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香榧绿藻Chlorella sp.是一种附着在榧树Torreya grandis枝、叶表面的粗糙灰绿色苔状物[1]。近些年，随着香榧T. grandis ‘Merrillii’种植面积的不断扩大，香榧病害发生率也在逐年攀升。现阶段香榧绿藻病害主要依赖石硫合剂等除藻剂进行防治，效果较明显，但存在抗药性以及会对环境造成二次污染等问题[2]。为保证榧农收益并贯彻可持续发展的理念，研发设计一种新型绿色灭藻剂具有重要意义。
近几年利用植物源物质对藻类进行抑制的研究不断开展，并且植物源物质作为抑藻剂具有见效快、易控制、生态安全性高等特点[3]。大蒜油作为一种提取自大蒜Allium sativum的天然产物，主要成分是二烯丙基硫化物(DAS)、二烯丙基二硫化物(DADS)和二烯丙基三硫化物(DATS)[4−5]。已有研究证明：大蒜油具有生物活性作用，已被应用于医学、食品、抑菌等各个领域[6−8]。有研究表明：以β-环糊精包封大蒜油纳米颗粒，能够通过控制释放来延长大蒜油的活性，但这需要很高的包封率(75%~90%)[9−10]。SALEHI等[11]研究发现：银纳米粒子和大蒜油的联合作用可有效治疗耐药性微生物菌株引起的皮肤感染。STREHLOW等[12]将大蒜油封装于乳糖形成的微球中，开发出一种用于治疗肺部疾病的微粒制剂。由此可见，科研人员通过改性包封大蒜油来改善其挥发性强、气味强烈、不溶于水等物理化学特性，但改性过程都较复杂，包封率较低[13]。因此急需一种新型的方法，在保存大蒜油的同时扩大其适用性，保证其杀菌效果的同时又弥补其易挥发等不足。微乳液恰好能够兼顾两者。微乳液是指由水、油、表面活性剂以及少量助表面活性剂自发形成的透明或半透明并带有淡蓝色光泽的热力学稳定体系，粒径为10~100 nm，具有良好的稳定性、两亲性等特点[14−15]。微乳技术解决了微胶囊化技术包埋率低的问题[16]。有研究表明：表面包埋技术能降低油品的氧化速率[17−19]。将大蒜油制备成微乳液不仅能克服诸多加工技术限制，而且在一定程度上掩盖了大蒜油的刺激性气味。另外，100 nm以下的大蒜油微乳液更有利于进一步对其进行封装和加工[20]。随着微乳液在药物制备、采油、微生物反应器、纳米颗粒合成等方面的广泛应用，大蒜油制备成微乳液将具有广阔的市场价值，这对大蒜油的推广应用具有重要意义[21−23]。
基于以上分析，本研究分析了表面活性剂和助表面活性剂与大蒜油之间的质量配比对水包油微乳液形成条件的影响以及粒径分布特征，测试了最佳条件制备的大蒜油微乳液的离心、温度、pH稳定性以及抑藻效果。
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材料与试剂：大蒜油(江苏正大清江制药有限公司)，槐糖脂(化学纯，陕西亿康龙生物技术有限公司)，吐温80 (Tween 80，化学纯)，司盘80 (Span 80，化学纯)，丁二酸二辛酯磺酸钠(多库脂钠，化学纯)，无水乙醇(分析纯)，正丁醇(分析纯)，苏丹Ⅲ(分析纯)，亚甲基蓝(分析纯)均购自上海麦克林生化科技有限公司。香榧绿藻来自浙江农林大学林业与生物技术学院。
仪器与设备：MS104TS 型电子分析天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司)；DF-101S 型集热式磁力搅拌器(上海聚昆仪器设备有限公司)；紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技公司)；DT-300型zeta粒度分析仪(康塔仪器公司)。
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运用相转变法制备大蒜油微乳液。按照预定比例称取一定量的表面活性剂、助表面活性剂和大蒜油混合均匀，使混合表面活性剂与大蒜油质量比为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9。在磁力搅拌器的持续搅拌下，向其中缓慢滴加水相，当体系由浑浊变为澄清时，停止滴水，记录此时各相质量百分比，以油相、水相、表面活性剂(含助表面活性剂)混合物相作为顶点，标出各临界点并连线即得大蒜油微乳区。
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根据GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[24]，分别以槐糖脂、Tween 80、Span 80、丁二酸二辛酯磺酸钠作为表面活性剂，无水乙醇作为助表面活性剂，固定表面活性剂与助表面活性剂的质量比为1∶1。按照1.2.1的方法制备大蒜油微乳液，并对微乳液状态进行细致描述[25]。结果见表1。
表 1 不同表面活性剂对微乳液形成的影响
Table 1. Effects of different surfactants on the formation of microemulsion
表面活性剂种类 不同表面活性剂与大蒜油质量比对微乳液的影响 9∶1 8∶2 7∶3 6∶4 5∶5 4∶6 3∶7 2∶8 1∶9 槐糖脂 − =− − =− − =− − =− − =+ − =+ − =+ − =+ − Tween 80 − − − =− − =− − =− − =− − × × Span 80 =− − =+ − =++ − =× − =× − =× ++ =+ − =× + =× ++ 多库脂钠 − − + + =++ − =++ − =++ ++ + + + + 说明：澄清透明(−)；较透明(+)；浑浊(+ +)；静置分层(=)；白色浊液(×)；分层，上下层均透明(=− −)；分层，上层较透明，下层透明(=+ −)；分层，上层浑浊，下层透明(=++ − )；分层，上层白色浊液，下层透明(=× −)；分层，上层白色浊液，下层较透明(=× +)；分层，上层白色浊液，下层浑浊(=× ++)。 -
分别以丙三醇、无水乙醇、正丁醇、无水乙醇与正丁醇按质量比1∶1混合为助表面活性剂，将表面活性剂与助表面活性剂按质量比1∶1混合。按照1.2.1的方法配制大蒜油微乳液，并根据微乳区域面积选择最适助表面活性剂。
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以Tween 80、正丁醇为助表面活性剂，比较5、25、45 ℃条件下大蒜油微乳液面积，确定最佳实验温度。
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在单因素实验的基础上，采用L9(33)混合正交实验，选取混合表面活性剂与大蒜油质量比A(λ)、助表面活性剂与表面活性剂质量比B(Km)、制备温度C(T)为因素，大蒜油粒径为考察对象进行3因素3水平正交实验。正交实验因素水平如表2所示。
表 2 正交实验因素表
Table 2. Orthogonal experiment factor table
水平 A(λ) B(Km) C(T)/℃ 1 4∶6 1∶2 5 2 5∶5 1∶1 25 3 6∶4 2∶1 45 -
分别向已制备好的等体积大蒜油微乳液中滴入苏丹Ⅲ和亚甲基蓝溶液。亚甲基蓝为水溶性染料，苏丹Ⅲ为油溶性染料。若亚甲基蓝在微乳液中扩撒速率快，且易分散，则为水包油型(O/W)型微乳液；若苏丹Ⅲ扩散速率快，且易分散，则为油包水型(W/O型)微乳液。
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将大蒜油微乳液在不同的转速(5000和10000 r·min−1)离心15 min，观察微乳液状态，在220 nm下测定其吸光度，并与未离心的微乳液(对照)的吸光度进行比较，按公式(1)计算透光率[26]。
$$ T = \frac{{{A_0}}}{{{A_1}}} \times 100\%。 $$ (1) 式(1)中：T为透光率(%)，A0为离心前微乳液吸光度，A1为离心后微乳液吸光度。将微乳液在不同温度条件下(−20、4、25、37、80 ℃)储存6 h，恢复室温后，在220 nm 下测定其吸光度，并与室温下微乳液的吸光度进行比较，按公式(1)计算透光率。将大蒜油微乳液加入到不同pH (1、5、9、13)溶液中，测定其在220 nm 波长下的吸光度，并与室温下微乳液吸光度作比较，按公式(1)计算透光率。
