香榧瘿螨采自浙江省嵊州市谷来镇（29°41'N，120°38'E），该镇为香榧老产区。香榧瘿螨带回实验室后在室内用新鲜香榧叶片继代饲养，并用体式显微镜对其进行观察。香榧苗来自浙江省诸暨市立勤香榧种植基地长势一致的2+3（2年生实生苗嫁接后再栽培3 a）香榧盆栽苗（盆径25 cm）。

试验于2018年9-10月在浙江农林大学国家林业和草原局林木良种繁育基地温室大棚（30°15'N，119°43'E）内进行。香榧叶条形，近对生于枝条的两侧，上表面光绿色，下表面有2条白色气孔带^[1]。选择健康无病虫害且叶片大小、数量基本一致的香榧1年生成熟枝条，按30头·枝条^-1的虫口密度，用0号带微钩的昆虫针轻轻地将香榧瘿螨接种到枝条叶表上，以未接种瘿螨的盆栽苗为空白对照组。每个处理重复3次，每重复5盆苗。每盆苗之间均保持一定的距离，对每个接螨的枝条于基部节处涂抹凡士林以防止瘿螨爬出供试枝条^[13]，并保持供试枝条隔离无交叉感染。依次在瘿螨侵染的第0天（即健康叶片）、第12天、第25天和第40天，分别剪取2个处理的香榧叶片，将每个重复的叶片各自混匀。采集的叶片用于形态解剖学的观察和总叶绿素质量分数的测定，使用前先用纸巾擦除叶表的瘿螨。

① 叶片组织结构。选取实验叶片靠中间部位切成1 mm × 2 mm大小的块状，将块状叶置于体积分数2.5%的戊二醛溶液中4 ℃条件下固定过夜；然后将样品用磷酸缓冲液（pH 7.0）漂洗3次，用质量分数1.0%的锇酸固定1.5 h，再用磷酸缓冲液漂洗3次；后用300、500、700、800、900、950 g·kg^-1梯度的乙醇溶液逐级脱水，用Spurr包埋剂与丙酮混合液进行渗透过夜；用半薄切片机（瑞典LKB 11800）切片，经亚甲基蓝染色后在正置荧光显微镜（日本OLYMPUS BX 60）下观察、拍照。②叶片气孔带结构。样品双固定、脱水方法同叶片组织结构，经临界点干燥、镀膜后在扫描电镜（日本Hitacbi TM-1000）下观察、拍照。③叶绿体超微结构。样品双固定、脱水、渗透处理方法同叶片组织结构，包埋好的样品用超薄切片机（日本Leica EM UC7）切片，经柠檬酸铅溶液和乙酸双氧铀染液染色后，在透射电镜（日本JEM-1230）下观察、拍照。

采用乙醇浸泡法^[14]，用紫外-可见分光光度计（日本UV-2600）全光谱扫描测定波长665 nm处的吸光值D（665）和649 nm处的吸光值D（649），并按公式计算鲜叶叶绿素质量分数，叶绿素质量分数（mg·g^-1）=0.1×[18.08×D（649）+6.63×D（665）]。数据采用Excel 2007与SPSS 17.0进行分析处理。

体式显微镜下观察螨害下的香榧叶片，发现香榧瘿螨可以吸食为害香榧植株的叶片上、下表面（图 1）。经长期观察发现，成螨多集中于香榧叶片上表面吸食（图 1A~B），并且雌成螨基本在香榧叶背2条白色气孔带上产卵，卵呈透明状的椭球形（图 1B~C）。

图  1  体式显微镜下观察香榧癭螨

Figure 1.  Stereomicroscope observation of N. abiesis

正置显微镜下观察瘿螨为害不同天数的香榧叶片组织结构，发现健康叶片上、下表皮均由一层紧密排列的细胞组成，不含叶绿体，表皮外覆着一层较薄的角质层；气孔器分布在下表皮，略内陷，由2个保卫细胞控制其开闭，周围密生分叉的角质钉（图 2A），这与前人有关榧树属Torreya植物解剖特征的描述^[15-16]一致；叶肉组织发达且明显分化为栅栏组织和海绵组织，栅栏细胞呈长圆柱状，垂直于叶表皮，且排列较紧密，内含较多的叶绿体，海绵细胞呈不规则的椭圆形或圆形，排列较为疏松（图 2A）。随着螨害时间的持续，栅栏组织和海绵组织细胞形状发生改变，但上、下表皮细胞未见有明显破损（图 2B~D）。从螨害第40天的叶片结构可见，栅栏组织厚度明显减小，细胞数量减少，尤其是下表皮上方的栅栏细胞；海绵细胞亦缩水变小，且细胞间隙变大而更为松散；气孔角质钉结构有所破损，保卫细胞缩小（图 2D）。

图  2  瘿蟎为害香榧叶片组织结构的动态变化

Figure 2.  Dynamic changes in the leaf tissue structure on different days after inoculation with mites

扫描电镜下观察健康与螨害第40天的香榧叶片气孔结构，发现健康叶片的气孔呈狭长椭圆形（图 3A~B，示半闭合状态的气孔），被乳突状角质钉包围而内陷，而角质钉高度密集，呈无规则分布（图 3A）。瘿螨为害后的叶片气孔有明显的损伤和萎缩（图 3D）。气孔周围的角质钉上附着有香榧瘿螨的卵（图 3C），卵在样品制备过程中因漂洗等操作而破裂或脱落。完整的卵呈椭圆形，平均大小为49.87 μm×39.48 μm；相比健康叶片，螨害后的角质钉表面附着了更多的絮状绒毛状物（图 3D）。

