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断奶是反刍动物饲养过程中必须经历的一个阶段，而早期断奶是为提高生产效率所采用的技术手段之一。断奶前瘤胃的充分发育为断奶成功实施和缓解断奶应激有着重要的意义[1]。近年来，瘤胃上皮细菌的变化受到研究学者的关注。有研究认为：不同于瘤胃内容物相关的细菌群落[2]，瘤胃上皮细菌群落在幼龄反刍动物中具有某些特定的功能(宿主代谢、免疫应答和瘤胃发育)[3−4]。瘤胃内容物相关细菌受到诸多宿主因素影响，如日粮、年龄、抗生素摄入以及宿主的健康；此外，这些菌群也受到环境因素的影响，如地理位置、季节和饲养方式等[5]。然而上述因素对瘤胃上皮相关菌群影响还未见报道。因此，准确认识瘤胃上皮细菌在反刍动物生长过程中的演化，有利于进一步通过营养手段调控瘤胃上皮细菌的组成，促进瘤胃上皮细菌的尽早成熟，为调控幼龄反刍动物的发育提供新思路。鉴于此，本研究以湖羊Ovis aries羔羊为研究对象，探讨了2个日龄羔羊瘤胃上皮细菌群落结构以及多样性的差异，为幼龄反刍动物实施早期断奶技术提供理论依据。
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选用10只出生体质量相近[(3.60±0.37) kg]的初生湖羊羔羊，于日龄5 d时饲喂代乳粉，每天3次，自由采食；并于日龄10 d开始饲喂开食料及羊草。代乳粉、开食料和羊草的营养水平见表1。羔羊分别于日龄30 d (D30)和45 d (D45)屠宰5只(n=5)。屠宰后，立即将瘤胃组织用无菌磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)冲洗3次，以清除不能附着的细菌，先置于液氮中，后迅速转移至−80 ℃保存。
表 1 饲料的化学成分组成
Table 1. Chemical composition of the feeds
饲料类别 饲料成分干物质质量分数/(g·kg−1) 干物质 粗蛋白 中性洗
涤纤维酸性洗
涤纤维钙 磷 粗灰分 代乳粉 945.0 184.0 36.0 9.0 7.2 6.3 41.0 开食料 914.0 174.0 169.0 73.0 12.1 5.9 73.0 羊草 929.0 84.9 659.0 384.0 2.4 1.0 60.0 说明：开食料为每100.0 g干物质中，由58.5 g玉米、10.0 g小麦粉、27.0 g豆粕、1.1 g碳酸氢钙、1.4 g石灰石、1.0 g氯化钠和1.0 g维生素矿物质组成的预混料。 -
羔羊瘤胃上皮样品送至上海锐翌生物科技有限公司进行测序及微生物多样性分析。提取羔羊瘤胃上皮细菌总DNA后，用341F/806R通用引物(上游为5′-ACTCCTACGGGRSGCAGCAG-3′；下游为5′-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3′)扩增16S rDNA保守区域V3~V4区，并对产物进行纯化，定量和均一化形成测序文库，测序平台为Illumina HiSeq PE250。测序完成后，对原始数据进行全质控，通过97%相似度的标准聚类，得到操作分类单元(OTU)，每个OTU被认为可代表1个物种。将具有代表性的OTU序列与数据库比对，得到每个OTU对应的物种分类信息以及从门到属水平各样品的群落组成情况[6]。原始数据提交到美国生物技术信息中心(NCBI)，序列号为PRJNA857329。
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数据采用Excel 2010进行整理，结果采用SAS 8.0软件Duncan’s方差分析对各处理组进行多重比较。
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下机序列经拼接、优化、质控后共得到460 073条优质序列，平均每个样品为(57 509±7 989)条。共获得OTU为503个，平均每个样品OTU有(252±38)个。2组瘤胃上皮细菌的稀疏曲线见图1，虽然没有得到完全的平缓，但斜率在不断的减小，说明趋向于饱和。
图 1 样品稀疏曲线
Figure 1. Rarefaction curves of samples
从α多样性指数(表2)可知：D45组羔羊瘤胃上皮细菌的OTU个数显著多于D30组羔羊(P＜0.05)，Chao1指数D45组有增加的趋势(P=0.07)，但是Shannon指数和Simpson指数2组间均差异不显著(P＞0.05)，Coverage指数2组均在99%以上。因此，说明测序深度能准确反映湖羊瘤胃上皮微生物组成。
表 2 不同日龄羔羊瘤胃上皮细菌多样性指数
Table 2. Ruminal epithelial bacterial diversity of Hu lambs at different ages
项目 OTU数 Chao1
指数Shannon
指数Simpson
指数Coverage
指数D30 171 b 243±28 a 4.98±0.16 a 0.93±0.02 a 99.90±0.04 a D45 211 a 290±33 a 5.32±0.39 a 0.93±0.04 a 99.80±0.02 a 均值标准误 11.100 15.400 0.148 0.014 0.000 P 0.040 0.070 0.152 0.932 0.338 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05)。 从韦恩图(图2)可见：不同日龄湖羊羔羊瘤胃细菌共有的OTU数为271个，D45组羔羊特有的OTU为169个，而D30组羔羊特有的OTU数较少，为63个。
图 2 不同日龄湖羊羔羊瘤胃细菌OTU韦恩图
Figure 2. Venn diagram showing the unique and shared OTUs at different ages in bacterial communities of Hu lambs