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用20 mL二甲基亚砜配制8 g·L−1大蒜油微乳液母液，向藻液中滴入0.5、4.0 mL大蒜油微乳液母液，使溶液最终体积为100 mL，大蒜油微乳液最终质量浓度为40、320 mg·L−1，实验组3个平行，对照组滴入等量二甲基亚砜，在第4、8、12 天观察藻液颜色变化，并运用血小板计数法，记录藻细胞密度变化。抑藻率计算公式如下：
$$ R_{{\rm{I}}} = \frac{{N_{{\rm{0}}} - N_{{\rm{S}}}}}{{N_{{\rm{0}}}}} \times 100\% 。 $$ (2) 式(2)中：RI为抑制率(%)，N0为对照组藻细胞密度，NS为处理组藻细胞密度。
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采用SPSS 26.0分析数据，并运用Origin 2018和Graphad prism 8绘制图形。
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按照1.2.1方法制备大蒜油微乳液并绘制拟三元相图，通过观察微乳液的状态、品相和计算微乳区面积(以总面积为1计)，考察表面活性剂对大蒜油微乳液形成的影响。结合表1和图1可知：4种表面活性剂中Span 80乳化效果不理想，各比例均存在明显分层现象，并随着油相质量的增加，品相越来越浑浊，难以形成微乳液。这表明Span 80并不适合作为制备大蒜油微乳液的表面活性剂。Tween 80的微乳区面积为14.42%，乳化效果最优，在表面活性剂相与大蒜油质量比为9∶1、8∶2、7∶3时，可形成外观澄清透明的微乳液，表面活性剂相与大蒜油质量比为6∶4、5∶5、4∶6、3∶7时，仅有少量浮油形成，表面活性剂相与大蒜油质量比为2∶8、1∶9时则为白色乳浊液。槐糖脂在制备大蒜油微乳液的过程中容易出现大油滴，仅表面活性剂相与大蒜油质量比为9∶1时能够形成较好的微乳液，微乳区面积为11.23%。多库脂钠微乳区面积为12.62%，在表面活性剂相与大蒜油质量比9∶1、8∶2时能够形成品相良好的微乳液，但随着油相质量的增加，品相开始分层并出现浑浊现象，并且浮油居多。这说明在相同环境下，同等质量的Tween 80较槐糖脂、多库脂钠能够增溶更多的大蒜油，更好地形成微乳液，多余的油会以浮油形式存在于微乳液上层，形成WinsorⅠ型微乳体系[27]。
图 1 不同表面活性剂对微乳液的影响
Figure 1. Effects of different surfactants on microemulsion
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实验发现：丙三醇作为助剂时无论如何改变表面活性剂与大蒜油质量比(Km)值，都无法形成大蒜油微乳液，其原因可能是大蒜油在丙三醇中溶解度低。由图2可知：用无水乙醇、正丁醇以及两者质量比1∶1混合作为助表面活性剂的微乳区面积分别为12.76%、15.89%、20.76%；不添加助剂的面积仅有11.46%。说明助表面活性剂的加入有明显的增溶效果。使用正丁醇作为助表面活性剂时，大蒜油微乳液均未出现分层现象。这说明正丁醇能够增溶更多质量的大蒜油(图3A)，其原因可能是正丁醇具有4个碳原子，表现出优于无水乙醇的亲水亲油性能。以质量比为1∶1混合两者作为助表面活性剂时，増溶效果最为明显，并且在质量比为6∶4、5∶5、4∶6时所形成的大蒜油微乳液品相较单独使用正丁醇的大蒜油微乳液具有更明显的丁达尔现象，这说明前者所形成的大蒜油微乳液粒径更小(图3B)。这可能是因为正丁醇具有良好的亲脂性，无水乙醇具有良好的亲水性，两者混合嵌入表面活性剂分子之间，与表面活性剂共同构成界面膜，分布在互不相溶的2种液体的接触界面上，改变界面膜的曲率，降低了界面膜张力，增加了界面流动性，促使微小液滴的形成，进而增大微乳区的面积和微乳液的稳定性[28]。
图 2 不同助剂的大蒜油微乳液拟三元相图
Figure 2. Quasi-ternary phase diagram of garlic oil microemulsion under different additives
图 3 不同体系下的大蒜油微乳液丁达尔现象
Figure 3. Tyndall phenomenon of garlic oil microemulsion under different systems
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以Tween 80为表面活性剂，以质量比1∶1混合无水乙醇和正丁醇作为助表面活性剂，在表面活性剂与助表面活性剂质量比为1∶1条件下，探讨不同制备温度对大蒜油微乳液的影响(图4)。45和5 ℃所形成的微乳区面积分别为15.14%、13.31%，均远小于25 ℃处理下所形成的微乳区面积(20.63%)，这与前人研究结果一致[29]。因此，选择25 ℃为大蒜油微乳液的制备温度，此时可达到最大的増溶效果。
图 4 不同温度下的大蒜油微乳液拟三元相图
Figure 4. Quasi-ternary phase diagram of garlic oil microemulsion under different temperatures
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如表3所示：以粒径为评测指标，3因素排序为A＞B＞C；以分级评分为指标，3因素排序为B＞A＞C。粒径与分级评分的最优方案均为A1B3C2，即混合表面活性剂与大蒜油质量比为4∶6，无水乙醇、正丁醇和Tween 80质量比为1∶1∶1，制备温度为25 ℃。有效粒径(d97)为20.1 nm，多分散系数(PDI)为0.144 (图5)。
表 3 正交实验结果
Table 3. Orthogonal experimental results
实验号 A(λ) B(Km) C(T)/℃ 粒径/nm 分级评分 1 1 1 1 59.3 92.5 2 2 3 3 87.2 90.1 3 1 2 3 65.5 91.7 4 2 1 2 105.2 89.4 5 3 1 3 139.6 82.4 6 1 3 2 20.1 96.3 7 3 3 1 43.0 93.7 8 3 2 2 129.2 84.8 9 2 2 1 154.7 81.4 粒径 K1 144.9 304.1 257 K2 347.1 349.4 254.4 K3 311.8 150.3 292.3 R 202.2 199.1 37.9 分级评分 K1 280.5 260.3 267.6 K2 260.9 257.9 270.5 K3 260.9 280.1 261.2 R 19.6 22.2 9.1 说明：微乳液状态分级评分：Ⅰ级. 为澄清透明黄色溶液，流动性好(91~100)；Ⅱ级. 澄清透明伴有淡蓝色光泽，流动性较好(81~90)；Ⅲ级. 半透明伴有淡蓝色光泽溶液(61~80)；Ⅳ级. 分层，乳化效果不好，有浮油(60以下)。 
图 5 A1B3C2大蒜油微乳液粒径分布
Figure 5. Particle size distribution of A1B3C2 garlic oil microemulsion
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由图6可以明显观察到：亚甲基蓝溶液在大蒜油微乳液中均匀分布，而苏丹Ⅲ则扩散缓慢，并出现分层现象。说明制备的大蒜油微乳液为水包油型(O/W型)微乳液。
图 6 亚甲基蓝(左)和苏丹Ⅲ(右)在大蒜油微乳液中的扩散结果
Figure 6. Diffusion results of methylene blue (left) and Sudan Ⅲ (right) in garlic oil microemulsion
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按照A1B3C2重复制备5个批次大蒜油微乳液，并在5 000和10 000 r·min−1下离心15 min，设5次重复。结果表明：对照的微乳液透光率为95.43%，5 000 r·min−1离心后微乳液的透光率为94.18%，10 000 r·min−1离心后微乳液的透光率为93.52%。这说明大蒜微乳液在高速离心后，微乳颗粒发生聚集现象，透光率有所降低，但透光率均高于90%，聚集程度较小，因此大蒜油微乳液具有较高的离心稳定性。