图  3  健康与螨害40 d香榧叶片气孔的扫描结构的比较

Figure 3.  A comparison in the leaf stomatal structure between healthy and 40-day mite-hurt leaves under the scanning electron microscope

透射电镜下观察瘿螨为害不同天数香榧叶肉细胞超微结构，发现健康叶片的叶肉细胞间有一定的空隙，相邻细胞壁界限明显，细胞内叶绿体数量较多，且紧贴细胞壁分布，线粒体也比较丰富（图 4A）。单个叶绿体的基粒片层垛叠紧密，结构清晰良好，体内嗜锇颗粒不多（图 4E）。随着螨害时间的持续，叶肉细胞逐渐膨胀变形，细胞间隙变大；叶绿体数量逐渐减少，体内出现膨大的淀粉粒；线粒体数量亦减少（图 4B~D）。螨害第12天（图 4F），叶绿体内嗜锇颗粒数量明显增多，基粒片层排列逐渐散乱，结构不清晰，至螨害第25天变得模糊（图 4G）。螨害第40天，叶肉细胞内大部分叶绿体膜被破坏，体内有淀粉粒沉积，并脱离细胞壁散乱地分布在细胞质中，片层结构瓦解甚至消失（图 4H）。

图  4  瘿螨为害香榧叶肉细胞超微结构的动态变化

Figure 4.  Dynamic changes in the ultrastructure of a mite-hurt mesophyll cell

相同螨害天数下，0~12 d处理与对照的叶绿素质量分数无显著差异，但在接种瘿螨25~40 d处理与对照间叶绿素质量分数达差异显著水平，瘿螨处理叶片的叶绿素质量分数下降很快，说明瘿螨为害随着时间的推移影响逐渐增强。瘿螨为害期处理与对照香榧叶片叶绿素质量分数动态发现，对照与处理香榧叶片叶绿素质量分数均呈下降趋势，但对照组0~12 d有轻微的下降，12 d后不同时间点间差异不显著；而螨害处理0~12 d香榧叶片叶绿素质量分数无显著下降，12 d后不同时间点间叶片叶绿素质量分数下降明显，差异显著（P < 0.05），在瘿螨接种第25~40天，叶绿素质量分数从3.91 mg·g^-1下降至3.3 mg·g^-1；螨害第40天与第0天相比，叶绿素质量分数下降了25.34%（图 5）。另外，通过F检验发现：瘿螨为害持续天数对叶绿素质量分数变化有显著影响（F=25.331，P < 0.05）。说明螨害导致叶绿素减少，从而影响叶片进行正常的光合作用。

图  5  瘿螨为害香榧叶片叶绿素质量分数的动态变化

Figure 5.  Dynamic changes in the leaf chlorophyll content with days after inoculatio with mites

逆境胁迫有多种，其中虫害胁迫是常见的一类生物胁迫^[17]。不同胁迫会对植物造成不同程度的为害，同样螨害会引起植物叶片细胞结构^[18]、生理^[19]、生化^[20]等方面的变化，这些变化反映植物体对逆境胁迫的响应。香榧叶片被香榧瘿螨刺吸式取食后，叶片组织细胞在形态结构、生理生化等方面产生了一系列变化。本研究表明：香榧叶片的下表皮上也有栅栏细胞，香榧瘿螨主要为害香榧叶片的叶肉组织，瘿螨为害后栅栏组织厚度明显减小，而栅栏组织是大量叶绿体存在的部位，进而影响叶绿素质量分数。结合体式显微镜下的观察，认为香榧瘿螨在香榧叶片上、下表面都有刺吸取食的行为。实验观察发现，成螨更喜欢在香榧叶片上表面取食，这可能跟与上表皮相连的栅栏组织厚且细胞内容物多有关。寄主植物的叶片下表皮是螨虫躲藏的主要场所，叶片气孔更是螨虫口针探入海绵组织的天然孔道^[8]，持续螨害使得气孔有明显的损伤和萎缩，严重影响了气孔的正常开闭，从而直接影响叶片的蒸腾作用和气体交换。由于保卫细胞内也含有少量叶绿体，推测其也可能是被香榧瘿螨刺吸后缩水变小^[21]。另外，通过体式显微镜观察发现，香榧瘿螨偏好在叶片气孔带上集中产卵，一方面叶片乳突状的结构为卵提供了更好的附着点，另一方面红豆杉属Taxus叶片气孔带的角质乳突具有抵御低温侵袭的功能^[22]，加上植物通过气孔蒸腾失水，气孔处所保持的湿度也为卵提供了合适的孵化条件。此外，叶片气孔密度一直是抗螨性的研究热点，气孔密度与植株抗螨性呈负相关^{[21, 23]}，这为后续选育抗螨性较强的香榧种质提供了研究思路。

叶绿体是植物体内最主要的细胞器之一，它的主要功能是进行光合作用，其结构的完整性与其功能的发挥紧密关联，而叶绿体对环境胁迫又比较敏感^[24]。超微结构研究表明：叶绿体对香榧瘿螨胁迫反应非常敏感。螨害后的叶绿体片层结构受损，膜系统被破坏，影响了光合产物的正常输出，导致叶绿体中有淀粉粒的沉积^[18]，无法进一步降解转化。叶绿体内嗜锇颗粒数量的增加，跟叶绿体的衰老退化有关^[25]，这具有一定的生理学意义。螨害使叶绿体数量减少，叶绿素质量分数减少，叶片逐渐失绿，继而枯萎脱落，直接导致香榧叶片光合能力下降，无法合成更多的养分，进而影响香榧的正常生长。

综上所述，香榧瘿螨吸食破坏了香榧叶片叶肉细胞和气孔器的结构，使得叶绿素质量分数减少，从而影响了香榧叶片正常的光合作用。