基于UniFrac的加权主坐标分析其第1主成分和第2主成分的贡献率分别为44.50%和19.51%(图3)。两组羔羊个体差异较为显著，分布较为涣散，然而D30组和D45组分离较远，说明随着日龄的增长羔羊瘤胃上皮细菌分布存在差异。
图 3 基于OTU水平的主坐标分析
Figure 3. PCoA based on OTU level
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瘤胃上皮细菌门分类图(图4)显示：瘤胃上皮细菌主要归于厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门Bacteroidetes、变形菌门Proteobacteria和放线菌门Actinobacteria四大类。D45组(14.10%)放线菌门的相对丰度较D30组(4.36%)高。
图 4 门水平上瘤胃上皮细菌的相对丰度
Figure 4. Relative abundance of ruminal epithelial bacteria on phylum level
由图5可知：羔羊瘤胃上皮细菌中，普雷沃氏菌属Prevotella、弯曲杆菌属Campylobacter、欧陆森氏菌属Olsenella和拟杆菌属Bacteroides为优势菌属，其中普雷沃氏菌属Prevotella所占比例为25%。
图 5 属水平上瘤胃上皮细菌的相对丰度
Figure 5. Relative abundance of ruminal epithelial bacteria on genus level
Kruskal-Wallis非参数检验获得的组间总体差异结果显示(图6)：与D30组羔羊相比，D45组羔羊瘤胃上皮弯曲杆菌属和肠单胞菌Intestinimonas的相对丰度显著降低(P＜0.05)，拟杆菌属和小杆菌属Dialister的相对丰度有降低的趋势(P=0.083)；而萨顿氏菌属Suttonella、脱硫弧菌属Desulfobulbus和单胞菌属Brachymonas的相对丰度显著增加(P＜0.05)，琥珀酸菌属Succiniclasticum有增加的趋势(P=0.083)。
图 6 瘤胃上皮微生物属水平上的差异菌属
Figure 6. Differences of ruminal epithelial bacteria on genus level
结合瘤胃挥发性脂肪酸、瘤胃乳头长度和宽度[7]，与瘤胃上皮微生物进行相关性分析发现(图7)：萨顿氏菌属与瘤胃挥发性脂肪酸呈正相关(P＜0.05)，拟杆菌属、琥珀酸菌属、瘤胃球菌属Ruminococcus和奇异菌属Atopobium与瘤胃乳头长度呈负相关(P＜0.001)，琥珀酸菌属与瘤胃乳头宽度呈正相关(P＜0.001)。
图 7 瘤胃上皮细菌与表型变量的相关分析
Figure 7. Coefficients for major ruminal epithelial bacterial genera and phenotypic variables
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反刍动物瘤胃内细菌可分为3个不同的亚群，包括瘤胃内容物细菌、饲料颗粒细菌和瘤胃上皮细菌，这3种细菌种群在瘤胃内相互影响相互作用[8]。然而，与另外2个种群相比，瘤胃上皮细菌因其较低的密度(占总菌数的1%~2%)而研究较少[9]。据报道：瘤胃上皮相关菌群在分类鉴定和功能上与瘤胃内容物细菌群存在明显差异[2, 10]。SADET-BOURGETEAU等[11]研究发现：瘤胃上皮菌群在饲喂高精料和粗饲料间不存在显著差异，推断与瘤胃内容物细菌群相比，瘤胃上皮菌似乎更加稳定。HU等[12]研究限饲对怀孕母羊影响时，发现瘤胃上皮菌群较为稳定，不受限饲影响。新生动物瘤胃上皮发育特征在宿主代谢、免疫应答和瘤胃发育中起着重要作用，因此瘤胃上皮细菌定植对微生物群与宿主的关系具有重要意义，可影响宿主的早期发育和健康[13]，甚至对成年后的表现和健康产生持久的影响[14−15]。杨斌[1]研究表明：日龄10 d羔羊瘤胃上皮已有丰富的微生物定植，微生物多样性已经建立。本研究发现：随着日龄的增加，日龄45 d组羔羊瘤胃上皮细菌的多样性较日龄30 d组更为丰富，且各自具有独特的菌群，这一结果与JIAO等[13]的结论一致。JIAO等[13]探究了5个日龄(0、7、28、42和70 d)山羊瘤胃上皮菌群的定植情况，结果发现每个日龄组的山羊瘤胃上皮都有其独特的菌群，且高日龄组的山羊瘤胃上皮菌群较低日龄组的更为多样化，这与瘤胃内容物的微生物定植过程相似[16−17]。MAO等[17]研究指出：日龄45 d羔羊瘤胃内容物细菌的OTU数和系统发育多样性指数均高于日龄30 d羔羊。
厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门三大菌门是湖羊瘤胃上皮的主要菌门，这与SCHÄREN等[18]、PETRI等[19]、JIAO等[13]报道的反刍动物瘤胃上皮微生物的主要菌门一致。ANDERSON等[20]研究指出：厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门在门水平上相对丰度可达79.70%。尽管某些细菌的丰度随年龄的变化而变化，但它们在所有日龄中均存在，说明这些细菌是湖羊瘤胃上皮微生物区系的核心菌群。LIU等[21]研究发现：饲喂开食料显著降低了变形菌门的相对丰度，这一菌门的许多成员主要负责蛋白质降解和固氮的作用[22]。JIAO等[13]研究发现：随着日龄的增加，山羊瘤胃上皮中变形菌门的相对丰度显著降低，可能与母乳的摄入降低和精料开食料的投入有关。本研究中，2个日龄组变形菌门的相对丰度并不存在显著差异，可能原因是2组羔羊的饲喂方式相同，且采食量无显著差异[6]。同样，瘤胃内容物菌群结果也显示：4个主要菌门在2个日龄组不存在显著差异[17]。