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如图7A所示：在25和37 ℃下，微乳体系保持着较高的透光率。80 ℃下，大蒜油微乳液透光率低于37 ℃以及对照，并且存在极显著差异(P＜0.01)，原因可能是Tween 80中的氢键不稳定，其亲水性随温度升高而降低，造成微乳体系的稳定性降低[14]。在5 ℃处理下的大蒜油微乳液透光率有所下降，但微乳液透光率略大于90%，且与25 ℃以及室温和对照之间无明显差异(P＞0.05)，说明微乳液的稳定性较好，与−20 ℃之间存在显著差异(P＜0.05)。这表明低温条件对大蒜油微乳液的影响要小于高温条件，大蒜油微乳液更适合在常温条件下储存。
图 7 大蒜油微乳液的温度和pH稳定性
Figure 7. Temperature and pH stability of garlic oil microemulsion
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如图7B所示：不同pH对大蒜油微乳液透光率的影响与对照组之间均不显著。其原因可能是Tween 80是非离子型表面活性剂，亲水性受酸碱浓度的影响较小，所以大蒜油微乳液的pH稳定性良好。此结果与前人研究一致[17]。
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图8为添加不同质量浓度大蒜油微乳液后，藻液状态的变化情况。对照组第12天藻液颜色较第0 天时明显加深，表明藻液生长状态良好。添加40、320 mg·L−1大蒜油微乳液的处理组藻液颜色在第4、8、12天均呈不同程度的减退，最后发黄直至透明。如图9所示：第0 天时对照组与处理组之间无明显差异，第4、8、12天时，对照组与处理组之间均存在显著差异(P＜0.05)，第12 天时，40和320 mg·L−1处理组之间无显著差异(P＞0.05)，这说明随着培养时间的延长，低质量浓度(40 mg·L−1)与高质量浓度(320 mg·L−1)大蒜油微乳液之间的药效差异逐渐减小。第12 天时，40 mg·L−1处理组抑藻率为80.65%，320 mg·L−1处理组抑藻率为82.54%，可能是因为微乳液体系使低质量浓度大蒜油能够缓慢释放并持续作用于藻液[30−31]。
图 8 大蒜油微乳液的抑藻效果
Figure 8. Algae inhibition effect of garlic oil microemulsion
图 9 不同质量浓度大蒜油微乳液对香榧绿藻藻细胞密度的影响
Figure 9. Effects of different concentrations of garlic oil microemulsion on the algal density in Chlorella sp.
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采用相转变法制备大蒜油微乳液，从不同表面活性剂、助表面活性剂中筛选最佳组分，确定制备大蒜油微乳液的最佳制备条件为：Tween 80/无水乙醇/正丁醇为混合表面活性剂，其中：m(Tween 80)∶m(无水乙醇)∶m(正丁醇)为1∶1∶1，混合表面活性剂与大蒜油质量比为4∶6，制备温度为25 ℃。在该条件下制备的大蒜油微乳液外观澄清透明伴有淡蓝色光泽。该体系能在常温以及较低温度下保存，透光率高，稳定性良好。320 mg·L−1大蒜油微乳液抑藻率为82.54%。
Preparation and algae inhibition of garlic oil microemulsion
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摘要:
目的 将大蒜油加工制备成大蒜油微乳液，以期提高大蒜油的稳定性，并开发新型植物源灭藻剂。 方法 运用相转变法和拟三元图探讨表面活性剂和助表面活性剂种类以及质量比(Km)对大蒜油微乳液体系形成的影响并进行正交实验。考察了以最优条件制备的大蒜油微乳液在不同温度、不同pH以及5 000和10 000 r·min−1离心条件下的稳定性，并进行了大蒜油微乳液抑藻实验。 结果 最佳制备条件为25 ℃、以吐温80 (Tween 80)为表面活性剂，乙醇和正丁醇为助表面活性剂，三者质量比为1∶1∶1，混合表面活性剂与大蒜油质量比为4∶6。所得微乳液为黄色澄清透明状液体并伴有淡蓝色光泽，有效粒径为20.1 nm，多分散系数为0.144。320 mg·L−1大蒜油微乳液的抑藻率为82.54%。 结论 成功制备的水包油型大蒜油微乳液，稳定性良好，粒径大小合适，抑藻效果明显，有望制备成新型的灭藻剂。图9表3参31 Abstract:Objective This study aims to prepare microemulsion from garlic oil in order to improve the stability of garlic oil and develop a new type of plant-derived algaecide. Method The effects of surfactant and co-surfactant types and mass ratio (Km) on the formation of garlic oil microemulsion system were investigated by phase transition method and pseudo-ternary diagram, and orthogonal experiments were carried out. The stability of garlic oil microemulsion prepared under the optimal conditions under different temperature, pH and centrifugation conditions of 5 000 and 10 000 r·min−1 was investigated, and the algae inhibition of garlic oil microemulsion experiment was carried out. Result The optimum preparation conditions were 25 ℃, Tween 80 as surfactant, ethanol and n-butanol as co-surfactants. The mass ratio of the three was 1∶1∶1, and the mass ratio of mixed surfactant and garlic oil was 4∶6. The obtained microemulsion was yellow clear transparent liquid with light blue luster. The average particle size was 20.1 nm and the polydispersity coefficient was 0.144. The algae inhibition rate of 320 mg·L−1 garlic oil microemulsion was 82.54%. Conclusion The successfully prepared oil-in-water type garlic oil microemulsion has good stability, suitable particle size, and obvious algae inhibitory effect. It is expected to be a new algaecide. [Ch, 9 fig. 3 tab. 31 ref.] -
Key words:
- garlic oil microemulsion /
- pseudo-ternary phase diagram /
- surfactant /
- Chlorella sp.
