FEDERICA等[24]发现从橄榄油提炼出的角鲨烯、角鲨烷的δ13C平均值为-28.4‰±0.5‰，比从鲨鱼中提炼出的-20.5‰±0.7‰要低。角鲨烯、角鲨烷的δ13C与鲨鱼中提炼的角鲨烯、角鲨烷的掺入量呈线性正相关关系，且一旦掺入量体积分数高于10%就能鉴别。鉴于此，对4个标明橄榄油提炼市售样品检测，发现有1个样品添加了体积分数为70%的鲨鱼提炼出的角鲨烯或者角鲨烷，2个样品添加了体积分数为20%的鲨鱼提炼出的角鲨烯或者角鲨烷。郭莲仙等[25]研究发现：纯橄榄油的全油δ13C要小于掺假橄榄油，同时表明，植物油的脂肪酸组成联合植物全油、主要脂肪酸的δ13C值能综合判别植物油掺假。
3.3 香精香料
FEDERICA等[26]结合气相联用质谱(GC-MS)和气相联用火焰离子化检测(GC-FID)发现玫瑰Rosa rugosa精油的δ13C平均值为-27.5‰，典型的C3植物，而一般的掺假精油来源于C4植物，且5%~8%的掺入量难以通过玫瑰精油的中的δ13C平均值检测。FEDERICA发现玫瑰精油的成分乙酸香叶酯、香叶醇的δ13C值没有随C4精油的掺入量发生改变，可以用于玫瑰精油掺假鉴别。BONACCORSI[27]检测了莱姆Citrus aurantifolia精油中α-苹烯、苧烯、β-苹烯等多个组分的δ13C值，通过多组分的折线图比较了市售莱姆精油和真实莱姆精油各组分δ13C值的差异，发现市售精油中有5瓶掺假。
SCHMIDT等[28]采用稳定同位素技术检测香草醛的掺假，发现天然香草醛的δ13C值为-16.8‰~ -21.5‰，而人工合成的香草醛的δ13C值为-24.9‰~36.2‰，因此可以用碳同位素比值检测天然香草醛的掺假。GREULE等[29]测定香草醛分子以及香草醛甲氧基上的δ13C和δD，并将2组δ13C和δD用散点图分析，建立了判别香草醛掺假的区间。
利用稳定同位素技术鉴别时，往往选取产品中的某一种或者几种组分测定研究。此时，需要其他仪器的辅助，比如HPLC-IRMS和GC-IRMS等，将待测组分分离后检测。掺假鉴别一般研究的是δ13C同位素的比值，这主要是由于市面上的掺假大部分为C4成分对C3成分的掺假，此外也有与氢、氧、氮等同位素相结合分析。研究过程必须要有真实的样品，对其所测的数据与其他待检样品的数据比较，才能得出最终的结果。
3.4 在有机产品认证研究中的应用
有机产品是指不使用人工合成物质如化学农药、化肥、植物生长调节剂、饲料添加剂等通过有机生产体系生产出来的产品，它与绿色食品和无公害食品共同组成中国的安全食品。中国政府自2002年起在全国范围内全面推进“无公害食品行动计划”，旨在实现中国食用农林产品的无公害生产，保障消费安全。对有机产品，除了需要对产地进行认证外，还要求在产品的加工、包装、运输、储存、销售过程中不受到污染，同时需要有完善的质量控制、跟踪审查体系，以及可靠的产品认证方法。稳定同位素技术以δ15N为判定指标，进行植物性有机产品与普通产品的区别。因为植物性有机产品不允许使用氮肥，只能使用有机肥料，研究发现氮肥的δ15N值接近于0，而有机肥料的δ15N值较高，施用有机肥料的植物通过同位素分馏使得有机产品的δ15N高于普通产品[30-31]。
RAPISARDA等[32]分别检测了2种橙子Citrus的δ15N，发现有机橙子中果肉蛋白质和氨基酸的δ15N值都要高于普通橙子，利用这2个参数对有机橙子的鉴别率能达90.63%。CAMIN等[33]检测了橙子、草莓Fragaria × ananassa，柑橘的δ13C，δ2H，δ18O，δ15N和δ34S以及其他的物理化学参数(pH、葡萄糖、果糖等)，发现根据δ15N值、抗坏血酸和固体可溶物能够有效鉴别有机产品，但是δ15N容易受到水果种类、年份、种植地区的影响。冯海强等[34]发现与施尿素的茶树Camellia sinensis相比，施有机肥的茶树其茶叶的δ15N明显要高，因为有机肥为粪便，其本身的δ15N就高，表明根据δ15N判别有机茶叶具有可行性。
4. 稳定同位素技术的优、缺点
稳定同位素技术的优点有：①灵敏度高。用于检测的样品只需几毫克甚至零点几毫克，极大方便了低含量组分的检测。②实验过程简单快速。使用高自动化的同位素质谱仪，许多样品可以直接检测，避免了繁琐的提取和纯化工作。③适用范围广。在掺假鉴别过程中，普通方法难以检测结构相似的掺假物，而稳定同位素技术利用同位素的比值及分布能鉴别这一类物质；④安全环保。稳定同位素没有放射性，且实验过程中不会造成二次污染。这些优点使得稳定同位素技术的使用越来越广。
然而该技术还存在一些不足之处。首先，稳定同位素技术所需设备较为昂贵，普通实验室难以配备，使得样品的分析成本高。其次，该技术在鉴别、溯源时，如果不同的地区具有相似的环境，则同位素比值分布差异性有可能不显著，这将对产品的溯源造成一定的困难。因此，在使用稳定同位素技术时还需考虑多方面的因素。
5. 结语
稳定同位素技术在追溯林产品产地来源、鉴别掺假、有机产品认证等方面有着重要的作用。但是，目前，稳定同位素技术对林产品产地溯源及鉴别主要源于植物自身代谢导致的同位素分馏效应，由于中国幅员辽阔，气候、纬度等因素也对稳定同位素分馏有一定影响，因此植物生长机理与产地环境之间的关系需要深入研究，并将研究结果深入推广，使之能够用于更多林产品的溯源和鉴别问题。单一元素指标难以达到检测目的，可研究采用多元素，多种化合物检测，并利用LDA-PCA对测定结果进行分析，或联用其他的检测手段HPLC-IRMS和GC-IRMS等，进行有效成分的深入研究，及分子内的稳定同位素分布研究，从而建立更为可靠的林产品检测方法和溯源识别体系。
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图 1 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤N2O通量的影响