属水平上，普雷沃氏菌属、弯曲杆菌属和欧陆森氏菌属三大菌属是湖羊瘤胃上皮的优势菌属。这一结果与LIU等[21]的研究结果一致，且发现弯曲杆菌属在日龄45 d组相对丰度显著降低。弯曲杆菌属是革兰氏阴性菌，在奶牛、绵羊以及山羊的肠道中定植[23]。JIAO等[13]发现：日龄42 d的山羊羔羊瘤胃上皮弯曲杆菌属占优势，其相对丰度可达20.33%。INGLIS等[24]和KRUEGER等[23]均研究指出：与饲喂精饲料相比，饲喂粗饲料，可从牛的瘤胃中分离出较多的弯曲杆菌属。本研究发现：随着日龄的增加，小杆菌属相对丰度有下降趋势。小杆菌属能够分解糖类，所包含的菌种常在口腔内被检测到[25−26]，同时，小杆菌属也在瘤胃中出现[27−28]。研究表明：口腔中小杆菌属含量的增加与唾液减少有关[29]，这提示瘤胃上皮小杆菌属相对丰度的减少可能与瘤胃的缓冲能力和液体周转有关[1, 28]。JIAO等[13]研究指出：日龄70 d羔羊瘤胃上皮中脱硫弧菌属是优势菌属，相对丰度达3.78%。有研究认为：脱硫弧菌属与硫的还原和丙酸的生成有关[30]，琥珀酸菌属虽然不能发酵碳水化合物和氨基酸，但能将琥珀酸盐转化为丙酸[31]，然而本研究中脱硫弧菌属和琥珀酸菌属的丰度与丙酸水平[6]呈相反的变化。
本研究表明：萨顿氏菌属与瘤胃挥发性脂肪酸呈正相关，拟杆菌属、琥珀酸菌属、瘤胃球菌属和奇异菌属与瘤胃乳头长度呈负相关，而琥珀酸菌属与瘤胃乳头宽度呈正相关，说明这些菌可能参与挥发性脂肪酸的代谢以及瘤胃组织的发育。此外，也有研究认为：特异的微生物通过促炎和抗炎途径及上皮细胞介导的信号来调节宿主的免疫反应[32]。
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日龄45 d组羔羊瘤胃上皮细菌群落多样性较日龄30 d组更为丰富，且2个日龄组有各自不同的微生物区系，提示不同日龄羔羊的瘤胃上皮细菌定植存在差异，且通过相关性分析表明：这些菌群参与了瘤胃挥发性脂肪酸的代谢与瘤胃乳头的发育。
Differences of ruminal epithelial bacterial diversity of Hu lambs at different ages
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摘要:
目的 比较不同日龄湖羊Ovis aries羔羊瘤胃上皮细菌多样性及菌群组成差异，为幼龄反刍动物早期断奶提供理论依据。 方法 选用10只出生体质量相近的初生湖羊羔羊，分别于日龄30 d (D30)和45 d (D45)各屠宰5只以获得瘤胃上皮组织，对其进行测序及微生物多样性分析。 结果 D45组羔羊瘤胃上皮细菌的操作分类单元(OTU)个数显著多于D30组羔羊(P＜0.05)，Chao1指数D45组有增加的趋势(P=0.07)。与D45组相比，D30组羔羊瘤胃细菌弯曲杆菌属Campylobacter和肠单胞菌Intestinimonas的相对丰度显著降低(P＜0.05)，拟杆菌属Bacteroides和小杆菌属Dialister的相对丰度有降低的趋势(P=0.083)；而萨顿氏菌属Suttonella、脱硫弧菌属Desulfobulbus和单胞菌属Brachymonas的相对丰度显著增加(P＜0.05)，琥珀酸菌属Succiniclasticum有增加的趋势(P=0.083)。相关性分析发现：萨顿氏菌属与瘤胃挥发性脂肪酸含量呈正相关(P＜0.05)，拟杆菌属、琥珀酸菌属、瘤胃球菌属Ruminococcus和奇异菌属Atopobium与瘤胃乳头长度呈负相关(P＜0.01)，琥珀酸菌属与瘤胃乳头宽度呈正相关(P＜0.01)。 结论 不同日龄羔羊的瘤胃上皮细菌定植存在差异，这些菌群参与瘤胃挥发性脂肪酸代谢及瘤胃乳头发育。图7表2参32 Abstract:Objective This study, with a comparison of the diversity and composition of rumen epithelial bacteria among Hu lambs (Ovis aries) of different ages, is aimed to provide basic data for early weaning of young ruminants. Method Ten male Hu lambs, with similar birth weight, were used in this study. At 30 days of age (D30) and 45 days of age (D45), five lambs were randomly selected and slaughtered to obtain rumen epithelial tissues (n=5), respectively. Sequencing and microbial diversity analysis were performed on them. Result The Operational Taxonomic Unit (OTU) number in D45 group was larger than that in D30 group (P＜0.05), with the Chao1 index in D45 group showing a tendency to increase (P=0.07). The relative abundances of Campylobacter and Intestinimonas declined (P＜0.05) with age, while the relative abundances of Suttonella, Desulfobulbus and Brachymonas increased (P＜0.05) with age. The relative abundances of Bacteroides and Dialister tended to decrease (P=0.083), whereas Succiniclasticum tended (P=0.083) to