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在植物细胞中，内膜系统(endomembrane system)是一个由多种细胞器组成的精密网络，负责囊泡运输和细胞内物质的精确分配。这一系统在植物的生长发育以及应对各种环境胁迫(如高温、干旱等)起着不可或缺的作用[1]。这些细胞器包括内质网(endoplasmic reticulum, ER)，高尔基体(golgi)，反式高尔基体网络/早期内吞体(trans-golgi network/early endosome, TGN/EE)，液泡前体/多囊泡体/晚期内吞体(prevacuolar compartment/multivesicular body/late endosome, PVC/MVB/LE)，自噬体(autophagosome)和液泡(vacuole)等[2]。在液泡转运途径(vacuolar transport pathway)中，蛋白质在内质网中合成，然后被包装进COPⅡ (coat proten Ⅱ)囊泡中，运送到高尔基体进行进一步的修饰。经过TGN/EE的转运，这些蛋白质被分选到MVB/PVC/LE中，最终运输至液泡行使功能或降解。内吞体分选转运复合物(endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)是一类在真核细胞内质膜系统中高度保守的蛋白质复合物[3]。ESCRT特异性调控PVC/MVB/LE的生成以及从PVC/MVB到液泡/溶酶体的蛋白质分选[4−5]。它在细胞质或质膜中的蛋白质修饰和运输中发挥关键作用，对蛋白质分泌途径、内吞作用以及各种重要的信号通路都有重要贡献[3, 6−7]。
作为固着生物，植物需要不断监测环境变化，这些变化的环境往往不利于植物的生长发育，包括非生物胁迫如盐胁迫、干旱胁迫，生物胁迫如病原体感染。植物为了应对这些不利条件，已经进化出有效而复杂的响应系统[8−9]。在干旱条件下，植物细胞中的脱落酸(abscisic acid, ABA)开始积累，形成ABA-PYRABACTIN RESISTANCE (PYR)/PYR-LIKE (PYL)/REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTORS (RCAR)-2C型蛋白磷酸酯酶(2C-type protein phosphatases, PP2C)三元复合物和SnRK2 (SNF1-related protein kinase 2) 结合。这种结合导致SnRK2被磷酸化，激活下游基因，积极调控ABA信号响应基因表达[10]。在盐胁迫条件下，植物感知到过量的Na+ 并激活盐过度敏感(salt over-sensitivity, SOS)途径，随后SOS2激酶和质膜定位的Na+ 抗转运蛋白SOS1发挥作用，将多余的Na+ 排出细胞，促进植物的生存和生长[8−9, 11]。植物在与病原体长期的“博弈”中演化出2套免疫系统，即模式诱导免疫(pattern-triggered immunity, PTI)和效应诱导免疫(effector-triggered immunity, ETI)。植物通过细胞膜上的受体蛋白识别病原体携带的一些分子，激活PTI以抵抗病原体入侵。另一类受体，核苷酸结合亮氨酸重复蛋白(nucleotide-binding leucine-rich repeat protein, NLR)，感知毒性蛋白，触发ETI，随后激活更强烈的免疫反应[12−13]。
植物细胞中，内膜运输和泛素介导的蛋白质降解途径在胁迫相关货物分子的正确递送中起着重要作用。ESCRT复合体是调节货物蛋白运输和降解的蛋白复合物之一。本研究总结了近年来ESCRT介导的内膜运输系统在植物胁迫响应中的研究进展，以期为构建精准的ESCRT介导逆境响应分子调控网络提供参考。
1. ESCRT复合物的组成和生物学功能
在后生动物和真菌中，ESCRT复合体主要由5个亚基组成：ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ和VPS4 (vacuolar protein sorting 4)/SKD1 (suppressor of K+ transport growth defect 1)[7, 14]。然而，在植物中没有发现ESCRT-0亚基的同源蛋白，但是拟南芥Arabidopsis thaliana基因组编码9种TOLs蛋白 (TOM1-like proteins)[15−16]。TOLs蛋白具有保守的VHS[VPS27, HRS (hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate)]和STAM (signal transducing adaptor molecule)结构域，能有效地与泛素结合并行使与ESCRT-0类似的功能[16−18]。此外，在植物中鉴定了其他ESCRT相关蛋白，包括FREE1 (FYVE domain protein required for endosomal sorting 1)[2, 4]、ALIX (apoptosis-linked gene-2 interacting protein X)[19]、PROS (SKD1 positive regulatory factor)[20−21] 和BRAF (Bro1-domain protein as FREE1 suppressor)[22]。
1.1 ESCRT-0
ESCRT-0复合物是由2个异聚亚基VPS27/HRS和Hse1 (Hbp STAM, EAST1)/STAM按照数量1∶1构成的多价泛素结合蛋白复合体[5, 23]。VPS27含有1个PSAP基序，可与ESCRT-Ⅰ亚基Vps23结合，从而募集异四聚体ESCRT-Ⅰ [24]。ESCRT-0含有GAT (GGA and Tom1)结构域[25]和多个泛素结合结构域，包括UIM (ubiquitin-interacting motif)结构域和位于氨基末端的VHS结构域[23]。它的主要功能是识别泛素化蛋白并富集底物[2]，除此以外，还具有招募网格蛋白(clathrin)、泛素化连接酶及去泛素化酶的作用[26]。
1.2 ESCRT-Ⅰ