Figure 1 Effects of biochar-based urea and common urea on soil N2O fluxes in a Ph. edulis forest
图 2 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤N2O年累积排放量的影响
Figure 2 Biochar-based urea and common urea effects on annual cumulative soil N2O effluxes in a Ph. edulis forest
图 3 炭基尿素和普通尿素对毛竹林土壤温度和含水量的影响
Figure 3 Biochar-based urea and common urea effects on soil temperature and moisture content in a Ph. edulis forest
图 4 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤不同形态氮组分的影响
Figure 4 Biochar-based urea and common urea effects on different soil N fractions in a Ph. edulis forest
图 5 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤脲酶和蛋白酶活性的影响
Figure 5 Biochar-based urea and common urea effects on activities of urease and protease in Ph. edulis forest soil
表 1 不同施肥处理对9个响应变量影响的重复测量方差分析
Table 1. Repeated measures ANOVA for the effects of different fertilization treatments on nine response variables
项目 土壤温度 土壤含水量 NH4 +-N NO3 −-N WSON MBN 脲酶 蛋白酶 N2O 处理 ns ns ** ** ** ns ** ** ** 处理后时间 ** ** ** ** ** ** ** ** ** 处理×处理后时间 ** * ** ** ** ** ** ** ** 说明：ns表示影响不显著; *表示影响显著(P＜0.05); **表示影响极显著(P＜0.01) 
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表 2 炭基尿素和尿素对毛竹林土壤环境因子年均值的影响
Table 2. Biochar-based urea and common urea effects on annual mean value of soil environmental factors in a Ph. edulis forest
处理 NH4 +-N/
(mg·kg−1)NO3 −-N/
(mg·kg−1)WSON/
(mg·kg−1)MBN/
(mg·kg−1)脲酶/
(μmol·g−1·h−1)蛋白酶/
(μmol·g−1·h−1)ck 6.96 d 2.44 e 15.5 b 42.3 ab 1.15 b 0.88 c LU 9.52 b 3.34 b 16.1 b 43.1 a 1.28 a 0.97 b HU 11.84 a 3.60 a 16.9 a 43.3 a 1.33 a 1.03 a LBU 8.72 c 2.85 d 14.5 c 41.1 b 1.11 b 0.86 d HBU 9.14 bc 3.02 c 13.5 d 42.4 ab 1.00 c 0.77 e 说明：不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)
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表 3 毛竹林土壤N2O通量与土壤因子的相关性
Table 3. Relationships between soil N2O efflux and environmental factors in a Ph. edulis forest
土壤因子 各处理土壤N2O与土壤因子的相关性 ck LU HU LBU HBU R2 P R2 P R2 P R2 P R2 P 土壤温度 0.75 ＜0.01 0.68 ＜0.01 0.77 ＜0.01 0.78 ＜0.01 0.62 ＜0.01 土壤含水量 0.18 ＞0.05 0.13 ＞0.05 0.16 ＞0.05 0.24 ＞0.05 0.20 ＞0.05 土壤NH4 +-N 0.73 ＜0.01 0.32 ＜0.05 0.30 ＜0.05 0.51 ＜0.01 0.46 ＜0.01 土壤NO3 −-N 0.47 ＜0.01 0.23 ＞0.05 0.31 ＜0.05 0.51 ＜0.01 0.52 ＜0.01 土壤WSON 0.46 ＜0.01 0.71 ＜0.01 0.68 ＜0.01 0.59 ＜0.01 0.48 ＜0.01 土壤MBN 0.51 ＜0.01 0.23 ＞0.05 0.35 ＜0.05 0.66 ＜0.01 0.76 ＜0.01 土壤脲酶 0.77 ＜0.01 0.52 ＜0.01 0.69 ＜0.01 0.90 ＜0.01 0.89 ＜0.01 土壤蛋白酶 0.78 ＜0.01 0.50 ＜0.01 0.62 ＜0.01 0.82 ＜0.01 0.75 ＜0.01
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