increase. The abundance of Suttonella was positively (P＜0.05) correlated with rumen total volatile fatty acid concentration, while the abundances of Bacteroides, Succiniclasticum, Ruminococcus and Atopobium were negatively (P＜0.01) correlated with ruminal papillae length, and the abundance of Succiniclasticum was positively (P＜0.01) correlated with rumen papillae width. Conclusion It was revealed that colonization by ruminal epithelial bacteria is age related and might participate in the metabolism of volatile fatty acid and ruminal papillae development of the rumen. [Ch, 7 fig. 2 tab. 32 ref.] -
Key words:
- age /
- Hu lambs /
- rumen epithelial /
- ruminal bacteria
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随着电镀、制革、冶金、染料等工业的不断发展，重金属对水体污染已严重破坏了生态平衡[1]。中国长江三峡水库区段沉积物中重金属元素含量受上游泥沙及沿江城市和工厂废水、废气和固体废弃物排放影响，已严重超标[2]。因此，如何将排放废水中重金属含量有效降低至排放标准以下，是当前水处理领域需要迫切解决的问题之一。吸附法作为一种有效去除废水中污染物的方法，因其低成本、实用、高效和环境友好性，得到了广泛应用。介孔二氧化硅(如：MCM-41、SBA-15和MCM-48)等材料因其具有均匀的孔结构、孔容、热稳定性等优良特性，常被选作吸附材料而被广泛应用[3-4]，但因其表面吸附官能团的数量及类型单一，限制了其在低浓度污水处理中的应用。树枝状大分子是一类具有高度支化结构的分子，具有大量的末端基团，且可形成笼状结构，可与重金属离子配位形成稳定的螯合物，有利于重金属的吸附，且毒性低，安全可靠[5]，所以，在介孔二氧化硅上合成树枝状化合物成为一种有效的研究方向。DIALLO等[6]研究了在有序介孔分子筛(SBA)上合成PAMAM树枝状化合物，并应用于重金属离子处理，取得较好吸附效果，因其特殊结构被广泛应用于生物医药、电子传感器、废水处理等领域[7-9]。SUN等[10]报道了在硅胶表面合成低代的枝状化合物(G1)，并研究了其对二价汞离子[Hg(Ⅱ)]的吸附性能，吸附容量达260 mg·g−1，表现出良好的吸附性能。BARAKAT等[11]研究了在二氧化钛表面合成枝状化合物并应用于水溶液中Pb2+的吸附及动力学，认为PAMAM枝状化合物是一种非常有前景的吸附剂。本研究将SBA-15接枝改性合成树枝状大分子，引入氨基，并用巯基乙酸改性嫁接巯基，成功合成了功能化枝状复合吸附材料(SBA-15-G3-SH)，并通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)、X射线衍射(XRD)、Zeta电位分析和氮气吸附-脱附等温线(BET)等方法对合成材料的结构和物理化学性质进行了表征；研究了SBA-15-G3-SH吸附剂对铬离子[Cr(Ⅵ)]的吸附及环境因素(如pH、吸附时间、浓度等)对吸附性能的影响，对吸附等温线、动力学、热力学等进行了研究，以期为有效去除水中重金属污染物提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料和仪器
SBA-15介孔分子筛(购于上海卓悦化工科技有限公司，孔容1.178 cm3·g−1，BET比表面积≥600 m2·g−1，孔径7~9 nm)；甲苯、氨丙基三乙氧基硅烷、甲醇、丙烯酸甲酯、巯基乙酸、重铬酸钾、乙二胺四乙酸二钠盐等均为分析纯。722型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，ZJSHA-BA水浴恒温振荡器(常州中捷试验仪器制造有限公司)，PHS-2F型酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。
1.2 枝状复合功能吸附剂(SBA-15-G3-SH)的制备
将10 g SBA-15介孔分子筛和300 mL甲苯溶剂加入烧杯，水浴搅拌30 min后放入500 mL圆底烧瓶中；将溶有3 g氨丙基三乙氧基硅烷的甲醇溶液20 mL缓慢滴入上述溶液中，80 ℃反应；6 h后，将经过改性后的SBA-15-G0加入到60 mL丙烯酸甲酯和300 mL甲醇溶剂中，于25 ℃反应24 h得到产物SBA-15-G0.5，经抽滤，用甲醇溶液洗涤，干燥过夜。再将SBA-15-G0.5与150 mL乙二胺，25 ℃在200 mL甲醇溶剂中反应24 h，抽滤，用甲醇溶液洗涤，干燥过夜，产物记为SBA-15-G1(1代)。重复进行上述步骤可得SBA-15-G2(2代)、SBA-15-G3(3代)。将50 mL巯基乙酸改性剂与5 g的SBA-15-G3放入300 mL乙醇水溶液(体积比为1∶1)中，室温磁力搅拌48 h。反应后的混合物经过滤后，分别用乙醇和去离子水洗涤3次，在室温下自然干燥后备用，产品记为SBA-15-G3-SH。
1.3 吸附实验