ESCRT-Ⅰ复合物由亚基VPS23/TSG101、VPS28、VPS37和MVB12 (MVB sorting factor of 12 kDa)按照1∶1∶1∶1 的数量比组装而成[14, 27]。ESCRT-Ⅰ与位于复合物两端的ESCRT-0和ESCRT-Ⅱ相互作用[28]。酵母细胞中，在VPS23/TSG101的N末端的UEV (ubiquitin E2 variant)结构域与ESCRT-0的P[S/T]-AP基序相互作用[2]。VPS28通过C末端四螺旋束与ESCRT-Ⅱ组分VSP36中的GLUE (GRAM-like ubiquitin binding in EAP45)结构域相互作用[29]。VPS37含有位于N端的碱性α螺旋(N-terminal basic helix, NTBH)，能结合酸性膜脂，通过高度柔性区域连接到核心结构[25]。ESCRT-Ⅰ负责将泛素化的膜货物分子分拣到MVB[14, 27]。
1.3 ESCRT-Ⅱ
ESCRT-Ⅱ复合物是一种Y型异源四聚体，由亚基VPS22/EAP30、VPS36/EAP45和VPS25/EAP20以1∶1∶2的数量比例组成的。VPS22通过CC (coiled-coil)结构域与VPS36的C末端结合形成主干[30]。VPS36通过其N端GLUE结构域与ESCRT-Ⅰ组分蛋白VPS28相互作用，从而识别泛素化蛋白。VPS25通过与VPS20相互作用，促进ESCRT-Ⅲ复合物组分的募集和组装[30]。ESCRT-Ⅱ主要通过与ESCRT-Ⅰ协同，有选择地招募泛素化货物分子。
1.4 ESCRT-Ⅲ
ESCRT-Ⅲ复合物由4个核心亚基组成，即VPS2/CHMP2 (charged multivesicular body protein 2)、VPS20/CHMP6、VPS24/CHMP3和SNF7/CHMP4。此外还有3种辅助蛋白，即Did2 (Doa4-independent degradation2)/CHMP1、VPS60/CHMP5和IST1 (increased sodium tolerance 1)。ESCRT-Ⅲ的MIM (MIT interacting motif )可以与VPS4结合，中间柔性区域包括至少1个CC结构域[31−32]。ESCRT通路激活后，VPS20首先被VPS25招募并激活，然后SNF7被多聚化[28]。随后，VPS24桥接SNF7与VPS2[33]，进入内吞体后VPS24与VPS2结合。最后，VPS2招募ATP酶VPS4，而Did2招募Vta1或IST1完成组装[26]。ESCRT-Ⅲ主要驱动PVC/MVB腔内囊泡 (intraluminal vesicle, ILV)的形成[31−32]。
1.5 VPS4/SKD1
VPS4/SKD1复合物属于AAA-ATP酶蛋白家族。该复合物也被称为VPS4/SKD1-LIP5 (lyst-interacting protein 5)，通过水解ATP促进ESCRT-Ⅲ复合物从PVC/MVB上脱落，分解进入下一个循环[33]。SKD1通过C端的富含α螺旋结构域与LIP5相互作用[34]。LIP5丰度的增加可能会增强SKD1的活性，有助于植物在逆境条件下的耐受性[34]。VPS4/SKD1在维持细胞内ESCRT复合物的稳定性和参与细胞内物质的降解中起着至关重要的作用。
1.6 FREE1
FREE1是双子叶植物中特有的ESCRT蛋白，在酵母和动物中均未发现其同源蛋白。FREE1的N端区域具有富含脯氨酸和谷氨酰胺的内在无序区(intrinsically disordered region, IDR)、1个保守的FYVE结构域和C端的CC结构域[4, 35]。FREE1通过N端富含脯氨酸的区域(proline-rich region)与ALIX相互作用[21]，通过FYVE结构域，FREE1选择性地识别并结合磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidyl inositol-3-phosphate, PI3P)，最终定位于MVB [36]。FREE1在植物的生长发育过程、泛素化蛋白的内吞体分选等细胞活动中都是必不可少的[36]。此外，FREE1能与植物自噬调节蛋白SH3P2 (SH3 domain-containing protein 2)发生相互作用，并与磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidyl inositol-3-kinase, PI3K)复合物结合，调节植物自噬降解[37−38]。
1.7 ALIX
ALIX代表了一种进化上保守的ESCRT-Ⅲ相关蛋白，可介导G蛋白偶联受体PAR1和 P2Y1的泛素非依赖性分选到ILV进行降解[39]。在结构上，ALIX具有N端Bro1结构域、中央V结构域和柔性的C端富含脯氨酸的区域[40]。Bro1结构域负责将SNF7募集到囊泡膜上[33]，V结构域充当泛素结合结构域，促进ALIX与泛素化蛋白的相互作用[41]。在货物蛋白运输过程中，ALIX严格调节了ESCRT-Ⅰ和ESCRT-Ⅲ复合物的活性，这在控制ABA受体蛋白的丰度和促进其降解等方面起着重要作用[41]。最近的研究阐明了ALIX的非常规ESCRT功能，ALIX通过与逆转运复合体(retromer complex)的核心亚基相互作用来调节可溶性蛋白质的液泡分选[2, 42]。这项研究进一步揭示了植物中液泡运输和内吞体循环途径之间存在交互关系。
2. ESCRT复合体调节植物干旱胁迫反应
干旱是影响植物正常生长发育的非生物胁迫之一。干旱能破坏渗透调节系统，导致细胞脱水并合成ABA，进而导致气孔闭合、活性氧(ROS)积累和光合作用抑制[10]。ABA信号通路的核心成分包括可溶性ABA受体PYR/PYL/RCAR、PP2C和SnRK2。 PYR/PYL/RCAR受体通过PP2C依赖性SnRK2激活调节ABA转录反应[43−44]。在干旱条件下，ABA浓度的升高导致ABA与PYR/PYL/RCAR受体直接结合，形成ABA-PYR/PYL/RCAR复合物。该复合物抑制PP2C，将SnRK2维持在磷酸化的活性状态，随后激活下游转录因子AREB (ABA responsive element binding protein)/ABF(ABRE binding factor)和阴离子通道SLAC1 (Slow anion channel 1)[45]，正向调节ABA响应基因的表达[10, 46]。
PYR/PYL/RCAR受体(PYR1、PYL4、PYL8和PYL9)的泛素化发生在质膜上，由CRL4 (Cullin4-RING E3 ubiquitin ligase)和 RSL1(E3 ubiquitin ligase RING finger of seed longevity 1)触发网格蛋白介导的内吞作用，进而促使了PYR1和PYL4进入囊泡递送至液泡降解，导致ABA信号衰减。ABA受体从质膜到内吞体的转运依赖于ESCRT组分(FYVE1、VPS23A和ALIX)(图1)。这些ESCRT组分直接与未修饰的PYL相互作用[35, 41, 47]，随后ABA受体通过26S蛋白酶体或液泡途径降解。
图 1 ESCRT复合体调控植物ABA信号通路Figure 1 ESCRT complex regulates ABA signaling pathway in plant2.1 VPS23A
VPS23A具有一个泛素偶联酶变体UEV结构域，其中缺乏泛素偶联(ubiquitin-conjugating, UBC)结构域中保守的半胱氨酸，暗示其具有泛素结合能力[48]。作为ESCRT-Ⅰ复合物的组分，VPS23A主要参与质膜货物分子的运输和降解，负调控ABA 信号转导[48]。敲除VPS23A能增强ABA信号通路中关键激酶OST1 (open stomata 1)的活性。VPS23A通过调节OST1的上游关键调控因子，进而在转录和翻译水平上影响关键转录因子的表达。这一过程中，VPS23A不仅识别PYL4，还能识别K63连接的泛素链。此外，VPS23A影响PYR1的亚细胞定位和PYL4的稳定性。说明VPS23A可能识别植物中泛素化和非泛素化的PYLs，从而促进PYLs与PP2C的结合并影响ABA受体的稳定性，从而调节ABA信号转导和抗旱性[47]。此外，有研究表明：去泛素化酶 UBP12/UBP13与E3泛素连接酶XBAT35.2协同调控VPS23A的去泛素化[10]。然而，ubp12和ubp13突变体表现出与vps23a突变体类似的ABA敏感和耐旱性的表型。过表达VPS23A能恢复这些表型。但是VPS23A蛋白的稳定性随着ABA诱导 UBP12/UBP13 蛋白水平的升高而降低。UBP12/UBP13的积累增强了VPS23A的E3连接酶XBAT35.2的去泛素化。XBAT35.2微妙地调节了VPS23A的蛋白质水平，对ABA反应起到了正调节作用[10, 48]。总而言之，UBP12/UBP13通过对VPS23A进行精确的泛素化修饰，间接调控ABA信号转导。这对ABA通路和ESCRT复合体之间的相互作用提供了新的思路。
2.2 FREE1
FREE1蛋白N端(含有1个IDR)以不依赖ABA的方式与ABA受体相互作用[35]，随后RSL1蛋白将PYL4募集到内吞体表面。在干旱条件下，FREE1可通过异位磷酸化激活，与RSL1形成复合物，并将磷酸化信号转导至RSL1。从而启动钙信号、ROS通路等关键胁迫信号通路，激活靶基因，增强抵御外界环境胁迫的能力。有研究表明：free1突变体表现出对ABA的超敏反应[50]。free1突变体中ABA受体的液泡运输受阻，导致PYL4积累和对ABA的反应性增强。这项研究证明了FREE1在ABA受体从质膜转运到内吞体/液泡降解中的功能。此外，FREE1还在细胞核中转录抑制ABA信号转导作用[50−51]。ABA处理后，SnRK2激酶与FREE1相互作用，磷酸化C端CC结构域中的丝氨酸残基。随后FREE1向细胞核中迁移。进入细胞核后，FREE1就会与碱性亮氨酸拉链转录因子(basic leucine zipper transcription factor, bZIP) ABA反应元件结合因子4 (ABA-responsive element binding factor 4, ABF4)和ABA不敏感因子5 (ABA-insensitive 5, ABI5)相互作用，减弱它们与顺式调节序列下游基因的结合，从而抑制转录活性，削弱ABA反应并减轻ABA对植物生长的抑制[11]。具有C端部分缺失或磷酸化丝氨酸位点突变的free1-c端突变体植物，避免了free1功能缺失突变体的胚胎致死性，并在正常生长条件下表现出正常的液泡分选和植物发育。这些研究证明了FREE1磷酸化的缺失和入核受阻会增强植物对ABA的响应，说明了内膜转运和ABA信号在转录水平上相互关联。暗示了植物ESCRT蛋白FREE1在细胞质和细胞核中具有双重功能[50]。
2.3 ALIX
有研究表明：ALIX参与调节植物气孔开闭和ABA受体的降解。ALIX能直接与 PYR/PYL/RCAR受体相互作用，通过抑制CRL4和E3泛素连接酶来促进PYL8的积累[52−53]。ALIX与PYL的相互作用可能依赖于C端的IDR区域。ALIX的Bro1结构域中260位的甘氨酸突变为天冬氨酸能破坏其与PYL和VPS23A的相互作用，暗示了这个在维持货物与受体复合物完整性中的作用，并为alix-1突变体对ABA的超敏反应提供了分子基础[41, 54]。ALIX功能受损会导致亚细胞定位发生改变，进而过度积累PYR/PYL/RCAR受体，这意味着ALIX作为负调节因子参与ABA信号通路的调控[41]。
2.4 LIP5
LIP5 (lyst-interacting protein 5)作为SKD1的正调节因子，激活SDK1的ATP酶活性[55]。LIP5属于Vtal家族，是一种参与各种生物过程的ESCRT-Ⅲ相关蛋白。它在ABA介导的信号转导中发挥关键作用来正向调节抗旱性[56]。在正常条件下，LIP5蛋白不稳定，细胞中丰度较低[57]。LIP5的表达受到ABA和干旱的诱导，其过表达会导致植物的ABA超敏反应，造成气孔过度闭合，减少水分流失，从而提高耐旱性。相反，lip5突变体表现出ABA不敏感的表型，这个表型进一步说明了LIP5在抗旱中的作用[56]。
3. ESCRT复合体调节植物盐胁迫响应
土壤盐碱化是严重影响植物生长发育的非生物胁迫之一，在世界范围内给作物生产造成了巨大损失[58−59]。盐胁迫会升高细胞渗透压，导致钠积累。遭受盐胁迫后，植物可通过调节离子稳态、激活渗透胁迫途径、激活激素信号通路，以及调节细胞骨架动力学和细胞壁组成等多种机制进行应对[60]。作为保守的盐胁迫响应信号途径，SOS信号通路由钠转运蛋白SOS1、调节蛋白SOS2和SOS3，以及SOS3钙结合蛋白8 (SOS3-like calcium-binding protein 8/ calcineurin b-like protein10, SCaBP8/CBL10)组成。受到盐胁迫后，植物细胞通过SOS3/SCaBP8-SOS2-SOS1的顺序激活而将胞内过量 Na+ 排出，以维持 K+/Na+平衡，保护植物免受盐胁迫[9, 11]。
3.1 SOS信号通路的核心组成部分
SOS途径通过调节盐胁迫下Na+/H+逆向转运蛋白活性来维持离子稳态。SOS1是植物耐盐能力的关键Na+/H+反向转运蛋白，能利用H+梯度来驱动Na+排出细胞，其由定位于质膜的具有12个跨膜结构域的N端和定位于细胞质C端自抑制区域组成[61]。过表达SOS1能维持较高的K+/Na+，因而增强了植物的耐盐性[62]。SOS2被NaCl激活，随后磷酸化SOS3/SCaBP8。被招募到质膜后，SOS2能激活质膜H+-ATP酶，为SOS1的Na+转运活性提供能量[63−64]。SOS3/SCaBP8可以感知盐胁迫诱导的Ca2+升高，在结合Ca2+时与SOS2相互作用，并磷酸化SOS2。SOS3蛋白的中间区域能通过肉豆蔻酰化与质膜相连，并因此将 SOS3/SCaBP8-SOS2复合物招募到质膜，最终磷酸化SOS1增强其Na+/H+逆向转运活性[61]。