用去离子水配置质量浓度为1 000 mg·L−1的Cr(Ⅵ)溶液，实验时再稀释至所需质量浓度。典型的SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)溶液吸附实验：取50 mL质量浓度为200 mg·L−1的Cr(Ⅵ)溶液于250 mL的锥形瓶中，用5 mol·L−1的硫酸调节Cr(Ⅵ)溶液至一定的pH，加入100 mg制备的SBA-15-G3-SH吸附剂，在水浴振荡器中振荡吸附反应一定时间，然后用0.22 μm的滤膜过滤，滤液用紫外可见分光光度计在540 nm处测定Cr(Ⅵ)的吸光度，计算出其质量浓度、吸附量和去除率。
SBA-5-G3-SH吸附剂对Cr(Ⅵ)的吸附效果用吸附量(qe)和去除率(E)来表示。其计算公式分别如式(1)和式(2)所示[12]。
$$ {q_{\rm{e}}} = \frac{{{{\text{c}}_0} - {c_{\text{e}}}}}{m}V \text{；} $$ (1) $$ E = \frac{{{{\text{c}}_0} - {c_{t}}}}{{{{\text{c}}_0}}} \times 100{\text{% }} 。 $$ (2) 式(1)和式(2)中：qe为在平衡时的吸附量(mg·g−1)；c0和ce分别为初始和平衡时的Cr(Ⅵ)质量浓度(mg·L−1)；ct为在吸附时间t时Cr(Ⅵ)的质量浓度(mg·L−1)；V为Cr(Ⅵ)溶液的体积(L)；m为吸附剂的质量(g)；E为Cr(Ⅵ)的去除效率(%)。
离子强度的影响实验在Cr(Ⅵ)离子质量浓度为200 mg·L−1，温度为298 K，硫酸钠浓度为 0.02~0.10 mol·L−1的条件下进行。
1.4 吸附动力学和热力学实验
吸附动力学实验：取100 mL初始质量浓度为200 mg·L−1的重铬酸钾溶液，加入100 mg的SBA-15-G3-SH吸附剂，设置一系列反应时间梯度(5~1 800 min)，测量吸附后的Cr(Ⅵ)质量浓度。分别用准一级和准二级吸附动力学模型分析吸附过程并计算吸附速率。准一级和准二级吸附动力学模型如式(3)和式(4)所示。
$$ \mathrm{ln}\left({q}_{{\rm{e}}}-{q}_{t}\right)=\mathrm{ln}\left({q}_{{\rm{e}}}\right)-{k}_{1}t\text{；} $$ (3) $$ \frac{t}{{{q_t}}} = \frac{1}{{q_{\rm{e}}^2{k_2}}} + \left( {\frac{1}{{{q_{\rm{e}}}}}} \right)t 。 $$ (4) 式(3)和式(4)中：qt表示t时刻吸附量(mg·g−1)；t表示反应时间(min)；qe表示平衡吸附量(mg·g−1)；k1和k2分别表示准一级和准二级动力学方程反应速率常数，单位分别为min−1和g·mg−1·min−1。吸附等温线实验：分别取一系列质量浓度梯度(250~500 mg·L−1)的Cr(Ⅵ)溶液50 mL，加入SBA-15-G3-SH吸附剂100 mg，吸附时间为1 800 min。采用Langmuir和Freundlich方程分别对吸附等温线进行拟合。Langmuir和Freundlich方程分别见式(5)和式(6)所示。
$$ \frac{{{c_{\rm{e}}}}}{{{q_{\rm{e}}}}} = \frac{1}{{{K_{\rm{L}}}{q_{\rm{m}}}}} + \frac{{{c_{\rm{e}}}}}{{{q_{\rm{m}}}}} \text{；} $$ (5) $$ \lg {q_{\rm{e}}} = \lg {K_{\rm{F}}} + \frac{1}{n}\lg {c_{\rm{e}}} 。 $$ (6) 式(5)和式(6)中：ce表示吸附平衡时Cr(Ⅵ)的质量浓度(mg·L−1)；qm表示Langmuir最大吸附量(mg·g−1)；KL为Langmuir吸附常数(L·mg−1)；KF为Freundlich吸附常数，n是与温度、体系有关的常数。
吸附热力学：为了研究温度对SBA-15-G3-SH上吸附Cr(Ⅵ)的影响，通过式(7)和式(8)计算不同温度下的焓变(ΔHθ)、熵变(ΔSθ) 和吉布斯自由能变(ΔGθ)值。
$$ {\Delta G}^{\text{θ}}=-RT\mathit{{\rm{ln}}}{K}_{{\rm{L}}} \text{；} $$ (7) $$ \text{}\text{ln}{{K}}_{{\rm{L}}}=\frac{{\Delta S}^{\text{θ} }}{R}-\frac{{\Delta H}^{\text{θ} }}{RT} 。 $$ (8) 式(7)和式(8)中：R表示热力学常数(8.314 J·mol−1·K−1)；T表示热力学温度(K)；ΔSθ(J·mol−1·K−1)和ΔHθ(kJ·mol−1)分别从lnKL的截距和斜率计算得到；ΔGθ(kJ·mol−1)根据式(7)计算得到。
1.5 性能表征
场发射扫描电子显微镜(FESEM)和能量色散X-射线光谱(EDS)表征：采用德国Carl Zeiss公司生产的GeminiSEM 300型场发射扫描电子显微镜进行。样品经喷金处理。红外表征：取1~2 mg样品在玛瑙研钵中研磨成细粉末与干燥的溴化钾混合均匀，装入模具内，在压片机上压制成片测试。采用Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪对催化剂样品进行表征，扫描范围为 400~4 000 cm−1，扫描100次。粉末X射线衍射仪分析：实验在XRD-6000型粉末X射线衍射仪上进行，扫描电压为 40.0 kV，扫描电流为30.0 mA，铜靶，2θ为10°~50°，扫描速率为2°·min−1。BET表征：采用美国康塔仪器公司生产的Novae孔径测试仪测定催化剂的比表面积、孔径分布等，以氩气(Ar)为工作气体，高纯氦(He)为吸附气体。催化剂质量为0.1~0.2 g，从室温以10 ℃·min−1升温到200 ℃，脱气180 min，在液氮(−196 ℃)温度下进行比表面积及孔结构等测试。
2. 结果与讨论
2.1 表征分析
2.1.1 FESEM和EDS表征