盐胁迫可以刺激植物细胞ESCRT复合物的活性和组装，从而促进质膜定位的转运蛋白的内吞作用和降解。因此，盐胁迫信号通路与ESCRT复合体之间的联系对于理解植物响应盐胁迫的机制尤为重要(图2)。
3.2 VPS23A
ESCRT-Ⅰ组分VPS23A通过增强SOS途径调节植物耐盐性[11]。VPS23A与SOS2、SOS3之间均存在相互作用，但不与SOS1互作。VPS23A与SOS2互作促进其泛素化，从而调控SOS2蛋白向质膜的循环再利用。而VPS23A功能缺失突变体对盐胁迫敏感，由于SOS2细胞膜定位减少，导致SOS1的磷酸化水平降低，SOS1活性受到抑制，使得Na+外排能力降低，从而影响植物对盐胁迫的响应。因此，VPS23A的功能是促进SOS2/SOS3复合体的结合来驱动SOS2定位到细胞膜[11]。
3.3 LIP5
LIP5调控的内吞体分选途径是植物响应非生物胁迫的关键细胞过程之一[55]。LIP5与SKD1相互作用提高植物的盐耐受性。LIP5是盐诱导的细胞内活性氧增加所必需的，与盐胁迫反应的信号转导有关。盐胁迫在很大程度上依赖于LIP5刺激植物细胞内吞作用和囊泡运输。在缺乏功能性丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase 3/6, MAPK3/6)的情况下，LIP5蛋白会被快速降解[36]。在盐胁迫下，LIP5被MAPK磷酸化的水平增加，同时稳定性也增加，因而蛋白水平升高。然而LIP5中MAPK磷酸化位点的突变降低了LIP5的稳定性，并破坏了LIP5突变体盐敏感表型回补的可能性[36, 55]。
4. ESCRT参与调控植物的先天免疫
植物在自然生境中会遭受各种生物胁迫，包括各种微生物、病原菌的侵染和植食性昆虫的取食等。植物免疫系统是植物在自然生态系统中生存和生产的基础。植物为抵抗病原菌的入侵，进化出2层先天免疫系统来检测和应对各种生物攻击，分别由细胞表面定位的模式识别受体(pattern-recognition receptors, PRRs)和细胞内核苷酸结合域富含亮氨酸重复序列的受体(nucleotide-binding leucine-rich repeat proteins, NLRs)启动[66]。
4.1 植物先天免疫系统
第1层免疫系统通过PRRs直接识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)或损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)，触发PTI [13]。PTI具有较低的病原体识别特异性，早期不诱导强烈的免疫反应。PTI通过细菌鞭毛蛋白等PAMPs激活MAPK依赖和MAPK不依赖的信号通路[12]。PTI在抑制病原体入侵和维持植物叶片微生物群落的动态平衡方面发挥着重要作用。为了抑制PTI，病原体通常会向植物细胞传递效应物，这些效应物可能被NLR受体蛋白直接或间接识别并激活第2层更强的免疫信号ETI [13]，ETI具有较高的病原体识别特异性，通常表现为与快速程序性细胞死亡相关的超敏反应[12]。PRRs和NLRs发起的信号传导导致了大量重叠的下游细胞反应，包括防御基因表达、ROS产生和胼胝质沉积[13, 67]。在免疫反应早期，NADPH氧化酶RBOHD介导的ROS产生是连接PRR和NLR介导的免疫反应的关键。此外，受体样细胞质激酶BIK1 (Botrytis-induced kinase 1)是ETI期间RBOHD、基因表达和细菌抗性充分激活所必需的[66−67]。flg22是细菌鞭毛蛋白中的一个保守的小肽，它通过识别PRR蛋白FLS2 (flagellin sensing 2)及其共受体BAK1引发免疫反应。flg22是研究最多的PAMP，其诱导的免疫是研究植物与微生物相互作用的最常使用的模式系统之一。
4.2 VPS37-1和 VPS28-2
ESCRT复合体亚基及其相关蛋白的突变通常会导致严重的发育缺陷，然而，vps37-1和vps28-2突变体没有明显的发育缺陷，但都对病原菌感染更敏感，可见VPS37-1和 VPS28-2调控了FLS2的MVB分选，在flg22激活的气孔防御和植物免疫中起着至关重要的作用[68]。
4.3 LIP5
拟南芥LIP5是植物基础防御中病原响应MAPK级联反应的关键靶点，正向调节MVB的生物发生。正常情况下LIP5表达水平较低， 但病原菌诱导后LIP5与MAPK3/6相互作用并磷酸化，LIP5蛋白稳定性和含量得到提升，这对病原体诱导的囊泡运输和植物基础免疫力都非常重要[36]。如盐胁迫响应通路一样，LIP5在植物免疫系统中的关键作用也依赖于其与SKD1的相互作用，进而刺激SKD1的ATP酶活性。虽然LIP5蛋白的MAPK磷酸化位点突变不会影响其与SKD1互作，但会降低其稳定性[36, 55, 69]。
4.4 酵母ESCRT蛋白Vps23、Vps24、Snf7和Vps4
酵母ESCRT蛋白Vps23、Vps24、Snf7和Vps4的表达抑制了病毒在植物宿主中的复制。对番茄丛状突病毒(tomato bushy stunt tombusvirus, TBSV)的全基因组筛选确定了7种参与病毒复制和复制酶复合物组装的ESCRT蛋白[70]。TBSV p33复制蛋白可直接与酵母ESCRT组分Vps23和Bro1相互作用，将Vps23招募到病毒复制相关的过氧化物酶体上。在缺乏ESCRT蛋白的情况下，病毒RNA更容易被核糖核酸酶降解，ESCRT蛋白在复制酶复合体中对病毒RNA起到了保护作用。并且复制酶复合体的精确组装可能依赖于ESCRT蛋白，这种依赖关系可能帮助病毒逃避宿主防御监视系统的识别，并防止基因沉默机制对其RNA的破坏[70]。
5. 总结与展望
随着全球气候变化和生态压力的增加，植物如何应对各种逆境胁迫已经成为植物学和农学领域的重要研究课题。最新研究发现：ESCRT复合体在调控植物胁迫响应中起着关键作用。例如，在干旱胁迫条件下，ESCRT通过调节ABA的积累和运输来帮助植物适应水分不足的环境。在盐胁迫下，ESCRT复合体参与Na+的排出和细胞壁的修复，以减轻盐害对植物的影响。此外，ESCRT还在生物胁迫中发挥作用，如参与植物与病原菌之间的相互作用。本研究总结了ESCRT复合体和相关蛋白参与调控植物非生物和生物胁迫响应分子机制的最新研究(表1)。
表 1 调控逆境胁迫响应的ESCRT复合体蛋白Table 1 ESCRT machineries regulating stress responsesESCRT亚基 基因名(基因编号) 调控胁迫响应中发挥的功能 参考文献 ESCRT-Ⅰ VPS23A(AT3G12400) 与SOS2/SOS3复合物相互作用进而增强耐盐性 [11] 与ABA受体相互作用并介导其液泡降解 [10, 11, 47] VPS28-2(AT4G05000)
VPS37-1(AT3G53120)调节病毒的基因表达，参与病毒粒子的组装和释放 [68] ESCRT-Ⅲ Vps24(AT5G22950)
Snf7(AT2G19830)
Vps4(AT2G27600)保护病毒RNA不受核糖核酸酶的影响 [70] VPS4/SKD1 LIP5(AT4G26750) 调节离子平衡、渗透势和应激相关基因的表达 [36, 55] 促进ABA的合成和信号转导 [56] 影响植物免疫应答的其他信号转导途径 [36, 55, 69] ESCRT相关蛋白 FREE1(AT1G20110) 利用内吞体和非内吞体功能反向调节ABA信号 [35, 50−51] ALIX(AT1G15130) 控制ABA受体的积累 [41, 52−53] 尽管现有的研究已经揭示了诸如FREE1、VPS23A等ESCRT蛋白在植物应对逆境胁迫中的重要作用，但是鉴于ESCRT复合体的复杂性和多样性，其余ESCRT蛋白应对逆境胁迫的功能探索尚处于初级阶段。此外，植物ESCRT蛋白有着数量不等的同源基因，如ESCRT-Ⅰ蛋白VPS23A和VPS23B、ESCRT-Ⅲ蛋白SNF7-1和SNF7-2等，这些同源基因编码的蛋白在调控逆境胁迫响应过程中是发挥不同的功能还是功能冗余尚不清楚。因此有必要深入发掘ESCRT调控植物逆境胁迫响应的分子机制。随着研究技术的更新迭代，超分辨显微镜、3D电子断层扫描成像、光电联用显微镜等更高分辨率的成像技术逐渐应用到细胞生物学领域。在纳米级分辨率下解析不同细胞器的形态特征变化，可以更加透彻地了解ESCRT和PVC/MVB/LE在植物逆境胁迫响应中的功能。总之，对ESCRT介导的内膜运输在调控植物应对逆境胁迫中的研究为农业生产和环境保护提供更多创新的思路和方法。
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图 2 不同助剂的大蒜油微乳液拟三元相图
Figure 2 Quasi-ternary phase diagram of garlic oil microemulsion under different additives
图 3 不同体系下的大蒜油微乳液丁达尔现象
Figure 3 Tyndall phenomenon of garlic oil microemulsion under different systems
图 4 不同温度下的大蒜油微乳液拟三元相图
Figure 4 Quasi-ternary phase diagram of garlic oil microemulsion under different temperatures
图 5 A1B3C2大蒜油微乳液粒径分布
Figure 5 Particle size distribution of A1B3C2 garlic oil microemulsion
图 6 亚甲基蓝(左)和苏丹Ⅲ(右)在大蒜油微乳液中的扩散结果
Figure 6 Diffusion results of methylene blue (left) and Sudan Ⅲ (right) in garlic oil microemulsion
图 9 不同质量浓度大蒜油微乳液对香榧绿藻藻细胞密度的影响
Figure 9 Effects of different concentrations of garlic oil microemulsion on the algal density in Chlorella sp.
表 1 不同表面活性剂对微乳液形成的影响
Table 1. Effects of different surfactants on the formation of microemulsion
表面活性剂种类 不同表面活性剂与大蒜油质量比对微乳液的影响 9∶1 8∶2 7∶3 6∶4 5∶5 4∶6 3∶7 2∶8 1∶9 槐糖脂 − =− − =− − =− − =− − =+ − =+ − =+ − =+ − Tween 80 − − − =− − =− − =− − =− − × × Span 80 =− − =+ − =++ − =× − =× − =× ++ =+ − =× + =× ++ 多库脂钠 − − + + =++ − =++ − =++ ++ + + + + 说明：澄清透明(−)；较透明(+)；浑浊(+ +)；静置分层(=)；白色浊液(×)；分层，上下层均透明(=− −)；分层，上层较透明，下层透明(=+ −)；分层，上层浑浊，下层透明(=++ − )；分层，上层白色浊液，下层透明(=× −)；分层，上层白色浊液，下层较透明(=× +)；分层，上层白色浊液，下层浑浊(=× ++)。 
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表 2 正交实验因素表
Table 2. Orthogonal experiment factor table
水平 A(λ) B(Km) C(T)/℃ 1 4∶6 1∶2 5 2 5∶5 1∶1 25 3 6∶4 2∶1 45
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表 3 正交实验结果
Table 3. Orthogonal experimental results
实验号 A(λ) B(Km) C(T)/℃ 粒径/nm 分级评分 1 1 1 1 59.3 92.5 2 2 3 3 87.2 90.1 3 1 2 3 65.5 91.7 4 2 1 2 105.2 89.4 5 3 1 3 139.6 82.4 6 1 3 2 20.1 96.3 7 3 3 1 43.0 93.7 8 3 2 2 129.2 84.8 9 2 2 1 154.7 81.4 粒径 K1 144.9 304.1 257 K2 347.1 349.4 254.4 K3 311.8 150.3 292.3 R 202.2 199.1 37.9 分级评分 K1 280.5 260.3 267.6 K2 260.9 257.9 270.5 K3 260.9 280.1 261.2 R 19.6 22.2 9.1 说明：微乳液状态分级评分：Ⅰ级. 为澄清透明黄色溶液，流动性好(91~100)；Ⅱ级. 澄清透明伴有淡蓝色光泽，流动性较好(81~90)；Ⅲ级. 半透明伴有淡蓝色光泽溶液(61~80)；Ⅳ级. 分层，乳化效果不好，有浮油(60以下)。
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