图1A清晰的显示了SBA-15的结构和形貌。与图1A相比，经接枝改性后的样品(图1B)中可以观察到在SBA-15-G3-SH表面有一些小的颗粒物。从图2可看出：硫和氮元素是均匀分布在SBA-15-G3-SH上。可推断，接枝改性基团不仅接枝在SBA-15的表面，同时也接枝在孔道内部。SBA-15样品中主要含有碳(C)、氧(O)、硅(Si)等元素，其摩尔分数分别为 9.35%、64.50%和26.15%；而SBA-15-G3-SH吸附剂中的主要元素为碳、氮、氧、硅、硫(S)等，其摩尔分数分别为38.62%、9.21%、35.04%、15.10%和2.03%。结果表明：在SBA-15上成功地嫁接上了—NH2和—SH基团。
图 1 SBA-15 (A)和SBA-15-G3-SH (B)样品的FESEM图Figure 1 FESEM images of SBA-15 (A) and SBA-15-G3-SH (B)
图 2 SBA-15(A)和SBA-15-G3-SH(B)的EDS图Figure 2 EDS spectra of SBA-15(A) and SBA-15-G3-SH(B)2.1.2 BET表征
对改性前SBA-15和改性后的SBA-15-G3-SH进行了BET分析。SBA-15的比表面积为668.04 m2·g−1，孔径为6.75 nm，孔容为1.42 cm3·g−1；SBA-15-G3-SH的比表面积降低为109.29 m2·g−1，孔径为3.82 nm，孔容为0.15 cm3·g−1。
在介孔材料SBA-15上嫁接PAMAM树状大分子官能化和巯基基团导致比表面积、孔容和孔径减小，在接枝过程中，多孔材料的结构性能降低[13-14]。在图3可以看出：样品呈现典型的Langmuir Ⅳ型吸附/脱附等温曲线，同时还出现H1型迟滞环(图3)，并且具有明显的毛细孔凝聚，说明该样品为典型的二维六方结构，并且该方法制备出的吸附剂的介孔结构均很发达。改性前后吸附剂均存在滞后环，说明改性后吸附剂的孔道结构完好[15]。
图 3 SBA-15和SBA-15-G3-SH的氮气吸附/脱附等温线Figure 3 N2 adsorption/desorption isotherms of SBA-15 and SBA-15-G3-SH2.1.3 FTIR分析
从图4可以看出：在804 cm−1处强的吸收峰归属于Si—O—Si的SiO4对称伸缩振动吸收峰，1 087 cm−1则归属于Si—O—Si反对称振动吸收峰；966 cm−1的吸收峰归属于Si—OH的弯曲振动吸收峰；在465 cm−1处的峰是Si—O—Si键振动吸收峰；在3 082 cm−1处的峰是由于不对称的—NH2 伸缩振动所致；在2 923~2 958 cm−1处，可观察到SBA-15-G3-SH树状大分子中—CH伸缩振动[16-17]；图4 A与图4B相比，SBA-15-G3-SH可以明显看到嫁接了巯基后在2 500~2 600 cm−1处有较大的峰值，对应的是CH2—SH的伸缩振动峰。由此可见，氨基和巯基官能团成功嫁接到SBA-15介孔材料上。
图 4 SBA-15 (A)和SBA-15-G3-SH (B)的红外光谱图Figure 4 Infrared spectra of SBA-15 (A) and SBA-15-G3-SH (B)2.1.4 XRD分析
从图5可以看出：改性后的SBA-15-G3-SH衍射峰的强度有一定程度的减弱，但2个样品的衍射峰位置基本一致，说明SBA-15经过改性后与之前有相似的晶体结构，并且六方晶系的(100)、(110)和(200)晶面特征衍射峰强度均出现较大程度的减弱，这可能是由于接枝有机官能团之后，虽然介孔材料的孔道结构特征没出现明显的变化，孔道组成成分变得更加丰富，从而导致其有序性下降[18]。分析发现：SBA-15-G3-SH的衍射峰强度明显比SBA-15要低。有研究表明：氨改性和树状大分子嫁接巯基不影响SBA-15的结构阻隔性[19]，且经过改性后表面成功接上了游离氨基和巯基。
图 5 SBA-15-G3和 SBA-15-G3-SH的 X射线衍射谱图Figure 5 X-ray diffraction spectra of SBA-15 and SBA-15-G3-SH2.1.5 Zeta电位分析
由图6可知：在酸性条件下，SBA-15-G3-SH表面大量的伯胺和次氨基团与氢离子(H+)相互作用，易形成阳离子基；在pH较高时SBA-15-G3-SH的电荷较低。这是因为巯基基团在嫁接过程中失去了部分氨基，导致降低较明显。SBA-15-G3-SH吸附剂的Zeta电位随pH增加而降低。当 pH＞5时，Cr(Ⅵ)主要以Cr2O7 2−形式存在；而当pH＜2时，增加的H+与CrO4 2−相结合，Cr(Ⅵ)主要以HCrO4 −的形式存在，影响了SBA-15-G3-SH还原；当pH为2~5时，Cr(Ⅵ)主要以CrO4 2−形式存在，可较好地与巯基发生络合反应。结合Zeta电位数据可以看出：将pH调至2~3可以使Cr(Ⅵ)被更好的吸附。
图 6 SBA-15-G3-SH样品在不同pH下的Zeta电位测定Figure 6 Zeta potential measurement of SBA-15-G3-SH at different pH values2.2 环境条件对吸附性能的影响
2.2.1 不同pH的影响
pH是吸附材料吸附效果的一个重要影响因素，因为其不仅会使吸附材料表面的荷电状态发生改变，甚至还会改变金属离子的存在状态[20]。从图7可看出：当Cr(Ⅵ)溶液的pH＜2.3时，SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)吸附量随pH增大而增大，这是因为该pH下 Cr(Ⅵ)以 HCrO4 −的形式存在，溶液中H+ 会与Cr(Ⅵ)发生竞争吸附，提高溶液pH，溶液中H+浓度下降，Cr(Ⅵ)与巯基有更多的接触机会，有利于Cr(Ⅵ)的吸附。然而，随着溶液pH继续增大，Cr(Ⅵ)存在形式变为 Cr2O7 2−，该离子空间结构较大，不易进入孔道，减少了与巯基的接触。SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的吸附主要是通过表面的巯基与Cr(Ⅵ)生成稳定的螯合物，所以随着与巯基接触的Cr(Ⅵ)的减少，吸附率也逐渐降低。因此SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的较佳吸附pH为2.3。
图 7 pH值对SBA-15-G3-SH吸附Cr(Ⅵ)的影响Figure 7 Effect of pH on Cr(Ⅵ) adsorption capacity of SBA-15-G3-SH2.2.2 Cr(Ⅵ)初始质量浓度对吸附量的影响
在25 ℃下， Cr(Ⅵ)溶液的pH为2.3，吸附剂SBA-15-G3-SH用量为0.1 g条件下，通过改变Cr(Ⅵ)溶液的质量浓度，研究初始质量浓度对吸附性能的影响。由图8可以看出：随着Cr(Ⅵ)初始质量浓度的增大，平衡吸附量呈增大趋势。这可能是由于随着Cr(Ⅵ)的初始质量浓度的增加，吸附剂上的吸附官能团(如巯基)与Cr(Ⅵ)接触机会更多，更有利于吸附的进行。当Cr(Ⅵ)质量浓度为500 mg·L−1时，吸附量达到最大(190.05 mg·g−1)。
2.3 吸附动力学
从图9可以看出：SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的吸附可分为2个阶段，开始阶段(＜60 min)吸附速率非常快，第2个阶段吸附速率逐渐变慢，并逐渐达到吸附平衡。这是因为初始阶段吸附剂表面有大量的活性位点，Cr(Ⅵ)易被吸附。随着吸附时间的增加，吸附剂表面活性位点减少，吸附变慢。
图 9 不同温度25、35、45 ℃条件下Cr(Ⅵ)吸附量与接触时间的关系Figure 9 Effect of Cr(Ⅵ) adsorption vs contact time at various temperatures of 25, 35 and 45 ℃对吸附数据进行吸附动力学拟合，拟合参数如表1所示。对比拟合曲线可知：SBA-15-G3-SH的吸附更符合准二级吸附动力学模型(R2＞0.998 0)。
表 1 吸附动力学模型的拟合参数Table 1 Fitting parameters of the adsorption kinetics modelsT/K 准一级吸附 准二级吸附 qe/ (mg·g−1) k1/min−1 R2 qe/(mg·g−1) k2/(g·mg−1·min−1) R2 298 93.615 9 0.000 6 0.760 8 164.745 0.000 18 0.999 2 308 95.985 8 0.000 6 0.767 2 163.399 0.000 18 0.999 2 318 100.133 1 0.000 6 0.801 5 162.075 0.000 16 0.998 9 2.4 吸附等温线
从表2可知：随着平衡质量浓度的增加，SBA-15-G3-SH 对Cr(Ⅵ)的平衡吸附量也呈现增加趋势，并且在质量浓度较低时增加迅速，达到一定质量浓度后增加趋势变缓，符合典型的Langmuir吸附模型规律。SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的吸附更符合Langmuir吸附等温线方程(R2=0.993 8)，线性关系很好，吸附过程为化学单层吸附，因此当Cr(Ⅵ)质量浓度较高时，与巯基结合的量也越多。随着Cr(Ⅵ)初始质量浓度增大吸附量逐渐增大，当巯基完全与Cr(Ⅵ)结合后，吸附量达到饱和。
表 2 吸附等温线模型的拟合参数Table 2 Fitting parameters of the adsorption isotherm modelsLangmuir 等温模型 Freundlich 等温模型 qm/(mg·g−1) KL/(L·mg−1) R2 KF n R2 192.31 0.294 0.993 8 117.69 10.07 0.960 5 2.5 吸附热力学
ΔGθ、ΔHθ和ΔSθ根据式(7)和式(8)计算得到(表3)。从表3可看出：在298、308和318 K时，ΔGθ分别为−12.99、−13.40和−13.77 kJ·mol−1。ΔGθ均为负值，表明SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)吸附在热力学上是一个自发过程，尤其是在高温条件下。这些结果表明：高温可能更有利于Cr(Ⅵ)吸附过程。此外，ΔHθ为−1.334 kJ·mol−1，说明SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的吸附是放热反应；ΔSθ为39.10 J·mol−1·K−1，表明随着吸附过程的进行，固-液界面的自由度增大，体系混乱度增大[21]。
表 3 SBA-15-G3-SH吸附Cr(Ⅵ)的热力学参数Table 3 Thermodynamic parameters of Cr(Ⅵ) adsorption onto SBA-15-G3-SHT/K ΔGθ /(kJ·mol−1) ΔHθ/(kJ·mol−1) ΔSθ/(J·mol−1·K−1) R2 298 −12.99 −1.334 39.10 0.998 7 308 −13.40 318 −13.77 2.6 离子强度对SBA-15-G3-SH吸附性能的影响
为了进一步研究溶液中干扰离子对SBA-15-G3-SH吸附Cr(Ⅵ)过程的影响，并探讨吸附过程中是否存在静电相互作用，在Cr(Ⅵ)溶液中加入一定量的硫酸钠来而考察对Cr(Ⅵ)的吸附的影响。从图10可以看出：随着溶液中硫酸钠浓度逐渐升高0~0.10 mol·L−1，SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的吸附量明显地降低，从163.92 mg·g−1降低到122.89 mg·g−1。离子强度的增加导致吸附剂对Cr(Ⅵ)的吸附量减少，这可能是由于吸附剂表面与溶液中离子间的静电相互作用导致的。溶液中引入的
${\rm{SO}}_4^{2-} $ 可能与Cr(Ⅵ)相互竞争SBA-15-G3-SH的活性中心，从而一定程度上抑制了SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的吸附。
图 10 离子浓度对Cr(Ⅵ)吸附的影响Figure 10 Effect of ionic strength on Cr(Ⅵ) adsorption onto SBA-15-G3-SH2.7 吸附机理
吸附动力学符合准二级动力学曲线说明：SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的吸附能力与吸附剂上的吸附点位有关，占据主导地位的是化学吸附而非物理吸附，主要通过巯基、氨基与金属离子的络合和静电吸附进行。从等温线更符合Langmuir曲线可得出：吸附过程为化学单层吸附，固体表面是均匀的，即表面上所有部位的吸附能力都相同，被吸附在固体表面上的分子相互之间无作用力。FESEM、EDS、FTIR、XRD的表征结果表明：SBA-15-G3-SH上成功地嫁接了—NH2和—SH官能团，并且这些基团的存在有利于重金属Cr(Ⅵ)的吸附。SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)具有优异的吸附能力归因于其嫁接的巯基与重金属离子间的络合作用，吸附的主要作用是SBA-15-G3-SH表面的—SH基团与重金属离子的表面络合作用，导致形成稳定的化合物，从而达到吸附并去除重金属离子的目的。离子浓度对吸附性能影响的实验表明：吸附剂表面与溶液中Cr(Ⅵ)金属离子之间可能还存在一定的静电相互作用，也有利于Cr(Ⅵ)的吸附。
3. 结论
本研究通过对介孔材料SBA-15的改性，成功地合成了具有树状大分子结构和巯基基团的复合吸附剂SBA-15-G3-SH。结果表明：合成的SBA-15-G3-SH中—NH2和—SH官能团被成功地嫁接在SBA-15中，且吸附剂对Cr(Ⅵ)具有较强的吸附能力，最大吸附量达192.31 mg·g−1。吸附效果随着温度升高而降低，吸附等温线和吸附动力学分别符合Langmuir方程和准二级动力学方程。热力学参数表明：SBA-15-G3-SH对Cr(Ⅵ)的吸附过程是自发的和吸热的。FESEM、EDS、FTIR、XRD的表征结果表明：SBA-15-G3-SH上成功地嫁接了—NH2和—SH官能团，并且这些基团的存在有利于吸附重金属Cr(Ⅵ)。吸附的主要作用为SBA-15-G3-SH表面的—SH基团的表面络合作用以及金属离子的静电吸引，形成稳定的化合物。循环重复性实验结果表明：枝状复合吸附剂SBA-15-G3-SH能重复利用且具有较好的吸附性能，具有高效、经济、环保等优良特性，是处理含重金属废水很有前景的一种吸附剂。
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图 2 不同日龄湖羊羔羊瘤胃细菌OTU韦恩图
Figure 2 Venn diagram showing the unique and shared OTUs at different ages in bacterial communities of Hu lambs
图 4 门水平上瘤胃上皮细菌的相对丰度
Figure 4 Relative abundance of ruminal epithelial bacteria on phylum level
图 5 属水平上瘤胃上皮细菌的相对丰度
Figure 5 Relative abundance of ruminal epithelial bacteria on genus level
图 6 瘤胃上皮微生物属水平上的差异菌属
Figure 6 Differences of ruminal epithelial bacteria on genus level
图 7 瘤胃上皮细菌与表型变量的相关分析
Figure 7 Coefficients for major ruminal epithelial bacterial genera and phenotypic variables
表 1 饲料的化学成分组成
Table 1. Chemical composition of the feeds
饲料类别 饲料成分干物质质量分数/(g·kg−1) 干物质 粗蛋白 中性洗
涤纤维酸性洗
涤纤维钙 磷 粗灰分 代乳粉 945.0 184.0 36.0 9.0 7.2 6.3 41.0 开食料 914.0 174.0 169.0 73.0 12.1 5.9 73.0 羊草 929.0 84.9 659.0 384.0 2.4 1.0 60.0 说明：开食料为每100.0 g干物质中，由58.5 g玉米、10.0 g小麦粉、27.0 g豆粕、1.1 g碳酸氢钙、1.4 g石灰石、1.0 g氯化钠和1.0 g维生素矿物质组成的预混料。 
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表 2 不同日龄羔羊瘤胃上皮细菌多样性指数
Table 2. Ruminal epithelial bacterial diversity of Hu lambs at different ages
项目 OTU数 Chao1
指数Shannon
指数Simpson
指数Coverage
指数D30 171 b 243±28 a 4.98±0.16 a 0.93±0.02 a 99.90±0.04 a D45 211 a 290±33 a 5.32±0.39 a 0.93±0.04 a 99.80±0.02 a 均值标准误 11.100 15.400 0.148 0.014 0.000 P 0.040 0.070 0.152 0.932 0.338 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05)。
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20220482
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